DE19920262A1 - Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen, wobei die Polyurethanmatrix in einem Lösungsmittelgemisch vorgelegt wird, wobei das Lösungsmittelgemisch zumindest zu 80% unpolare Lösungsmittel enthält, in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Aktivierungsreagenz befindet, so daß die anschließende Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Polyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polyurethan-Wundauflagen, an die wundheilungsrelevante Biomoleküle wie zum Beispiel Superoxid-Dismutase immobilisiert sind, mit denen es möglich ist, den normalen Heilungsprozeß einzuleiten beziehungsweise zu fördern. Durch eine temporäre und lokal begrenzte Applikation der wundheilungsfördernden Enzyme werden fehlende oder nicht ausreichend vor­ handene Faktoren ausgeglichen und ergänzt.

Die Aktivierung der funktionellen Gruppen zur kovalenten Kopplung von Proteinen, Anti­ körpern und Enzymen oder niedermolekularen organischen Substanzen über Amino­ gruppen sind in Standardwerken wie zum Beispiel W. H. Scouten, Immobilized Enzymes and Cells, in Methods Enzymol., Ed. K. Mosbach, 1987; 135 : 30 und in Immobilization of Enzymes and Cells, 1997; Ed. G. F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey; H. A. Staab, H. Bauer, K. M. Schneider in Azolides in Organic Synthesis and Biochemi­ stry, Wiley-VCH, 1998 ausführlich beschrieben. Als funktionelle Aminogruppen bei Pro­ teinen, Antikörpern und Enzymen können die α-Aminogruppen des Aminoterminus und die ω-Aminogruppen der oberflächenexponierten Aminosäureseitenketten von Lysin und Arginin fungieren. Zur Aktivierung können aber auch andere Reagenzien wie beispiels­ weise Carbonylditriazol (CDT) (vergleiche C. Delgado et al. 1992, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249) verwendet werden.

Entsprechende Kopplungsverfahren sind als Stand der Technik bekannt und werden zum Beispiel bei der Herstellung von Stoffen für präparative und analytische Anwen­ dungen eingesetzt. So ist beispielsweise in der EP 0 087 786 ein Verfahren zur Immobi­ lisierung des Eisen-Chelators Desferrioxamin über Bindung der primären Aminogruppe beschrieben, wobei DFO an Agarose-Polyaldehyd-Gelperlen gebunden wird.

Die kovalente Modifizierung von SOD (P. Pyatak et al., 1980, Res. Com. Chem. Path. and Pharmacol., 29, 115), Katalase (A. Abukovski et al., 1976, J. Biol. Chem., 252, 3582) und anderen Enzymen (M. L. Nucci et al., 1991, Advanced Drug Delivery Reviews, 6, 133) mit Polyethylenglykol durch Kopplung von aktiviertem Polyethylengly­ kol an Aminogruppen der Enzyme ist offenbart.

Hirano et al. (1994, J. Controlled Release, 28, 203) beschreibt die Herstellung von SOD- Polymerkonjugaten mit aktiviertem Divinylether und Maleionsäureanhydrid. Fortier beschreibt in der WO 95/15352 die kovalente Einbindung von Peroxidase und Katalase über Aminogruppen in ein Polymergel bestehend aus dem Protein BSA und voraktivier­ tem Polyethylenglykol. Maneke und Polakowski (1981, J. Chrom, 215, 13) beschreiben die Immobilisierung von α-Chymotrypsin an eine Polymermatrix aus Polyvinylalkohol und Terephthalaldehyd.

In der WO 98/02189 wird eine Methode zur Kopplung von wundheilungsrelevanten Enzymen oder Proteinen an Polyhydroxypolymere wie beispielsweise Cellulose beschrieben. Dabei wird das Aufquellen eines Polyhydroxypolymers in organischen Lösungsmitteln beansprucht.

Polyurethangele zählen ebenfalls zu den Polyhydroxyverbindungen, haben aber bei­ spielsweise gegenüber Cellulose den Nachteil, daß sie unter den bekannten Bedingun­ gen zur Aktivierung der Hydroxygruppen stark quellen.

In WO 96/31551 werden im trockenen Zustand Proteine oder Peptide als aktive Agen­ tien zu Polyurethan-vernetzten Microgelen gemischt. Die Microgele quellen im wäßrigen Medium zu Hydrogelen auf und setzen aus der Hydrogelmatrix das Protein beziehungs­ weise das Peptid wieder frei. Auch US 5,000,955 beschreibt Polyurethan-Hydrogele für kosmetische, biologische und medizinische Anwendungen. Kubische Phasen bestehend aus Glycerylmonooleat können Enzyme durch nicht-kovalente Bindungen, wie in WO 96/39125 berichtet, immobilisieren. Dabei bleibt durch die Immobilisierung die enzymati­ sche Aktivität erhalten und ist sogar, im Vergleich zu gelöstem Enzym, über einen länge­ ren Zeitraum erhöht.

DE 40 26 153 beschreibt die Herstellung eines Polyurethan-Kunststoffschaums, in des­ sen Poren ein Hydrogel eingelagert ist. An das aus Polysacchariden bestehende Hydro­ gel werden proteolytisch wirkende Enzyme wie zum Beispiel Trypsin, Gelatinase, Chy­ motrypsin und Kollagenase über eine Aktivierungsreaktion mit CDI oder dem Kopplungs­ reagenz Bromcyan gebunden. EP 0 236 610 beschreibt die Einarbeitung (Inkapsulie­ rung) von oxidativ wirkenden Enzymen wie zum Beispiel Glucoseoxidase in ein Urethanpräpolymer. Das Enzym wird durch Kontakt mit Serum aktiviert und produziert oxidierend wirkende Substanzen wie Wasserstoffperoxid zur Bekämpfung von Bakterien in infizierten Wunden.

Nach DE 36 06 265 werden therapeutisch wirksame nicht-immobilisierte Enzyme zur Wundreinigung in eine Wundauflage auf Polysaccharidbasis eingearbeitet. Als Enzym­ träger werden Cellulose-Schwammstücke vorgeschlagen, die durch Tauchen und Trän­ ken in eine Enzymlösung hergestellt werden. Nach Kontakt des Enzymträgers mit der Wunde werden die nicht-immobilisierten proteolytisch wirkenden Enzyme in die Wunde abgegeben.

Ein proteolytischer Wundverband als Trockenpuder oder Streupulver in Form von sphärischen Teilchen von 0,05 bis 0,5 mm auf Basis von Polysacchariden wie Dextran, Chitin und Chitosan, an denen eine Protease gebunden ist, wird in DE 34 44 746 beschrieben. Zur Aktivierung der Polysaccharidmatrix wurden Glutaraldehyd, Bromcyan, 2-Amino-4.6-dichlor-s-triazin und Einführen von Isothiocyanatgruppen mit Thiophosgen eingesetzt.

Seit Menschengedenken ist die Heilung von therapieresistenten Wunden eine große Herausforderung für die Medizin und Naturwissenschaften. Die heutigen Anforderungen an die Funktion von interaktiven Wundauflagen für chronische Wunden gehen zurück auf G. Winter (1962, Nature 193, 293) und sind jüngst von T. D. Turner neu formuliert worden (1994, Wound Rep. Reg. 2, 202). Im Vordergrund steht dabei die Schaffung eines feuchten Wundheilungsmilieus, das im Gegensatz zur traditionellen trockenen Wundbehandlung mit zum Beispiel Mullkompressen den natürlichen Abläufen der Wundheilung physiologische und damit bessere Konditionen bietet.

Das Prinzip der feuchten Wundheilung kann derzeit als der Stand der Technik in der Therapie schwer oder nicht heilender Wunden angesehen werden. Die Wundauflage muß die Hauptmenge des Exsudates aufnehmen und gleichzeitig aber auf der Wunde selbst einen Flüssigkeitsfilm belassen, in dem die eigentliche feuchte Wund­ heilung stattfindet. Bei trockenen und schwachexsudierenden Wunden muß die Ver­ sorgung der Wunde mit ausreichend Feuchtigkeit erfolgen, um eine Rehydrierung des dehydrierten Gewebes zu erreichen. In der auf diese Weise etablierten feuchten Wunde kommt es dann zur Proliferation von neuen Blutgefäßen und vermindertem Bakterienwachstum unter Einstellung eines geeigneten pH-Wertes. Erfüllt werden diese Anforderungen von Strukturen, wie beispielsweise Hydrogelen, Alginaten und Superabsorber enthaltenden Wundauflagen, die einen Überschuß von Wundexsudat aufnehmen können.

Unter dem Begriff "Störfaktoren" werden allgemein Stoffe oder Substanzen verstan­ den, die den Heilungsprozeß von Wunden verhindern oder verlangsamen und damit zur Ausbildung von chronischen Wunden führen. Dabei sind im Wundexsudat vor­ handene suspendierte Zellen (zum Beispiel entzündliche Zellen wie Leukozyten und Makrophagen) und Zellfragmente oder gelöste Bestandteile wie Antigene, Radikale (wie zum Beispiel reaktive Sauerstoffspezies, ROS), Ionen (wie zum Beispiel Eisen­ ionen), Proteine und Peptide eingeschlossen.

In der entzündlichen Phase der Wundheilung, die der Blutgerinnung und Blutplättchen- Aggregation nach Verletzung und Trauma folgt, wandern bevorzugt Neutrophile und Monozyten in das geschädigte Gewebe ein. Dort beginnen sie mit der Phagozytose von Keimen und dem Abbau von zerstörtem Gewebe und fremden Antigenen. Durch chemi­ sche Botenstoffe und Mikroorganismen aktiviert und stimuliert, kommt es zu einer stark erhöhten Produktion von ROS, auch "oxidative burst" genannt. Diese ROS werden in Granula gespeichert und bei weiterer Stimulierung in hohen lokalen Konzentrationen in das extrazelluläre Gewebe zur Bekämpfung von Mikroorganismen freigegeben.

In der normal verlaufenden Wundheilung kommt es nach erfolgreicher Beseitigung der immunologischen Reize zur Beendigung der entzündlichen Phase, und der Wiederauf­ bau des Gewebes kann beginnen. Bleiben jedoch diese Reize bestehen, wandern wei­ tere Leukozyten in das Gewebe nach und werden wiederum aktiviert, was zu einer dau­ erhaft entzündeten oder chronischen Wunde führt. Die Ausschüttung von ROS (O. Senel et al., 1997, Annals of Plastic Surgery, 39, 516) und proteolytischen Enzymen führt zu einer Schädigung des Gewebes (Halliwell & Gutteridge, 1989, Free Radicals in Biology and Medicine, 2. Auflage, Clarendon Press, Oxford).

Es ist erforderlich, daß das an die Polyurethangele (PU-Gele) gebundene Enzym eine hohe Spezifität für das in der Wundflüssigkeit vorhandene Substrat besitzt. Durch diese selektive Entfernung beziehungsweise Eliminierung des Substrats wird der Heilungsprozeß chronischer, d. h. schwer oder nicht heilender Wunden verbes­ sert beziehungsweise eingeleitet.

Im Falle eines enzymdotierten PU-Gels, das aus den Enzymen SOD und/oder Kata­ lase oder aus einer Mischung der beiden Enzyme besteht, ist ein selektives Entfer­ nen von ROS aus der Wundflüssigkeit möglich.

Das Enzym SOD katalysiert die Dismutationsreaktion von reaktivem Superoxid in die weniger toxischen Zwischenstufen Wasserstoffperoxid und Sauerstoff. Es tritt als dimere oder tetramere Form auf. Die verschiedenen Enzyme mit Molekulargewichten von 32 000 bis 56 000 Da haben Metall-Ionen wie Kupfer und Zink (Cu-Zn-SOD), Mangan (Mn-SOD) oder Eisen (Fe-SOD) als Co-Faktoren im katalytischen Zentrum. Das ubiquitäre Enzym SOD spielt die Hauptrolle in der zellulären Verteidigung gegen die sauerstoffvermittelte Toxizität von ROS und bei der Regulierung der intrazellulä­ ren Sauerstoffkonzentration (Fridovich, 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 97). Das durch die Reaktion der SOD gebildete Wasserstoffperoxid wird anschließend durch das in aeroben Organismen ubiquitäre Redoxenzym Katalase in einem mehrstufigen katalytischen Zyklus in die nichttoxischen Moleküle Wasser und Sauerstoff umge­ wandelt (Gouet et al., 1996, Nature Structural Biology, 3, 951). Außer Katalase sind auch die Enzyme Gluthathion-Peroxidase und Myeloperoxidase befähigt, Wasser­ stoffperoxid abzubauen.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine wasserunlösliche, wasseraufnehmende Poly­ urethanmatrix nach einem neuen Verfahren zu fertigen, die für medizinische Zwecke einsetzbar sind und sich in besonderem Maße zur Förderung der Heilung von chroni­ schen Wunden eignen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man bei der Herstellung der Polyurethanmatrix Enzyme immobilisiert, die mit den in Wundflüssigkeiten von chro­ nischen Wunden vorhandenen ROS wechselwirken, d. h. mit Faktoren, die den Wundheilungsprozess behindern, wobei man diese zusätzlichen Substanzen kova­ lent an die PU-Matrix bindet.

Dementsprechend beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Poly­ urethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen, wobei die Polyurethan­ matrix in einem Lösungsmittelgemisch vorgelegt wird, wobei das Lösungsmittel­ gemisch zumindest zu 80% unpolare Lösungsmittel enthält (insbesondere zwischen 80% und 95%), in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Aktivierungsreagenz befindet, so daß die anschließende Immobilisie­ rung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Polyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet.

In einer ersten bevorzugten Ausführungsform ist die Polyurethanmatrix ein Polyurethan­ gel oder ein daraus hergestellter Polyurethanschaum oder eine daraus hergestellte Polyurethan-Folie.

Die im wesentlichen wasserfreien und zum Teil selbstklebenden PU-Gelmassen sind zum Beispiel bekannt aus DE 196 18 825, EP 0 057 839, EP 0 147 588 sowie DE 43 08 347. Die dort beschriebenen Gele setzen sich zusammen aus Polyhydroxyverbin­ dungen und aromatischen oder aliphatischen Polyisocyanaten. Bevorzugt wird ein Polyurethangel bestehend aus Levagel (Copolymer aus Propylenoxid und Ethylen­ oxid mit einem Molekulargewicht von ca. 6400 g/mol, Bayer, Leverkusen) und Hexa­ methylendiisocyanat mit einem NCO/OH-Verhältnis von 0,3 bis 0,7 verwendet. Da nicht alle OH-Funktionalitäten während der Vernetzungsreaktion abreagieren, stehen für die kovalente Kopplung an eine PU-Matrix zur Immobilisierung von Substanzen in der hier beschriebenen Art und Weise freie OH-Funktionalitäten zur Verfügung.

Für den Einsatz der erfindungsgemäßen Polyurethanprodukte als Wundauflage ist es von Vorteil, wenn die immobilisierten Substanzen direkt an der PU-Oberfläche ange­ bunden sind. Für die Aktivierungsreaktion sind Lösungsmittel erforderlich, die das Aktivierungsreagenz lösen. In Aceton, Dioxan, Diethylether, Dimethylglycol oder Dichlormethan sowie Alkoholen und in Mischungen der genannten Lösungsmittel quillt das Polyurethan so stark, daß es bereits bei geringen mechanischen Belastun­ gen zerreißt. Außerdem werden niedermolekulare Bestandteile des Polyurethangels aus der Gelmatrix herausgelöst. Dadurch gehen einerseits gerade die Bestandteile verloren, die über viele freie OH-Gruppen für die Aktivierung und Kopplung verfügen und andererseits werden die mechanischen Eigenschaften des Polyurethangels ver­ ändert. Des weiteren können bei einer starken Quellung der PU-Matrix die Substan­ zen zum Teil auch im Inneren der PU-Matrix immobilisiert werden und haben damit für die Anwendung keinen Nutzen.

Das Lösungsmittelgemisch besteht insbesondere aus ungefähr 80% bis 95% der unpo­ laren Lösungsmittel und aus ungefähr 20% bis 5% der polaren bis leicht polaren organi­ schen Lösungsmittel, insbesondere aus 90% der unpolaren Lösungsmittel und 10% der polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel.

Die polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel sind insbesondere gewählt aus der Gruppe Aceton, Ether, Ketone, Ester, Amide, beispielsweise Methyl-tert.butylketon, Dioxan, Diethylether, Dimethylglycol, Dichlormethan, Ethylacetat, Dimethylformamid.

Als unpolare Lösungsmittel kommen vorzugsweise Hexan, Heptan und/oder Petrolether (zum Beispiel Petrolether 35/60) zum Einsatz.

In unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan, Heptan oder Petrolether findet kaum eine Quellung der Polyurethanmatrix statt. In diesen Lösungsmitteln sind die Aktivierungs­ reagenzien, wie zum Beispiel CDI oder CDT nahezu unlöslich. Bei der Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus 80% bis 95% der unpolaren Lösungsmittel, wie Hexan, Heptan oder Petrolether, und 20% bis 5% der polaren bis leicht polaren organi­ schen Lösungsmittel werden die Quellung und damit die genannten Nachteile stark unterdrückt, und es kann sich dennoch genug Aktivierungsreagenz lösen.

In Wasser zeigt das Polyurethangel ebenfalls eine nur geringe Quellneigung, wobei die generelle Verwendung von Wasser als Lösungsmittel für die Aktivierung jedoch deshalb ausscheidet, weil sich CDI und CDT in Wasser zersetzen. Zur Lösung diese Problems kann als Alternative das Aktivierungsreagenz Thiocarbonyldiimidazol (TCDI) eingesetzt werden.

In dieser alternativen Lösungsmöglichkeit wird ein Verfahren zur Herstellung einer Poly­ urethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen beansprucht, wobei die Poly­ urethanmatrix in Wasser als Lösungsmittel für das TCDI (ca. 1 Gew.-%) vorgelegt wird, in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Akti­ vierungsreagenz befindet, so daß die anschließende Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Polyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schich­ ten stattfindet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante ist das Biomolekül aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Chelatoren, Enzyminhibitoren, Enzymen, Peptiden und anderen Proteinen ausgewählt.

Besonders vorteilhaft läßt sich die erfindungsgemäß hergestellte Polyurethanmatrix zur Herstellung von Wundauflagen einsetzen.

Das an die Polyurethanmatrix kovalent gebundene Biomolekül sollte mit in Wundexsu­ dat vorhandenen Störfaktoren, die den Wundheilungsprozeß behindern, wechselwirken, wobei die Störfaktoren aus der Gruppe bestehend aus suspendierten Zellen und Zell­ fragmenten sowie gelösten Bestandteilen wie Antigene, Radikale, Ionen, Proteine, Pep­ tide, Lipide und freie Fettsäuren ausgewählt sind, wobei die Wechselwirkung ein Bin­ den, Komplexieren, Chelatisieren des Störfaktors oder eine chemische Reaktion mit dem Störfaktor umfaßt und wobei die Substanzen kovalent an ein Trägermaterial gebunden sind.

Beispielsweise ist es möglich, mit den enzymimmobilisierten Polyurethangelen toxi­ sche ROS in der Wundflüssigkeit von chronischen Wunden unschädlich zu machen.

Die Wundauflage ist besonders aus der Gruppe bestehend aus Verbänden, Verband­ mull, Binden, Kompressen, Watten, Pflastern, Folien, Filmen, Hydrokolloidverbänden, Gelen und dergleichen ausgewählt.

Schließlich sollte die Wundauflage in der Lage sein, Feuchtigkeit aufzunehmen.

Vorzugsweise sind die Störfaktoren Eisenionen und die mit den Störfaktoren wechsel­ wirkende Substanz ein Chelator, wobei dieser nun wieder insbesondere aus der Gruppe von immobilisierbaren Komplexbildnern wie zum Beispiel Desferrioxamin ausgewählt ist.

Weiter vorzugsweise sind die Störfaktoren reaktive Sauerstoffradikale und die mit den Störfaktoren wechselwirkende Substanz ein Radikalfänger, wobei dieser insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Superoxiddismutase, Katalase, Gluthathion-Peroxidase, Myeloperoxdase und Enzym-Mimics oder einer anderen Kombination davon ausgewählt ist.

Weiter vorzugsweise sind der Störfaktor eine Protease und die mit dem Störfaktor wechselwirkende Substanz ein Protease-Inhibitor, wobei dieser insbesondere aus der Gruppe bestehend aus natürlichen proteinogenen Protease-Inhibitoren aus der Klasse der tissue Inhibitors of Matrixmetalloproteinases wie zum Beispiel Alpha-2-Antiplasmin, Alpha-2-Makroglobulin, Alpha-1-Antichymotrypsin, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Alpha-1-Protease-Inhibitor ausgewählt ist.

Dann können die Störfaktoren Eisenionen sein und die mit den Störfaktoren wechselwir­ kende Substanz Desferrioxamin, alternativ reaktive Sauerstoffradikale und die mit den Stärfaktoren wechselwirkende Substanz ein Radikalfänger, wobei der Radikalfänger aus der Gruppe bestehend aus Superoxiddismutase, Katalase, Gluthathion-Peroxidase, Myeloperoxidase und Enzym-Mimics oder einer Kombination davon ausgewählt ist.

Weiterhin kann der Störfaktor eine Protease sein und die mit dem Störfaktor wech­ selwirkende Substanz ein Protease-Inhibitor, wobei der Protease-Inhibitor aus der Gruppe bestehend aus natürlichen proteinogenen Protease-Inhibitoren aus der Klasse der Tissue Inhibitors of Matrixmetalloproteinases, Aprotinin, Alpha-2-Antiplas­ min. Alpha-2-Makroglobulin, Alpha-1-Antichymotrypsin, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Alpha-1-Protease-Inhibitor ausgewählt ist.

Weiterhin wird erfindungsgemäß beschrieben, daß eine Kopplung auch über Spacer­ moleküle, das sind α,ω-difunktionelle Substanzen, wie beispielsweise 1,6-Diaminohexan oder 6-Aminohexancarbonsäure, an eine PU-Matrix möglich ist.

Durch die vorliegende Erfindung werden erstmals nach einem neuartigen Verfahren hergestellte PU-Gelmatrices als Wundauflage zur Verbesserung des Heilungsverlaufs von chronischen Wunden zur Verfügung gestellt.

Die aktiven Biomoleküle werden beim Entfernen der PU-Matrix ebenfalls mit entfernt, ohne daß sie in der Wunde beziehungsweise in der Wundflüssigkeit verbleiben. Die zur Wechselwirkung verwendeten, kovalent in die PU-Matrix eingebundenen Bio­ moleküle werden somit nur vorübergehend in die Wunde eingebracht und werden, nachdem sie ihre bestimmungsgemäße Aufgabe verrichtet haben (d. h., die oben genannten Wechselwirkungen eingegangen sind), wieder aus dem Wundbereich entfernt. Durch die selektive Beseitigung beziehungsweise Eliminierung der toxischen ROS, das proteolytische Auflösen von totem Gewebe und das Abtöten von Mikro­ organismen wird der Heilungsprozeß chronischer, d. h. schwer oder nicht heilender Wunden verbessert beziehungsweise eingeleitet.

In der chronischen Wunde findet man eine deutlich erhöhte Proteaseaktivität (Weck­ roth et al., 1996, J. Invest. Dermatol., 106, 1119; Grinell & Zhu, 1996, J. Invest. Der­ matol. 106, 335) im Vergleich zur akuten Wunde. Enzyme wie zum Beispiel SOD und Katalase, die durch ihre schützende Wirkung wundheilungsfördernd wirken, würden dadurch proteolytisch abgebaut und somit unwirksam. Ein Polyurethangel, an das solche Enzyme kovalent gebunden sind, wirkt als Schutzschild und kann den Angriff von Proteasen verhindern, wie mit Polyethylenglykol modifizierten gelösten Enzymen gezeigt wurde (J. S. Beckman et al., 1988, J. Biol. Chem., 14, 6884; Y. Inada et al., 1995, Tibtech, 13, 86).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es somit nicht nur, möglichst ein feuchtes Wundmilieu zu generieren, um den Heilungsprozeß chronischer Wunden zu verbes­ sern, sondern der Heilungsprozeß kann auch erfindungsgemäß dadurch weiter beschleunigt werden, zum Beispiel durch die oben genannten Umwandlungspro­ zesse.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert, ohne diese damit unnötig einschränken zu wollen.

Beispiele

Für die folgenden Beispiele wurden Polyurethangele eingesetzt, die aus einer Polyol­ komponente (Levagel, Bayer, Leverkusen) und einer Diisocyanatkomponente wie beispielsweise Hexamethylendiisocyanat (Bayer, Leverkusen) mit einem NCO/OH- Verhältnis von 0,3 bis 0,7 bestanden.

Beispiel 1 Herstellung einer mit N,N'-Carbonyldiimidazol (CDI) oder N,N'-Carbonylditriazol (CDT) aktivierten Polyurethanmatrix

Die Experimente zur Herstellung einer CDI-aktivierten beziehungsweise CDT-aktivierten Polyurethanmatrix wurden wie folgt durchgeführt.

10 identische Polyurethanstücke (1,2 mm Dicke, 15 mm Durchmesser, 275 mg/Stück) wurden in einem Gemisch aus 90 ml trockenem Hexan (oder Petrolether 35160) und 10 ml trockenem Aceton mit 1 g (6,25 mmol) CDI (Sigma, Steinheim) oder 1 g (6,1 mmol) CDT (Sigma, Steinheim) aktiviert.

In beiden Fällen lief die Reaktion in einem 250-ml-Rundkolben eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluß und mäßigem Rühren. Danach wurde das Lösungsmittel abdekantiert und die CDI-aktivierten beziehungsweise CDT-aktivier­ ten Polyurethanstücke auf silikonisiertem Trennpapier an der Luft bis zur Gewichtskon­ stanz getrocknet.

Beispiel 2 Herstellung einer mit Thiocarbonyldiimidazol (TCDI) aktivierten Polyurethanmatrix

Es wurden 10 identische Polyurethanstücke, wie in Beispiel 1 beschrieben, in 100 ml dest. Wasser mit 1 g Thiocarbonyldiimidazol (TCDI, Fluka, 5,6 mmol) aktiviert.

Die Reaktion lief zwei Stunden bei 32°C und mäßigem Rühren in einem 250-ml-Rund­ kolben.

Danach wurde das Wasser abdekantiert, und die PU-Stücke wurden, nach dreimaligem Waschen mit destilliertem Wasser, auf silikonisiertem Trennpapier getrocknet.

Beispiel 3 Kopplung der Spacermoleküle 6-Aminohexansäure oder 1,6-Diaminohexan an eine Polyurethanmatrix

10 identische Polyurethanstücke wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und anschließend in 20 ml NaHCO₃-Puffer (100 mM, pH 8.0), im weiteren als Kopplungs­ puffer bezeichnet, gelegt. Dazu wurden entweder 500 mg (3,81 mmol) 6-Aminohexan­ säure analytical grade (Serva, Heidelberg) oder 500 mg (4,3 mmol) 1,6-Diaminohexan (Fluka, Buchs) gegeben.

Die Reaktion lief über 18 Stunden bei Raumtemperatur, wobei intensiv gerührt wurde. Danach wurde die Pufferlösung abgegossen. Die Polyurethanstücke wurden dann ins­ gesamt je dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, um Reste der nicht gekoppelten 6-Aminohexansäure oder des 1,6-Diaminohexans zu entfernen. Anschließend wurden die mit 6-Aminocarbonsäure beziehungsweise 1,6-Diaminohexan gekoppelten Poly­ urethanstücke an der Luft bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Beispiel 4 Kopplung von Desferoxamin (DFO) an eine aktivierte Polyurethanmatrix

10 identische Polyurethanstücke, die wie in den Beispielen 1 oder 2 angegeben, aktiviert wurden, wurden in 20 ml Kopplungspuffer gelegt. Anschließend wurden je 200 mg DFO (0,30 mmol) (Sigma, Deisenhofen) zugegeben. Die Kopplungsreaktion lief unter intensi­ vem Rühren über 18 Stunden bei Raumtemperatur ab. Danach wurde die Pufferlösung abgegossen und mehrfach durch destilliertes Wasser ersetzt, um unspezifisch gebun­ denes DFO aus dem Polymer herauszuwaschen.

Der Nachweis des Kopplungsproduktes aus Polyurethan und DFO erfolgte mit einer Farbreaktion, die zugleich einen Funktionalitäts-Assay darstellt: Durch Komplexbildung von Eisen mit gelöstem DFO entsteht im Verhältnis 1 : 1 der intensiv orange gefärbte DFO-Eisen-III-Komplex Ferrioxamin (Hallaway et al., 1989, PNAS, 86, 10108). Die DFO- gekoppelte Polyurethanmatrix wurde 2-3 Stunden mit 200 µM Eisensulfat (pH 5.0) unter leichtem Rühren inkubiert, wobei es zu einer braunroten Färbung der Polyurethanmatrix kam, die die Immobilisierung von DFO beweist. Abschließend wurde die Polyurethan­ matrix mehrfach mit destilliertem Wasser gewaschen, um nichtgebundenes Eisen zu entfernen. Nach dem Stehenlassen über Nacht kam es zu einer Farbintensivierung der Muster. Eine Kontrolle mit nicht aktiviertem Polyurethan führte zu keiner Anfärbung mit Eisensulfatlösung.

Beispiel 5 Kopplung von bovinem Serumalbumin (BSA) an eine aktivierte Polyurethanmatrix

10 identische Polyurethanstücke wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und danach in 20 ml Kopplungspuffer gelegt. Dazu gibt man 200 mg BSA (Serva, rezeptor grade, lyophilisiert, 2,985 µmol).

Die Reaktion lief über 18 Stunden bei Raumtemperatur, wobei intensiv gerührt wurde. Danach wurde die Pufferlösung abdekantiert, und die Polyurethanstücke wurden insge­ samt dreimal gewaschen, um unspezifisch gebundenes Protein von der Polyurethan­ matrix zu lösen, zuerst mit einer 0,1%igen wässrigen Polyoxyethylensorbitanmono­ laurat-Lösung (Tween-20) von Fluka (Buchs), danach mit gesättigter NaCl-Lösung (Merck, Darmstadt) und zuletzt mit destilliertem Wasser.

Als Nachweis des an Polyurethan immobilisierten BSA wurde eine Färbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluorescamin (Fluram®) von Fluka (Buchs) durchgeführt.

15 mg des Farbstoffs wurden in 10 ml trockenem Aceton aufgelöst. Zu einem BSA- gekoppelten Polyurethanstück, das in 1 ml eines NaHCO₃-Puffers (100 mM, pH = 8.0) eingelegt war, wurden 250 µl der Fluorescaminlösung gegeben. Die Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop Fluovert FS (Leica, Bensheim) bei einer Anregungs­ frequenz von 390 nm und einer Emissionsfrequenz von 475 nm beobachtet.

Der Farbstoff reagierte spezifisch mit primären Aminogruppen des Proteins (S. Uden­ fried et. al., 1972, Science 178, 871), wobei die Hydrolyseprodukte und der Farbstoff selbst nicht fluoreszierend waren. Die Zersetzung des Farbstoffes sowie die Bildung des fluoreszierenden Produktes erfolgten in wässriger Lösung sehr schnell, so daß keine Störungen durch Nebenreaktionen auftraten.

An die Polyurethanmatrix immobilisierte Proteine können mit Trinitrobenzolsulfonsäure angefärbt werden (P. Cuatrecasas, C. B. Anfinsen, Affinity Chromatographie, Methods of Enzymologie, 1971, 22, S. 363). Zu einem Polyurethanstück mit immobilisiertem BSA in 30 ml destilliertem Wasser wurden 500 µl einer 5%igen wässrigen TNBS-Lösung gege­ ben. Die Lösung wurde unter Rühren eine Stunde auf dem Wasserbad erhitzt. Danach wurde unspezifisch gebundener Farbstoff mit destilliertem Wasser von der Poly­ urethanmatrix entfernt. Dieser Vorgang wurde solange wiederholt, bis das Wasch­ wasser farblos blieb. Es konnte gezeigt werden, daß die mit Enzym gekoppelte Poly­ urethanmatrix im Vergleich zu einer unbehandelten Polyurethanmatrix eine orange Fär­ bung der Polyurethanmatrix aufwies.

Beispiel 6 Kopplung von Superoxiddismutase (SOD) an eine aktivierte Polyurethanmatrix

Als Enzym wurde Hefe-SOD, Dismutin® BT, (Pentapharm, Basel) eingesetzt. Vor dem Einsatz in die Kopplungsreaktion mit der aktivierten Polyurethanmatrix wurde die SOD- Lösung umgepuffert, um Stabilisatoren wie zum Beispiel Parabene abzutrennen. Dazu wurden 2 ml der SOD-Lösung in einen Mikrokonzentrator (Amincon, Witten) mit einem Ausschlußvolumen von 10 kDa pipettiert. Dann wurde in einer Zentrifuge (Hettich, Modell EBA 35, Tuttlingen) bei einer Drehzahl von 3000 rpm 30 Minuten zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen und der Überstand mit 1 ml des Kopplungspuffers oder Wasser aufgefüllt. Dieser Vorgang wurde 3 mal wiederholt, und anschließend wurde die SOD-Lösung in einer Konzentration von 1,5 mg/ml (1 : 10-Verdünnung) für die Kopplung mit dem aktivierten Polyurethan eingesetzt.

Die Kopplungsreaktion wurde mit 10 identischen Polyurethanstücken durchgeführt, wobei die Aktivierungsreaktionen aus den Beispielen 1 angewandt wurden. Kopplungs­ bedingungen und Aufarbeitung der Produkte sind identisch wie in Beispiel 5 für die Kopplung von BSA an eine Polyurethanmatrix beschrieben.

Der Nachweis der Kopplung der Hefe-SOD an die Polyurethan-Matrix wurde mit einem ELISA geführt. Zunächst wurde die mit SOD-immobilisierte PU-Gelmatrix mit einem humanen Anti-(Cu/Zn)-Superoxiddismutase-Antikörper aus Schaf (Calbiochem, Nr. 574597) in einer Verdünnung von 1 : 500 bei Raumtemperatur für eine Stunde in einer 24-Well-Zellkulturplatte (Greiner, Frickenhausen) inkubiert. An diesen primären anti- (Cu/Zn)-SOD-Antikörper band ein sekundärer Antikörper, der mit einer Peroxidase kon­ jugiert ist. Das Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) wurde durch die Peroxidase umge­ setzt, woraus eine Farbreaktion resultierte, die spektroskopisch quantifiziert werden kann. Nach dem Abstoppen der Farbreaktion wurden je 150 µl der Lösungen in ein Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte transferiert und mit einem ELISA-Reader MR 5000 (Dynex, Denkendorf) photometrisch bei 450 nm bestimmt bei einer Referenz von 550 nm.

Für die Positivkontrolle wurde eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit Rundboden (Greiner, Frickenhausen) mit 20 µg/ml Hefe-SOD Dismutin® BT (Pentapharm, Basel) in je 1 ml Puffer (50 mM NaHCO₃, pH 9.4) pro Well beschichtet und über Nacht im Kühlschrank bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden mit je 1 ml pro Well an 20%igem Schweine- Serum (Gibco, Karlsruhe) für eine Stunde auf dem Schüttler bei Raumtemperatur die unspezifischen Bindungen blockiert. Nach 4 mal Waschen mit PBS-Puffer (135 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM KH₂PO4, 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7.5) mit 0,01% Tween-20 (Merck, Darmstadt) wurde der primäre Anti-(Cu/Zn)-Superoxiddismutase-Antikörper aus Schaf in einer Verdünnung von 1 : 500 in Verdünnungspuffer (0,5% Tween-20, 2% Schweine- Serum in PBS-Puffer) mit je 1 ml pro Well für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Danach wurde wiederum 4 mal mit Waschpuffer gewaschen und Peroxidase-konjugiertes Anti-Schaf IgG (Dianova, Nr. 713-035-147) als sekundärer Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 10.000 je 1 ml pro Well eine Stunde bei Raum­ temperatur auf dem Schüttler inkubiert. Nach weiterem 4-maligem Waschen mit Wasch­ puffer wurde die TMB-Substratlösung durch Auflösen von (10 mg/mL DMSO) und anschließender Zugabe von 70 µl TMB-Stammlösung zu 10 ml Acetatpuffer hergestellt. Pro Well wurden 1 ml der TMB-Lösung zugegeben und mit 13 µl H₂O₂ (3%) gestartet und für 20 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Nach 20 min wurde die entstehende Farbreaktion durch Zugabe von 140 µl pro Well 2 M H₂SO₄ abgestoppt und mit einem ELISA-Reader MR 5000 photometrisch bei 450 nm bestimmt bei einer Refe­ renz von 550 nm.

Beispiel 7 Kopplung von Hefe-SOD an eine Polyurethanmatrix über die Spacer 6-Aminohexansäure und 1,6-Diaminohexan

Polyurethanstücke, vorbehandelt mit einem 6-Aminohexansäure-Spacer oder 1,6- Diaminohexan-Spacer, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden in 20 ml destilliertem Wasser (pH-Wert mit 0,02 M Salzsäure auf 4, 5 eingestellt) eingelegt. Unter leichtem Rühren wurden dazu 500 mg (2,61 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl­ carbodiimid-hydrochlorid (EDC) zugesetzt und nach 1 Minute 10 ml einer SOD-Lösung (1,5 mg/ml) hinzugegeben. Die Kopplungsreaktion der Hefe-SOD an die Polyurethanmatrix lief für 18 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Bei Aufarbeitung und Reinigung des Polymers wurde wie unter Kopplung von bovinem Serumalbumin (BSA) an eine aktivierte Polyurethanmatrix (Beispiel 5) beschrieben, verfahren. Als Nachweis der Kopplungsreaktion wurde ein ELISA durchgeführt (siehe Beispiel 6).

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen, wobei die Polyurethanmatrix in einem Lösungsmittelgemisch vor­ gelegt wird, wobei das Lösungsmittelgemisch zumindest zu 80% unpolare Lösungsmittel enthält, in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Aktivierungsreagenz befindet, so daß die anschließen­ de Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Poly­ urethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyurethanmatrix ein Polyurethangel oder ein daraus hergestellter Polyurethanschaum oder eine daraus hergestellte Polyurethan-Folie ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel­ gemisch aus ungefähr 80% bis 95% der unpolaren Lösungsmittel und aus ungefähr 20% bis 5% der polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel besteht, ins­ besondere aus 90% der unpolaren Lösungsmittel und 10% der polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel, wobei die polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel insbesondere gewählt sind aus der Gruppe Aceton, Ether, Ketone, Ester, Amide.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das unpolare Lösungs­ mittel Hexan, Heptan und/oder Petrolether ist.

5. Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen, wobei die Polyurethanmatrix in Wasser als Lösungsmittel vorgelegt wird, in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Aktivierungsreagenz Thiocarbonyldiimidazol befindet, so daß die anschließende Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Polyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Chelatoren, Enzy­ minhibitoren, Enzymen, Peptiden und anderen Proteinen ausgewählt ist.

7. Verwendung der nach einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellten Poly­ urethanmatrix zur Herstellung von Wundauflagen.

8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Polyurethanmatrix kovalent gebundene Biomolekül mit in Wundexsu­ dat vorhandenen Störfaktoren, die den Wundheilungsprozeß behindern, wechsel­ wirkt, wobei die Störfaktoren aus der Gruppe bestehend aus suspendierten Zellen und Zellfragmenten sowie gelösten Bestandteilen wie Antigene, Radikale, Ionen, Proteine, Peptide, Lipide und freie Fettsäuren ausgewählt sind, wobei die Wechsel­ wirkung ein Binden, Komplexieren, Chelatisieren des Störfaktors oder eine chemi­ sche Reaktion mit dem Störfaktor umfaßt und wobei die Substanzen kovalent an ein Trägermaterial gebunden sind.

9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wundauflage aus der Gruppe bestehend aus Verbänden, Verbandmull, Binden, Kompressen, Watten, Pflastern, Folien, Filmen, Hydrokolloidverbänden, Gelen und dergleichen ausgewählt ist.