DE19923950A1 - New microorganisms that produce high sulfite levels at a late stage in their growth, useful for producing beer, prevent development of off-flavors by oxidation - Google Patents

Abstract

Microorganisms (A) able to produce delayed and large amounts of sulfite comprising a DNA construct (I) containing one or more genes (II) involved in the sulfite cycle under the control of a promoter, are new. Microorganisms (A) able to produce delayed and large amounts of sulfite comprising a DNA construct (I) containing one or more genes (II) involved in the sulfite cycle under the control of a promoter, are new. The high sulfite concentration appears at a late stage of substrate utilization, in the stationary growth phase, in the last third of the exponential growth phase or at a cell density of 60-90% of that achieved in the growth phase. Independent claims are also included for (I) and producing (A) by incorporation of (I).

Description

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Erzeugung verzögerter und erhöhter Sulfitkonzentration, die zu einem späten Zeitpunkt der Substratverwertung oder in der stationären Wachstumsphase oder im letzten Drittel der exponentiellen Wachstumsphase oder bei etwa 60% bis etwa 90% der in einer Wachstumsphase erreichbaren Zellzahl auftritt, umfassend ein DNA-Konstrukt, umfassend ein oder mehrere am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene unter der Kontrolle eines Promotors.The invention relates to a microorganism capable of producing delayed and increased sulphite concentration at a late stage of the substrate utilization or in the stationary growth phase or in the last third of the exponential growth phase or at about 60% to about 90% of the cell number achievable in a growth phase occurs, comprising a DNA construct comprising one or more genes involved in sulfite metabolism under the Control of a promoter.

In Abhängigkeit von den Lagerbedingungen kann es in abgefülltem Bier nach einiger Zeit zur Ausbildung eines Alterungsgeschmacks kommen. Für diesen Alterungsgeschmack sind vor allem Carbonyle verantwortlich, die durch Oxidation von Bierinhaltsstoffen entstehen. Sulfit ist von großer Wichtigkeit für die Geschmacksstabilität von Bier. Zum einen bildet das Sulfit mit Carbonylen nichtflüchtige, und damit aromainaktive Verbindungen. Als Reduktionsmittel verhindert es zum anderen Oxidationsreaktionen während des Alterungsprozesses.Depending on the storage conditions, it can become in bottled beer after a while Formation of an aging taste come. For this aging taste are above all Responsible for carbonyls, which result from the oxidation of beer ingredients. Sulphite is from of great importance for the taste stability of beer. On the one hand, the sulphite also forms Carbonylenes are non-volatile and therefore aroma-active compounds. As a reducing agent On the other hand, it prevents oxidation reactions during the aging process.

Sulfit ist ein Zwischenprodukt bei der Biosynthese schwefelhaltiger Aminosäuren, das durch Reduktion von Sulfat entsteht, welches aus der Würze aufgenommen wird. Eine detaillierte Darstellung dieses Stoffwechselweges in der Hefe ist in der Literatur beschrieben [siehe z. B. Narziss et al. (1995), Brauwelt 49, 2576-2606 und darin zitierte Literatur] und soll im folgenden kurz wiedergegeben werden.Sulphite is an intermediate product in the biosynthesis of sulphurous amino acids that is produced by Reduction of sulphate occurs, which is absorbed from the wort. A detailed Representation of this metabolic pathway in yeast is described in the literature [see z. B. Narciss et al. (1995), Brauwelt 49, 2576-2606 and literature cited therein] and is intended in the following be played back briefly.

• - Der erste Schritt ist die Sulfataufhahme aus dem Medium bzw. der Würze. Dies ist ein aktiver Prozeß, bei dem Permeasen der Hefezellen beteiligt sind.- The first step is the absorption of sulphate from the medium or the wort. This is an active one Process in which permeases of the yeast cells are involved.
• - Im zweiten und dritten Schritt wird das Sulfat enzymatisch aktiviert. Dabei sind die beiden Enzyme ATP-Sulfurylase und APS-Kinase (Adenosin-5'-Phosphosulfat-Kinase) beteiligt, wobei zwei Moleküle ATP verbraucht werden.- In the second and third step, the sulfate is activated enzymatically. The two are there Enzymes ATP sulfurylase and APS kinase (adenosine 5'-phosphosulfate kinase) involved, consuming two molecules of ATP.
• - Im vierten Schritt wird das aktivierte Sulfat zum Sulfit reduziert. Dieser Schritt wird durch das Enzym PAPS-Reduktase (3-Phosphoadenosyl-5-Phosphosulfat-Reduktase) katalysiert.- In the fourth step, the activated sulphate is reduced to sulphite. This step is through catalyzes the enzyme PAPS reductase (3-phosphoadenosyl-5-phosphosulfate reductase).
• - Im fünften Schritt wird das Sulfit durch die Sulfit-Reduktase zum Sulfid reduziert.- In the fifth step, the sulfite is reduced to sulfide by the sulfite reductase.

Das gebildete Sulfid steht dann für die Biosynthese der schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin und Cystein zur Verfügung. Methionin hemmt als Endprodukt die Bildung vieler Enzyme dieses Biosyntheseweges. Zusätzlich tritt bei vielen Schritten dieses Stoffwechselweges Feedbackhemmung auf, d. h. die Aktivität eines Enzyms wird durch eines der nachfolgenden Produkte herabgesetzt.The sulfide formed then stands for the biosynthesis of the sulfur-containing amino acids methionine and cysteine are available. As an end product, methionine inhibits the formation of many enzymes Biosynthetic pathway. In addition, this metabolic pathway occurs in many steps Feedback inhibition on, d. H. the activity of an enzyme is determined by one of the following Products discounted.

Eine Erhöhung der Sulfitkonzentration kann auf mehreren Wegen erreicht werden. Zum einen kann im Hefestoffwechsel die Umsetzung des Sulfits verhindert oder eingeschränkt werden. Zum anderen kann die Rate der Sulfitbildung verstärkt werden.An increase in the sulfite concentration can be achieved in several ways. On the one hand the conversion of sulfite can be prevented or restricted in the yeast metabolism. To the others can increase the rate of sulphite formation.

Durch Transformation von Hefezellen mit Plasmiden, die die Gene MET3 bzw. MET14 tragen, konnte die ausgeschiedene Sulfitmenge 6- bis 15fach erhöht werden [Korch, C. et al. (1991), Proc. EBC. Congr. 1991, 201-208]. Diese Gene kodieren die Enzyme ATP-Sulfurylase bzw. APS-Kinase.By transforming yeast cells with plasmids that carry the MET3 or MET14 genes, the amount of sulfite excreted could be increased 6 to 15 times [Korch, C. et al. (1991), Proc. EBC. Congr. 1991, 201-208]. These genes encode the enzymes ATP sulfurylase or APS kinase.

Weiterhin sind in der Literatur Beispiele dafür beschrieben, daß eine Erhöhung der Sulfitausscheidung auch durch Mutation in den Genen erreicht werden kann, deren Genprodukte für die Umsetzung von Sulfit benötigt werden. So führt eine Mutation im MET5-Gen, welches für eine Untereinheit der Sulfitreduktase kodiert, zu einer Anhäufung von Sulfit [Korch, C. et al. (1991) Proc. EBC Congr. 1991, 201-208]. Auch durch Anwendung gentechnischer Methoden kann dies erreicht werden. So konnte die Aktivität der Gene MET2 bzw. MET10 in Brauhefen reduziert bzw. ganz ausgeschaltet werden, wodurch ebenfalls eine erhöhte Sulfitbildung erreichtwurde [Hansen, J. & Kielland-Brandt, M. C. (1995), Proc. EBC Congr. 1995, 319-328; Hansen, J. & Kielland-Brandt, M. C. (1996), J. Biotechnology 50, 75-87; Hansen, J. & Kielland-Brandt, M. C. (1996) Nat. Biotechnol 14(11), 1587-91]. MET2 kodiert die Homoserin-O-Transacetylase, die die Umwandlung von Homoserin in O-Acetylhomoserin katalysiert. O-Acetylhomoserin ist das Intermediärprodukt, auf das das Sulfid als Endprodukt der Sulfatreduktion übertragen wird. Wird diese Substanz nicht mehr gebildet, wird das Sulfid angehäuft und kein Methionin mehr gebildet. Dadurch kommt es zu einer Derepression der biochemischen Sulfatreduktion, was auch zu einem Anstieg der Sulfitbildung führt. Partielle oder vollständige Inaktivierung des MET10- Gens, welches eine Untereinheit der Sulfit-Reduktase kodiert, resultierte ebenfalls in einer erhöhten Akkumulation von Sulfit. Von Nachteil ist bei diesem Verfahren jedoch, daß sich bei Einsatz der bisher modifizierten Hefen die Gärdauer verlängert und daß z. B. der Geschmack der erhaltenen Biere negativ beeinflußt wird.Furthermore, examples are described in the literature that an increase in Sulphite excretion can also be achieved by mutation in the genes, their gene products are required for the implementation of sulfite. A mutation in the MET5 gene, which is responsible for encoding a subunit of sulfite reductase, to an accumulation of sulfite [Korch, C. et al. (1991) Proc. EBC Congr. 1991, 201-208]. Also by using genetic engineering methods this can be achieved. So the activity of the genes MET2 and MET10 in brewing yeast reduced or completely switched off, whereby an increased sulfite formation was also achieved [Hansen, J. & Kielland-Brandt, M. C. (1995), Proc. EBC Congr. 1995, 319-328; Hansen, J. & Kielland-Brandt, M.C. (1996) J. Biotechnology 50, 75-87; Hansen, J. & Kielland-Brandt, M. C. (1996) Nat. Biotechnol 14 (11), 1587-91]. MET2 codes for homoserine O-transacetylase, which catalyzes the conversion of homoserine to O-acetylhomoserine. O-acetyl homoserine is the intermediate product to which the sulfide is transferred as the end product of the sulfate reduction. If this substance is no longer formed, the sulfide is accumulated and no more methionine educated. This leads to a derepression of the biochemical sulfate reduction, which also leads to an increase in sulphite formation. Partial or complete inactivation of the MET10 Gene encoding a subunit of sulfite reductase also resulted in one increased accumulation of sulfite. The disadvantage of this method, however, is that when Use of the previously modified yeasts prolonged the fermentation time and that, for. B. the taste of the beers obtained is adversely affected.

Ein weiterer Nachteil bei allen bisher angewandten Verfahren besteht darin, daß nicht nur die Sulfitmenge erhöht wird, sondern gleichzeitig eine gegenüber dem Ausgangsstamm deutlich verfrühte Bildung von Sulfit im Gärungsverlauf auftritt. Die bisher eingesetzten beispielhaften Bierbrauhefestämme haben am Ende der Wachstumsphase bereits mindestens 50% der im weiteren Gärverlauf maximal erreichten Sulfitkonzentration gebildet. Dadurch kann es schon während der Gärung zur Komplexbildung zwischen Würzecarbonylen und Sulfit kommen, wodurch die Reduktion der Würzecarbonyle behindert wird. Eine verfrühte Bildung von Sulfit hat somit einen negativen Effekt, da die Komplexe ins fertige Erzeugnis, z. B. ins Bier, gelangen können, wo sie nach Aufspaltung zum Alterungsgeschmack beitragen. Wegen des deutschen Reinheitsgebotes ist es für viele Brauer ebenfalls keine Alternative, Sulfit nach Abschluß des Gärprozesses dem fertigen Bier zuzusetzen.Another disadvantage of all previously used methods is that not only Sulphite amount is increased, but at the same time significantly compared to the original strain premature formation of sulphite occurs in the course of fermentation. The exemplary ones used so far Brewery strains already have at least 50% of the im at the end of the growth phase The maximum sulphite concentration reached was formed in the further fermentation process. So it can complex formation between wort carbonyls and sulphite occur during fermentation, whereby the reduction of the wort carbonyls is hindered. Has a premature formation of sulphite thus a negative effect, since the complexes in the finished product, z. B. in beer where they contribute to the aging taste after breakdown. Because of the German According to the Purity Law, it is also not an alternative for many brewers to use sulfite after the Add fermentation process to the finished beer.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht somit in der Bereitstellung eines für die Lebensmittelherstellung benötigten Mikroorganismus, der eine erhöhte Sulfitkonzentration erst nach der eigentlichen Lebensmittelherstellung erzeugt. Eine weitere der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist die Bereitstellung einer DNA-Sequenz zur verzögerten Erhöhung der Sulfitkonzentration. Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines für die Lebensmittelherstellung benötigten Mikroorganismus, der eine erhöhte Sulfitkonzentration erst nach der eigentlichen Lebensmittelherstellung erzeugt, bereitzustellen.The object on which the present invention is based is thus to provide a microorganism required for food production that increases Sulphite concentration only generated after the actual food production. Another of the The present invention is based on the provision of a DNA sequence for delayed increase in sulphite concentration. Furthermore, the invention is based on the object a process for the production of a microorganism required for food production, which only generates an increased sulphite concentration after the actual food production, provide.

Die Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Erzeugung verzögerter und erhöhter Sulfitkonzentration, die zu einem späten Zeitpunkt der Substratverwertung oder in der stationären Wachstumsphase oder im letzten Drittel der exponentiellen Wachstumsphase oder bei etwa 60% bis etwa 90% der in einer Wachstumsphase erreichbaren Zellzahl auftritt, umfassend ein DNA-Konstrukt, umfassend ein oder mehrere am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene unter der Kontrolle eines Promotors. Bevorzugt ist ein Mikroorganismus, der eine Hefe oder ein Bakterium ist. Besonders bevorzugt ist eine Hefe, wobei es sich bei dem Hefestamm um die Gattung Saccharomyces, vorzugsweise die Art Saccharomyces cerevisisae, ober- oder untergärige Brauhefen, Weinhefen, Sekthefen, Sakehefen, Sherryhefen, Brennereihefen oder Bäckereihefen oder Hefen der Gattungen Brettanomyces oder Kluyveromyces oder anderer in der Lebensmittelherstellung eingesetzter Hefen handelt. Ferner bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei das am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gen ausgewählt ist aus der Gruppe der Hefegene SUL1, SUL2, YGR125W, YOR251C, YPR003C, FZF1, YNR013C, MET3, MET14, MET16, MET25, MET22, MET1, MET8, MET5, MET10, MET18, MET2, MET6, SAM1, SAM2, oder einem Gen, welches ein Polypeptid mit APS-Kinase- oder PAPS- Reduktase-Aktivität kodiert. Besonders bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei das DNA- Konstrukt das am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gen in einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien, oder zwei verschiedene Gene in jeweils einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien, oder eine Vielzahl von Genen in jeweils einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien umfaßt. Ferner bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe der Promotoren der folgenden Hefegene der HSP-Gene, der SSA-Gene, HSP26, HSP30, YGP1, HXK1, MOL1 (THI4), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4 oder YAT1. Ferner bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei der Promotor und/oder das(die) unter der Kontrolle des Promotors stehende(n) am Sulfitstoffwechsel beteiligte(n) Gen(e) durch Modifikationen, umfassend Substitution, Insertion, Deletion, Inversion oder Addition modifiziert ist(sind). Besonders bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei der Promotor mit einem anderen Promotor oder dessen Fragment substituiert, inseriert oder addiert wird. Ferner bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei das Gen, welches ein Polypeptid mit APS-Kinase-Aktivität kodiert, eine Nukleinsäuresequenz von 60 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum MET14-Gen von Saccharomyces cerevisiae (GenBank Accession-Nummer S55315) identisch ist, oder wobei das Gen, welches ein Polypeptid mit PAPS-Reduktase-Aktivität kodiert, eine Nukleinsäuresequenz von 60 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum MET16-Gen von Saccharomyces cerevisiae (Protein-ID AAA34774; GenBank Accession-Nummer J055991) identisch ist. Besonders bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei der Promotor eine Nukleinsäuresequenz von 20 Basenpaaren umfaßt, die zu mindestens 60% zum HSP26-Promotor von Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. M23871 von GenBank) oder zum HSP30-Promotor von Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. X59750 von GenBank) identisch ist. Insbesondere bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei das DNA-Konstrukt in episomaler Form oder in ins Genom integrierter Form vorliegt.The object is achieved by providing a microorganism with the ability to Generation of delayed and increased sulphite concentration, which occurs at a later point in time of the Substrate utilization or in the stationary growth phase or in the last third of the exponential growth phase or at about 60% to about 90% of that in a growth phase achievable cell number occurs, comprising a DNA construct comprising one or more am Sulphite metabolism involved genes under the control of a promoter. Preferred is one Microorganism that is a yeast or a bacterium. A yeast is particularly preferred, wherein the yeast strain is of the genus Saccharomyces, preferably the species Saccharomyces cerevisisae, top- or bottom-fermenting brewing yeast, wine yeast, champagne yeast, sake yeast, Sherry yeast, distillery yeast or bakery yeast or yeasts of the genera Brettanomyces or Kluyveromyces or other yeasts used in food production. Further preference is given to a microorganism in which the gene involved in sulfite metabolism is selected from the group of yeast genes SUL1, SUL2, YGR125W, YOR251C, YPR003C, FZF1, YNR013C, MET3, MET14, MET16, MET25, MET22, MET1, MET8, MET5, MET10, MET18, MET2, MET6, SAM1, SAM2, or a gene that contains a polypeptide with APS kinase or PAPS Encodes reductase activity. A microorganism is particularly preferred, the DNA Construct the gene involved in sulfite metabolism in one copy or in a multitude of copies, or two different genes, each with one copy or a plurality of copies, or one A plurality of genes in each one copy or a plurality of copies comprises. Further a microorganism is preferred, the promoter being selected from the group of Promoters of the following yeast genes of the HSP genes, the SSA genes, HSP26, HSP30, YGP1, HXK1, MOL1 (THI4), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4 or YAT1. Also preferred is a Microorganism where the promoter and / or the (which) are under the control of the promoter standing (s) involved in the sulfite metabolism (s) gene (s) by modifications, comprising Substitution, insertion, deletion, inversion or addition is (are) modified. Particularly preferred is a microorganism, the promoter with another promoter or its Fragment is substituted, inserted or added. A microorganism is also preferred wherein the gene encoding a polypeptide having APS kinase activity is a Contains a nucleic acid sequence of 60 base pairs which is at least 60% related to the MET14 gene of Saccharomyces cerevisiae (GenBank Accession Number S55315) is identical, or where the Gene encoding a polypeptide with PAPS reductase activity, a nucleic acid sequence of 60 base pairs that are at least 60% related to the MET16 gene from Saccharomyces cerevisiae (protein ID AAA34774; GenBank accession number J055991) is identical. A microorganism is particularly preferred, the promoter being a nucleic acid sequence of 20 base pairs which are at least 60% to the HSP26 promoter from Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. M23871 from GenBank) or to the HSP30 promoter from Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. X59750 from GenBank) is identical. Particularly preferred is a Microorganism, where the DNA construct is in episomal form or integrated into the genome Form.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein DNA-Konstrukt, umfassend ein oder mehrere am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene unter der Kontrolle eines Promotors. Bevorzugt ist ein DNA- Konstrukt, wobei das am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gen ausgewählt ist aus der Gruppe der Hefegene SUL1, SUL2, YGR125W, YOR251C, YPR003C, FZF1, YNR013C, MET3, MET14, MET16, MET25, MET22, MET1, MET8, MET5, MET10, MET18, MET2, MET6, SAM1, SAM2, oder einem Gen, welches ein Polypeptid mit APS-Kinase- oder PAPS-Reduktase-Aktivität kodiert. Insbesondere bevorzugt ist ein DNA-Konstrukt, umfassend das am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gen in einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien, oder zwei verschiedene Gene in jeweils einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien, oder eine Vielzahl von Genen in jeweils einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien. Ferner bevorzugt ist ein DNA-Konstrukt, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe der Promotoren der folgenden Hefegene der HSP-Gene, der SSA-Gene, HSP26, HSP30, YGP1, HXK1, MOL1 (THI4), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4 oder YAT1. Ferner bevorzugt ist ein DNA-Konstrukt, wobei der Promotor und/oder das (die) unter der Kontrolle des Promotors stehende(n) am Sulfitstoffwechsel beteiligte(n) Gen(e) durch Modifikationen, umfassend Substitution, Insertion, Deletion, Inversion oder Addition modifiziert ist (sind). Besonders bevorzugt ist ein DNA-Konstrukt, wobei der Promotor mit einem anderen Promotor oder dessen Fragment substituiert, inseriert oder addiert wird. Ferner bevorzugt ist ein DNA-Konstrukt, wobei das Gen, welches ein Polypeptid mit APS-Kinase-Aktivität kodiert, eine Nukleinsäuresequenz von 60 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum MET14-Gen von Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. AAB19854) identisch ist, oder wobei das Gen, welches ein Polypeptid mit PAPS-Reduktase-Aktivität kodiert, eine Nukleinsäuresequenz von 60 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum MET16-Protein von Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. AAA34774) identisch ist. Besonders bevorzugt ist ein DNA-Konstrukt, wobei der Promotor eine Nukleinsäuresequenz von 20 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum HSP26-Promotor von Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. M23871) oder zum HSP30-Promotor von Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. X59750) identisch ist. Insbesondere bevorzugt ist ein DNA- Konstrukt in linearer oder zirkulärer Form.The object is also achieved by a DNA construct comprising one or more am Sulphite metabolism involved genes under the control of a promoter. Preferred is a DNA Construct, where the gene involved in sulfite metabolism is selected from the group of Yeast genes SUL1, SUL2, YGR125W, YOR251C, YPR003C, FZF1, YNR013C, MET3, MET14, MET16, MET25, MET22, MET1, MET8, MET5, MET10, MET18, MET2, MET6, SAM1, SAM2, or a gene which is a polypeptide with APS kinase or PAPS reductase activity coded. Particularly preferred is a DNA construct comprising that in sulfite metabolism involved gene in one copy or multiple copies, or two different genes in one copy at a time, or a plurality of copies, or a plurality of genes in one at a time Copy or multiple copies. Also preferred is a DNA construct, where the Promoter is selected from the group of promoters of the following yeast genes of the HSP genes, of the SSA genes, HSP26, HSP30, YGP1, HXK1, MOL1 (THI4), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4 or YAT1. Also preferred is a DNA construct, wherein the promoter and / or the (those) under the Control of the promoter (s) involved in the sulfite metabolism (s) gene (s) Modifications comprising substitution, insertion, deletion, inversion or addition modified is (are). Particularly preferred is a DNA construct, the promoter with another Promoter or its fragment is substituted, inserted or added. Also preferred is a A DNA construct, wherein the gene encoding a polypeptide with APS kinase activity is a Contains a nucleic acid sequence of 60 base pairs which is at least 60% related to the MET14 gene of Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. AAB19854) is identical, or where the gene which is a Polypeptide encoding PAPS reductase activity, a nucleic acid sequence of 60 base pairs contains at least 60% of the MET16 protein of Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. AAA34774) is identical. A DNA construct is particularly preferred, the promoter being a Contains nucleic acid sequence of 20 base pairs, at least 60% of which is related to the HSP26 promoter from Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. M23871) or to the HSP30 promoter from Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. X59750) is identical. Particularly preferred is a DNA Construct in linear or circular form.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zu Herstellung eines Mikroorganismus, umfassend das Einschleusen eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts. Bevorzugt ist ein Verfahren, wobei das Einschleusen durch Transformation, Transfektion, Lipofektion, Konjugation oder Kreuzung durchgeführt wird.The object is also achieved by providing a method for producing a A microorganism comprising the introduction of a DNA construct according to the invention. A method is preferred in which the introduction by transformation, transfection, Lipofection, conjugation, or crossing is performed.

Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Figuren erläutert.The invention is further illustrated by the following figures.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Wachstumskurven vier verschiedener Saccharomyces cerevisiae Stämme während der Gärungen in Würze und YEPM. L6, L1, L3 und L9 bezeichnen die Hefestämme; OD bedeutet optische Dichte. Fig. 1 is a schematic representation of growth curves showing four different strains of Saccharomyces cerevisiae during fermentation in wort and YEPM. L6, L1, L3 and L9 indicate the yeast strains; OD means optical density.

Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Sulfitbildung während der Gärungen in Würze und YEPM. L6, L1, L3 und L9 bezeichnen die Hefestämme. Fig. 2 shows a schematic representation of sulfite formation during fermentation in wort and YEPM. L6, L1, L3 and L9 denote the yeast strains.

Fig. 3 zeigt eine Autoradiographie einer Northern-Analyse zum Nachweis der MET14-RNA in verschiedenen Hefestämmen während der Gärung. L6, L1, L3 und L9 bezeichnen die Hefestämme. Fig. 3 shows an autoradiograph of a Northern analysis to detect the MET14-RNA in various yeast strains during fermentation. L6, L1, L3 and L9 denote the yeast strains.

Fig. 4 zeigt eine Autoradiographie einer Northern-Analyse zum Nachweis der MET16-RNA in verschiedenen Hefestämmen während der Gärung. L6, L1, L3 und L9 bezeichnen die Hefestämme. Fig. 4 shows an autoradiograph of a Northern analysis to detect the MET16-RNA in various yeast strains during fermentation. L6, L1, L3 and L9 denote the yeast strains.

Fig. 5 zeigt eine Autoradiographie einer Northern-Analyse zum Nachweis der HSP26-RNA und Act1-RNA in Würze und YEPM. Fig. 5 shows an autoradiograph of a Northern analysis for the detection of HSP26-RNA and RNA-Act1 in wort and YEPM.

Fig. 6 zeigt eine Autoradiographie einer Northern-Analyse zum Nachweis der HSP30-RNA und Act1-RNA in Würze und YEPM. Fig. 6 shows an autoradiograph of a Northern analysis for the detection of HSP30-RNA and RNA-Act1 in wort and YEPM.

Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmids YEp3014/Kan mit dem MET14-Gen hinter dem HSP30-Promotor. Fig. 7 shows a schematic representation of plasmid YEp3014 / Kan with the MET14 gene behind the HSP30 promoter.

DefinitionenDefinitions

Am "Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene" sind solche Gene, die direkt oder indirekt einen Einfluß auf die jeweilige intrazelluläre oder extrazelluläre Sulfitkonzentration ausüben. Insbesondere sind dies Gene die am Sulfat-, Sulfit-, Sulfid-, oder Schwefelstoffwechsel oder deren Regulation beteiligt sind, oder solche Gene, die am zellulären Transport beteiligt sind, insbesondere solche, die die Aufnahme von Sulfat beeinflussen.Genes involved in the "sulfite metabolism" are genes that have a direct or indirect influence exert on the respective intracellular or extracellular sulfite concentration. In particular are These genes are involved in sulfate, sulfite, sulfide, or sulfur metabolism or their regulation are involved, or those genes that are involved in cellular transport, especially those that affect the absorption of sulfate.

Der "Promotor" ist die DNA-Region, die dem Transkriptionsstart stromaufwärts vorgelagert ist und an der Bindung der RNA-Polymerase beteiligt ist, um die Transkription zu starten. Wie hier verwendet bedeutet der Begriff Promotor die DNA-Region bis zu 1000 Basenpaare vor dem Transkriptionsstart, umfaßt damit nicht nur die den Transkriptionsstart regulierenden sondern auch die zwischen den einzelnen regulierenden Elementen des Promotors liegenden nicht regulierenden DNA-Regionen.The “promoter” is the region of DNA which is upstream of the start of transcription and is involved in binding the RNA polymerase to start transcription. Like here when used the term promoter means the DNA region up to 1000 base pairs in front of the Transcription start, thus not only includes those regulating the start of transcription but nor are those between the individual regulating elements of the promoter regulatory regions of DNA.

Bevorzugt sind späte Promotoren wie HSP 30 Promotoren mit vergleichbaren Eigenschaften sind dem Fachmann bekannt. Dabei können späte Promotoren wie folgt definiert werden. DNA- Konstrukt bedeutet eine DNA-Sequenz, die in ihrer funktionellen Wirkungsweise natürlicherweise nicht in dem Mikroorganismus vorkommt. Das DNA-Konstrukt kann linear oder zirkulär als Plasmid, artifizielles Chromosom oder in sonstiger nicht ins Genom des Wirtsorganismus intergrierter replizierender Form oder als ins Genom des Wirtsorganismus intergrierter Form vorliegen. Bevorzugt sind Konstrukte, die einen Späten Promotor, wie HSp30, mit einem die Sulfitbildung erhöhenden Gen, wie z. B. MET14, in Kombination enthalten.Late promoters such as HSP 30 promoters with comparable properties are preferred known to the person skilled in the art. Late promoters can be defined as follows. DNA Construct means a DNA sequence that works naturally in its functional mode does not occur in the microorganism. The DNA construct can be linear or circular Plasmid, artificial chromosome or otherwise not into the genome of the host organism integrated replicating form or as a form integrated into the genome of the host organism are present. Preferred are constructs that have a late promoter, such as HSp30, with a die Sulphite formation-increasing gene, such as. B. MET14, included in combination.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Erzeugung erhöhter Sulfitkonzentration, die in der stationären Wachstumsphase oder im letzten Drittel der exponentiellen Wachstumsphase oder bei etwa 60% bis etwa 90% der in einer Wachstumsphase erreichbaren Zellzahl auftritt, umfassend eine DNA-Konstrukt, umfassend ein oder mehrere am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene unter der Kontrolle eines Promotors. Eine erhöhte Sulfitkonzentration bedeutet, daß die Regulation des Sulfitstoffwechselweges beeinträchtigt wird, so daß die Kinetik der Sulfitbildungsrate oder der Sulfitabbaurate im Laufe der Gärung verändert wird. Die Sulfitkonzentration wird einerseits dadurch erhöht, daß mehr Sulfit gebildet wird, andererseits dadurch, daß weniger gebildetes Sulfit abgebaut wird. Ferner tritt die Sulfitbildung verzögert ein, d. h. nicht bereits zu einem frühen Zeitpunkt während der Gärung und Substratverwertung, sondern erst in der stationären Wachstumsphase oder im letzten Drittel der exponentiellen Wachstumsphase oder bei etwa 60% bis etwa 90% der in einer Wachstumsphase erreichbaren Zellzahl.The present invention relates to the provision of a microorganism capable of Generation of increased sulphite concentration in the steady growth phase or in the last Third of the exponential growth phase, or at about 60% to about 90% of that in one Growth phase achievable cell number occurs comprising a DNA construct comprising a or several genes involved in sulfite metabolism under the control of a promoter. One increased sulphite concentration means that the regulation of the sulphite metabolic pathway is affected, so that the kinetics of the sulfite formation rate or the sulfite degradation rate in the course the fermentation is changed. The sulfite concentration is increased on the one hand that more Sulphite is formed, on the other hand by the fact that less sulphite formed is broken down. Further sulfite formation occurs with a delay, i.e. H. not already at an early stage during the Fermentation and substrate utilization, but only in the stationary growth phase or in the last Third of the exponential growth phase, or at about 60% to about 90% of that in one Cell number achievable in the growth phase.

Ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Erzeugung verzögerter und erhöhter Sulfitkonzentration ist ein Mikroorganismus, der zu einem späten Zeitpunkt der Substratverwertung oder in der stationären Wachstumsphase oder im letzten Drittel der exponentiellen Wachstumsphase oder bei etwa 60% bis etwa 90% der in einer Wachstumsphase erreichbaren Zellzahl weniger als etwa 10% bis etwa 50% der - insbesondere im Verlauf einer Gärung - maximal ereichbaren Sulfitkonzentration bildet, wobei die Sulfitkonzentration nach Beendigung der stationären Wachstumsphase bzw. nach Beendigung einer Gärung oder nach Beendigung einer Nachgärung oder zum Zeitpunkt der Abfüllung eines Getränkes bei etwa 2 bis etwa 400 mg/l liegt. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus hat unter Braubedingungen in Würze demnach erst weniger als etwa 50% der im weiteren Gärverlauf maximal erreichten Sulfitmenge gebildet. Zur Bestimmung der Sulfitkonzentration werden die im Brauereibereich üblichen und dem Fachmann geläufigen Methoden verwendet, wie z. B. die SO₂-Bestimmung nach Grant (1947), Anal. Chem 19, 345-346 oder die enzymatische Bestimmung mit dem Testkit der Firma Boehringer Mannheim.A microorganism according to the invention with the ability to generate delayed and increased sulfite concentration is a microorganism that occurs at a late point in time of substrate utilization or in the stationary growth phase or in the last third of the exponential growth phase or at about 60% to about 90% of the cell number that can be achieved in a growth phase less than about 10% to about 50% of the maximum achievable sulfite concentration - especially during fermentation - the sulfite concentration after the end of the stationary growth phase or after the end of a fermentation or after the end of a secondary fermentation or at the time of bottling a beverage at about 2 to about 400 mg / l. The microorganism according to the invention has therefore only formed less than about 50% of the maximum amount of sulfite reached in the further course of fermentation in wort under brewing conditions. To determine the sulfite concentration, the methods customary in the brewery sector and familiar to the person skilled in the art are used, such as, for. B. the SO ₂ determination according to Grant (1947), Anal. Chem 19, 345-346 or the enzymatic determination with the test kit from Boehringer Mannheim.

Die bei der Gärung entstehende SO₂-Menge ist von einer Vielzahl von Faktoren abhängig und ist auch z. B. in verschiedenen Bieren sehr unterschiedlich [Narziss et al. (1995), Brauwelt 49, 2576-2606]. Alkohohlfreie (0-4 mg/l) und obergärige Biere (< 5 mg/l) weisen den geringsten SO₂- Gehalt auf, hingegen liegen untergärige Biere bei ca. 3-7 mg/l (vereinzelt bis 10 mg/l) und Starkbiere häufig bei über 10 mg/l. _{The amount of SO 2} produced during fermentation depends on a number of factors and is also e.g. B. in different beers very differently [Narziss et al. (1995), Brauwelt 49, 2576-2606]. Alcohol-free (0-4 mg / l) and top-fermented beers (<5 mg / l) have the lowest SO ₂ content, while bottom-fermented beers are around 3-7 mg / l (occasionally up to 10 mg / l) and Strong beers often above 10 mg / l.

Die für Bier zugelassenen SO₂-Grenzwerte sind unterschiedlich, in Deutschland liegen sie bei 10 mg/l. [Narziss et al. (1995), Brauwelt 49, 2576-2606]. Die für die Bierstabilisierung sinnvollen SO₂-Konzentrationen liegen bei 10-25 mg/l. Hingegen liegen die in der EG zugelassenen Grenzwerte für Weine bei 120 bis 400 mg schweflige Säure pro Liter, je nach Weinsorte [Krämer, J. (1992), Lebensmittelmikrobiologie, 2. Auflage, Ulmer Taschenbuchverlag, Eugen Ulmer GmbH , Stuttgart]. Demzufolge werden je nach Anwendungsgebiet unterschiedliche SO₂- Konzentrationen angestrebt. _{The SO 2} limit values permitted for beer are different, in Germany they are 10 mg / l. [Narziss et al. (1995), Brauwelt 49, 2576-2606]. _{The SO 2} concentrations that make sense for beer stabilization are 10-25 mg / l. In contrast, the limit values for wines permitted in the EC are 120 to 400 mg sulfurous acid per liter, depending on the type of wine [Krämer, J. (1992), Lebensmittelmikrobiologie, 2nd edition, Ulmer Taschenbuchverlag, Eugen Ulmer GmbH, Stuttgart]. _{As a result, different SO 2} concentrations are aimed for depending on the area of application.

Je nach Produkt kommen demnach erfindungsgemäße Mikroorganismen zum Einsatz, die sich im Bezug auf die im Verlaufe des Produktionsprozesses maximal erreichbare Sulfitkonzentration oder im Bezug auf die Sulfitkonzentration des fertigen Produktes unterscheiden. Im Unterschied zu den bisher bekannten gentechnisch veränderten Brauhefen zeichnen sich die erfindungsgemäßen Mikroorganismen dadurch aus, daß die Sulfitbildung verzögert erfolgt und daß somit eine nachteilige Beeinflussung des Geschmacks nicht, oder nur in verringertem Maße auftritt.Depending on the product, microorganisms according to the invention are used which are located in the Relation to the maximum sulphite concentration that can be achieved in the course of the production process or in terms of the sulphite concentration of the finished product. In the difference to the previously known genetically modified brewing yeasts stand out Microorganisms according to the invention characterized in that the sulfite formation is delayed and that there is no adverse effect on the taste, or only to a lesser extent occurs.

Ferner umfassen die erfindungsgemäßen Mikroorganismen ein DNA-Konstrukt, daß ein oder mehrere am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene unter der Kontrolle eines Promotors enthalten. DNA-Konstrukt bedeutet eine DNA-Sequenz, die in ihrer funktionellen Wirkungsweise natürlicherweise nicht in dem Mikroorganismus vorkommt. Dem Fachmann ist ersichtlich, daß die DNA-Sequenz 1) vollständig synthetisch erzeugt werden kann, 2) aus DNA-Sequenzabschnitten erzeugt werden kann, die zu einem Teil synthetisch hergestellt und zum anderen Teil aus natürlicherweise in dem Mikroorganismus vorkommenden DNA-Sequenzabschnitten bestehen kann und 3) vollständig aus natürlicherweise in dem Mikroorganismus vorkommenden DNA- Sequenzabschnitten bestehen kann, wobei jedoch die DNA-Sequenzabschnitte natürlicherweise in dem Mikroorganismus nicht funktionell miteinander in Verbindung stehen.Furthermore, the microorganisms according to the invention comprise a DNA construct that one or contain several genes involved in sulfite metabolism under the control of a promoter. DNA construct means a DNA sequence that works in its functional mode does not occur naturally in the microorganism. It is apparent to those skilled in the art that the DNA sequence 1) can be generated completely synthetically, 2) from DNA sequence segments can be produced, which is partly made synthetically and partly made from DNA sequence segments naturally occurring in the microorganism exist can and 3) completely from DNA naturally occurring in the microorganism Sequence sections can exist, but the DNA sequence sections naturally in not functionally related to the microorganism.

Bevorzugt ist ein Mikroorganismus, der eine Hefe oder ein Bakterium ist. Besonders bevorzugt ist eine in der Lebensmittelherstellung verwendete Hefe [siehe z. B. Dittrich (1993), Mikrobiologie der Lebensmittel, Behr's Verlag, Hamburg], wobei es sich bei dem Hefestamm z. B. um die Gattung Saccharomyces, vorzugsweise die Art Saccharomyces cerevisisae, z. B. ober- oder untergärige Brauhefen, Weinhefen, Sekthefen, Sakehefen, Sherryhefen, Brennereihefen oder Bäckereihefen oder Hefen der Gattungen Breuanomyces oder Kluyveromyces oder anderer in der Lebensmittelherstellung eingesetzter Hefen handelt.Preferred is a microorganism that is a yeast or a bacterium. Particularly preferred is a yeast used in food production [see e.g. B. Dittrich (1993), Microbiology der Lebensmittel, Behr's Verlag, Hamburg], whereby the yeast strain z. B. to the Genus Saccharomyces, preferably the species Saccharomyces cerevisisae, e.g. B. above or bottom-fermented brewing yeast, wine yeast, champagne yeast, sake yeast, sherry yeast, distillery yeast or Bakery yeasts or yeasts of the genera Breuanomyces or Kluyveromyces or others in the Yeast used in food production.

Bevorzugt sind am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene ausgewählt aus der Gruppe der Hefegene SUL1 (entsprechend den Basen 789194-791773 des Chromosoms II der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer Y13134), SUL2 (entsprechend den Basen 323545-326226 des Chromosoms XII der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer Y13138), YGR125W (entsprechend den Basen 742319-745429 des Chromosoms VII der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer Y13135), YOR251C (entsprechend den Basen 803462-802548 des Chromosoms XV der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession- Nummer Y13140), YPR003C (entsprechend den Basen 563763-561499 des Chromosoms XVI der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer U00094), FZF1 (entsprechend den Basen 22304-23203 des Chromosoms VII der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession- Nummer Y13135), YNR013C (entsprechend den Basen 651709-649025 des Chromosoms XIV der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer Y13139), MET3 (entsprechend den Basen 455926-457461 des Chromosoms X der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession- Nummer Y13136), MET14 (entsprechend den Basen 439023-438415 des Chromosoms XI der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer Y13137), MET16 (entsprechend den Basen 877627-876842 des Chromosoms XVI der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer U00094), MET25, identisch mit MET15 oder MET17 (entsprechend den Basen 732542-733876 des Chromosoms XII der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession- Nummer Y13138), MET22 (entsprechend den Basen 207175-206102 des Chromosoms XV der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer Y13140), MET1, identisch mit MET20 (entsprechend den Basen 571248-573029 des Chromosoms XI der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer Y13137), MET8 (entsprechend den Basen 650327-651151 des Chromosoms II der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer Y13134), MET5, identisch mit ECM17 (entsprechend den Basen 682974-678646 des Chromosoms X der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer 13136), MET10 (entsprechend den Basen 213299-216406 des Chromosoms VI der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession- Nummer D50617), MET18 (entsprechend den Basen 113806-116904 des Chromosoms IX der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer Y13139), MET2 (entsprechend den Basen 117347-118807 des Chromosoms IX der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession- Nummer Z47047), MET6 (entsprechend den Basen 342163-339860 des Chromosoms V der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer U00092), SAM1 (entsprechend den Basen 515264-516412 des Chromosoms XII der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession- Nummer Y13138), SAM2 (entsprechend den Basen 1454467-1453313 des Chromosoms IV der Hefe oder der DNA gemäß Genbank Accession-Nummer Z71256) oder einem Gen, welches ein Polypeptid mit APS-Kinase- oder PAPS-Reduktase-Aktivität kodiert. Besonders bevorzugt ist ein Mikroorganismus, umfassend ein DNA-Konstrukt, daß das am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gen in einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien, oder zwei verschiedene am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene in jeweils einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien, oder eine Vielzahl von am Sulfitstoffwechsel beteiligten Genen in jeweils einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien umfaßt.Preferably, genes involved in sulfite metabolism are selected from the group of yeast genes SUL1 (corresponding to bases 789194-791773 of chromosome II of yeast or DNA according to Genbank accession number Y13134), SUL2 (corresponding to bases 323545-326226 of the chromosome XII of the yeast or the DNA according to Genbank accession number Y13138), YGR125W (corresponding to bases 742319-745429 of chromosome VII of yeast or the DNA according to Genbank accession number Y13135), YOR251C (according to the bases 803462-802548 of chromosome XV of yeast or DNA according to Genbank Accession- Number Y13140), YPR003C (corresponding to bases 563763-561499 of chromosome XVI of the yeast or the DNA according to Genbank accession number U00094), FZF1 (according to the Bases 22304-23203 of chromosome VII of yeast or DNA according to Genbank Accession- Number Y13135), YNR013C (corresponding to bases 651709-649025 of chromosome XIV of the yeast or the DNA according to Genbank accession number Y13139), MET3 (according to the Bases 455926-457461 of chromosome X of yeast or DNA according to Genbank Accession- Number Y13136), MET14 (corresponding to bases 439023-438415 of chromosome XI of Yeast or the DNA according to Genbank accession number Y13137), MET16 (according to the Bases 877627-876842 of chromosome XVI of the yeast or the DNA according to Genbank Accession number U00094), MET25, identical to MET15 or MET17 (according to the Bases 732542-733876 of chromosome XII of yeast or DNA according to Genbank Accession- Number Y13138), MET22 (corresponding to bases 207175-206102 of chromosome XV of Yeast or the DNA according to Genbank accession number Y13140), MET1, identical to MET20 (corresponding to bases 571248-573029 of chromosome XI of yeast or DNA according to Genbank accession number Y13137), MET8 (corresponding to bases 650327-651151 des Chromosome II of the yeast or DNA according to Genbank Accession number Y13134), MET5, identical to ECM17 (corresponding to bases 682974-678646 of chromosome X of yeast or the DNA according to Genbank accession number 13136), MET10 (according to the bases 213299-216406 of chromosome VI of yeast or DNA according to Genbank Accession- Number D50617), MET18 (corresponding to bases 113806-116904 of chromosome IX of Yeast or the DNA according to Genbank accession number Y13139), MET2 (according to the Bases 117347-118807 of chromosome IX of yeast or DNA according to Genbank Accession- Number Z47047), MET6 (corresponding to bases 342163-339860 of chromosome V of yeast or the DNA according to Genbank accession number U00092), SAM1 (according to the bases 515264-516412 of chromosome XII of yeast or DNA according to Genbank Accession- Number Y13138), SAM2 (corresponding to bases 1454467-1453313 of chromosome IV of Yeast or the DNA according to Genbank Accession number Z71256) or a gene which is a Encodes polypeptide with APS kinase or PAPS reductase activity. One is particularly preferred A microorganism comprising a DNA construct that the gene involved in sulfite metabolism in one copy or a multitude of copies, or two different ones in the sulphite metabolism involved genes in one copy or in a large number of copies, or in a large number of am The genes involved in sulfite metabolism in each case one copy or a large number of copies includes.

Eine weitere Ausführungsform betrifft einen Mikroorganismus, umfassend ein DNA-Konstrukt, umfassend einen Promotor ausgewählt aus der Gruppe der Promotoren der folgenden Hefegene der HSP-Gene, der SSA-Gene, HSP26, HSP30, YGP1, HXK1, MOL1 (THI4), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4 oder YAT1. Eine im Gegensatz zum Stand der Technik verzögert einsetzende Sulfitbildung während der stationären Wachstumsphase oder im letzten Drittel der exponentiellen Wachstumsphase oder bei etwa 60% bis etwa 90% der in einer Wachstumsphase erreichbaren Zellzahl wird z. B. durch die Verwendung von Promotoren erreicht, die erst nach Erreichen der stationären Phase aktiviert werden. Solche Promotoren sind meist Streß-induziert bzw. Glukose­ reprimiert. Die Regulation verschiedener Promotoren z. B. in Weinhefen untersuchten Riou, C. et al. (1997); YEAST 13, 903-915. Demnach können z. B. die Promotoren der stressinduzierten Hitzeschockgene (SSA- und HSP-Gene) verwendet werden, da diese im Verlaufe der Gärung erst zu einem späten Zeitpunkt ihr Expressionsmaximum erreichen. Ebenso geeignet ist der Einsatz von Promotoren, die durch Gärungsprodukte induziert werden. Ein Beispiel hierfür ist der Promotor des Carnitin-Acyltransferase-Gens (YATI), der durch Glukose reprimiert und durch C2- Verbindungen, wie Ethanol oder Acetat induziert wird [Schmalix, W. & Bandlow, W. (1993), J. Biol. Chem. 268 (36), 27428-27439]. Ein Vergleich der Transkriptmengen verschiedener streß- bzw. hitzeinduzierter Gene zeigt, daß in Saccharomyces cerevisiae die Promotoren der HSP26 und HSP30-Gene besonders geeignet für eine verzögerte Sulfitbildung sind, da diese Gene gleichzeitig verzögert und sehr stark exprimiert werden. Die Analyse der Transkriptmengen verschiedener, an der Sulfitbildung beteiligter Gene in Hefen mit unterschiedlichem Sulfitbildungsvermögen im Verlauf der Gärung zeigte, daß eine starke Expression der Gene MET14 bzw. MET16 mit einer erhöhten Sulfitbildung korreliert. Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung ist überraschenderweise ein Mikroorganismus mit dem eine verzögerte Sulfitbildung dadurch erreicht wird, daß eine funktionelle Verbindung von DNA- Sequenzen, umfassend einen Promotor der Gene HSP26 oder HSP30 und ein kodierender Bereich der Gene MET14 oder MET16 in einen Produktionsstamm, insbesondere eine Brauhefe eingebracht wird. Z. B. zeigt Bier, welches mit einer derart veränderten Brauhefe hergestellt wird, nicht nur eine verzögerte Ausbildung des Alterungsgeschmacks sondern ist auch geschmacklich ohne nachteilige Veränderung. Neben dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gibt es eine Vielzahl von Variationsmöglichkeiten, durch die der Zeitpunkt der Sulfitbildung verändert werden kann, insbesondere durch Kombination der kodierenden Bereiche der Gene MET14/MET16 mit einem Promotor, der eine veränderte, insbesondere verzögerte Expression dieser Gene bewirkt.Another embodiment relates to a microorganism comprising a DNA construct, comprising a promoter selected from the group of the promoters of the following yeast genes the HSP genes, the SSA genes, HSP26, HSP30, YGP1, HXK1, MOL1 (THI4), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4 or YAT1. In contrast to the state of the art, it starts with a delay Sulphite formation during the stationary growth phase or in the last third of the exponential Growth phase or at about 60% to about 90% of that which can be achieved in a growth phase Cell count is z. B. achieved through the use of promoters that only after reaching the stationary phase are activated. Such promoters are mostly stress-induced or glucose repressed. The regulation of various promoters e.g. B. in wine yeast investigated Riou, C. et al. (1997); YEAST 13, 903-915. Accordingly, z. B. the promoters of the stress-induced Heat shock genes (SSA and HSP genes) are used, as these only occur in the course of fermentation reach their maximum expression at a late point in time. The use is just as suitable from promoters induced by fermentation products. An example of this is the Promoter of the carnitine acyltransferase gene (YATI), which is repressed by glucose and by C2- Compounds such as ethanol or acetate is induced [Schmalix, W. & Bandlow, W. (1993), J. Biol. Chem. 268 (36), 27428-27439]. A comparison of the transcript amounts of different stressful or heat-induced genes shows that in Saccharomyces cerevisiae the promoters of HSP26 and HSP30 genes are particularly suitable for delayed sulfite formation because these genes at the same time delayed and very strongly expressed. Analysis of the amount of transcripts different genes involved in sulfite formation in yeast with different Sulphite formation in the course of fermentation showed that a strong expression of the genes MET14 and MET16 correlated with increased sulphite formation. A particularly advantageous one Surprisingly, one embodiment of the invention is a microorganism with one delayed sulfite formation is achieved by the fact that a functional connection of DNA Sequences comprising a promoter of the genes HSP26 or HSP30 and a coding region of the MET14 or MET16 genes in a production strain, in particular a brewer's yeast is introduced. E.g. beer which is produced with brewing yeast modified in this way shows not only a delayed development of the aging taste but is also tasty without detrimental change. In addition to this preferred embodiment of the invention, there are a multitude of possible variations that change the timing of sulphite formation can be, in particular by combining the coding regions of the genes MET14 / MET16 with a promoter that changes, in particular delayed, expression this causes genes.

Eine weitere Ausführungsform betrifft einen Mikroorganismus, wobei der Promotor und/oder das (die) unter der Kontrolle des Promotors stehende(n) am Sulfitstoffwechsel beteiligte(n) Gen(e) durch Modifikationen, umfassend Substitution, Insertion, Deletion, Inversion oder Addition modifiziert ist (sind). Besonders bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei der Promotor mit einem anderen Promotor oder dessen Fragment substituiert, inseriert oder addiert wird.Another embodiment relates to a microorganism, wherein the promoter and / or the gene (s) under the control of the promoter involved in sulfite metabolism by modifications including substitution, insertion, deletion, inversion or addition is (are) modified. A microorganism is particularly preferred, the promoter with another promoter or its fragment is substituted, inserted or added.

Erfindungsgemäß kann der Promotor bis zu 1000 Basenpaare vor dem Transkriptionsstart umfassen, da sich bekannterweise einige, für die Transkriptionsregulation von Genen bedeutsame DNA-Sequenzen in großer Entfernung vom Transkriptionsstart befinden. Für die Transkriptionsregulation bedeutsame DNA-Sequenzen sind solche, die die Transkriptionsrate eines Gens quantitativ oder in Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Zellen modulieren. Es ist bekannt, daß viele regulativ bedeutsame DNA-Sequenzen ihre Funktion auch dann ausüben können, wenn ihre Lokalisation im Bezug auf den Transkriptionsstart verändert wird. Andererseits ist bekannt, daß ein Großteil der DNA-Sequenzen, die dem Transkriptionsstart vorgelagert sind, keinen entscheidenden Einfluß auf die Transkriptionsregulation eines Gens ausüben. Ein Promotor und auch das am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gen können durch Deletion, Addition, Substitution, Inversion oder Insertion modifiziert werden, so daß eine signifikante Veränderung der Transkriptionsregulation oder Aktivität des Gens auftritt. Dem Fachmann ist bekannt wo und wie er in den DNA-Regionen eine Modifikation einführen muß, um die Transkriptionsregulation oder Aktivität des Gens zu verändern. Die Modifikation beträgt mindestens 1 Nukleotid innerhalb der Promotor- oder der kodierenden Region eines am Sulfitstoffwechsel beteiligten Gens.According to the invention, the promoter can be up to 1000 base pairs before the start of transcription include, since some are known to be important for the regulation of transcription of genes DNA sequences are located at a great distance from the start of transcription. For the DNA sequences that are important for transcription regulation are those that increase the rate of transcription of a gene quantitatively or depending on the physiological state of the cells. It is known that many DNA sequences that are important for regulation then also exercise their function if their localization is changed in relation to the start of transcription. On the other hand, it is known that a large part of the DNA sequences involved in the start of transcription are upstream, no decisive influence on the transcription regulation of a gene exercise. A promoter and the gene involved in sulfite metabolism can be deleted by deletion, Addition, substitution, inversion or insertion can be modified so that a significant Change in transcriptional regulation or activity of the gene occurs. The skilled person is known where and how he has to introduce a modification in the DNA regions in order to achieve the To alter transcriptional regulation or activity of the gene. The modification is at least 1 nucleotide within the promoter or coding region of an am The gene involved in sulfite metabolism.

Ebenso kann die Regulation eines Gens verändert werden, wenn für die Transkriptionsregulation bedeutsame DNA-Sequenzen in die Nachbarschaft eines Gens gebracht werden, vorzugsweise in den, dem Transkriptionsstart vorgelagerten DNA-Bereich. Dabei kann der natürliche Promotor des am Sulfitstoffwechsel beteiligten Gens vollkommen oder teilweise durch einen anderen Promotor oder dessen Fragment oder einzelnen Fragmenten ersetzt werden. Es ergeben sich somit eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten von DNA-Sequenzen mit denen die Transkriptionsregulation von Genen, die die Sulfitbildung beeinflussen, erfindungsgemäß eingestellt werden kann.Likewise, the regulation of a gene can be changed if for transcription regulation significant DNA sequences are brought into the vicinity of a gene, preferably in the DNA area upstream of the start of transcription. The natural promoter of the gene involved in sulphite metabolism completely or partially by another Promoter or its fragment or individual fragments are replaced. It surrender thus a multitude of possible combinations of DNA sequences with which the Transcription regulation of genes which influence sulfite formation, according to the invention can be adjusted.

Ferner bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei das Gen, welches ein Polypeptid mit APS- Kinase-Aktivität kodiert, eine Nukleinsäuresequenz von 60 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum MET14-Gen von Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. AAB 19854) identisch ist, oder wobei das Gen, welches ein Polypeptid mit PAPS-Reduktase-Aktivität kodiert, eine Nukleinsäuresequenz von 60 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum MET16-Gen von Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. AAA34774) identisch ist. Besonders bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei der Promotor eine Nukleinsäuresequenz von 20 Basenpaaren umfaßt, die zu mindestens 60% zum HSP26-Promotor von Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. M23871) oder zum HSP30-Promotor von Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. X59750) identisch ist. Zwei Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen sind identisch, wenn sie in einem spezifizierten Abschnitt zu 100% in ihrer Sequenz übereinstimmen. Erfindungsgemäß sind zwei Sequenzen zu beispielsweise 90% identisch, wenn sie in einem spezifizierten Abschnitt zu 90% in ihrer Sequenz übereinstimmen. Wenn sich bei dem Vergleich zweier Sequenzen dann eine höhere Identität ergibt, wenn in eine der beiden Sequenzen Gaps (Lücken) von ein oder mehreren Nukleotiden bzw. Aminosäuren Länge eingefügt werden, so verringert sich je nach Länge des Gaps der Grad der Identität. Bei Einfügen eines Gaps von der Länge 1, 2, 3 usw. Nukleotiden bzw. Aminosäuren sind die beiden Sequenzen an 1, 2, 3 usw. Positionen (im Bereich des Gaps) nicht identisch. Insbesondere bevorzugt ist ein Mikroorganismus, wobei das DNA-Konstrukt in episomaler Form oder in ins Genom integrierter Form vorliegt.Also preferred is a microorganism, the gene which is a polypeptide with APS- Encodes kinase activity, contains a nucleic acid sequence of 60 base pairs leading to at least 60% to the MET14 gene of Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. AAB 19854) is identical, or where the gene which encodes a polypeptide with PAPS reductase activity, contains a nucleic acid sequence of 60 base pairs which is at least 60% related to the MET16 gene from Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. AAA34774) is identical. One is particularly preferred Microorganism, wherein the promoter comprises a nucleic acid sequence of 20 base pairs, which is at least 60% to the HSP26 promoter of Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. M23871) or to the HSP30 promoter from Saccharomyces cerevisiae (Acc.-No. X59750) is identical. Two nucleic acid or amino acid sequences are identical if they are in one specified section match 100% in their sequence. There are two according to the invention For example, sequences are 90% identical if they are 90% in match their sequence. If, when comparing two sequences, a higher Identity results when gaps of one or more in one of the two sequences Nucleotides or amino acids are inserted in length, so decreases depending on the length of the Gaps the degree of identity. When inserting a gap of length 1, 2, 3 etc. nucleotides or The two sequences at 1, 2, 3 etc. positions (in the region of the gap) are not amino acids identical. A microorganism is particularly preferred, the DNA construct in episomal form or in a form integrated into the genome.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Bereitstellung eines DNA-Konstrukt, umfassend ein oder mehrere am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene unter der Kontrolle eines Promotors, wobei das DNA-Konstrukt verwendet wird, um den erfindungsgemäßen Mikroorganismus herzustellen. Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt wird z. B. durch Transformation, Transfektin, Lipofektion, Konjugation oder Kreuzung in einen Mikroorganismus eingeschleust. Dem Fachmann sind die Verfahren geläufig, die zur Einschleusung des erfindungsgemäßen DNA- Konstrukts verwendet werden. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus kann zur Herstellung von Lebensmitteln, z. B. Bier, Wein, Sekt, Sherry, Sake oder von anderen biotechnologisch erwünschten Stoffwechselendprodukten verwendet werden. Dabei kann ein Gemisch aus Hefen und Bakterien verwendet werden. Die Lebensmitteln oder andere biotechnologisch erwünschte Stoffwechselendprodukte können hergestellt werden, indem der erfindungsgemäße Mikroorganismus auf eine Vorstufe der herzustellenden Erzeugnisse einwirkt.The present invention further relates to the provision of a DNA construct comprising a or several genes involved in sulfite metabolism under the control of a promoter, where the DNA construct is used to produce the microorganism of the invention. The DNA construct of the invention is z. B. by transformation, transfectin, Lipofection, conjugation or crossing introduced into a microorganism. To the A person skilled in the art is familiar with the methods that are used for introducing the DNA according to the invention Construct can be used. The microorganism according to the invention can be used for production of food, e.g. B. beer, wine, sparkling wine, sherry, sake or other biotechnological desired metabolic end products are used. A mixture of yeasts can be used and bacteria can be used. The food or other biotechnologically desirable Metabolic end products can be produced by the inventive Microorganism acts on a preliminary stage of the products to be manufactured.

Beispiel 1example 1 Sulfitbildung in verschiedenen Hefestämmen unter BraubedingungenSulphite formation in various yeast strains under brewing conditions

Zur Überprüfung der Expressionsstärke verschiedener Gene aus dem Methioninstoffwechsel wurden die Stämme L1, L3, L6 und L9 herangezogen (siehe Tabelle 1). Die Stämme wurden nach ihrem unterschiedlichen Sulfitbildungsvermögen ausgesucht.To check the level of expression of various genes from the methionine metabolism the strains L1, L3, L6 and L9 were used (see Table 1). The tribes were after selected for their different sulphite-forming abilities.

Tabelle 1 Table 1

Saccharomyces Stämme Saccharomyces strains

IfGB (Institut für Gärungsgewerbe, Berlin), YGSC (Yeast Genetic Stock Center) IfGB (Institute for Fermentation Industry, Berlin), YGSC (Yeast Genetic Stock Center)

Mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Stämmen wurden Gärversuche in Erlenmeyerkolben mit Gäraufsätzen durchgeführt. Pro Probenahme wurde ein Kolben verwendet. Die Gärung erfolgte in je 100 ml YEPM bzw. Würze. Es wurde eine Ausgangszellzahl von 1 × 10⁷ Zellen/ml eingestellt. Zu den Probenahmezeiten wurde die OD bei 600 nm gemessen, die Zellen abzentrifugiert und bei -70°C eingefroren. Die Probenüberstände wurden für weitere Analysen bei -20°C aufbewahrt. Die Sulfitkonzentrationen wurden mit dem Sulfit-Test-Kit von Boehringer Mannheim bestimmt. Die Wachstumskurven (Fig. 1) lassen erkennen, daß der Übergang in die stationäre Phase nach ca. 20 h erfolgte. Die Sulfitmengen, die die Stämme während der Gärung bildeten, unterschieden sich deutlich (Fig. 2). Der Stamm L6 hat deutlich mehr Sulfit als die Stämme L3 und L9 gebildet. Der Stamm L1 zeigte eine intermediäre Sulfitbildung.With the strains listed in Table 1, fermentation tests were carried out in Erlenmeyer flasks with fermentation attachments. One flask was used per sampling. The fermentation took place in 100 ml of YEPM or wort. A starting cell number of 1 × 10 ⁷ cells / ml was set. At the sampling times, the OD was measured at 600 nm, the cells were centrifuged off and frozen at -70 ° C. The sample supernatants were stored at -20 ° C for further analysis. The sulfite concentrations were determined with the sulfite test kit from Boehringer Mannheim. The growth curves ( FIG. 1) show that the transition to the stationary phase took place after about 20 hours. The amounts of sulfite that the strains formed during fermentation differed markedly ( Fig. 2). The strain L6 formed significantly more sulfite than the strains L3 and L9. The strain L1 showed an intermediate sulphite formation.

Beispiel 2Example 2 Expression von MET3, MET14 und MET16 in verschiedenen Hefestämmen unter GärbedingungenExpression of MET3, MET14 and MET16 in different yeast strains under fermentation conditions

Zur Isolierung der RNA wurden die bei -70°C eingefrorenen Hefezellen mit 700 µl Puffer 26 (0,5 M NaCl, 0,2 M Tris, 10 mM EDTA, pH 7,5) und 20 µl β-Mercaptoethanol versetzt. Nach Zugabe von 700 µl Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) wurde die Suspension in flüssigen Stickstoff eingefroren. Danach erfolgte Zermörsern im Dismembrator (Firma B. Braun; 2 min. Amplitude: 1,2-1,5 cm). Das Zellpulver wurde aufgetaut und in ein Reaktionsgefäß überführt. Nach 10 min kräftigem Mischen wurde 1 h bei 14.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und erneut mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die wäßrige Phase wurde mit 1/10 Vol. 1 M Essigsäure versetzt (mit DEPC behandeltem H₂O angesetzt). Fällung der RNA erfolgte durch Zugabe von 0,7 Volumen EtOH (96%) für 20 min bei -70°C. Nach Zentrifugation (2 min. 14.000 × g) wurde der Überstand abgenommen und das Pellet mit 70% EtOH (mit DEPC-H₂O angesetzt) gewaschen, 5 min bei Raumtemperatur getrocknet und in 100-200 µl DEPC-H₂O gelöst. Die RNA wurde photometrisch quantifiziert (OD₂₆₀) und pro Spur ca. 30 µg durch Elektrophorese in Formaldehyd-Gelen aufgetrennt [nach Sambrock et al. (1989), Molecular Cloning - a laboratory manual. 2^nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York].To isolate the RNA, the yeast cells frozen at -70 ° C. were mixed with 700 μl of buffer 26 (0.5 M NaCl, 0.2 M Tris, 10 mM EDTA, pH 7.5) and 20 μl of β-mercaptoethanol. After adding 700 μl of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1), the suspension was frozen in liquid nitrogen. This was followed by grinding in a dismembrator (B. Braun; 2 min. Amplitude: 1.2-1.5 cm). The cell powder was thawed and transferred to a reaction vessel. After 10 minutes of vigorous mixing, it was centrifuged at 14,000 × g for 1 hour. The supernatant was transferred to a new reaction vessel and extracted again with phenol / chloroform. 1/10 volume of 1 M acetic acid was added to the aqueous phase (H ₂ O treated with DEPC was prepared). The RNA was precipitated by adding 0.7 volumes of EtOH (96%) for 20 min at -70 ° C. After centrifugation (2 min. 14,000 × g) the supernatant was removed and the pellet _{was washed with 70% EtOH (prepared with DEPC-H 2} O), dried for 5 min at room temperature and dissolved in 100-200 μl DEPC-H ₂ O. The RNA was quantified photometrically (OD ₂₆₀ ) and about 30 μg per lane was separated by electrophoresis in formaldehyde gels [according to Sambrock et al. (1989) Molecular Cloning - a laboratory manual. 2 ^nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York].

Nach Beendigung des Laufes wurde die im Gel enthaltene RNA auf eine ungeladene Nylonmembran (Amersham) nach Vorschrift des Herstellers transferiert. Als Sonden wurden 400 -600 bp lange, gereinigte PCR-Fragmente verwendet, die mit dem Megaprime DNA labelling system (Amersham) und [α-³²P] dATP radioaktiv markiert waren. Zur Herstellung der Sonden wurden folgende Primer verwendet:
MET3:
5'-CAGAACATCCAGCCATTAGC-3' (SEQ ID NR: 1)
5'-ACACCCTTGGAGTTCTTACC-3' (SEQ ID NR: 2)
MET14:
5'-TCTAGAATCATTCCACTACG-3' (SEQ ID NR: 3)
5'-GAAGATCTAGAATCATTCCACTACG-3' (SEQ ID NR: 4)
MET16:
5'-ACGCCACAGGAGATTATTGC-3' (SEQ ID NR: 5)
5'-TTTAACCTGCTCGAACGTCC-3' (SEQ ID NR: 6)After the end of the run, the RNA contained in the gel was transferred to an uncharged nylon membrane (Amersham) according to the manufacturer's instructions. The probes used were 400-600 bp long, purified PCR fragments which ^{were radioactively labeled with the Megaprime DNA labeling system (Amersham) and [α- 32} P] dATP. The following primers were used to produce the probes:
MET3:
5'-CAGAACATCCAGCCATTAGC-3 '(SEQ ID NO: 1)
5'-ACACCCTTGGAGTTCTTACC-3 '(SEQ ID NO: 2)
MET14:
5'-TCTAGAATCATTCCACTACG-3 '(SEQ ID NO: 3)
5'-GAAGATCTAGAATCATTCCACTACG-3 '(SEQ ID NO: 4)
MET16:
5'-ACGCCACAGGAGATTATTGC-3 '(SEQ ID NO: 5)
5'-TTTAACCTGCTCGAACGTCC-3 '(SEQ ID NO: 6)

Es wurden Northern-Blot-Analysen mit Sonden für die Gene MET3, MET14 und MET16 durchgeführt. Anhand der Kontrollhybridisierungen mit einer ACT1-Sonde (Acc.-Nr. L00026 von GenBank) waren geringe Schwankungen in der aufgetragenen RNA-Menge erkennbar, die bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt wurden. Die beobachteten Unterschiede lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Northern blot analyzes were carried out with probes for the MET3, MET14 and MET16 genes. The control hybridizations with an ACT1 probe (Acc. No. L00026 from GenBank) showed slight fluctuations in the amount of RNA applied, which were taken into account when interpreting the results. The observed differences can be summarized as follows:

• 1. Das MET3-Transkript konnte in allen 4 Stämmen nur schwach nachgewiesen werden, zwischen den Stämmen traten keine signifikanten Unterschiede auf.1. The MET3 transcript could only be detected weakly in all 4 strains, there were no significant differences between the strains.
• 2. Bei MET14 gab es dagegen deutliche Unterschiede bei den gebildeten Transkriptmengen (Fig. 3). Im Stamm L6 war über die gesamte Versuchszeit eine große Menge an Transkripten vorhanden. Der Stamm L1 zeigte dagegen nur zum Zeitpunkt t = 10 h eine sehr hohe MET14- RNA-Menge, während im weiteren Gärverlauf die Transkriptmenge im Vergleich zu den Stämmen L3 und L9 nicht erhöht war. Bei den Stämmen mit niedriger Sulfitbildungsrate (L3 und L9) war während des gesamten Gärungsverlaufes sehr viel weniger MET14-RNA zu beobachten als im Stamm L6, bzw. als im Stamm L1 zum Zeitpunkt T = 10 h.2. In contrast, with MET14 there were clear differences in the amounts of transcripts formed ( FIG. 3). A large amount of transcripts was present in strain L6 over the entire duration of the experiment. In contrast, strain L1 showed a very high amount of MET14 RNA only at time t = 10 h, while in the further course of fermentation the amount of transcript was not increased in comparison with strains L3 and L9. In the strains with a low sulfite formation rate (L3 and L9), much less MET14 RNA was observed during the entire fermentation process than in strain L6 or than in strain L1 at time T = 10 h.
• 3. MET16 wird im Stamm L6 deutlich stärker transkribiert als in den drei anderen Stämmen (Fig. 4), wobei das Maximum bei 20 h lag (Ende der log-Phase).3. MET16 is transcribed significantly more strongly in strain L6 than in the three other strains ( FIG. 4), the maximum being at 20 h (end of the log phase).

Die Gene MET14 und MET16 werden also im Stamm L6, mit dem hohen Sulfitbildungsvermögen, viel stärker exprimiert als in den anderen Stämmen, die deutlich weniger Sulfit bilden. Im Stamm L1, der intermediäre Sulfitbildung zeigt, ist hingegen nur das MET14-Gen im Laufe der logarithmischen Wachstumsphase (10 h) deutlich stärker exprimiert, als in den Kontrollstämmen L3 und L9. Aus diesen Ergebnissen kann man schlußfolgern, daß die Stärke der Expression der Gene MET14 und MET16 von großer Bedeutung für die Sulfitbildung ist. Das MET3-Gen scheint dagegen, zumindest bei den Stämmen L6 und L1, nur eine untergeordnete Rolle für die Sulfitbildung zu spielen.The genes MET14 and MET16 are thus in the strain L6, with the high one Sulphite-forming ability, expressed much more strongly than in the other strains, which is significantly less Form sulfite. In contrast, strain L1, which shows intermediate sulfite formation, only contains the MET14 gene expressed significantly more strongly in the course of the logarithmic growth phase (10 h) than in the Control strains L3 and L9. From these results it can be concluded that the strength of the Expression of the genes MET14 and MET16 is of great importance for sulfite formation. That In contrast, the MET3 gene appears to be only a minor one, at least in the L6 and L1 strains To play a role in sulphite formation.

Beispiel 3Example 3 Eipression von stress- bzw. hitzeinduzierten Genen unter GärbedingungenOverexpression of stress- or heat-induced genes under fermentation conditions

Zur Bestimmung der Transkriptmengen der Gene HSP26 und HSP30 wurden mit dem Stamm L6 Parallelgärungen in YEPM und Würze, wie in Beispiel 1 geschildert, angesetzt. Außerdem wurden die Transkription der Gene HSP12, HSP42, SSA3 (HSP70), HSP78, HSP82 und HSP104 untersucht. Diese Gene zeigten jedoch nicht die gewünschte verzögerte Expression, bzw. wurden zu schwach exprimiert.To determine the amount of transcript of the genes HSP26 and HSP30, strain L6 Parallel fermentations in YEPM and wort, as described in Example 1, are set up. aside from that were the transcription of the genes HSP12, HSP42, SSA3 (HSP70), HSP78, HSP82 and HSP104 examined. However, these genes did not or did not show the desired delayed expression too weakly expressed.

Zell-Ernte, RNA-Extraktion, Northern-Blot und Hybridisierung wurden durchgeführt, wie in Beispiel 1 und 2 geschildert. Zur Herstellung der Sonden wurden folgende Primer verwendet:
HSP26:
5'-CGTCAGTTAGCAAACACACC-3' (SEQ ID NR: 7)
5'-ACACCATTTGCGTAGTCTGC-3' (SEQ ID NR: 8)
HSP30:
5'-GAGGTTCGGATTGGTTATGG-3' (SEQ ID NR: 9)
5'-CAGGTACACAGCATAAGTGC-3' (SEQ ID NR: 10)Cell harvest, RNA extraction, Northern blot and hybridization were carried out as described in Examples 1 and 2. The following primers were used to produce the probes:
HSP26:
5'-CGTCAGTTAGCAAACACACC-3 '(SEQ ID NO: 7)
5'-ACACCATTTGCGTAGTCTGC-3 '(SEQ ID NO: 8)
HSP30:
5'-GAGGTTCGGATTGGTTATGG-3 '(SEQ ID NO: 9)
5'-CAGGTACACAGCATAAGTGC-3 '(SEQ ID NO: 10)

Die Northern-Blot-Analysen der mRNA's der Gene HSP26 und HSP30 zeigten, daß die Transkription in beiden Fällen, im Vergleich zum ACT1-Gen, erst verzögert ihr Maximum erreichte. Für HSP26 lag das Maximum bei 30 h, d. h. zu Beginn der stationären Phase (Fig. 5). Bei HSP30 (Fig. 6) trat die maximale Transkriptmenge erst nach 50 h, mitten in der stationären Phase, auf.The Northern blot analyzes of the mRNAs of the genes HSP26 and HSP30 showed that the transcription in both cases only reached its maximum with a delay compared to the ACT1 gene. The maximum for HSP26 was 30 h, ie at the beginning of the stationary phase ( FIG. 5). In the case of HSP30 ( FIG. 6), the maximum amount of transcript only occurred after 50 h, in the middle of the stationary phase.

Beispiel 4Example 4 Überexpression der Gene MET14 und MET16 unter Kontrolle der HSP26- und HSP30-PromotorenOverexpression of the MET14 and MET16 genes under the control of HSP26 and HSP30 promoters

Die Gene MET14 und MET16 wurden durch eine PCR mit genomischer DNA von S. cerevisiae und Primern folgender Sequenzen amplifiziert:
MET14:
5'-CACCCATGGCTACTAATATTACTTG-3' (SEQ ID NR: 11)
5'-TATAAGCTTGCAAGCTCGGTTGAACAC-3' (SEQ ID NR: 12)
MET16:
5'-AATCCATGGGGAAGACCTATCATTTGAATAATG-3' (SEQ ID NR: 13)
5'-GGTGGAAGCTTGGTTTTTATAG-3' (SEQ ID NR: 14)The MET14 and MET16 genes were amplified by a PCR with genomic DNA from S. cerevisiae and primers of the following sequences:
MET14:
5'-CACCCATGGCTACTAATATTACTTG-3 '(SEQ ID NO: 11)
5'-TATAAGCTTGCAAGCTCGGTTGAACAC-3 '(SEQ ID NO: 12)
MET16:
5'-AATCCATGGGGAAGACCTATCATTTGAATAATG-3 '(SEQ ID NO: 13)
5'-GGTGGAAGCTTGGTTTTTATAG-3 '(SEQ ID NO: 14)

Entsprechend wurden die HSP26- und HSP30-Promotoren durch PCR mit folgenden Primersequenzen amplifiziert:
HSP26:
5'-GGGGAATTCCAGTAGAAGGACATCGTTG-3' (SEQ ID NR: 15)
5'-GGGAAGCTTGCCATGGTAATTTGTTTAGTTTGTTTG-3' (SEQ ID NR: 16)
HSP30:
5'-TTAGAATTCCCTGCGCTCCTTAAC-3' (SEQ ID NR: 17)
5'-AAGAAGCTTGCCATGGGAAATTTGTTGTTTTTAGTAATC-3' (SEQ ID NR: 18)Accordingly, the HSP26 and HSP30 promoters were amplified by PCR with the following primer sequences:
HSP26:
5'-GGGGAATTCCAGTAGAAGGACATCGTTG-3 '(SEQ ID NO: 15)
5'-GGGAAGCTTGCCATGGTAATTTGTTTAGTTTGTTTG-3 '(SEQ ID NO: 16)
HSP30:
5'-TTAGAATTCCCTGCGCTCCTTAAC-3 '(SEQ ID NO: 17)
5'-AAGAAGCTTGCCATGGGAAATTTGTTGTTTTTAGTAATC-3 '(SEQ ID NO: 18)

Das Amplifikationsprotokoll sah wie folgt aus: The amplification protocol was as follows:

genomische DNA (5 µg)genomic DNA (5 µg) 1 µl1 µl H₂OH ₂ O 19,8 µl19.8 µl Puffer (10x)Buffer ( 10 x) 2,5 µl2.5 µl dNTP (10 mM)dNTP (10 mM) 0,25 µl0.25 µl Primer A (10 µMPrimer A (10 µM 0,2 µl0.2 µl Primer B (10 µMPrimer B (10 µM 0,2 µl0.2 µl MgCl₂ MgCl ₂ 0,75 µl0.75 µl Taq-Polymerase (5 U/µl)Taq polymerase (5 U / µl) 0,3 µl0.3 µl

Primer A + B sind die jeweils zur Amplifikation notwendigen vorwärts- und revers-Primer, wie oben spezifiziert.Primers A + B are the forward and reverse primers required for amplification, such as specified above.

Das Reaktionsgemisch wurde dem nachfolgenden Zyklus mit einem handelsüblichen Thermocyler unterzogen:
The reaction mixture was subjected to the following cycle with a commercially available Thermocyler:

Die so erhaltenen PCR-Produkte wurden über ein Agarosegel aufgetrennt und aus diesen ausgeschnitten. Aus den Gelquadern wurde die DNA mit einem handelsüblichen Kit (Quiaquick Gel Extraction Kit der Firma Quiagen) eluiert. Sie stand danach für weitere Klonierungsvorgänge zur Verfügung. Zu diesem Zweck wurden die Promotoren mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut. Anschließend wurden sie in die multiple Klonierungsschnittstelle des Vektors Yep358 (Moore (1995); ATCC-Nr. 37733) ligiert. Im terminalen Klonierungsschritt wurde ein zusätzliches Markergen, KanR, in das Konstrukt eingefügt. Dieses Gen kann ebenfalls wie zuvor beschrieben durch Amplifikation erhalten werden oder alternativ wird es aus einem Vektor ausgeschnitten. Die Klonierung in das bestehende Konstrukt erfolgte über eine PvuII- Schnittstelle.The PCR products obtained in this way were separated on and from an agarose gel cut out. The DNA was extracted from the gel blocks using a commercially available kit (Quiaquick Gel Extraction Kit from Quiagen) eluted. She then stood for further cloning operations to disposal. For this purpose, the promoters with the restriction enzymes EcoRI and HindIII digested. They were then inserted into the multiple cloning interface of the Vector Yep358 (Moore (1995); ATCC No. 37733). In the terminal cloning step an additional marker gene, KanR, was inserted into the construct. This gene can too can be obtained by amplification as previously described or, alternatively, it is made from a Vector cut out. The cloning into the existing construct took place via a PvuII- Interface.

Schließlich wurden die so konstruierten Plasmide durch Elektroporation (Becker und Guarente (1991), Methods Enzymol 194, 182-187) in die Hefe transformiert. Hefezellen, die Plasmide erhielten ließen sich selektionieren und daran erkennen, daß sie 1. ohne Uracil wachsen konnten und/oder 2. resistent gegen das Antibiotikum G418 waren.Finally, the plasmids constructed in this way were electroporated (Becker and Guarente (1991), Methods Enzymol 194, 182-187) transformed into the yeast. Yeast cells, the plasmids obtained could be selected and recognized by the fact that they 1. could grow without uracil and / or 2. were resistant to the antibiotic G418.

Es wurden 10⁵-10⁸ Zellen transformiert und auf einer Agar-Platte mit dem Medium YEPD (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 20 g/l Glukose, 17-25 g/l Agar) G418 in einer Konzentration von 500 µg/ml. Die wachsenden Klone waren resistent gegen dieses Antibiotikum und enthielten das transformierte Plasmid. Zur weiteren Verifizierung wurde überprüft, ob die Zellen auch in der Lage waren, ohne Uracil zu wachsen, falls die Ausgangsstämme Uracil-auxotroph waren. Bei Wein-, Bier- oder Bäckerhefestämmen, die eher prototroph sind, ist dieses Ziel zum Beispiel zu erreichen, indem das Plasmid aus den Stämmen reisoliert wird.10 ⁵ -10 ⁸ cells were transformed and G418 on an agar plate with the medium YEPD (10 g / l yeast extract, 20 g / l peptone, 20 g / l glucose, 17-25 g / l agar) in one concentration of 500 µg / ml. The growing clones were resistant to this antibiotic and contained the transformed plasmid. For further verification it was checked whether the cells were also able to grow without uracil if the starting strains were uracil auxotroph. In the case of wine, beer or baker's yeast strains, which are more prototrophic, this goal can be achieved, for example, by re-isolating the plasmid from the strains.

Claims (28)

1. Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Erzeugung verzögerter und erhöhter Sulfitkonzentration, die zu einem späten Zeitpunkt der Substratverwertung oder in der stationären Wachstumsphase oder im letzten Drittel der exponentiellen Wachstumsphase oder bei etwa 60% bis etwa 90% der in einer Wachstumsphase erreichbaren Zellzahl auftritt, umfassend ein DNA- Konstrukt, umfassend ein oder mehrere am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene unter der Kontrolle eines Promotors.1. Microorganism with the ability to produce delayed and increased Sulphite concentration at a late stage of the substrate recovery or in the stationary Growth phase or in the last third of the exponential growth phase or at around 60% up to about 90% of the cell number achievable in a growth phase occurs, comprising a DNA Construct comprising one or more genes involved in sulfite metabolism under the control a promoter. 2. Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus eine Hefe oder ein Bakterium ist.2. The microorganism of claim 1, wherein the microorganism is a yeast or a Bacterium is. 3. Hefe nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Hefestamm um die Gattung Saccharomyces, vorzugsweise die Art Saccharomyces cerevisisae, ober- oder untergärige Brauhefen, Weinhefen, Sekthefen, Sakehefen, Sherryhefen, Brennereihefen oder Bäckereihefen oder Hefen der Gattungen Brettanomyces oder Kluyveromyces oder anderer in der Lebensmittelherstellung eingesetzter Hefen handelt.3. Yeast according to claim 2, wherein the yeast strain is of the genus Saccharomyces, preferably the species Saccharomyces cerevisisae, top- or bottom-fermenting brewing yeast, wine yeast, Sparkling wine yeasts, sake yeasts, sherry yeasts, distillery yeasts or bakery yeasts or yeasts of the genera Brettanomyces or Kluyveromyces or others used in food production Yeasts. 4. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gen ausgewählt ist aus der Gruppe der Hefegene SUL1, SUL2, YGR125W, YOR251C, YPR003C, FZF1, YNR013C, MET3, MET14, MET16, MET25, MET22, MET1, MET8, MET5, MET10, MET18, MET2, MET6, SAM1, SAM2, oder einem Gen, welches ein Polypeptid mit APS- Kinase- oder PAPS-Reduktase-Aktivität kodiert.4. Microorganism according to one of claims 1 to 3, wherein the sulfite metabolism involved gene is selected from the group of yeast genes SUL1, SUL2, YGR125W, YOR251C, YPR003C, FZF1, YNR013C, MET3, MET14, MET16, MET25, MET22, MET1, MET8, MET5, MET10, MET18, MET2, MET6, SAM1, SAM2, or a gene that contains a polypeptide with APS Encodes kinase or PAPS reductase activity. 5. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das DNA-Konstrukt das am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gen in einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien, oder zwei verschiedene Gene in jeweils einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien, oder eine Vielzahl von Genen in jeweils einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien umfaßt.5. Microorganism according to one of claims 1 to 4, wherein the DNA construct is the am Sulphite metabolism involved gene in one copy or in multiple copies, or two different genes in each one copy or a multiplicity of copies, or a multiplicity of Genes in each case one copy or a plurality of copies comprises. 6. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe der Promotoren der folgenden Hefegene der HSP-Gene, der SSA-Gene, HSP26, HSP30, YGP1, HXK1, MOL1 (THI4), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4 oder YAT1. 6. Microorganism according to one of claims 1 to 5, wherein the promoter is selected from the group of promoters of the following yeast genes of the HSP genes, the SSA genes, HSP26, HSP30, YGP1, HXK1, MOL1 (THI4), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4 or YAT1. 7. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Promotor und/oder das(die) unter der Kontrolle des Promotors stehende(n) am Sulfitstoffwechsel beteiligte(n) Gen(e) durch Modifikationen, umfassend Substitution, Insertion, Deletion, Inversion oder Addition modifiziert ist(sind).7. Microorganism according to one of claims 1 to 6, wherein the promoter and / or the gene (s) under the control of the promoter involved in sulfite metabolism by modifications including substitution, insertion, deletion, inversion or addition is (are) modified. 8. Mikroorganismus nach Anspruch 7, wobei der Promotor mit einem anderen Promotor oder dessen Fragment substituiert, inseriert oder addiert wird.8. Microorganism according to claim 7, wherein the promoter with another promoter or whose fragment is substituted, inserted or added. 9. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Gen, welches ein Polypeptid mit APS-Kinase-Aktivität kodiert, eine Nukleinsäuresequenz von 60 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum MET14-Gen von Saccharomyces cerevisiae identisch ist.9. Microorganism according to one of claims 1 to 8, wherein the gene which a Polypeptide encoding APS kinase activity, a nucleic acid sequence of 60 base pairs which is at least 60% identical to the MET14 gene from Saccharomyces cerevisiae. 10. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Gen, welches ein Polypeptid mit PAPS-Reduktase-Aktivität kodiert, eine Nukleinsäuresequenz von 60 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum MET16-Gen von Saccharomyces cerevisiae identisch ist.10. Microorganism according to one of claims 1 to 9, wherein the gene which a Polypeptide encoding PAPS reductase activity, a nucleic acid sequence of 60 base pairs which is at least 60% identical to the MET16 gene from Saccharomyces cerevisiae. 11. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Promotor eine Nukleinsäuresequenz von 20 Basenpaaren umfaßt, die zu mindestens 60% zum HSP26-Promotor von Saccharomyces cerevisiae oder zum HSP30-Promotor von Saccharomyces cerevisiae identisch ist.11. Microorganism according to one of claims 1 to 10, wherein the promoter is a Nucleic acid sequence of 20 base pairs, which is at least 60% to the HSP26 promoter from Saccharomyces cerevisiae or to the HSP30 promoter from Saccharomyces cerevisiae is identical. 12. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das DNA-Sequenz in episomaler Form oder in ins Genom integrierter Form vorliegt.12. Microorganism according to one of claims 1 to 11, wherein the DNA sequence in episomal form or in a form integrated into the genome. 13. DNA-Konstrukt, umfassend ein oder mehrere am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gene unter der Kontrolle eines Promotors.13. DNA construct comprising one or more genes involved in sulfite metabolism below the control of a promoter. 14. DNA-Konstrukt nach Anspruch 13, wobei das am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gen ausgewählt ist aus der Gruppe der Hefegene SUL1, SUL2, YGR125W, YOR251C, YPR003C, FZF1, YNR013C, MET3, MET14, MET16, MET25, MET22, MET1, MET8, MET5, MET10, MET18, MET2, MET6, SAM1, SAM2, oder einem Gen, welches ein Polypeptid mit APS-Kinase- oder PAPS-Reduktase-Aktivität kodiert. 14. DNA construct according to claim 13, wherein the gene involved in sulfite metabolism is selected from the group of yeast genes SUL1, SUL2, YGR125W, YOR251C, YPR003C, FZF1, YNR013C, MET3, MET14, MET16, MET25, MET22, MET1, MET8, MET5, MET10, MET18, MET2, MET6, SAM1, SAM2, or a gene that contains a polypeptide with APS kinase or encodes PAPS reductase activity. 15. DNA-Konstrukt nach Anspruch 13 oder 14, umfassend das am Sulfitstoffwechsel beteiligte Gen in einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien, oder zwei verschiedene Gene in jeweils einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien, oder eine Vielzahl von Genen in jeweils einer Kopie oder einer Vielzahl von Kopien.15. DNA construct according to claim 13 or 14, comprising the sulfite metabolism involved gene in one copy or multiple copies, or two different genes in one copy at a time, or a plurality of copies, or a plurality of genes in one at a time Copy or multiple copies. 16. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe der Promotoren der folgenden Hefegene der HSP-Gene, der SSA-Gene, HSP26, HSP30, YGP1, HXK1, MOL1 (THI4), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4 oder YAT1.16. DNA construct according to one of claims 13 to 15, wherein the promoter is selected from the group of promoters of the following yeast genes of the HSP genes, the SSA genes, HSP26, HSP30, YGP1, HXK1, MOL1 (THI4), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4 or YAT1. 17. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei der Promotor und/oder das(die) unter der Kontrolle des Promotors stehende(n) am Sulfitstoffwechsel beteiligte(n) Gen(e) durch Modifikationen, umfassend Substitution, Insertion, Deletion, Inversion oder Addition modifiziert ist(sind).17. DNA construct according to one of claims 13 to 16, wherein the promoter and / or the gene (s) under the control of the promoter involved in sulfite metabolism by modifications including substitution, insertion, deletion, inversion or addition is (are) modified. 18. DNA-Konstrukt nach Anspruch 17, wobei der Promotor mit einem anderen Promotor oder dessen Fragment substituiert, inseriert oder addiert wird.18. DNA construct according to claim 17, wherein the promoter with another promoter or whose fragment is substituted, inserted or added. 19. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei das Gen, welches ein Polypeptid mit APS-Kinase-Aktivität kodiert, eine Nukleinsäuresequenz von 60 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum MET14-Gen von Saccharomyces cerevisiae identisch ist.19. DNA construct according to one of claims 13 to 18, wherein the gene which a Polypeptide encoding APS kinase activity, a nucleic acid sequence of 60 base pairs which is at least 60% identical to the MET14 gene from Saccharomyces cerevisiae. 20. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 13 bis 19, wobei das Gen, welches ein Polypeptid mit PAPS-Reduktase-Aktivität kodiert, eine Nukleinsäuresequenz von 60 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum MET16-Protein von Saccharomyces cerevisiae identisch ist.20. DNA construct according to one of claims 13 to 19, wherein the gene which a Polypeptide encoding PAPS reductase activity, a nucleic acid sequence of 60 base pairs which is at least 60% identical to the MET16 protein from Saccharomyces cerevisiae. 21. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 13 bis 20, wobei der Promotor eine Nukleinsäuresequenz von 20 Basenpaaren enthält, die zu mindestens 60% zum HSP26-Promotor von Saccharomyces cerevisiae oder zum HSP30-Promotor von Saccharomyces cerevisiae identisch ist.21. DNA construct according to any one of claims 13 to 20, wherein the promoter is a Contains nucleic acid sequence of 20 base pairs, at least 60% of which is related to the HSP26 promoter from Saccharomyces cerevisiae or to the HSP30 promoter from Saccharomyces cerevisiae is identical. 22. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 13 bis 21 in linearer oder zirkulärer Form. 22. DNA construct according to one of claims 13 to 21 in linear or circular form. 23. Verfahren zu Herstellung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend das Einschleusen eines DNA-Konstrukts nach einem der Ansprüche 13 bis 22.23. A method for producing a microorganism according to any one of claims 1 to 12, comprising introducing a DNA construct according to any one of claims 13 to 22. 24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Einschleusen durch Transformation, Transfektion, Lipofektion, Konjugation oder Kreuzung durchgeführt wird.24. The method according to claim 23, wherein the introduction by transformation, Transfection, lipofection, conjugation or crossing is performed. 25. Verwendung des Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung von Lebensmitteln, Bier, Wein oder biotechnologisch erwünschter Stoffwechselendprodukte.25. Use of the microorganism according to any one of claims 1 to 12 for production of food, beer, wine or biotechnologically desirable metabolic end products. 26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei der Mikroorganismus ein Gemisch aus Hefen und Bakterien ist.26. Use according to claim 25, wherein the microorganism is a mixture of yeasts and Bacteria is. 27. Verfahren zur Herstellung von Lebensmitteln, Bier, Wein oder biotechnologisch erwünschter Stoffwechselendprodukte, umfassend das Einwirken des Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 auf eine Vorstufe der genannten Erzeugnisse.27. Process for the production of food, beer, wine or biotechnological desired metabolic end products, including exposure to the microorganism after one of claims 1 to 12 to a preliminary stage of said products. 28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Mikroorganismus ein Gemisch aus Hefen und Bakterien ist.28. The method of claim 27, wherein the microorganism is a mixture of yeasts and Bacteria is.