DE19920262A1 - Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten BiomolekülenInfo
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Abstract
Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen, wobei die Polyurethanmatrix in einem Lösungsmittelgemisch vorgelegt wird, wobei das Lösungsmittelgemisch zumindest zu 80% unpolare Lösungsmittel enthält, in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Aktivierungsreagenz befindet, so daß die anschließende Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Polyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polyurethan-Wundauflagen,
an die wundheilungsrelevante Biomoleküle wie zum Beispiel Superoxid-Dismutase
immobilisiert sind, mit denen es möglich ist, den normalen Heilungsprozeß einzuleiten
beziehungsweise zu fördern. Durch eine temporäre und lokal begrenzte Applikation
der wundheilungsfördernden Enzyme werden fehlende oder nicht ausreichend vor
handene Faktoren ausgeglichen und ergänzt.
Die Aktivierung der funktionellen Gruppen zur kovalenten Kopplung von Proteinen, Anti
körpern und Enzymen oder niedermolekularen organischen Substanzen über Amino
gruppen sind in Standardwerken wie zum Beispiel W. H. Scouten, Immobilized Enzymes
and Cells, in Methods Enzymol., Ed. K. Mosbach, 1987; 135 : 30 und in Immobilization of
Enzymes and Cells, 1997; Ed. G. F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey;
H. A. Staab, H. Bauer, K. M. Schneider in Azolides in Organic Synthesis and Biochemi
stry, Wiley-VCH, 1998 ausführlich beschrieben. Als funktionelle Aminogruppen bei Pro
teinen, Antikörpern und Enzymen können die α-Aminogruppen des Aminoterminus und
die ω-Aminogruppen der oberflächenexponierten Aminosäureseitenketten von Lysin und
Arginin fungieren. Zur Aktivierung können aber auch andere Reagenzien wie beispiels
weise Carbonylditriazol (CDT) (vergleiche C. Delgado et al. 1992, Critical Reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249) verwendet werden.
Entsprechende Kopplungsverfahren sind als Stand der Technik bekannt und werden
zum Beispiel bei der Herstellung von Stoffen für präparative und analytische Anwen
dungen eingesetzt. So ist beispielsweise in der EP 0 087 786 ein Verfahren zur Immobi
lisierung des Eisen-Chelators Desferrioxamin über Bindung der primären Aminogruppe
beschrieben, wobei DFO an Agarose-Polyaldehyd-Gelperlen gebunden wird.
Die kovalente Modifizierung von SOD (P. Pyatak et al., 1980, Res. Com. Chem. Path.
and Pharmacol., 29, 115), Katalase (A. Abukovski et al., 1976, J. Biol. Chem., 252,
3582) und anderen Enzymen (M. L. Nucci et al., 1991, Advanced Drug Delivery
Reviews, 6, 133) mit Polyethylenglykol durch Kopplung von aktiviertem Polyethylengly
kol an Aminogruppen der Enzyme ist offenbart.
Hirano et al. (1994, J. Controlled Release, 28, 203) beschreibt die Herstellung von SOD-
Polymerkonjugaten mit aktiviertem Divinylether und Maleionsäureanhydrid. Fortier
beschreibt in der WO 95/15352 die kovalente Einbindung von Peroxidase und Katalase
über Aminogruppen in ein Polymergel bestehend aus dem Protein BSA und voraktivier
tem Polyethylenglykol. Maneke und Polakowski (1981, J. Chrom, 215, 13) beschreiben
die Immobilisierung von α-Chymotrypsin an eine Polymermatrix aus Polyvinylalkohol und
Terephthalaldehyd.
In der WO 98/02189 wird eine Methode zur Kopplung von wundheilungsrelevanten
Enzymen oder Proteinen an Polyhydroxypolymere wie beispielsweise Cellulose
beschrieben. Dabei wird das Aufquellen eines Polyhydroxypolymers in organischen
Lösungsmitteln beansprucht.
Polyurethangele zählen ebenfalls zu den Polyhydroxyverbindungen, haben aber bei
spielsweise gegenüber Cellulose den Nachteil, daß sie unter den bekannten Bedingun
gen zur Aktivierung der Hydroxygruppen stark quellen.
In WO 96/31551 werden im trockenen Zustand Proteine oder Peptide als aktive Agen
tien zu Polyurethan-vernetzten Microgelen gemischt. Die Microgele quellen im wäßrigen
Medium zu Hydrogelen auf und setzen aus der Hydrogelmatrix das Protein beziehungs
weise das Peptid wieder frei. Auch US 5,000,955 beschreibt Polyurethan-Hydrogele für
kosmetische, biologische und medizinische Anwendungen. Kubische Phasen bestehend
aus Glycerylmonooleat können Enzyme durch nicht-kovalente Bindungen, wie in WO
96/39125 berichtet, immobilisieren. Dabei bleibt durch die Immobilisierung die enzymati
sche Aktivität erhalten und ist sogar, im Vergleich zu gelöstem Enzym, über einen länge
ren Zeitraum erhöht.
DE 40 26 153 beschreibt die Herstellung eines Polyurethan-Kunststoffschaums, in des
sen Poren ein Hydrogel eingelagert ist. An das aus Polysacchariden bestehende Hydro
gel werden proteolytisch wirkende Enzyme wie zum Beispiel Trypsin, Gelatinase, Chy
motrypsin und Kollagenase über eine Aktivierungsreaktion mit CDI oder dem Kopplungs
reagenz Bromcyan gebunden. EP 0 236 610 beschreibt die Einarbeitung (Inkapsulie
rung) von oxidativ wirkenden Enzymen wie zum Beispiel Glucoseoxidase in ein
Urethanpräpolymer. Das Enzym wird durch Kontakt mit Serum aktiviert und produziert
oxidierend wirkende Substanzen wie Wasserstoffperoxid zur Bekämpfung von Bakterien
in infizierten Wunden.
Nach DE 36 06 265 werden therapeutisch wirksame nicht-immobilisierte Enzyme zur
Wundreinigung in eine Wundauflage auf Polysaccharidbasis eingearbeitet. Als Enzym
träger werden Cellulose-Schwammstücke vorgeschlagen, die durch Tauchen und Trän
ken in eine Enzymlösung hergestellt werden. Nach Kontakt des Enzymträgers mit der
Wunde werden die nicht-immobilisierten proteolytisch wirkenden Enzyme in die Wunde
abgegeben.
Ein proteolytischer Wundverband als Trockenpuder oder Streupulver in Form von
sphärischen Teilchen von 0,05 bis 0,5 mm auf Basis von Polysacchariden wie Dextran,
Chitin und Chitosan, an denen eine Protease gebunden ist, wird in DE 34 44 746
beschrieben. Zur Aktivierung der Polysaccharidmatrix wurden Glutaraldehyd, Bromcyan,
2-Amino-4.6-dichlor-s-triazin und Einführen von Isothiocyanatgruppen mit Thiophosgen
eingesetzt.
Seit Menschengedenken ist die Heilung von therapieresistenten Wunden eine große
Herausforderung für die Medizin und Naturwissenschaften. Die heutigen Anforderungen
an die Funktion von interaktiven Wundauflagen für chronische Wunden gehen zurück
auf G. Winter (1962, Nature 193, 293) und sind jüngst von T. D. Turner neu formuliert
worden (1994, Wound Rep. Reg. 2, 202). Im Vordergrund steht dabei die Schaffung
eines feuchten Wundheilungsmilieus, das im Gegensatz zur traditionellen trockenen
Wundbehandlung mit zum Beispiel Mullkompressen den natürlichen Abläufen der
Wundheilung physiologische und damit bessere Konditionen bietet.
Das Prinzip der feuchten Wundheilung kann derzeit als der Stand der Technik in der
Therapie schwer oder nicht heilender Wunden angesehen werden. Die Wundauflage
muß die Hauptmenge des Exsudates aufnehmen und gleichzeitig aber auf der
Wunde selbst einen Flüssigkeitsfilm belassen, in dem die eigentliche feuchte Wund
heilung stattfindet. Bei trockenen und schwachexsudierenden Wunden muß die Ver
sorgung der Wunde mit ausreichend Feuchtigkeit erfolgen, um eine Rehydrierung des
dehydrierten Gewebes zu erreichen. In der auf diese Weise etablierten feuchten
Wunde kommt es dann zur Proliferation von neuen Blutgefäßen und vermindertem
Bakterienwachstum unter Einstellung eines geeigneten pH-Wertes. Erfüllt werden
diese Anforderungen von Strukturen, wie beispielsweise Hydrogelen, Alginaten und
Superabsorber enthaltenden Wundauflagen, die einen Überschuß von Wundexsudat
aufnehmen können.
Unter dem Begriff "Störfaktoren" werden allgemein Stoffe oder Substanzen verstan
den, die den Heilungsprozeß von Wunden verhindern oder verlangsamen und damit
zur Ausbildung von chronischen Wunden führen. Dabei sind im Wundexsudat vor
handene suspendierte Zellen (zum Beispiel entzündliche Zellen wie Leukozyten und
Makrophagen) und Zellfragmente oder gelöste Bestandteile wie Antigene, Radikale
(wie zum Beispiel reaktive Sauerstoffspezies, ROS), Ionen (wie zum Beispiel Eisen
ionen), Proteine und Peptide eingeschlossen.
In der entzündlichen Phase der Wundheilung, die der Blutgerinnung und Blutplättchen-
Aggregation nach Verletzung und Trauma folgt, wandern bevorzugt Neutrophile und
Monozyten in das geschädigte Gewebe ein. Dort beginnen sie mit der Phagozytose von
Keimen und dem Abbau von zerstörtem Gewebe und fremden Antigenen. Durch chemi
sche Botenstoffe und Mikroorganismen aktiviert und stimuliert, kommt es zu einer stark
erhöhten Produktion von ROS, auch "oxidative burst" genannt. Diese ROS werden in
Granula gespeichert und bei weiterer Stimulierung in hohen lokalen Konzentrationen in
das extrazelluläre Gewebe zur Bekämpfung von Mikroorganismen freigegeben.
In der normal verlaufenden Wundheilung kommt es nach erfolgreicher Beseitigung der
immunologischen Reize zur Beendigung der entzündlichen Phase, und der Wiederauf
bau des Gewebes kann beginnen. Bleiben jedoch diese Reize bestehen, wandern wei
tere Leukozyten in das Gewebe nach und werden wiederum aktiviert, was zu einer dau
erhaft entzündeten oder chronischen Wunde führt. Die Ausschüttung von ROS (O.
Senel et al., 1997, Annals of Plastic Surgery, 39, 516) und proteolytischen Enzymen
führt zu einer Schädigung des Gewebes (Halliwell & Gutteridge, 1989, Free Radicals in
Biology and Medicine, 2. Auflage, Clarendon Press, Oxford).
Es ist erforderlich, daß das an die Polyurethangele (PU-Gele) gebundene Enzym
eine hohe Spezifität für das in der Wundflüssigkeit vorhandene Substrat besitzt.
Durch diese selektive Entfernung beziehungsweise Eliminierung des Substrats wird
der Heilungsprozeß chronischer, d. h. schwer oder nicht heilender Wunden verbes
sert beziehungsweise eingeleitet.
Im Falle eines enzymdotierten PU-Gels, das aus den Enzymen SOD und/oder Kata
lase oder aus einer Mischung der beiden Enzyme besteht, ist ein selektives Entfer
nen von ROS aus der Wundflüssigkeit möglich.
Das Enzym SOD katalysiert die Dismutationsreaktion von reaktivem Superoxid in die
weniger toxischen Zwischenstufen Wasserstoffperoxid und Sauerstoff. Es tritt als
dimere oder tetramere Form auf. Die verschiedenen Enzyme mit Molekulargewichten
von 32 000 bis 56 000 Da haben Metall-Ionen wie Kupfer und Zink (Cu-Zn-SOD),
Mangan (Mn-SOD) oder Eisen (Fe-SOD) als Co-Faktoren im katalytischen Zentrum.
Das ubiquitäre Enzym SOD spielt die Hauptrolle in der zellulären Verteidigung gegen
die sauerstoffvermittelte Toxizität von ROS und bei der Regulierung der intrazellulä
ren Sauerstoffkonzentration (Fridovich, 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 97). Das
durch die Reaktion der SOD gebildete Wasserstoffperoxid wird anschließend durch
das in aeroben Organismen ubiquitäre Redoxenzym Katalase in einem mehrstufigen
katalytischen Zyklus in die nichttoxischen Moleküle Wasser und Sauerstoff umge
wandelt (Gouet et al., 1996, Nature Structural Biology, 3, 951). Außer Katalase sind
auch die Enzyme Gluthathion-Peroxidase und Myeloperoxidase befähigt, Wasser
stoffperoxid abzubauen.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine wasserunlösliche, wasseraufnehmende Poly
urethanmatrix nach einem neuen Verfahren zu fertigen, die für medizinische Zwecke
einsetzbar sind und sich in besonderem Maße zur Förderung der Heilung von chroni
schen Wunden eignen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man bei der Herstellung der
Polyurethanmatrix Enzyme immobilisiert, die mit den in Wundflüssigkeiten von chro
nischen Wunden vorhandenen ROS wechselwirken, d. h. mit Faktoren, die den
Wundheilungsprozess behindern, wobei man diese zusätzlichen Substanzen kova
lent an die PU-Matrix bindet.
Dementsprechend beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Poly
urethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen, wobei die Polyurethan
matrix in einem Lösungsmittelgemisch vorgelegt wird, wobei das Lösungsmittel
gemisch zumindest zu 80% unpolare Lösungsmittel enthält (insbesondere zwischen
80% und 95%), in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in
dem sich das Aktivierungsreagenz befindet, so daß die anschließende Immobilisie
rung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Polyurethanmatrix oder an
oberflächennahen Schichten stattfindet.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform ist die Polyurethanmatrix ein Polyurethan
gel oder ein daraus hergestellter Polyurethanschaum oder eine daraus hergestellte
Polyurethan-Folie.
Die im wesentlichen wasserfreien und zum Teil selbstklebenden PU-Gelmassen sind
zum Beispiel bekannt aus DE 196 18 825, EP 0 057 839, EP 0 147 588 sowie DE 43
08 347. Die dort beschriebenen Gele setzen sich zusammen aus Polyhydroxyverbin
dungen und aromatischen oder aliphatischen Polyisocyanaten. Bevorzugt wird ein
Polyurethangel bestehend aus Levagel (Copolymer aus Propylenoxid und Ethylen
oxid mit einem Molekulargewicht von ca. 6400 g/mol, Bayer, Leverkusen) und Hexa
methylendiisocyanat mit einem NCO/OH-Verhältnis von 0,3 bis 0,7 verwendet. Da
nicht alle OH-Funktionalitäten während der Vernetzungsreaktion abreagieren, stehen
für die kovalente Kopplung an eine PU-Matrix zur Immobilisierung von Substanzen in
der hier beschriebenen Art und Weise freie OH-Funktionalitäten zur Verfügung.
Für den Einsatz der erfindungsgemäßen Polyurethanprodukte als Wundauflage ist es
von Vorteil, wenn die immobilisierten Substanzen direkt an der PU-Oberfläche ange
bunden sind. Für die Aktivierungsreaktion sind Lösungsmittel erforderlich, die das
Aktivierungsreagenz lösen. In Aceton, Dioxan, Diethylether, Dimethylglycol oder
Dichlormethan sowie Alkoholen und in Mischungen der genannten Lösungsmittel
quillt das Polyurethan so stark, daß es bereits bei geringen mechanischen Belastun
gen zerreißt. Außerdem werden niedermolekulare Bestandteile des Polyurethangels
aus der Gelmatrix herausgelöst. Dadurch gehen einerseits gerade die Bestandteile
verloren, die über viele freie OH-Gruppen für die Aktivierung und Kopplung verfügen
und andererseits werden die mechanischen Eigenschaften des Polyurethangels ver
ändert. Des weiteren können bei einer starken Quellung der PU-Matrix die Substan
zen zum Teil auch im Inneren der PU-Matrix immobilisiert werden und haben damit
für die Anwendung keinen Nutzen.
Das Lösungsmittelgemisch besteht insbesondere aus ungefähr 80% bis 95% der unpo
laren Lösungsmittel und aus ungefähr 20% bis 5% der polaren bis leicht polaren organi
schen Lösungsmittel, insbesondere aus 90% der unpolaren Lösungsmittel und 10% der
polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel.
Die polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel sind insbesondere gewählt aus
der Gruppe Aceton, Ether, Ketone, Ester, Amide, beispielsweise Methyl-tert.butylketon,
Dioxan, Diethylether, Dimethylglycol, Dichlormethan, Ethylacetat, Dimethylformamid.
Als unpolare Lösungsmittel kommen vorzugsweise Hexan, Heptan und/oder Petrolether
(zum Beispiel Petrolether 35/60) zum Einsatz.
In unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan, Heptan oder Petrolether findet kaum eine
Quellung der Polyurethanmatrix statt. In diesen Lösungsmitteln sind die Aktivierungs
reagenzien, wie zum Beispiel CDI oder CDT nahezu unlöslich. Bei der Verwendung
eines Lösungsmittelgemisches aus 80% bis 95% der unpolaren Lösungsmittel, wie
Hexan, Heptan oder Petrolether, und 20% bis 5% der polaren bis leicht polaren organi
schen Lösungsmittel werden die Quellung und damit die genannten Nachteile stark
unterdrückt, und es kann sich dennoch genug Aktivierungsreagenz lösen.
In Wasser zeigt das Polyurethangel ebenfalls eine nur geringe Quellneigung, wobei die
generelle Verwendung von Wasser als Lösungsmittel für die Aktivierung jedoch deshalb
ausscheidet, weil sich CDI und CDT in Wasser zersetzen. Zur Lösung diese Problems
kann als Alternative das Aktivierungsreagenz Thiocarbonyldiimidazol (TCDI) eingesetzt
werden.
In dieser alternativen Lösungsmöglichkeit wird ein Verfahren zur Herstellung einer Poly
urethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen beansprucht, wobei die Poly
urethanmatrix in Wasser als Lösungsmittel für das TCDI (ca. 1 Gew.-%) vorgelegt wird,
in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Akti
vierungsreagenz befindet, so daß die anschließende Immobilisierung des Biomoleküls
bevorzugt an der Oberfläche der Polyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schich
ten stattfindet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante ist das Biomolekül aus der Gruppe
bestehend aus Antikörpern, Chelatoren, Enzyminhibitoren, Enzymen, Peptiden und
anderen Proteinen ausgewählt.
Besonders vorteilhaft läßt sich die erfindungsgemäß hergestellte Polyurethanmatrix zur
Herstellung von Wundauflagen einsetzen.
Das an die Polyurethanmatrix kovalent gebundene Biomolekül sollte mit in Wundexsu
dat vorhandenen Störfaktoren, die den Wundheilungsprozeß behindern, wechselwirken,
wobei die Störfaktoren aus der Gruppe bestehend aus suspendierten Zellen und Zell
fragmenten sowie gelösten Bestandteilen wie Antigene, Radikale, Ionen, Proteine, Pep
tide, Lipide und freie Fettsäuren ausgewählt sind, wobei die Wechselwirkung ein Bin
den, Komplexieren, Chelatisieren des Störfaktors oder eine chemische Reaktion mit
dem Störfaktor umfaßt und wobei die Substanzen kovalent an ein Trägermaterial
gebunden sind.
Beispielsweise ist es möglich, mit den enzymimmobilisierten Polyurethangelen toxi
sche ROS in der Wundflüssigkeit von chronischen Wunden unschädlich zu machen.
Die Wundauflage ist besonders aus der Gruppe bestehend aus Verbänden, Verband
mull, Binden, Kompressen, Watten, Pflastern, Folien, Filmen, Hydrokolloidverbänden,
Gelen und dergleichen ausgewählt.
Schließlich sollte die Wundauflage in der Lage sein, Feuchtigkeit aufzunehmen.
Vorzugsweise sind die Störfaktoren Eisenionen und die mit den Störfaktoren wechsel
wirkende Substanz ein Chelator, wobei dieser nun wieder insbesondere aus der Gruppe
von immobilisierbaren Komplexbildnern wie zum Beispiel Desferrioxamin ausgewählt ist.
Weiter vorzugsweise sind die Störfaktoren reaktive Sauerstoffradikale und die mit den
Störfaktoren wechselwirkende Substanz ein Radikalfänger, wobei dieser insbesondere
aus der Gruppe bestehend aus Superoxiddismutase, Katalase, Gluthathion-Peroxidase,
Myeloperoxdase und Enzym-Mimics oder einer anderen Kombination davon ausgewählt
ist.
Weiter vorzugsweise sind der Störfaktor eine Protease und die mit dem Störfaktor
wechselwirkende Substanz ein Protease-Inhibitor, wobei dieser insbesondere aus der
Gruppe bestehend aus natürlichen proteinogenen Protease-Inhibitoren aus der Klasse
der tissue Inhibitors of Matrixmetalloproteinases wie zum Beispiel Alpha-2-Antiplasmin,
Alpha-2-Makroglobulin, Alpha-1-Antichymotrypsin, Sojabohnen-Trypsininhibitor und
Alpha-1-Protease-Inhibitor ausgewählt ist.
Dann können die Störfaktoren Eisenionen sein und die mit den Störfaktoren wechselwir
kende Substanz Desferrioxamin, alternativ reaktive Sauerstoffradikale und die mit den
Stärfaktoren wechselwirkende Substanz ein Radikalfänger, wobei der Radikalfänger aus
der Gruppe bestehend aus Superoxiddismutase, Katalase, Gluthathion-Peroxidase,
Myeloperoxidase und Enzym-Mimics oder einer Kombination davon ausgewählt ist.
Weiterhin kann der Störfaktor eine Protease sein und die mit dem Störfaktor wech
selwirkende Substanz ein Protease-Inhibitor, wobei der Protease-Inhibitor aus der
Gruppe bestehend aus natürlichen proteinogenen Protease-Inhibitoren aus der
Klasse der Tissue Inhibitors of Matrixmetalloproteinases, Aprotinin, Alpha-2-Antiplas
min. Alpha-2-Makroglobulin, Alpha-1-Antichymotrypsin, Sojabohnen-Trypsininhibitor
und Alpha-1-Protease-Inhibitor ausgewählt ist.
Weiterhin wird erfindungsgemäß beschrieben, daß eine Kopplung auch über Spacer
moleküle, das sind α,ω-difunktionelle Substanzen, wie beispielsweise 1,6-Diaminohexan
oder 6-Aminohexancarbonsäure, an eine PU-Matrix möglich ist.
Durch die vorliegende Erfindung werden erstmals nach einem neuartigen Verfahren
hergestellte PU-Gelmatrices als Wundauflage zur Verbesserung des Heilungsverlaufs
von chronischen Wunden zur Verfügung gestellt.
Die aktiven Biomoleküle werden beim Entfernen der PU-Matrix ebenfalls mit entfernt,
ohne daß sie in der Wunde beziehungsweise in der Wundflüssigkeit verbleiben. Die
zur Wechselwirkung verwendeten, kovalent in die PU-Matrix eingebundenen Bio
moleküle werden somit nur vorübergehend in die Wunde eingebracht und werden,
nachdem sie ihre bestimmungsgemäße Aufgabe verrichtet haben (d. h., die oben
genannten Wechselwirkungen eingegangen sind), wieder aus dem Wundbereich
entfernt. Durch die selektive Beseitigung beziehungsweise Eliminierung der toxischen
ROS, das proteolytische Auflösen von totem Gewebe und das Abtöten von Mikro
organismen wird der Heilungsprozeß chronischer, d. h. schwer oder nicht heilender
Wunden verbessert beziehungsweise eingeleitet.
In der chronischen Wunde findet man eine deutlich erhöhte Proteaseaktivität (Weck
roth et al., 1996, J. Invest. Dermatol., 106, 1119; Grinell & Zhu, 1996, J. Invest. Der
matol. 106, 335) im Vergleich zur akuten Wunde. Enzyme wie zum Beispiel SOD und
Katalase, die durch ihre schützende Wirkung wundheilungsfördernd wirken, würden
dadurch proteolytisch abgebaut und somit unwirksam. Ein Polyurethangel, an das
solche Enzyme kovalent gebunden sind, wirkt als Schutzschild und kann den Angriff
von Proteasen verhindern, wie mit Polyethylenglykol modifizierten gelösten Enzymen
gezeigt wurde (J. S. Beckman et al., 1988, J. Biol. Chem., 14, 6884; Y. Inada et al.,
1995, Tibtech, 13, 86).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es somit nicht nur, möglichst ein feuchtes
Wundmilieu zu generieren, um den Heilungsprozeß chronischer Wunden zu verbes
sern, sondern der Heilungsprozeß kann auch erfindungsgemäß dadurch weiter
beschleunigt werden, zum Beispiel durch die oben genannten Umwandlungspro
zesse.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert, ohne
diese damit unnötig einschränken zu wollen.
Für die folgenden Beispiele wurden Polyurethangele eingesetzt, die aus einer Polyol
komponente (Levagel, Bayer, Leverkusen) und einer Diisocyanatkomponente wie
beispielsweise Hexamethylendiisocyanat (Bayer, Leverkusen) mit einem NCO/OH-
Verhältnis von 0,3 bis 0,7 bestanden.
Die Experimente zur Herstellung einer CDI-aktivierten beziehungsweise CDT-aktivierten
Polyurethanmatrix wurden wie folgt durchgeführt.
10 identische Polyurethanstücke (1,2 mm Dicke, 15 mm Durchmesser, 275 mg/Stück)
wurden in einem Gemisch aus 90 ml trockenem Hexan (oder Petrolether 35160) und 10
ml trockenem Aceton mit 1 g (6,25 mmol) CDI (Sigma, Steinheim) oder 1 g (6,1 mmol)
CDT (Sigma, Steinheim) aktiviert.
In beiden Fällen lief die Reaktion in einem 250-ml-Rundkolben eine Stunde lang bei
Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluß und mäßigem Rühren. Danach wurde
das Lösungsmittel abdekantiert und die CDI-aktivierten beziehungsweise CDT-aktivier
ten Polyurethanstücke auf silikonisiertem Trennpapier an der Luft bis zur Gewichtskon
stanz getrocknet.
Es wurden 10 identische Polyurethanstücke, wie in Beispiel 1 beschrieben, in 100 ml
dest. Wasser mit 1 g Thiocarbonyldiimidazol (TCDI, Fluka, 5,6 mmol) aktiviert.
Die Reaktion lief zwei Stunden bei 32°C und mäßigem Rühren in einem 250-ml-Rund
kolben.
Danach wurde das Wasser abdekantiert, und die PU-Stücke wurden, nach dreimaligem
Waschen mit destilliertem Wasser, auf silikonisiertem Trennpapier getrocknet.
10 identische Polyurethanstücke wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und
anschließend in 20 ml NaHCO3-Puffer (100 mM, pH 8.0), im weiteren als Kopplungs
puffer bezeichnet, gelegt. Dazu wurden entweder 500 mg (3,81 mmol) 6-Aminohexan
säure analytical grade (Serva, Heidelberg) oder 500 mg (4,3 mmol) 1,6-Diaminohexan
(Fluka, Buchs) gegeben.
Die Reaktion lief über 18 Stunden bei Raumtemperatur, wobei intensiv gerührt wurde.
Danach wurde die Pufferlösung abgegossen. Die Polyurethanstücke wurden dann ins
gesamt je dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, um Reste der nicht gekoppelten
6-Aminohexansäure oder des 1,6-Diaminohexans zu entfernen. Anschließend wurden
die mit 6-Aminocarbonsäure beziehungsweise 1,6-Diaminohexan gekoppelten Poly
urethanstücke an der Luft bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
10 identische Polyurethanstücke, die wie in den Beispielen 1 oder 2 angegeben, aktiviert
wurden, wurden in 20 ml Kopplungspuffer gelegt. Anschließend wurden je 200 mg DFO
(0,30 mmol) (Sigma, Deisenhofen) zugegeben. Die Kopplungsreaktion lief unter intensi
vem Rühren über 18 Stunden bei Raumtemperatur ab. Danach wurde die Pufferlösung
abgegossen und mehrfach durch destilliertes Wasser ersetzt, um unspezifisch gebun
denes DFO aus dem Polymer herauszuwaschen.
Der Nachweis des Kopplungsproduktes aus Polyurethan und DFO erfolgte mit einer
Farbreaktion, die zugleich einen Funktionalitäts-Assay darstellt: Durch Komplexbildung
von Eisen mit gelöstem DFO entsteht im Verhältnis 1 : 1 der intensiv orange gefärbte
DFO-Eisen-III-Komplex Ferrioxamin (Hallaway et al., 1989, PNAS, 86, 10108). Die DFO-
gekoppelte Polyurethanmatrix wurde 2-3 Stunden mit 200 µM Eisensulfat (pH 5.0) unter
leichtem Rühren inkubiert, wobei es zu einer braunroten Färbung der Polyurethanmatrix
kam, die die Immobilisierung von DFO beweist. Abschließend wurde die Polyurethan
matrix mehrfach mit destilliertem Wasser gewaschen, um nichtgebundenes Eisen zu
entfernen. Nach dem Stehenlassen über Nacht kam es zu einer Farbintensivierung der
Muster. Eine Kontrolle mit nicht aktiviertem Polyurethan führte zu keiner Anfärbung mit
Eisensulfatlösung.
10 identische Polyurethanstücke wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und
danach in 20 ml Kopplungspuffer gelegt. Dazu gibt man 200 mg BSA (Serva, rezeptor
grade, lyophilisiert, 2,985 µmol).
Die Reaktion lief über 18 Stunden bei Raumtemperatur, wobei intensiv gerührt wurde.
Danach wurde die Pufferlösung abdekantiert, und die Polyurethanstücke wurden insge
samt dreimal gewaschen, um unspezifisch gebundenes Protein von der Polyurethan
matrix zu lösen, zuerst mit einer 0,1%igen wässrigen Polyoxyethylensorbitanmono
laurat-Lösung (Tween-20) von Fluka (Buchs), danach mit gesättigter NaCl-Lösung
(Merck, Darmstadt) und zuletzt mit destilliertem Wasser.
Als Nachweis des an Polyurethan immobilisierten BSA wurde eine Färbung mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Fluorescamin (Fluram®) von Fluka (Buchs) durchgeführt.
15 mg des Farbstoffs wurden in 10 ml trockenem Aceton aufgelöst. Zu einem BSA-
gekoppelten Polyurethanstück, das in 1 ml eines NaHCO3-Puffers (100 mM, pH = 8.0)
eingelegt war, wurden 250 µl der Fluorescaminlösung gegeben. Die Fluoreszenz wurde
mit einem Fluoreszenzmikroskop Fluovert FS (Leica, Bensheim) bei einer Anregungs
frequenz von 390 nm und einer Emissionsfrequenz von 475 nm beobachtet.
Der Farbstoff reagierte spezifisch mit primären Aminogruppen des Proteins (S. Uden
fried et. al., 1972, Science 178, 871), wobei die Hydrolyseprodukte und der Farbstoff
selbst nicht fluoreszierend waren. Die Zersetzung des Farbstoffes sowie die Bildung des
fluoreszierenden Produktes erfolgten in wässriger Lösung sehr schnell, so daß keine
Störungen durch Nebenreaktionen auftraten.
An die Polyurethanmatrix immobilisierte Proteine können mit Trinitrobenzolsulfonsäure
angefärbt werden (P. Cuatrecasas, C. B. Anfinsen, Affinity Chromatographie, Methods of
Enzymologie, 1971, 22, S. 363). Zu einem Polyurethanstück mit immobilisiertem BSA in
30 ml destilliertem Wasser wurden 500 µl einer 5%igen wässrigen TNBS-Lösung gege
ben. Die Lösung wurde unter Rühren eine Stunde auf dem Wasserbad erhitzt. Danach
wurde unspezifisch gebundener Farbstoff mit destilliertem Wasser von der Poly
urethanmatrix entfernt. Dieser Vorgang wurde solange wiederholt, bis das Wasch
wasser farblos blieb. Es konnte gezeigt werden, daß die mit Enzym gekoppelte Poly
urethanmatrix im Vergleich zu einer unbehandelten Polyurethanmatrix eine orange Fär
bung der Polyurethanmatrix aufwies.
Als Enzym wurde Hefe-SOD, Dismutin® BT, (Pentapharm, Basel) eingesetzt. Vor dem
Einsatz in die Kopplungsreaktion mit der aktivierten Polyurethanmatrix wurde die SOD-
Lösung umgepuffert, um Stabilisatoren wie zum Beispiel Parabene abzutrennen. Dazu
wurden 2 ml der SOD-Lösung in einen Mikrokonzentrator (Amincon, Witten) mit einem
Ausschlußvolumen von 10 kDa pipettiert. Dann wurde in einer Zentrifuge (Hettich,
Modell EBA 35, Tuttlingen) bei einer Drehzahl von 3000 rpm 30 Minuten zentrifugiert.
Das Filtrat wurde verworfen und der Überstand mit 1 ml des Kopplungspuffers oder
Wasser aufgefüllt. Dieser Vorgang wurde 3 mal wiederholt, und anschließend wurde die
SOD-Lösung in einer Konzentration von 1,5 mg/ml (1 : 10-Verdünnung) für die Kopplung
mit dem aktivierten Polyurethan eingesetzt.
Die Kopplungsreaktion wurde mit 10 identischen Polyurethanstücken durchgeführt,
wobei die Aktivierungsreaktionen aus den Beispielen 1 angewandt wurden. Kopplungs
bedingungen und Aufarbeitung der Produkte sind identisch wie in Beispiel 5 für die
Kopplung von BSA an eine Polyurethanmatrix beschrieben.
Der Nachweis der Kopplung der Hefe-SOD an die Polyurethan-Matrix wurde mit einem
ELISA geführt. Zunächst wurde die mit SOD-immobilisierte PU-Gelmatrix mit einem
humanen Anti-(Cu/Zn)-Superoxiddismutase-Antikörper aus Schaf (Calbiochem, Nr.
574597) in einer Verdünnung von 1 : 500 bei Raumtemperatur für eine Stunde in einer
24-Well-Zellkulturplatte (Greiner, Frickenhausen) inkubiert. An diesen primären anti-
(Cu/Zn)-SOD-Antikörper band ein sekundärer Antikörper, der mit einer Peroxidase kon
jugiert ist. Das Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) wurde durch die Peroxidase umge
setzt, woraus eine Farbreaktion resultierte, die spektroskopisch quantifiziert werden
kann. Nach dem Abstoppen der Farbreaktion wurden je 150 µl der Lösungen in ein Well
einer 96-Well-Mikrotiterplatte transferiert und mit einem ELISA-Reader MR 5000
(Dynex, Denkendorf) photometrisch bei 450 nm bestimmt bei einer Referenz von 550
nm.
Für die Positivkontrolle wurde eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit Rundboden (Greiner,
Frickenhausen) mit 20 µg/ml Hefe-SOD Dismutin® BT (Pentapharm, Basel) in je 1 ml
Puffer (50 mM NaHCO3, pH 9.4) pro Well beschichtet und über Nacht im Kühlschrank
bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden mit je 1 ml pro Well an 20%igem Schweine-
Serum (Gibco, Karlsruhe) für eine Stunde auf dem Schüttler bei Raumtemperatur die
unspezifischen Bindungen blockiert. Nach 4 mal Waschen mit PBS-Puffer (135 mM
NaCl, 3 mM KCl, 8 mM KH2PO4, 1,5 mM Na2HPO4, pH 7.5) mit 0,01% Tween-20 (Merck,
Darmstadt) wurde der primäre Anti-(Cu/Zn)-Superoxiddismutase-Antikörper aus Schaf in
einer Verdünnung von 1 : 500 in Verdünnungspuffer (0,5% Tween-20, 2% Schweine-
Serum in PBS-Puffer) mit je 1 ml pro Well für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem
Schüttler inkubiert. Danach wurde wiederum 4 mal mit Waschpuffer gewaschen und
Peroxidase-konjugiertes Anti-Schaf IgG (Dianova, Nr. 713-035-147) als sekundärer
Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 10.000 je 1 ml pro Well eine Stunde bei Raum
temperatur auf dem Schüttler inkubiert. Nach weiterem 4-maligem Waschen mit Wasch
puffer wurde die TMB-Substratlösung durch Auflösen von (10 mg/mL DMSO) und
anschließender Zugabe von 70 µl TMB-Stammlösung zu 10 ml Acetatpuffer hergestellt.
Pro Well wurden 1 ml der TMB-Lösung zugegeben und mit 13 µl H2O2 (3%) gestartet
und für 20 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Nach 20 min wurde die
entstehende Farbreaktion durch Zugabe von 140 µl pro Well 2 M H2SO4 abgestoppt und
mit einem ELISA-Reader MR 5000 photometrisch bei 450 nm bestimmt bei einer Refe
renz von 550 nm.
Polyurethanstücke, vorbehandelt mit einem 6-Aminohexansäure-Spacer oder 1,6-
Diaminohexan-Spacer, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden in 20 ml destilliertem
Wasser (pH-Wert mit 0,02 M Salzsäure auf 4, 5 eingestellt) eingelegt. Unter leichtem
Rühren wurden dazu 500 mg (2,61 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl
carbodiimid-hydrochlorid (EDC) zugesetzt und nach 1 Minute 10 ml einer SOD-Lösung
(1,5 mg/ml) hinzugegeben. Die Kopplungsreaktion der Hefe-SOD an die
Polyurethanmatrix lief für 18 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Bei
Aufarbeitung und Reinigung des Polymers wurde wie unter Kopplung von bovinem
Serumalbumin (BSA) an eine aktivierte Polyurethanmatrix (Beispiel 5) beschrieben,
verfahren. Als Nachweis der Kopplungsreaktion wurde ein ELISA durchgeführt (siehe
Beispiel 6).
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten
Biomolekülen, wobei die Polyurethanmatrix in einem Lösungsmittelgemisch vor
gelegt wird, wobei das Lösungsmittelgemisch zumindest zu 80% unpolare
Lösungsmittel enthält, in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach
quillt und in dem sich das Aktivierungsreagenz befindet, so daß die anschließen
de Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Poly
urethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyurethanmatrix ein
Polyurethangel oder ein daraus hergestellter Polyurethanschaum oder eine daraus
hergestellte Polyurethan-Folie ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel
gemisch aus ungefähr 80% bis 95% der unpolaren Lösungsmittel und aus ungefähr
20% bis 5% der polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel besteht, ins
besondere aus 90% der unpolaren Lösungsmittel und 10% der polaren bis leicht
polaren organischen Lösungsmittel, wobei die polaren bis leicht polaren organischen
Lösungsmittel insbesondere gewählt sind aus der Gruppe Aceton, Ether, Ketone,
Ester, Amide.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das unpolare Lösungs
mittel Hexan, Heptan und/oder Petrolether ist.
5. Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten
Biomolekülen, wobei die Polyurethanmatrix in Wasser als Lösungsmittel vorgelegt
wird, in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem
sich das Aktivierungsreagenz Thiocarbonyldiimidazol befindet, so daß die
anschließende Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der
Polyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß das Biomolekül aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Chelatoren, Enzy
minhibitoren, Enzymen, Peptiden und anderen Proteinen ausgewählt ist.
7. Verwendung der nach einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellten Poly
urethanmatrix zur Herstellung von Wundauflagen.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß das in der Polyurethanmatrix kovalent gebundene Biomolekül mit in Wundexsu
dat vorhandenen Störfaktoren, die den Wundheilungsprozeß behindern, wechsel
wirkt, wobei die Störfaktoren aus der Gruppe bestehend aus suspendierten Zellen
und Zellfragmenten sowie gelösten Bestandteilen wie Antigene, Radikale, Ionen,
Proteine, Peptide, Lipide und freie Fettsäuren ausgewählt sind, wobei die Wechsel
wirkung ein Binden, Komplexieren, Chelatisieren des Störfaktors oder eine chemi
sche Reaktion mit dem Störfaktor umfaßt und wobei die Substanzen kovalent an ein
Trägermaterial gebunden sind.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß die Wundauflage aus der Gruppe bestehend aus Verbänden, Verbandmull,
Binden, Kompressen, Watten, Pflastern, Folien, Filmen, Hydrokolloidverbänden,
Gelen und dergleichen ausgewählt ist.
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