DE19917871A1 - Nucleic acid sequencing involving chain extension reaction in presence of chain terminator e.g. for detecting mutations - Google Patents

Abstract

Determining the position of at least one nucleotide (A) within a particularly segment of a target nucleic acid (present in a sample) comprises: (i) combining the sample with a reaction mixture to synthesize, from the sample, chain-extension products which display the presence of (A); and (ii) evaluating the products. Determining the position of at least one nucleotide (A) within a particularly segment of a target nucleic acid (present in a sample) comprises: (i) combining the sample with a reaction mixture to synthesize, from the sample, chain-extension products which display the presence of (A); and (ii) evaluating the products. The reaction mixture also includes: (a) an unconventional nucleotide (I); and (b) an enzyme (II) that is able to degrade polynucleotides that contain (I).

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNGBACKGROUND OF THE INVENTION

Diese Erfindung betrifft DNA-Sequenzierungsreaktionen und insbesondere verbesserte Sequenzierungsreaktions-Protokolle, die thermisch stabile Polymerase-Enzyme mit verringerten Fehlerraten verwenden.This invention relates to DNA sequencing reactions, and more particularly improved sequencing reaction protocols that are thermally stable Use polymerase enzymes with reduced error rates.

Die DNA-Sequenzierung kann in zwei unterschiedlichen Umgebungen durchgeführt werden: in einer Forschungsumgebung, in der jedes Verfahren ziemlich einzigartig ist und in dem die Sequenz, die bestimmt wird, im allgemeinen vor Beendigung der Sequenz-Bestimmung nicht bekannt ist; und in einer diagnostischen Umgebung, in der das gleiche Verfahren bei vielen Proben wiederholt wird und die Sequenzen, die bestimmt werden, im allgemeinen bekannt sind. Während die grundsätzlichen Verfahren, die in diesen zwei Umgebungen verwendet werden, die gleichen sein können, machen die Anforderungen an Geschwindigkeit, Kosteneffizienz und geringes Fehlerrisiko in der diagnostischen Umgebung viele der tatsächlich verwendeten Techniken zu schwerfällig, um ihre wirksame Verwendung zu gestatten. Dies hat die Verfügbarkeit der Diagnostik auf Sequenzierungs-Basis beschränkt und hat in der Tat einige fragen lassen, ob die Sequenzierung jemals für eine diagnostische Routine-Verwendung kosteneffizient sein kann.DNA sequencing can be done in two different environments be carried out: in a research environment in which every procedure is quite unique and in which the sequence that is determined in the general is not known before completion of the sequence determination; and in a diagnostic environment in which the same procedure is used on many samples is repeated and the sequences that are determined in general are known. While the basic procedures used in these two Environments that can be the same can be used Requirements for speed, cost efficiency and low risk of errors in The diagnostic environment uses many of the techniques actually used cumbersome to allow their effective use. This has the Availability of diagnostics is limited on a sequencing basis and has in the Did some ask if sequencing ever for a diagnostic Routine use can be cost-effective.

Das ideale DNA-Sequenzierungsverfahren zur Verwendung in einer diagnostischen Umgebung hätte die folgenden Eigenschaften: (1) es könnte ein DNA-haltige Probe verwenden, welche nur einer minimalen Vorbehandlung unterzogen worden wäre, um die DNA für eine Sequenzierung zugänglich zu machen; (2) es würde erfordern, daß diese Probe nur mit einer einzigen Reaktionsmischung vereinigt wird, was demgemäß das Fehlerrisiko und eine Kontamination verringern würde und die Leichtigkeit erhöhen würde, mit welcher das Verfahren automatisiert werden kann; und (3) es würde eine kurze Zeitspanne erfordern, um die Sequenzbestimmung durchzuführen, was demgemäß die Mindestkosten bezüglich Ausrüstung und Labor zur Durchführung des Tests verringern würde.The ideal DNA sequencing method for use in a Diagnostic environment would have the following characteristics: (1) it could be one Use DNA-containing sample with minimal pretreatment would have been subjected to the DNA for sequencing accessible do; (2) it would require that this sample be sampled with only one Reaction mixture is combined, which is accordingly the risk of error and a Reduce contamination and increase the ease with which  the procedure can be automated; and (3) it would be a short one Require time to perform the sequence determination, which Accordingly, the minimum cost of equipment and laboratory to carry out of the test.

Sowohl für Forschung als auch für Diagnostik wird die DNA-Sequenzierung im allgemeinen unter Verwendung der Techniken durchgeführt, die auf dem Kettenabbruchs-Verfahren beruhen, das von Sanger et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (U.S.A.) 74 (12): 5463-5467 (1977), beschrieben wurde. Im Grunde wird in diesem Verfahren zu testende DNA isoliert, einzelsträngig gemacht und in vier Gefäße gegeben. In jedem Gefäß sind die notwendigen Komponenten, um den DNA-Strang zu replizieren, d. h. eine Matrizen-abhängige DNA-Polymerase, ein kurzes Primer-Molekül, das komplementär zu einer bekannten Region der zu sequenzierenden DNA ist, und die Standard-Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs), üblicherweise als A, C, G und T dargestellt, in einem Puffer, der für die Hybridisierung zwischen dem Primer und der zu sequenzierenden DNA und die Kettenverlängerung des hybridisierten Primers förderlich ist. Zusätzlich enthält jedes Gefäß eine kleine Menge von einer Art (d. h. einer Spezies) Didesoxynucleotidtriphosphat (ddNTP), z. B. Didesoxyadenosintriphosphat (ddA).For both research and diagnostics, DNA sequencing is used in the Generally, using the techniques performed on the Chain termination methods based on Sanger et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (U.S.A.) 74 (12): 5463-5467 (1977). Basically in isolated DNA isolated, single-stranded and in four Given vessels. In each vessel are the necessary components to the DNA strand to replicate, d. H. a template-dependent DNA polymerase short primer molecule that is complementary to a known region of sequencing DNA, and the standard deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), usually shown as A, C, G and T, in a buffer suitable for the Hybridization between the primer and the DNA to be sequenced and the Chain extension of the hybridized primer is conducive. Additionally contains each vessel a small amount of one species (ie one species) Dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP), e.g. B. dideoxyadenosine triphosphate (ddA).

In jedem Gefäß hybridisiert der Primer mit einer spezifischen Stelle auf der isolierten DNA. Die Primer werden dann verlängert, jede Base für sich, um ein neues Nucleinsäure-Polymer zu bilden, das zu den isolierten DNA-Stücken komplementär ist. Wenn ein Didesoxynucleotidtriphosphat in das sich verlängernde Polymer einverleibt wird, bricht dies den Polymerstrang ab und verhindert, daß er weiter verlängert wird. Demgemäß wird in jedem Gefäß ein Satz von verlängerten Polymeren mit spezifischen Längen gebildet, welche die Positionen des Nucleotids anzeigen, das dem Didesoxynucleotid in diesem Gefäß entspricht. Die Sätze von Polymeren werden dann unter Verwendung von Gelelektrophorese ausgewertet, um die Sequenz zu bestimmen. In each vessel, the primer hybridizes with a specific site on the isolated DNA. The primers are then extended, each base one by one to form new nucleic acid polymer, which can be isolated to the DNA pieces is complementary. When a dideoxynucleotide triphosphate enters the extending polymer is incorporated, this breaks off the polymer strand and prevents it from being extended further. Accordingly, in each vessel Set of elongated polymers with specific lengths formed the View positions of the nucleotide that correspond to the dideoxynucleotide in this vessel equivalent. The sets of polymers are then made using Gel electrophoresis evaluated to determine the sequence.  

Wie Church und Gilbert beobachten, "ist in einer Säugerzelle die DNA, die irgendeiner Gensequenz entspricht, von DNA umgeben, die einigen Millionen anderer Sequenzen entspricht", "The Genomic Sequencing Technique" in Medical Genetics: Past, Present and Future, Alan R. Liss, Inc., S. 17-21 (1991). Das gleiche gilt zu einem größeren oder kleineren Ausmaß für jede komplexe DNA-Probe, die beispielsweise mikrobische genetische Materialien, genetische Pflanzenmaterialien, vollständige cDNA-Bibliotheken usw. enthält. In der Vergangenheit sind DNA-Sequenzierungsverfahren mit dieser Komplexität umgegangen, indem sie Schritte hinzufügten, welche die interessierende DNA relativ zu anderen in der Probe vorliegenden DNA-Spezies beträchtlich reinigen. Diese Reinigung ist durch Klonieren der zu sequenzierenden DNA vor der Sequenzierung oder durch Amplifikation eines ausgewählten Teiles des genetischen Materials in einer Probe zur Anreicherung der Konzentration einer interessierenden Region relativ zu anderer DNA bewerkstelligt worden. Beispielsweise ist es möglich, einen ausgewählten Teil eines Gens unter Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren, wie in den US-Patenten Nr. 4,683,194, 4,683,195 und 4,683,202 beschrieben, auf welche hiermit Bezug genommen wird. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung von Paaren von Primern, einen für jeden Strang der doppelsträngigen DNA, der mit einer Stelle hybridisiert, die nahe einer interessierenden Region in einem Gen angeordnet ist. Kettenverlängerungspolymerisation (ohne ein Ketten­ abbrechendes Nucleotid) wird dann in wiederholten Zyklen durchgeführt, um die Anzahl von Kopien der interessierenden Region um ein Vielfaches zu erhöhen. Die amplifizierten Polynucleotide werden dann aus der Reaktionsmischung abgetrennt und als Ausgangsmaterial für die Sequenzierungsreaktion verwendet. Gelfand et al. haben ein thermostabiles Enzym, "Taq-Polymerase", das von dem Organismus Thermus aquaticus abstammt, beschrieben, welches in diesem Amplifikationsverfahren nützlich ist (siehe die US-Patente Nr. 4,889,818; 5,352,600 und 5,079,352, auf welche hiermit Bezug genommen wird). Es ist auch offenbart worden, daß die Taq-Polymerase bei der Sequenzierung von DNA nützlich ist, wenn gewisse spezielle Bedingungen eingehalten werden, US-Patent Nr. 5,075,216, auf das hiermit Bezug genommen wird. As Church and Gilbert observe, "DNA in a mammalian cell is the DNA corresponds to any gene sequence, surrounded by DNA, some millions Other Sequences "," The Genomic Sequencing Technique "in Medical Genetics: Past, Present and Future, Alan R. Liss, Inc., pp. 17-21 (1991). The same applies to a greater or lesser extent for each complex DNA sample containing, for example, microbial genetic materials, genetic Plant materials, complete cDNA libraries, etc. contains. In the The past is DNA sequencing with this complexity bypassed by adding steps that the DNA of interest significantly cleanse relative to other DNA species present in the sample. This purification is by cloning the DNA to be sequenced before Sequencing or by amplification of a selected part of the genetic material in a sample to enrich the concentration of a region of interest relative to other DNA. For example, it is possible to place a selected part of a gene under Using a polymerase chain reaction (PCR) to amplify, as in the U.S. Patent Nos. 4,683,194, 4,683,195 and 4,683,202, which are incorporated herein by reference is hereby incorporated by reference. This procedure involves the use of Pair primers, one for each strand of double-stranded DNA, with a site that hybridizes near a region of interest in a gene is arranged. Chain extension polymerisation (without a chain terminating nucleotide) is then carried out in repeated cycles to obtain the Increase number of copies of the region of interest by a multiple. The amplified polynucleotides are then removed from the reaction mixture separated and used as starting material for the sequencing reaction. Gelfand et al. have a thermostable enzyme, "Taq polymerase", that of the Organism Thermus aquaticus descends, described in this Amplification method is useful (see U.S. Patent Nos. 4,889,818; 5,352,600 and 5,079,352, which are hereby incorporated by reference). It is also disclosed that the Taq polymerase in the sequencing of DNA useful if certain special conditions are met, US Patent No. 5,075,216, which is hereby incorporated by reference.  

Verbesserungen bezüglich der ursprünglichen Technik, die von Sanger et al. beschrieben worden ist, haben Verbesserungen bezüglich des Enzyms ein­ geschlossen, welches verwendet wird, um die Primerkette zu verlängern. Beispielsweise haben Tabor et al. Enzyme wie T7 DNA-Polymerase beschrieben, welche ein erhöhtes Fortschreiten und erhöhte Einbauraten von Didesoxy­ nucleotiden aufweisen. (Siehe das US-Patent Nr. 4,795,699 und die EP-A-0 386 857, auf die hiermit Bezug genommen wird). In jüngerer Zeit haben Reeve et al. ein thermostabiles Enzym-Präparat, als Thermo Sequenase® bezeichnet, mit verbesserten Qualitäten für die DNA-Sequenzierung beschrieben; Nature 376: 796-797 (1995); EP-A-0 655 506, worauf hiermit Bezug genommen wird. Für die Sequenzierung wird das Thermo Sequenase®-Produkt mit einer amplifizierten DNA-Probe verwendet, die 0,5-2 µg einzelsträngige DNA (oder 0,5 bis 5 µg doppelsträngige DNA) in vier Aliquoten enthält, und wobei man jede Aliquote mit dem Thermo Sequenase®-Enzympräparat, einer Didesoxynucleotid-Abbruchs­ mischung, die ein ddNTP und alle vier dNTPs enthält, und mit einem Farbstoff-markierten Primer vereinigt, der mit der zu sequenzierenden DNA hybridisiert. Die Mischung wird in eine Thermozyklus-Vorrichtung gegeben und 20 bis 30 Zyklen der Hybridisierung, Verlängerung und Denaturierung unterzogen, um meßbare Mengen von Farbstoff-markierten Verlängerungsprodukten mit variierenden Längen zu erzeugen, welche dann durch Gelelektrophorese ausgewertet werden. Die EP-A-0 655 506 sagt weiter aus, daß Thermo Sequenase® und ähnlich Enzyme für Amplifikationsreaktionen verwendet werden können.Improvements in the original technique described by Sanger et al. have been described, have improvements in the enzyme closed, which is used to extend the primer chain. For example, Tabor et al. Described enzymes such as T7 DNA polymerase, which an increased progression and increased incorporation rates of dideoxy have nucleotides. (See U.S. Patent No. 4,795,699 and U.S. Pat EP-A-0 386 857, which is hereby incorporated by reference). More recently, Reeve et al. a thermostable enzyme preparation, termed Thermo Sequenase®, with improved qualities for DNA sequencing described; Nature 376: 796-797 (1995); EP-A-0 655 506, which is incorporated herein by reference. For the Sequencing will amplify the Thermo Sequenase® product with one DNA sample containing 0.5-2 μg of single-stranded DNA (or 0.5 to 5 μg double-stranded DNA) in four aliquots, and including each aliquot with the Thermo Sequenase® enzyme preparation, a dideoxynucleotide termination mixture containing one ddNTP and all four dNTPs, and with one Dye-labeled primer combined with the DNA to be sequenced hybridized. The mixture is placed in a thermocycling apparatus and 20 subjected to 30 cycles of hybridization, extension and denaturation, measurable amounts of dye labeled extension products to produce varying lengths, which are then gel electrophoresed be evaluated. EP-A-0 655 506 further states that Thermo Sequenase® and similar enzymes can be used for amplification reactions can.

Trotz der Beobachtungen in der Technik, daß Enzyme, die für eine Amplifikation nützlich sind, auch für eine Sequenzierung verwendet werden können und umgekehrt, sind Bemühungen, die Amplifikationsreaktion und die Sequenzierungsreaktion in einem einzigen Schritt zu vereinigen, begrenzt geblieben. Ruano und Kidd, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 88: 2815-2819 (1991) und das US-Patent Nr. 5,427,911, auf die alle hiermit Bezug genommen wird, beschreiben ein Verfahren, welches sie als "gekoppelte Amplifikation und Sequenzierung" (CAS) bezeichnen, für die Sequenzierung von DNA. In diesem Verfahren wird eine Probe in einer ersten Reaktionsstufe mit zwei Primern behandelt und über eine solche Zahl von Zyklen amplifiziert, daß eine 10000- bis 100000fache Amplifikation erzielt wird. Dann wird während der exponentiellen Phase der Amplifikationsreaktion ein ddNTP zugesetzt, und die Reaktion wird zusätzlichen thermischen Zyklen unterzogen, um Kettenabbruchs-Sequen­ zierungsfragmente zu erzeugen. Das CAS-Verfahren erfüllt nicht die Kriterien, die oben für einen idealen diagnostischen Assay angegeben wurden, da es eine zwischenzeitliche Zugabe von Reagenzien (den ddNTP-Reagenzien) erfordert. Dies führt eine Gelegenheit für einen Fehler oder eine Kontamination ein und erhöht die Komplexität jeder Apparatur, die für die Automation verwendet würde.Despite the observations in the art that enzymes necessary for amplification useful, can also be used for sequencing and conversely, efforts are the amplification reaction and the Limited sequencing reaction in a single step remained. Ruano and Kidd, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 88: 2815-2819 (1991) and U.S. Patent No. 5,427,911, all of which are hereby incorporated by reference. describe a method which calls them "coupled amplification and Sequencing "(CAS), for the sequencing of DNA  Method is a sample in a first reaction stage with two primers treated and amplified over such a number of cycles that a 10000- to 100,000 times amplification is achieved. Then, during the exponential Phase of the amplification reaction is added to a ddNTP, and the reaction becomes subjected to additional thermal cycles to chain termination sequences produce ornamental fragments. The CAS procedure does not fulfill the Criteria given above for an ideal diagnostic assay, since there is an interim addition of reagents (the ddNTP reagents) requires. This introduces an opportunity for error or contamination and increases the complexity of any equipment used for automation would.

Das Problem von Fehlern, die während der Amplifikation auftreten, ist in einem Ansatz durch die Einverleibung von ungewöhnlichen Nucleotiden (z. B. dUTP), welche einem enzymatischen Angriff (zum Beispiel mit Uracil-N-glycosylase) und Abbau unterliegen, in die sich verlängernden Polymere angesprochen worden. Siehe das US-Patent Nr. 5,418,149, auf das hiermit Bezug genommen wird. Derartige Moleküle können meistenteils auf die gleiche Weisen verwendet werden, wie herkömmliche Amplifikationsprodukte verwendet werden, können aber als Kontaminanten aus anderen Reaktionen durch die Einverleibung eines Vorbehandlungsschrittes, der ein geeignetes Enzym verwendet, um die modifizierten Nucleinsäure-Polymere abzubauen, beseitigt werden.The problem of errors that occur during amplification is in one Approach by incorporation of unusual nucleotides (eg dUTP), which an enzymatic attack (for example with uracil N-glycosylase) and Subject to degradation, have been addressed in the extending polymers. See U.S. Patent No. 5,418,149, which is incorporated herein by reference. Such molecules can most often be used in the same ways can be used as conventional amplification products but as contaminants from other reactions through the incorporation of a Pretreatment step using a suitable enzyme to the degraded modified nucleic acid polymers are eliminated.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Sequenzierung von hochkomplexen DNA-Proben bereitzustellen, welches für eine Verwendung in der diagnostischen Umgebung und für eine Automation gut geeignet ist und welches ein Mittel zur Minimierung von Fehlern, die durch Kontamination und Nucleinsäurepolymer-Mitschleppens verursacht werden, bereitstellt.It is an object of the present invention to provide a method for sequencing to provide highly complex DNA samples which are suitable for use in the diagnostic environment and is well suited for automation and which a means to minimize errors caused by contamination and Nucleic acid polymer entrainment is provided.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Sequenzierung von DNA bereitzustellen, welches eine DNA-haltige Probe verwendet, die lediglich einer minimalen Vorbehandlung unterzogen worden ist, um die DNA für eine Sequenzierung zugänglich zu machen, und welches ein Mittel zur Minimierung von Fehlern bereitstellt, die durch Kontamination und Nucleinsäurepo­ lymer-Mitschleppung verursacht werden.It is a further object of the invention to provide a method for sequencing DNA which uses a DNA-containing sample containing only one minimal pretreatment has been subjected to the DNA for a  Sequencing, and which is a means of minimization from errors caused by contamination and nucleic acid po lymer carryover.

Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Sequenzierung von DNA bereitzustellen, welches die Vereinigung einer komplexen DNA-haltigen Probe mit lediglich einer einzigen Reaktionsmischung erfordert, wodurch das Fehlerrisiko und eine Kontamination verringert werden und die Leichtigkeit erhöht wird, mit welcher das Verfahren automatisiert werden kann.It is yet another object of the invention to provide a method for sequencing Provide DNA, which is the union of a complex DNA-containing Requires sample with only a single reaction mixture, whereby the Risk of error and contamination are reduced and the ease increased becomes, with which the procedure can be automated.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY OF THE INVENTION

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Sequenzierung einer interessierenden Region in einer DNA-Probe bereit, in welcher ein einziger Satz von Reagenzien zu einer minimal behandelten Probe gegeben wird, um nützliche Sequenzierungsergebnisse zu erzeugen. Die Erfindung beruht auf der über­ raschenden Beobachtung und Entdeckung, daß die Zugabe einer Reaktions­ mischung, welche die thermostabile Polymerase Thermo Sequenase®, zwei Primer, die sich an Stellen, welche die interessierende Region flankieren, an komplementäre Stränge eines Ziel-DNA-Moleküls binden, eine Mischung von Nucleotidtriphosphaten (A, C, G und T) und ein Didesoxynucleotidtriphosphat enthält, zu einer DNA-Probe, die Ziel- und Nicht-Ziel-DNA in im wesentlichen natürlicher Menge enthält, einschließlich hochkomplexer DNA-Proben, wie menschlicher genomischer DNA, und das Verarbeiten der Vereinigung durch mehrere Zyklen der Hybridisierung, Verlängerung und Denaturierung die Erzeugung einer Mischung zum Ergebnis hat, die direkt auf ein Gel zur Sequenzanalyse der interessierenden Region geladen werden kann. Die Reaktionsmischung schließt auch ein unkonventionelles Nucleotid und ein geeignetes Enzym für den Abbau von Nucleinsäure-Polymeren ein, die das unkonventionelle Nucleotid enthalten. The present invention provides a method for sequencing a region of interest in a DNA sample in which a single sentence from reagents to a minimally treated sample to be useful To produce sequencing results. The invention is based on the surprising observation and discovery that the addition of a reaction mixture containing the thermostable polymerase Thermo Sequenase®, two Primers that attach to sites flanking the region of interest bind complementary strands of a target DNA molecule, a mixture of Nucleotide triphosphates (A, C, G and T) and a dideoxynucleotide triphosphate contains, to a DNA sample, the target and non-target DNA in substantially contains a natural amount, including highly complex DNA samples, such as human genomic DNA, and processing the association several cycles of hybridization, extension and denaturation Producing a mixture has the result of being directly on a gel Sequence analysis of the region of interest can be loaded. The Reaction mixture also includes an unconventional nucleotide and suitable enzyme for the degradation of nucleic acid polymers containing the contain unconventional nucleotide.  

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Sequenzierung einer ausgewählten Region eines Ziel-Nucleinsäure-Polymers, umfassend die Schritte:
One aspect of the present invention is a method for sequencing a selected region of a target nucleic acid polymer comprising the steps of:

• (a) Vereinigen einer Probe in natürlicher Menge, welche das Ziel-Nuclein­ säure-Polymer enthält, mit einer Reaktionsmischung, die drei Arten von Desoxy­ nucleotidtriphosphaten, ein unkonventionelles Nucleotidtriphosphat, das dem vierten Basentyp entspricht, ein Didesoxynucleotidtriphosphat, einen ersten und zweiten Primer, ein Enzym, das Nucleinsäure-Polymere abbaut, welche das unkonventionelle Nucleotid enthalten, und ein thermisch stabiles Polymerase-Enzym umfaßt, welches Didesoxynucleotide mit einer Geschwindigkeit, die nicht weniger als etwa das 0,4fache der Geschwindig­ keit des Einbaus von Desoxynucleotiden beträgt, in ein sich verlängerndes Nucleinsäure-Polymer einbaut, um eine Reaktionsmischung zu bilden, wobei der erste und zweite Primer sich an Stellen, welche die ausgewählt Region flankieren, an den Sinn-Strang bzw. den Antisinn-Strang des Ziel-Nucleinsäure-Polymers binden;(a) Combine a sample in natural amount containing the target nuclide acid polymer containing, with a reaction mixture, the three types of deoxy nucleotide triphosphates, an unconventional nucleotide triphosphate, the corresponds to the fourth base type, a dideoxynucleotide triphosphate, a first and second primers, an enzyme that degrades nucleic acid polymers, which contain the unconventional nucleotide, and a thermally stable one Polymerase enzyme comprising dideoxynucleotides with a Speed not less than about 0.4 times the speed of incorporation of deoxynucleotides into a lengthening Nucleic acid polymer incorporates to form a reaction mixture, wherein the first and second primers are located at locations which the selected region flank, to the sense strand or the antisense strand of the Binding target nucleic acid polymer;
• (b) Einwirkenlassen einer anfänglichen Stufe auf die Reaktionsmischung, in welcher das Enzym, welches Nucleinsäure-Polymere abbaut, die das unkonventionelle Nucleotid enthalten, über eine Zeitspanne aktiv ist, die ausreicht, um die unkonventionelle Nucleinsäure enthaltenden Nucleinsäure-Polymere, die in der Probe anwesend sein können, abzubauen;(b) exposing the reaction mixture to an initial step, in which degrades the enzyme which degrades nucleic acid polymers, which is the containing unconventional nucleotide that is active over a period of time sufficient to contain the unconventional nucleic acid Nucleic acid polymers that may be present in the sample dismantle;
• (c) Einwirkenlassen einer Mehrzahl von Temperaturzyklen, von denen jeder mindestens eine Denaturierungsphase bei hoher Temperatur und eine Verlängerungsphase bei niedrigerer Temperatur einschließt, auf die Reaktionsmischung, um eine Produktmischung herzustellen, die Sequenzierungsfragmente umfaßt, die durch den Einbau des Didesoxynucleotids abgebrochen sind; und(c) exposure to a plurality of temperature cycles, each of which at least one denaturation phase at high temperature and a Extension phase includes at lower temperature on the Reaction mixture to produce a product mixture, the Comprises sequencing fragments generated by the incorporation of the Dideoxynucleotides are broken off; and
• (d) Auswerten der Produktmischung, um die Längen der erzeugten Sequenzierungsfragmente zu bestimmen.(d) evaluating the product mixture to determine the lengths of the produced To determine sequencing fragments.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Fig. 1 erläutert das Verfahren der Erfindung schematisch; Fig. 1 schematically illustrates the method of the invention;

Fig. 2A und 2B zeigen einen Vergleich von Sequenzierungsversuchen, die unter Verwendung von Thermo Sequenase® als Polymerase in dem Verfahren der Erfindung durchgeführt wurden, mit Ergebnissen, die unter Verwendung anderer thermostabiler Polymerasen in einem Vergleichsexperiment erhalten wurden; Figures 2A and 2B show a comparison of sequencing assays performed using Thermo Sequenase® as the polymerase in the method of the invention with results obtained using other thermostable polymerases in a comparative experiment;

Fig. 3 zeigt die Datenspur von Fig. 2A in größerer Einzelheit; Fig. 3 shows the data track of Fig. 2A in greater detail;

Fig. 4 erläutert eine Ausführungsform der Erfindung mit mehreren Farbstoffen; Fig. 4 illustrates an embodiment of the invention with a plurality of dyes;

Fig. 5 erläutert eine zweite Ausführungsform der Erfindung mit mehreren Farbstoffen; und Fig. 5 illustrates a second embodiment of the invention with a plurality of dyes; and

Fig. 6A und 6B erläutern eine dritte Ausführungsform der Erfindung mit mehreren Farbstoffen. Figs. 6A and 6B illustrate a third embodiment of the invention with a plurality of dyes.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Die vorliegende Erfindung beantwortet den Bedarf an einem einfachen und leicht zu automatisierenden Sequenzierungsverfahren, das direkt bei Proben verwendet werden kann, die komplexe Mischungen von DNA enthalten. Um derartige Mischung von DNA-Präparaten zu unterscheiden, welche in der Vergangenheit sequenziert worden sind, verwenden die Beschreibung und die Ansprüche dieser Anmeldung den Ausdruck "Probe in natürlicher Menge", um eine derartige Mischung zu beschreiben. Wie hierin verwendet, ist eine "Probe in natürlicher Menge" eine Probe, die behandelt worden ist, um DNA in der Probe für eine Hybridisierung mit Oligonucleotid-Primern zugänglich zu machen, beispielsweise durch Lyse, Zentrifugation, um Zelltrümmer zu entfernen, und proteolytische Verdauung, um die DNA freizusetzen, welche aber keinem bevorzugten Reinigungs- oder Amplifikationsschritt unterzogen worden ist, um die Menge an Ziel-DNA relativ zur Nicht-Ziel-DNA, die in der anfänglichen Probe vorhanden ist, zu vergrößern. Der Ausdruck "in natürlicher Menge " erfordert jedoch nicht die Anwesenheit aller DNA aus der ursprünglichen Probe. Demgemäß wäre eine komplexe Probe, die nur Kern-DNA oder nur Mitochondrien-DNA oder irgendeine Unterfraktion von Kern- oder Mitchondrien-DNA enthält und durch Isolation aus einer Gewebeprobe erhalten, aber keiner Vorzugsamplifikation unterzogen worden ist, eine Probe "in natürlicher Menge" innerhalb der Bedeutung dieses Ausdrucks in der Beschreibung und den Ansprüchen dieser Anmeldung. Der Ausdruck "in natürlicher Menge" würde auch eine DNA-Probe, die durch Umwandlung, beispielsweise durch Reverse Transkription, eines Gesamt-mRNA-Prä­ parats oder des Genoms eines RNA-Virus in cDNA hergestellt worden ist; DNA, die aus einer einzelnen Bakterienkolonie isoliert worden ist, welche auf einer Platte wächst, oder aus einer angereicherten Bakterienkultur; und ein virales DNA-Präparat, in welchem im wesentlichen das gesamte virale Genom isoliert ist, einschließen. Der Ausdruck "in natürlicher Menge" umfaßt keine Probe, in welcher die isolierte DNA keine komplexe Kombination von DNA-Mole­ külen ist und würde demgemäß beispielsweise kein gereinigtes Plasmid-Prä­ parat umfassen, das lediglich eine einzige Plasmid-Spezies enthält.The present invention answers the need for a simple and easy automated sequencing method used directly on samples which contain complex mixtures of DNA. To such Mix of DNA preparations to distinguish in the past have used the description and the claims of these Register the term "sample in natural quantity" to such a To describe the mixture. As used herein, a "sample in natural Amount "a sample that has been treated to contain DNA in the sample for a Hybridization with oligonucleotide primers, for example by lysis, centrifugation to remove cell debris, and proteolytic Digestion to release the DNA but which is not preferred  Purification or amplification step has been subjected to the amount of Target DNA relative to the non-target DNA present in the initial sample, to enlarge. However, the phrase "in natural quantity" does not require the Presence of all DNA from the original sample. Accordingly, one would be complex sample containing only nuclear DNA or just mitochondrial DNA or any Subfraction of nuclear or mitochondrial DNA contains and by isolation obtained a tissue sample, but not subjected to preferential amplification has become a sample "in natural quantity" within the meaning of this Expression in the description and claims of this application. The Expression "in natural quantity" would include a DNA sample through Conversion, for example by reverse transcription, of a total mRNA pre or genome of an RNA virus in cDNA; DNA that has been isolated from a single bacterial colony, which a plate grows or from an enriched bacterial culture; and a viral DNA preparation in which essentially the entire viral genome is isolated. The term "in natural quantity" does not include any Sample in which the isolated DNA does not contain a complex combination of DNA moles Accordingly, for example, no purified plasmid pre is which contains only a single plasmid species.

Proben in natürlicher Menge von Säuger-DNA können aus flüssigen Proben, z. B. Blut oder Urin, oder Gewebeproben durch irgendeine einer Anzahl von Techniken, einschließlich Lyse, Zentrifugation, um Zelltrümmer zu entfernen, und proteolytischer Verdauung, um die DNA freizusetzen; Salzfällung oder Stan­ dard-SDS-Proteinase K-Phenol-Extraktion hergestellt werden. Proben in natürlicher Menge können auch unter Verwendung von Testsätzen, beispielsweise dem Gentra Pure Gene DNA Isolation Kit, hergestellt werden.Samples in native amount of mammalian DNA can be prepared from liquid samples, e.g. B. Blood or urine, or tissue samples by any of a number of Techniques, including lysis, centrifugation to remove cell debris, and proteolytic digestion to release the DNA; Salt precipitation or Stan dard-SDS proteinase K phenol extraction. Samples in natural Amount can also be determined using test sets, such as Gentra Pure Gene DNA Isolation Kit.

Das Verfahren der Erfindung verwendet die Eigenschaften von Enzymen wie Thermo Sequenase®, nämlich die Fähigkeit, die Desoxynucleotide in ein sich verlängerndes Polynucleotid mit einer Geschwindigkeit einzubauen, die nicht geringer als etwa das 0,4fache der Geschwindigkeit des Einbaus von Desoxy­ nucleotiden ist, um ein Verfahren zur Sequenzierung eines Nuclein­ säure-Polymers aus einer Probe in natürlicher Menge in einem einzigen Satz von thermozyklischen Reaktionen bereitzustellen, welche in einem einzigen Gefäß durchgeführt werden können. Demgemäß ist das Verfahren der Erfindung ideal für eine Automation geeignet.The process of the invention utilizes the properties of enzymes such as Thermo Sequenase®, namely the ability to turn the deoxynucleotides into a extend the polynucleotide at a rate that is not less than about 0.4 times the rate of incorporation of deoxygen  nucleotides is a procedure for sequencing a nuclein Acid polymer from a sample in natural quantity in a single set of provide thermocyclic reactions, which in a single vessel can be performed. Accordingly, the method of the invention is ideal suitable for automation.

Fig. 1 erläutert die fundamentale Einfachheit und Eleganz des Verfahrens der Erfindung in Form eines Fließdiagramms. Wie in Fig. 1 gezeigt, wird eine Probe, die ein Ziel-Nucleinsäure-Polymer enthält, das eine zu sequenzierende Region einschließt, mit einer Reaktionsmischung vereinigt, die zwei Primer, eine Mischung von dNTPs, ein Ketten-abbrechendes Nucleotidtriphosphat, d. h. ein Didesoxynucleotidtriphosphat, und eine thermostabile Polymerase mit einer hohen Affinität für einen ddNTP-Einbau in einem Puffer enthält, der für eine Hybridisierung und Matrizen-abhängige Polymerisation geeignet ist. Die Mischung wird über eine Zahl von thermischen Zyklen verarbeitet, welche ausreicht, um nachweisbare Mengen an Sequenzierungsfragmenten zu erzeugen, im allgemeinen 20 bis 50 Zyklen. Während jedes Zyklus hybridisiert jeder der Primer mit dem jeweiligen Strang von in der Probe vorliegender Ziel-DNA, und die Primer-Kettenverlängerung unter Verwendung der Polymerase-Enzyme und der Nucleotidtriphosphat-Einsatzmaterialien schreitet fort, bis sie durch Einbau eines Ketten-abbrechenden Nucleotidtriphosphats beendet wird. Dies hat die Erzeugung von Sequenzierungsfragmenten zur Folge, die denjenigen vergleichbar sind, die in einer herkömmlichen Sequenzierungsreaktion erzeugt werden. Die Analyse dieser Fragmente liefert Information bezüglich der Sequenz der ausgewählten Region der Ziel-DNA. Diejenigen Verlängerungsprodukte, die nicht vor Erreichen der Region, die komplementär zu dem anderen Primer ist, abgebrochen sind, können als Matrize für die Erzeugung von Sequenzierungsfragmenten in späteren Zyklen dienen, obwohl dies im allgemeinen nur zu einem sehr kleinen Ausmaß stattfindet. Schließlich wird die Produktmischung, die Didesoxy-terminierte Fragmente enthält, zur Analyse der Positionen der Base, die dem Ketten-abbrechenden Nucleotidtriphosphat innerhalb des Ziel-Nucleinsäure-Polymers entsprechen, auf eine Elektrophoresegel geladen. Fig. 1 illustrates the fundamental simplicity and elegance of the method of the invention in the form of a flow chart. As shown in Figure 1, a sample containing a target nucleic acid polymer including a region to be sequenced is combined with a reaction mixture containing two primers, a mixture of dNTPs, a chain terminating nucleotide triphosphate, ie, a dideoxynucleotide triphosphate , and contains a thermostable polymerase with high affinity for ddNTP incorporation in a buffer suitable for hybridization and template-dependent polymerization. The mixture is processed over a number of thermal cycles sufficient to produce detectable quantities of sequencing fragments, generally 20 to 50 cycles. During each cycle, each of the primers hybridizes to the respective strand of target DNA present in the sample, and primer chain extension using the polymerase enzymes and the nucleotide triphosphate feedstocks proceeds until terminated by incorporation of a chain terminating nucleotide triphosphate , This results in the generation of sequencing fragments that are comparable to those generated in a conventional sequencing reaction. The analysis of these fragments provides information regarding the sequence of the selected region of the target DNA. Those extension products that do not terminate before reaching the region that is complementary to the other primer may serve as a template for the generation of sequencing fragments in later cycles, although generally only to a very small extent. Finally, the product mixture containing dideoxy terminated fragments is loaded onto an electrophoresis gel to analyze the positions of the base corresponding to the chain terminating nucleotide triphosphate within the target nucleic acid polymer.

Die Arbeitsweise der Erfindung kann im Zusammenhang mit einem hypothetischen 200 Nt-DNA-Fragment mit gleichen Mengen jeder Base verstanden werden. Dies bedeutet, daß es 50 potentielle Abbruchsereignisse während des Zyklus gibt. Bei jedem Zyklus hätten einige der Produkte die volle Länge (und wären demgemäß in der Lage, mit einem der zwei Primer zu hybridisieren, um mehr Sequenzierungsfragmente zu erzeugen) und einige wären an den Stellen verkürzt, wo die ddNTP addiert worden ist. Wenn jeder dieser Abbruchsvorgänge als Ergebnis der relativen Konzentration von ddNTP im Vergleich zu dNTP und des relativen Einbaus durch das Enzym eine statistische Wahrscheinlichkeit des Auftretens von einmal in 500 aufweist, dann wird insgesamt ein Abbruchsprodukt in etwas weniger als zehn Prozent der Reaktionen auftreten. Tabelle 1 zeigt die relativen Mengen von Produkten mit voller Länge und Kettenabbruch, die theoretisch nach 10, 20 und 30 Zyklen einer Reaktion gemäß der Erfindung unter Verwendung dieses 200 Nt-Polynucleotids unter Annahme verschiedener Verhältnisse von verkürztem Produkt zu Produkt voller Länge gebildet werden.The operation of the invention may be in the context of a hypothetical 200 nt DNA fragment with equal amounts of each base be understood. This means that there are 50 potential crash events during the cycle there. At each cycle, some of the products would have the full one Length (and would therefore be able to use one of the two primers too hybridize to produce more sequencing fragments) and some would be shortened at the points where the ddNTP has been added. If each of these Abort events as a result of the relative concentration of ddNTP in the Comparison to dNTP and relative incorporation by the enzyme a statistical Probability of occurrence of once in 500, then becomes altogether a crash product in a little less than ten percent of the Reactions occur. Table 1 shows the relative amounts of products with full length and chain termination, theoretically after 10, 20 and 30 cycles of a Reaction according to the invention using this 200 Nt polynucleotide assuming various ratios of shortened product to product be formed full length.

Die absoluten und relativen Mengen von Nucleotidtriphosphaten und Ketten-ab­ brechenden Nucleotidtriphosphaten können für das spezielle verwendete Enzym optimiert werden. In der tatsächlichen Praxis wurde gefunden, daß mit Thermo Sequenase® nützliche Ergebnisse erhalten werden, wenn die Reaktion über 35 bis 45 Zyklen unter Verwendung eines Molverhältnisses Didesoxy : Desoxy von 1 : 100 bis 1 : 300 durchgeführt wird. Im allgemeinen wird jedes Nucleotidtriphosphat bei Konzentrationen von 250 µM bis 1,5 mM in die Reaktionsmischung eingeschlossen, und das Ketten-abbrechende Nucleotidtriphosphat wird bei einer Konzentration von 0,5 µM bis 30 µM eingeschlossen, um Zusammensetzungen zu erzeugen, in denen das Molverhältnis des Ketten-abbrechenden Nucleotidtriphosphats zu dem entsprechenden Nucleotidtriphosphat 1 : 50 bis 1 : 1000, vorzugsweise 1 : 100 bis 1 : 500, beträgt. Dies hat einen Einbau eines Ketten-abbrechenden Nucleotidtriphosphats in 30 bis fast 100 Prozent der sich verlängernden Polymerketten, die während der thermischen Zyklen der Reaktionsmischung gebildet werden, zur Folge.The absolute and relative amounts of nucleotide triphosphates and chains Breaking nucleotide triphosphates may be used for the particular Enzyme can be optimized. In actual practice it was found that with Thermo Sequenase® useful results are obtained when the reaction over 35 to 45 cycles using a molar ratio  Dideoxy: deoxy is carried out from 1: 100 to 1: 300. In general, will each nucleotide triphosphate at concentrations of 250 μM to 1.5 mM in the Reaction mixture included, and the chain-breaking Nucleotide triphosphate is at a concentration of 0.5 μM to 30 μM included to produce compositions in which the Molar ratio of the chain terminating nucleotide triphosphate to the corresponding nucleotide triphosphate 1: 50 to 1: 1000, preferably 1: 100 to 1: 500. This has an installation of a chain-breaking Nucleotide triphosphate in 30 to almost 100 percent of the lengthening Polymer chains during the thermal cycles of the reaction mixture to be formed.

Ein Schlüsselfaktor bei der erfolgreichen Durchführung des Verfahrens der Erfindung ist die Verwendung von Thermo Sequenase® oder eines vergleichbaren Enzyms als thermostabile Polymerase in der Reaktionsmischung. Derartige Enzyme sind durch eine hohe Affinität für den Einbau von Didesoxynucleotiden in die sich verlängernde Nucleotidkette gekennzeichnet. Allgemein sollte für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die verwendete Polymerase derart sein, daß sie Didesoxynucleotide mit einer Geschwindigkeit, die nicht weniger als etwa das 0,4fache des Geschwindigkeit des Einbaus von Desoxynucleotiden beträgt, in ein sich verlängerndes Nucleinsäure-Polymer einbaut. Von Thermo Sequenase® ist bekannt, daß sie den Einbau von Didesoxynucleotiden begünstigt, und sie ist zur Verwendung in der Erfindung geeignet. Tabor et al. haben ebenfalls Enzyme mit gesteigertem Voranschreiten und hohen und gesteigerten Raten des Einbaus von Didesoxynucleotiden beschrieben (siehe EP 0 655 506). Roche verkauft eine Polymerase unter der eingetragenen Marke TAQ-FS, die ebenfalls diese Kriterien erfüllt.A key factor in the successful implementation of the process of Invention is the use of Thermo Sequenase® or a comparable Enzyme as a thermostable polymerase in the reaction mixture. such Enzymes are characterized by a high affinity for the incorporation of dideoxynucleotides in the extending nucleotide chain is characterized. Generally should be for the Purpose of the present invention, the polymerase used be such that They dideoxynucleotide at a rate not less than about that 0.4 times the rate of incorporation of deoxynucleotides, in incorporates an extending nucleic acid polymer. From Thermo Sequenase® is known to favor the incorporation of dideoxynucleotides, and it is suitable for use in the invention. Tabor et al. also have enzymes with increased progress and high and increased rates of installation of dideoxynucleotides (see EP 0 655 506). Roche sells one Polymerase under the registered trademark TAQ-FS, which also meets these criteria Fulfills.

Die Fig. 2A und 2B und Fig. 3 erläutern die Bedeutung dieser Eigenschaft des verwendeten Polymerase-Enzyms. Die Fig. 2A und 3 zeigen eine Sequenzierungs-Datenspur einer tatsächlichen heterozygoten Patientenprobe von DNA in natürlicher Menge, die unter Verwendung von Thermo Sequenase® und Primern, die das Exon 2 des Von Hippel-Lindau-Gens flankieren, in einem Verfahren gemäß der Erfindung erhalten wurde. Es wurden große, gut definierte Peaks erhalten, welche den Abbruchsfragmenten entsprachen, was die Sequenzauswertung der Probe sehr einfach machte. Zusätzlich sind die Peaks bei homozygoten Peaks alle von etwa der gleichen Größe und leicht von Peaks für Basen an heterozygoten Orten unterscheidbar. Dieses Ergebnis wurde unter Durchführung des Tests in einem einzigen Reaktionsgefäß mit einer einzigen nicht angereicherten Reaktionsmischung in insgesamt 45 thermischen Zyklen erhalten. Vergleichbare Ergebnisse könnten unter Verwendung von weniger Reaktionszyklen, zum Beispiel 35 Zyklen, wie hierin in Beispiel 1 gezeigt, erhalten werden. Figures 2A and 2B and Figure 3 illustrate the importance of this property of the polymerase enzyme used. Figures 2A and 3 show a sequencing data trace of an actual heterozygous patient sample of DNA in natural amount using Thermo Sequenase® and primers flanking the exon 2 of the Von Hippel Lindau gene in a method according to the invention was obtained. Large, well-defined peaks were obtained which corresponded to the termination fragments, making the sequence evaluation of the sample very easy. In addition, the peaks in homozygous peaks are all of about the same size and easily distinguishable from peaks for bases at heterozygous sites. This result was obtained by conducting the test in a single reaction vessel with a single non-enriched reaction mixture for a total of 45 thermal cycles. Comparable results could be obtained using fewer reaction cycles, for example 35 cycles, as shown in Example 1 herein.

Im Gegensatz dazu zeigt Fig. 2B die Spur, die erhalten wurde, als eine Kombination von Vent und Sequitherm® anstelle von Thermo Sequenase® über insgesamt 45 thermische Zyklen verwendet wurde. In dieser Spur sind die Peaks für die Abbruchsfragmente viel kleiner und weniger gut definiert. Weiter sind die Peaks von sehr variabler Höhe und gestatteten nicht die Identifizierung von heterozygoten Peaks auf der Grundlage der Peakhöhe. Die Durchführung des gleichen Experiments unter Verwendung von Taq-Polymerase allein hatte eine Datenspur zum Ergebnis, die keine verwertbaren Peaks enthielt.In contrast, Figure 2B shows the trace obtained when a combination of Vent and Sequitherm® was used instead of Thermo Sequenase® for a total of 45 thermal cycles. In this lane, the peaks for the demolition fragments are much smaller and less well defined. Further, the peaks are of very variable height and did not allow identification of heterozygous peaks based on peak height. Performing the same experiment using Taq polymerase alone resulted in a data trace that contained no exploitable peaks.

Im Verfahren dieser Erfindung wird eine Probe in natürlicher Menge, die eine Ziel-DNA-Sequenz enthält oder vermutlich enthält, in einer Reaktionsmischung mit einer geeigneten Polymerase, allen vier Arten von Desoxynucleotidtriphosphaten, einem Didesoxynucleotriphosphat und einem ersten und zweiten Primer vereinigt. Bei den Primern, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann es sich um irgendein Paar von Primern handeln, die mit dem Sinn- und Antisinn-Strang der Ziel-DNA an Stellen hybridisieren, die eine ausgewählte, zu sequenzierende Region flankieren, und die nicht beide an benachbarten Stellen in menschlicher DNA oder einer anderen DNA, die möglicherweise in der Probe gefunden wird, hybridisieren. Wie hierin verwendet, versteht sich der Ausdruck "flankieren", daß er eine Positionierung der Primer an den 5'-Enden der ausgewählten Region auf jedem DNA-Strang bedeutet, so daß die Verlängerung der Primer zu einer Replikation der Region zwischen den Primern führt. Die Primer sind vorzugsweise so ausgewählt, daß das Primerpaar eine Region flankiert, die etwa 500 Bp oder weniger beträgt, obwohl Primer, die größere Regionen an DNA überspannen, mit einer Anpassung der Sequen­ zierungsmischung (im allgemeinen einer Erhöhung der relativen Menge an Desoxynucleotidtriphosphaten) verwendet werden können, um die Menge an längeren erzeugten Sequenzierungsfragmenten zu erhöhen.In the method of this invention, a sample in natural amount, which is a Contains or suspected of containing target DNA sequence in a reaction mixture a suitable polymerase, all four types of deoxynucleotide triphosphates, a dideoxynucleotide phosphate and a first and second primer. The primers used in the method of the present invention it can be any pair of primers that are with the sense and Antisense strand of target DNA at sites that hybridize to a selected, zu flanking the sequencing region, and not both at adjacent locations in human DNA or other DNA possibly in the sample is found, hybridize. As used herein, the term is understood "flank" that it is a positioning of the primer at the 5 'ends of the  selected region on each strand of DNA means so that the extension the primer leads to replication of the region between the primers. The Primers are preferably selected so that the primer pair is a region Flanked, which is about 500 bp or less, although primer, the larger Spanning regions of DNA, with an adaptation of the sequences cation mixture (generally an increase in the relative amount of Deoxynucleotide triphosphates) can be used to control the amount of to increase longer generated sequencing fragments.

Primer können so ausgewählt werden, daß sie mit hoch konservierten Regionen hybridisiert werden, welche in allen Varianten der Ziel-DNA die gleichen sind, oder sie können als degenerierte Primer hergestellt werden, um bekannten Sequenzabwandlungen an der Primerstelle Rechnung zu tragen. Demgemäß kann sowohl der erste als auch der zweite Primer der Erfindung eine diskrete Oligonucleotid-Spezies sein, oder es kann sich um einen Satz von Oligonu­ cleotid-Primern mit ähnlichen, aber nicht identischen Sequenzen handeln.Primers can be selected to work with highly conserved regions which are the same in all variants of the target DNA, or they can be prepared as degenerate primers to known ones To take account of sequence modifications at the primer site. Accordingly, For example, both the first and second primers of the invention may be discrete Be oligonucleotide species, or it may be a set of oligonucleotides cleotid primers with similar but not identical sequences.

Einer der oder beide Primer können mit einer nachweisbaren Markierung an ihrem 5'-Ende markiert sein, insbesondere mit einer fluoreszierenden Markierung, wie Fluorescein, oder einem Cyanin-Farbstoff, wie Cy5.5. Falls bei beiden Primern Markierungen verwendet werden, sollten die gewählten Markierungen spektroskopisch unterscheidbar sein, d. h. sie sollten entweder ein unterschiedliches Anregungsspektrum oder ein unterschiedliches Emissionsspektrum aufweisen, so daß ein Primer von dem anderen unterschieden werden kann. Wenn beide Primer mit verschiedenen nachweisbaren Markierungen markiert sind, z. B. mit zwei verschiedenen Fluoro­ phoren, wie in dem Verfahren, das von Wiemann et al., "Simultaneous On-Line DNA Sequencing on Both Strands with Two Fluorescent Dyes", Anal. Biochem. 224: 117-121 (1995) beschrieben ist, kann die Sequenz von beiden Strängen der Probe in einer einzigen Reaktion bestimmt werden. One or both primers may be labeled with a detectable label be marked at its 5 'end, in particular with a fluorescent marker, such as fluorescein, or a cyanine dye, such as Cy5.5. If both Primers markers should be used should the chosen markers be distinguishable spectroscopically, d. H. they should either be one different excitation spectrum or a different one Have emission spectrum, so that one primer from the other can be distinguished. If both primers with different detectable markers are marked, for. B. with two different fluoro phoren, as in the method described by Wiemann et al., "Simultaneous On-Line DNA Sequencing on Both Strands with Two Fluorescent Dyes ", Anal. Biochem. 224: 117-121 (1995), the sequence of both strands the sample can be determined in a single reaction.  

Die Nucleotidtriphosphat-Einsatzmaterialmischung ist eine Standardmischung von drei der vier üblichen Desoxynucleotid-Basen (A, C, G und T) plus einem unkonventionellen Nucleotid, das der vierten Base entspricht, in einem Puffer, der für eine Matrizen-abhängig Primerverlängerung mit dem verwendeten Enzym geeignet ist. Wie es der Fachmann erkennt, variieren die speziellen Konzentrationen der Nucleotidtriphosphate und die Natur des Puffers abhängig von dem verwendeten Enzym. Standard-Puffer und -Reagenzkonzentrationen für verschiedene bekannte Polymerase-Enzyme können in der Erfindung verwendet werden.The nucleotide triphosphate feed mixture is a standard mixture of three of the four common deoxynucleotide bases (A, C, G and T) plus one unconventional nucleotide corresponding to the fourth base in a buffer containing for a template-dependent primer extension with the enzyme used suitable is. As one skilled in the art will appreciate, the specific ones vary Concentrations of nucleotide triphosphates and the nature of the buffer dependent from the enzyme used. Standard buffer and reagent concentrations for Various known polymerase enzymes can be used in the invention become.

Der Ausdruck "unkonventionelle Nucleotide" bezeichnet unnatürliche oder analog-artige Nucleotidtriphosphate, die in einer Matrizen-abhängigen Weise in die Sequenzierungsfragmente polymerisiert werden können. Unnatürliche Formen von modifizierten Nucleotiden schließen alkylierte Nucleotide und Nucleotide, die durch Alkylhydroxylierung modifiziert sind, ein. Spezielle Beispiele für modifizierte Nucleotide umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, N-7-Methylguanin, Desoxyuridin, Desoxyinosin, Desoxy-5,6-dihydroxythymin (aus von mit OsO₄ behandelter DNA), 5',6'-Dihydroxydihydrothymin und Desoxy-3'-methyladenosin. Unkonventionelle Nucleotide können auch natürliche Formen von Nucleotiden einschließen, die üblicherweise nicht in DNA enthalten sind. Demgemäß sind für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Uracil und Hypoxanthin unkonventionelle Nucleotide.The term "unconventional nucleotides" refers to unnatural or analogous nucleotide triphosphates that can be polymerized in a template-dependent manner into the sequencing fragments. Unnatural forms of modified nucleotides include alkylated nucleotides and nucleotides modified by alkylhydroxylation. Specific examples of modified nucleotides include, but are not limited to, N-7-methylguanine, deoxyuridine, deoxyinosine, deoxy-5,6-dihydroxythymine (from OsO ₄ treated DNA), 5 ', 6'-dihydroxydihydrothymine and deoxy- 3'-methyladenosine. Unconventional nucleotides may also include natural forms of nucleotides, which are not usually contained in DNA. Accordingly, for purposes of the present invention, uracil and hypoxanthine are unconventional nucleotides.

Ein wichtiges Merkmal der in der Erfindung verwendeten unkonventionellen Nucleotide ist das Vorhandensein eines Enzyms, welches bei Temperaturen unter denjenigen, die normalerweise mit der Erzeugung von Sequenzie­ rungsfragmenten unter Verwendung einer thermostabilen Polymerase verbunden sind, Polynucleotide abbaut, welche die unkonventionellen Nucleotide enthalten, um sie als Substrate für eine weitere Erzeugung von Sequenzierungsfrag­ menten ungeeignet zu machen. Die Reaktionsmischung gemäß der Erfindung schließt ein geeignetes Enzym, häufig eine Glycosylase, ein. Beispiele für spezielle Enzyme schließen ein: Uracil-N-glycosylase, Hypoxanthin-DNA-gly­ cosylase, 3-Methyladenin-DNA-glycosylase I und II, Hydroxymethylura­ cil-DNA-glycosylase und Formamidopyrimidin-DNA-glycosylasen. Das Enzym ist bevorzugt eine thermolabiles Enzym, so daß es für die Zerstörung mitgeschleppter Polynucleotide vor der ersten Sequenzierungsreaktion aktiv ist, aber anschließend inaktiv ist. Bei der Auswahl der Reaktionsbedingungen sollte darauf achtgegeben werden, daß die Temperatur nach der Synthese von Sequenzierungsfragmenten nicht auf eine Temperatur erniedrigt wird, die einen signifikanten Abbau der gewünschten Produkte vor der Analyse gestattet.An important feature of the unconventional used in the invention Nucleotide is the presence of an enzyme which is at temperatures below those normally involved with the generation of sequencing tion fragments using a thermostable polymerase are degrading polynucleotides containing the unconventional nucleotides, to them as substrates for further generation of sequencing query make them unsuitable. The reaction mixture according to the invention includes a suitable enzyme, often a glycosylase. examples for special enzymes include: uracil N-glycosylase, hypoxanthine-DNA-gly  cosylase, 3-methyladenine-DNA-glycosylase I and II, hydroxymethylura cil DNA glycosylase and formamidopyrimidine DNA glycosylases. The enzyme is prefers a thermolabile enzyme so that it destroys entrained polynucleotides is active prior to the first sequencing reaction, but then inactive. When choosing the reaction conditions should be careful that the temperature after the synthesis of Sequencing fragments is not lowered to a temperature that a significant degradation of the desired products prior to analysis.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Reaktionsmischung schließt auch mindestens eine Art (oder eine Spezies) von Ketten-abbrechendem Nucleotidtri­ phosphat ein. Gesonderte Reaktionen für die vier verschiedenen Typen von Basen können entweder gleichzeitig oder aufeinanderfolgend durchgeführt werden. Die gleichzeitige Durchführung mit allen vier Basen stimmt mit der herkömmlichen Sequenzierungspraxis überein. Jedoch vereinigt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Eingefäß-Methode dieser Anmeldung mit "Einspuren-Sequenzierung", die in der gemeinsam übertragenen US-Patentanmeldung Nr. 08/577,858 beschrieben ist. Bei einer Einspuren-Sequen­ zierung ist häufig die Bestimmung der Positionen von lediglich einem (oder in jedem Fall weniger als vier) Nucleotid(en) einer Zielsequenz ausreichend, um die Anwesenheit eines Ziel-Mikroorganismus festzustellen und die qualitative Natur desselben zu bestimmen, indem man einen Fingerabdruck oder Balkencode der Zielsequenz bereitstellt, welcher ausreichend sein kann, um ihn von allen anderen bekannten Varietäten der Sequenz zu unterscheiden. Der Durchsatz wird durch die Verringerung der Zahl von Reaktionen und Elektrophoresedurchläufen, die erforderlich ist, um eine Sequenz zu identifizieren, erhöht. Durch Auswahl der Reihenfolge der getesteten Basen und Zwischenprodukt-Analyse kann es unnötig sein, mit allen vier Basen umzusetzen, um die Anwesenheit und spezifische qualitative Natur irgendeines in der Probe anwesenden Ziel-Mikroorganismus zu bestimmen. The reaction mixture used in the present invention also includes at least one species (or species) of chain-terminating nucleotide tri phosphate. Separate reactions for the four different types of Bases can be performed either simultaneously or sequentially become. The simultaneous execution with all four bases agrees with the conventional sequencing practice. However, a preferred one combines Embodiment of the present invention, the Eingefäß method of this Sign in with "single track sequencing" in the co-transmitted U.S. Patent Application No. 08 / 577,858. For a single track sequen It is often the determination of the positions of just one (or in any event less than four) nucleotide (s) of a target sequence is sufficient, to determine the presence of a target microorganism and the qualitative Determine the nature of the same by giving a fingerprint or Provides the bar code of the target sequence, which may be enough to make it to distinguish from all other known varieties of the sequence. The Throughput is reduced by reducing the number of reactions and Electrophoresis runs required to identify a sequence elevated. By selecting the order of the tested bases and Intermediate analysis may be unnecessary to implement with all four bases, around the presence and specific qualitative nature of any in the sample determine the target microorganism present.  

Das vorliegende Verfahren kann in Kombination mit irgendeiner Art von Nachweissystem verwendet werden, welches mit der auf den Primern verwendeten Markierung kompatibel ist. Beispielsweise kann eine Pharmacia A.L.F.-Sequenziervorrichtung verwendet werden, wenn Fluorescein-markierte Primer verwendet werden, während ein Visible Genetics MicroGene Blaster geeignet ist, wenn die verwendete Markierung Cy5.5 ist. Wenn mehrere Markierungen verwendet werden, kann die Probe auf mehreren Instrumenten aufgearbeitet werden, oder sie kann auf einem Instrument ausgewertet werden, welches in der Lage ist, Signale aus mehreren Markierungen nachzuweisen. Ein Beispiel für ein derartiges Instrument ist der Prism 377 Sequencer (Applied Biosystems Inc.), welcher vier Farbstoffe in einer einzigen Bahn nachweist und unterscheidet. Spektroskopisch unterscheidbare Farbstoffe, die durch den Prism 377 erkannt werden, sind die FAM-, ROX-, TAMRA- und JOE-Farbstoffe, die in der Technik bekannt sind.The present method may be used in combination with any type of Detection system to be used, which with the on the primers used mark is compatible. For example, a Pharmacia A.L.F. sequencer used when fluorescein-labeled Primers are used while a Visible Genetics MicroGene Blaster is suitable when the label used is Cy5.5. If several Markers can be used on multiple instruments or it can be evaluated on an instrument, which is able to detect signals from several markings. On An example of such an instrument is the Prism 377 Sequencer (Applied Biosystems Inc.) which detects four dyes in a single lane and different. Spectroscopically distinguishable dyes, which by Prism 377 are the FAM, ROX, TAMRA and JOE dyes that are in known in the art.

Die Möglichkeit des Nachweises von mehreren Farbstoffen führt zu einem breiten Bereich von Anwendungen für die Erfindung, welche zu einer verbesserten Genauigkeit bei der Sequenzierung und zu einem verbesserten instrumentellen Durchsatz führt. Beispielsweise erläutert Fig. 4 ein Verfahren zum Erhalt sowohl der Vorwärts- als auch der Umkehrsequenzen einer Ziel-Nucleinsäuresequenz unter Verwendung von zwei Primern, jeder mit einer spektroskopisch unterscheidbaren Markierung. Die Probe in natürlicher Menge wird mit dem Vorwärts- und dem Umkehrprimer gemischt, jeder mit einer unterscheidbaren Markierung (1 und 2). Die Reaktion wird mit vier Abbruchsreaktionen, eine jeweils für A, C, G und T, durchgeführt. Jede Reaktion wird in eine einzige Vertiefung eines automatisierten Sequenzierungsinstruments eingeführt, welches mindestens zwei verwendete Markierungen nachweist und unterscheidet. Die Ergebnisse, die aus der Markierung 1 nachgewiesen werden, werden kombiniert, um die Vorwärtssequenz zu ergeben. Die Ergebnisse, die aus der Markierung 2 nachgewiesen werden, werden kombiniert, um die Umkehrsequenz zu ergeben. Die zwei Sequenzen können zur gegenseitigen Überprüfung und Korrektur irgendwelcher Zweideutigkeiten in der Basenbenennung verwendet werden. The ability to detect multiple dyes results in a broad range of applications for the invention, resulting in improved sequencing accuracy and improved instrumental throughput. For example, Figure 4 illustrates a method for obtaining both the forward and reverse sequences of a target nucleic acid sequence using two primers, each with a spectroscopically distinguishable label. The sample in natural amount is mixed with the forward and reverse primers, each with a distinguishable label (1 and 2). The reaction is carried out with four termination reactions, one for A, C, G and T, respectively. Each reaction is introduced into a single well of an automated sequencing instrument which detects and distinguishes at least two labels used. The results detected from label 1 are combined to give the forward sequence. The results detected from label 2 are combined to give the reverse sequence. The two sequences can be used to mutually review and correct any ambiguity in base naming.

Zusätzlich kann die entgegengesetzte Sequenz dazu verwendet werden, die Sequenz in nächster Nähe eines Primers zu bestätigen, von der empirisch gefunden wird, daß sie auf im Handel erhältlichen automatisierten DNA-Sequenziervorrichtungen schwierig zu bestimmen ist.In addition, the opposite sequence can be used to To confirm sequence in close proximity of a primer, by empirical found that they are commercially available on automated DNA sequencing devices is difficult to determine.

Fig. 5 demonstriert die Verwendung von mehreren Markierungen auf eine andere Weise. In diesem Fall können unter der Annahme, daß das Instrument zwischen vier Markierungen unterscheiden kann, vier Gene oder Genfragmente in einer einzigen Probe gleichzeitig sequenziert werden. Vier Paare von Primern werden zu genomischer DNA einer Patientenprobe gegeben. Jedes Paar ist für ein anderes Ziel spezifisch, möglicherweise für vier Exons desselben interessierenden Gens (P, Q, R und S). Ein Mitglied jedes Paares ist an eine nachweisbare Markierung (1, 2, 3 oder 4) konjugiert, und jede Markierung ist von den anderen unterscheidbar. Diese Mischung wird in vier Abbruchsreak­ tions-Röhrchen aufgeteilt, jeweils eines für ddA, ddC, ddG und ddT, und thermisch verarbeitet. Die Abbruchsreaktions-Produkte werden in eine Bahn aufgetragen, wodurch also das Verfahren verwendet wird, das in der US-Patentanmeldung Serial Nr. 08/634,284, die auf den Rechtsnachfolger der vorliegenden Erfindung übertragen ist und auf die hiermit Bezug genommen wird, offenbart ist. Die Ergebnisse jeder Markierung werden kombiniert, um die Sequenz des Exons zu ergeben, für welches dieser Primer spezifisch ist. Fig. 5 demonstrates the use of multiple tags in a different way. In this case, assuming that the instrument can distinguish between four labels, four genes or gene fragments can be sequenced simultaneously in a single sample. Four pairs of primers are added to genomic DNA of a patient sample. Each pair is specific for another target, possibly for four exons of the same gene of interest (P, Q, R and S). One member of each pair is conjugated to a detectable label (1, 2, 3 or 4) and each label is distinguishable from the others. This mixture is divided into four termination reaction tubes, one each for ddA, ddC, ddG and ddT, and thermally processed. The quench reaction products are coated in a web, thus employing the process disclosed in U.S. Patent Application Serial No. 08 / 634,284, assigned to the assignee of the present invention and incorporated herein by reference. The results of each label are combined to give the sequence of the exon for which this primer is specific.

Eine weitere Ausführungsform macht sich die Tatsache zunutze, daß eine einzige ddA-Abbruchsreaktion die A-Nucleotide jedes Stranges identifiziert, Fig. 6A, wodurch die komplementäre Base (in diesem Fall T) im entgegengesetzten Strang identifiziert wird (d. h. die A-Abbruchsstellen auf dem entgegengesetzten Strang entsprechen den T-Nucleotid-Stellen in dem ersten Strang). Die komplementäre Base kann an den "fehlenden" Stellen des entgegengesetzten Stranges lokalisiert werden. Man bemerke, daß die Sequenz des entgegengesetzten Stranges umgekehrt werden muß, bevor sie zu den fehlenden Stellen addiert wird, da sie am entgegengesetzten Ende des Zielgens beginnt und die Kettenverlängerung in der entgegengesetzten Richtung stattfindet. Another embodiment takes advantage of the fact that a single ddA termination reaction identifies the A nucleotides of each strand, Fig. 6A, identifying the complementary base (in this case T) in the opposite strand (ie, the A termination sites on the strand) opposite strand correspond to the T nucleotide sites in the first strand). The complementary base can be located at the "missing" sites of the opposite strand. Note that the sequence of the opposite strand must be reversed before it is added to the missing sites, since it starts at the opposite end of the target gene and the chain extension takes place in the opposite direction.

In Fig. 6B wird eine zweite Abbruchsreaktion für ddC hinzugefügt. Dies gestattet die Identifizierung von C und seinem Komplement G in jedem Strang. Wenn diese Ergebnisse zu der ersten Reaktion addiert werden, wird eine volle DNA-Sequenz erhalten. So kann auf der Grundlage von zwei Abbruchsreaktionen, die jeweils einen ddNTP-Ketten-Terminator verwenden, die volle 4-Bahnen-Sequenz eines Gens erhalten werden.In Fig. 6B, a second termination reaction for ddC is added. This allows the identification of C and its complement G in each strand. When these results are added to the first reaction, a full DNA sequence is obtained. Thus, based on two termination reactions, each using a ddNTP chain terminator, the full 4-pathway sequence of a gene can be obtained.

Die Basenbenennung und das Zusammenstellen der Sequenzen, wie in den Fig. 6A und 6B erläutert, kann unter Verwendung von GeneObjects-Software (Visible Genetics Inc., Toronto) und unter Verwendung von Techniken erleichtert werden, die in den US-Patentanmeldungen Nr. 08/497,202 und 08/670,534, auf die hiermit Bezug genommen wird, offenbart sind.The base designation and assembly of the sequences, as illustrated in Figures 6A and 6B, can be facilitated using Gene Objects software (Visible Genetics Inc., Toronto) and using techniques described in U.S. Patent Application Nos. 08 / 814,066 / 497,202 and 08 / 670,534, which are hereby incorporated by reference.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird in vielen Zusammenhängen vor­ teilhaft angewendet, einschließlich: (1) des Nachweises von Mutationen, insbesondere Mutationen von medizinischer Bedeutung, in Proben, die von einem menschlichen Patienten, einem Tier, einer Pflanze oder einem Mikroorganismus abstammen; (2) der Bestimmung des HLA-Typs, ergänzend zu Transplantationsverfahren; (3) des Nachweises und der Identifizierung von Mikroorganismen, insbesondere pathogenen Mikroorganismen, in einer Probe; und (4) der in-situ-Sequenzierungsreaktionen, um Sequenzierungsfragmente innerhalb einer histologischen Probe zu erzeugen, die dann von einem ausgewählten Ort auf dem Gewebepräparat entfernt und zur Sequenzanalyse auf ein Gel aufgetragen werden. Dieses letztgenannte Vorgehen ist besonders für die Auswertung von archivierten Proben in retrospektiven Untersuchungen nützlich, bei welchen der Ausgang eines Krankheitszustandes bekannt ist, aber die potentiell verursachende Mutation nicht. Dieses Verfahren kann mit markierten Primern für eine Einbasen-Sequenzierung (oder für eine Mehrbasen-Sequen­ zierung unter Verwendung mehrerer Gewebeproben) verwendet werden.The method of the present invention is used in many contexts partially applied, including: (1) the detection of mutations, in particular mutations of medical importance, in samples obtained from a human patient, an animal, a plant or a microorganism descended; (2) the determination of the HLA type, in addition to Transplant procedures; (3) the detection and identification of Microorganisms, in particular pathogenic microorganisms, in a sample; and (4) the in situ sequencing reactions to sequencing fragments within a histological sample, which is then generated by a selected location on the tissue preparation and for sequence analysis on Apply a gel. This last procedure is particularly for the Evaluation of archived samples useful in retrospective investigations, in which the outcome of a disease state is known, but the not causing potentially mutation. This procedure can be marked with Primers for single-base sequencing (or for multi-base sequencing ornamentation using multiple tissue samples).

Das Grundverfahren der Erfindung kann auch durch verschiedene Abwandlungen verbessert werden, ohne vom Bereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen. The basic method of the invention can also be achieved by various modifications can be improved without departing from the scope of the present invention.  

Beispielsweise können Verbesserungen bei der Reproduzierbarkeit und Empfind­ lichkeit erhalten werden, indem man eine Kombination eines Enzyms mit einer hohen Affinität für den Einbau von Didesoxynucleotidtriphosphaten in das sich verlängernde Polymer, z. B. Thermo Sequenase®, und eines Enzyms mit einer niedrigen Affinität für den Einbau von Didesoxynucleotidtriphosphaten in das sich verlängernde Polymer, z. B. Taq-Polymerase, unter Bedingungen verwendet, bei denen beide Enzyme aktiv die Matrizen-abhängige Primerverlängerungs­ polymerisation katalysieren. Wie oben bemerkt, erzeugt das Enzym mit hoher Affinität fast vollständig Abbruchsprodukte, wobei sehr wenige der Polymere tat­ sächlich zur vollen Länge verlängert werden. Andererseits erzeugt das Enzym mit niedriger Affinität fast ausschließlich Produkte mit voller Länge bei relativ wenig Abbruchsprodukten. Die Zugabe des Enzyms mit niedriger Affinität zur Reaktions­ mischung erhöht die Empfindlichkeit des Verfahrens durch die Erzeugung von mehr zu sequenzierendem Material mit voller Länge, ohne die Verarbeitungszeit zu steigern oder Verarbeitungsschritte hinzuzufügen. Die Steigerung der Empfindlichkeit kann gesteuert werden, indem man das in der Mischung vorliegende Verhältnis von Enzym mit hoher Affinität zu Enzym mit niedriger Affinität variiert.For example, improvements in reproducibility and sensitivity be obtained by combining a combination of an enzyme with a high affinity for the incorporation of dideoxynucleotide triphosphates in the extending polymer, z. Thermo Sequenase®, and an enzyme with a low affinity for the incorporation of dideoxynucleotide triphosphates in itself extending polymer, z. Taq polymerase used under conditions which both enzymes actively use the template-dependent primer extension catalyze polymerization. As noted above, the enzyme produces high levels Affinity almost completely kill products, with very few of the polymers did to be extended to full length. On the other hand, the enzyme produces with low affinity almost exclusively full length products at relatively low Demolition products. The addition of the enzyme with low affinity to the reaction mixture increases the sensitivity of the process by generating more full length material to be sequenced without the processing time increase or add processing steps. The increase of Sensitivity can be controlled by mixing that in the mix present ratio of high affinity enzyme to lower enzyme Affinity varies.

Es wird jedoch angemerkt, daß der Einschluß eines Enzyms mit niedriger Affinität unter Erzeugung eines Produktes mit voller Länge auch die Bildung eines sehr intensiven, markierten Produktpeaks mit voller Länge zur Folge hat. Dieser Peak kann die Analyse der Basen nahe dem Ende der Sequenz schwierig machen. Um die Vorteile einer gesteigerten Empfindlichkeit zu erhalten, während weniger Produkt mit voller Länge hergestellt wird, kann es wünschenswert sein, ein Enzym mit niedriger Affinität zu verwenden, welches thermolabiler als Taq-Polymerase ist, so daß das Enzym mit niedriger Affinität im wesentlichen am Ende der ersten 15 bis 25 Zyklen inaktiviert ist. Dies würde die Erzeugung von längeren Fragmenten früh im Assay und die Erzeugung von mehr abgebrochenen Fragmenten später im Assay gestatten. It is noted, however, that the inclusion of a low affinity enzyme producing a full-length product also makes the formation of a lot result in intense, labeled full-length product peaks. This peak may make analysis of the bases near the end of the sequence difficult. Around to get the benefits of increased sensitivity while less Product produced with full length, it may be desirable to have an enzyme low-affinity, which is more thermolabile than Taq polymerase is such that the low affinity enzyme is essentially at the end of the first 15 to 25 cycles is inactivated. This would be the generation of longer ones Fragments early in the assay and the production of more aborted Allow fragments later in the assay.  

Die Reaktionsmischung der Erfindung kann auch andere Additive einschließen, welche die Bildung von Sequenzierungsfragmenten verstärken. Beispielsweise ist ein Produkt, das als Taq-Start® Antibody bezeichnet wird, ein monoklonaler Anti­ körper, der sich an Taq-Polymerase bindet und deren Aktivitäten blockiert. Dieser Antikörper wird PCR-Reaktionen, die Taq-Polymerase verwenden, zugesetzt, um die Enzymaktivität während des Versuchsaufbaus zu blockieren, um die Bildung von nicht-spezifischen Amplifikationsprodukten zu verhindern oder zu verringern. TaqStart® Antibody kann in der vorliegenden Erfindung mit Thermo Sequenase® verwendet werden, um nicht-spezifische Primerverlängerungsreaktionen zu verringern.The reaction mixture of the invention may also include other additives, which enhance the formation of sequencing fragments. For example a product called Taq-Start® Antibody, a monoclonal anti body, which binds to Taq polymerase and blocks their activities. This Antibody is added to PCR reactions using Taq polymerase to to block the enzyme activity during the experimental setup to increase the formation prevent or reduce non-specific amplification products. TaqStart® Antibody can be used in the present invention with Thermo Sequenase® can be used to non-specific primer extension reactions to decrease.

Das Verfahren der Erfindung kann auch in Verbindung mit Johnson & John­ son-Techniken, die als "PCR IN A POUCH" bekannt sind, welche im US-Patent Nr. 5,460,780 beschrieben ist, auf das hiermit Bezug genommen wird, verwendet werden.The process of the invention may also be used in conjunction with Johnson & John son techniques known as "PCR IN A POUCH" described in US Pat. 5,460,780, incorporated herein by reference become.

Während das bevorzugte Verfahren zur Sequenzierung von Nucleinsäure-Poly­ meren gemäß der Erfindung die Verwendung eines Einschrittverfahrens, wie oben beschrieben, beinhaltet, umfaßt die Erfindung auch andere Verwendungen von unkonventionellen Nucleotiden bei der Herstellung von Sequenzierungs­ fragmenten, um einen Mechanismus für die Verringerung des Risikos der Mitschleppungskontamination in Laboratorien bereitzustellen, welche Sequen­ zierungsreaktionen durch die Hinzufügung eines einleitenden Abbauschrittes vor jedem Sequenzierungsverfahren durchführen. So ist die Erfindung im breitesten Sinne ein Verfahren zur Sequenzierung eines Nucleinsäure-Polymers in einer Probe, in welchem die Probe mit einer Reaktionsmischung vereinigt wird, die ein unkonventionelles Nucleotid, drei konventionelle Nucleotid-Basen, mindestens eine Art eines Ketten-abbrechenden Nucleotidtriphosphats, ein Polymerase-Enzym und ein Enzym für den Abbau von Polynucleotiden enthält, welche die unkonventionelle Base enthalten. Die Sequenzierungsreaktion kann als einziger Schritt aus DNA in natürlicher Menge vorgenommen werden, wie oben beschrieben, oder sie kann bei einer zuvor amplifizierten Probe (vorzugsweise unter Verwendung eines unkonventionellen Nucleotids) durchgeführt werden. Die Sequenzierungsfragmente können unter Verwendung irgendeines bekannten Verfahrens, einschließlich einer Zyklussequenzierung, CAS, bidirektionalen Sequenzierung oder herkömmlichen Einzelverlängerungs-Sequenzierung, erhalten werden.While the preferred method for sequencing nucleic acid poly meren according to the invention, the use of a one-step process, such as described above, the invention also includes other uses of unconventional nucleotides in the production of sequencing fragments to provide a mechanism for reducing the risk of To provide carryover contamination in laboratories, which sequen ciation reactions by the addition of an introductory degradation step perform any sequencing procedure. So the invention is the widest A process for sequencing a nucleic acid polymer in a Sample in which the sample is combined with a reaction mixture containing a unconventional nucleotide, three conventional nucleotide bases, at least a type of chain-terminating nucleotide triphosphate, a polymerase enzyme and an enzyme for the degradation of polynucleotides comprising the contain unconventional base. The sequencing reaction can be the only Step from DNA in natural quantity, as above described or it may in a previously amplified sample (preferably  using an unconventional nucleotide). The Sequencing fragments can be synthesized using any of the known Procedure, including a cycle sequencing, CAS, bidirectional Sequencing or conventional single-extension sequencing, to be obtained.

Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben.The invention will now be described with reference to the following non-limiting Examples are described.

BEISPIEL 1EXAMPLE 1 DNA-Amplifikation mittels PCR mit dUTP und Uracyl-n-glycosylaseDNA amplification by PCR with dUTP and uracyl-n-glycosylase

PCR-MuttermischungPCR master batch HK-UNG-VerdünnungspufferHK-UNG dilution buffer 10 µl10 μl HK-UNGHK-UNG 1 µl1 μl 10X PCR-Puffer II10X PCR buffer II 55 µl55 μl 25 mM MgCl₂ 25 mM MgCl ₂ 66 µl66 μl dNTP-MischungdNTP mix 66 µl66 μl PCR-PrimerPCR primers 13 µl13 μl Steriles WasserSterile water 284 µl284 μl AmpliTaq DNA-Polymerase zu 5 E/µlAmpliTaq DNA polymerase at 5 U / μl 2,8 µl2.8 μl

wobei
HK-UNG-Verdünnungspuffer 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT und 0,1% Triton X-100 ist
HK-UNG Thermolabile Uracyl-N-Glycosylase, Epicentre Technologies, ist 10X PCR-Puffer II: 100 mM Tris-HCl, pH 8,3 bei 25°C; 500 mM KCl
dNTP-Mischung: 2,5 mM dATP, 2,5 mM dCTP, 2,5 mM dGTP und 2,5 mM dUTP
PCR-Primer: 2,0 µM Primer CT1590, 2,0 µM Primer KL1-Cy5.5
Primer KL1-Cy5.5: 5'-TCC GGA GCG AGT TAC GAA GA-3', markiert mit Cy5.5
Primer CT1 590: 5'-ATG CCC GGG ATT GGT TGA TC-3', unmarkiert
45 µl der PCR-Muttermischung wurden in ein dünnwandiges 200 µl-PCR-Röhrchen gegeben.in which
HK-UNG dilution buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT and 0.1% Triton X-100
HK-UNG Thermolabile Uracyl N-Glycosylase, Epicenter Technologies, is 10X PCR Buffer II: 100mM Tris-HCl, pH 8.3 at 25 ° C; 500 mM KCl
dNTP mixture: 2.5 mM dATP, 2.5 mM dCTP, 2.5 mM dGTP and 2.5 mM dUTP
PCR primer: 2.0 μM primer CT1590, 2.0 μM primer KL1-Cy5.5
Primer KL1-Cy5.5: 5'-TCC GGA GCG AGT TAC GAA GA-3 'labeled with Cy5.5
Primer CT1 590: 5'-ATG CCC GGG ATT GGT TGA TC-3 ', unlabelled
45 μl of the PCR masterbatch was added to a thin-walled 200 μl PCR tube.

5 µl eines rekombinanten Plasmids (pUC8, das kryptisches Plasmid von Chlamydia trachomatis, Serovar L1 enthielt) zu 400 Kopien µl/.5 μl of a recombinant plasmid (pUC8, the cryptic plasmid of Chlamydia trachomatis, Serovar L1) to 400 copies μl /.

Das Röhrchen wurde geschlossen und in die Thermozyklus-Apparatur gegeben. Die PCR wurde mit den folgenden Bedingungen gestartet:
The tube was closed and placed in the thermocycling apparatus. The PCR was started with the following conditions:

37°C 15 min
75°C 15 min
94°C 5 min
37 Zyklen des folgenden:
94°C 30 s
61°C 30 s
72°C 45 s
dann
72°C 5 min
Halten bei 4°C.37 ° C 15 min
75 ° C 15 min
94 ° C 5 min
37 cycles of the following:
94 ° C 30 s
61 ° C 30 s
72 ° C 45 s
then
72 ° C 5 min
Hold at 4 ° C.

Sequenzierung des dUTP-haltigen Amplicons mittels CLIP mit dUTP.Sequencing of the dUTP-containing amplicon by CLIP with dUTP.

CLIP-MuttermischungCLIP masterbatch Sequenzierungspuffersequencing buffer 22 µl22 μl CLIP-PrimerCLIP primer 12 µl12 μl Thermo Sequenase® bei 32 E/µlThermo Sequenase® at 32 U / μl 2,2 µl2.2 μl Steriles WasserSterile water 84,8 µl84.8 μl

wobei
Sequenzierungspuffer: Tris-HCl, 260 mM, pH 9,1 bei 25°C; MgCl₂ in which
Sequencing buffer: Tris-HCl, 260 mM, pH 9.1 at 25 ° C; MgCl ₂

, 39 mM in ddH₂ , 39 mM in ddH ₂

O
CLIP-Primer: 2,0 µM Primer CT1 431 F-Cy5.5, 2,0 µM Primer CT1 538R
Primer CT1431F-Cy5.5: 5'-GTG CAT AAA CTT CTG AGG AT-3', markiert mit Cy5.5
Primer CT1538R: 5'-GTA AAC GCT CCT CTG AAG TC-3', unmarkiert.O
CLIP primer: 2.0 μM primer CT1 431 F-Cy5.5, 2.0 μM primer CT1 538R
Primer CT1431F-Cy5.5: 5'-GTG CAT AAA CTT CTG AGG AT-3 'labeled with Cy5.5
Primer CT1538R: 5'-GTA AAC GCT CCT CTG AAG TC-3 ', unlabeled.

11 µl der CLIP-Muttermischung wurden zu einem Röhrchen gegeben, 2 µl des dUTP-haltigen Amplicons, durch die obige PCR-Reaktion erzeugt, wurden zu den 11 µl CLIP-Muttermischung gegeben, dies ist die Probenmuttermischung; 20 µl steriles Mineralöls wurden zu vier dünnwandigen 200 µl-PCR-Röhrchen gegeben.11 μl of the CLIP mother mix was added to a tube, 2 μl of the dUTP-containing amplicons generated by the above PCR reaction have been identified as Add 11 μl CLIP mother mix, this is the sample mother mix; 20 μl sterile mineral oil were added to four thin-walled 200 μl PCR tubes.

3 µl der Probenmuttermischung wurden zu jedem der vier Röhrchen gegeben, die das Mineralöl enthielten.3 μl of the sample mother mix was added to each of the four tubes, the contained the mineral oil.

3 µl A-Sequenzierungsmischung (750 µM dATP, 750 µM dCTP, 750 µM dGTP, 750 µM dUTP, 2,5 µM ddATP) wurden zu dem ersten der vier Röhrchen gegeben.3 μl A sequencing mixture (750 μM dATP, 750 μM dCTP, 750 μM dGTP, 750 μM dUTP, 2.5 μM ddATP) were added to the first of the four tubes.

3 µl C-Sequenzierungsmischung (750 µM dATP, 750 µM dCTP, 750 µM dGTP, 750 µM dUTP, 2,5 µM ddCTP) wurden zu dem zweiten der vier Röhrchen gegeben.3 μl C sequencing mixture (750 μM dATP, 750 μM dCTP, 750 μM dGTP, 750 μM dUTP, 2.5 μM ddCTP) became the second of the four tubes given.

3 µl G-Sequenzierungsmischung (750 µM dATP, 750 µM dCTP, 750 µM dGTP, 750 µM dUTP, 2,5 µM ddGTP) wurden zu dem dritten der vier Röhrchen gegeben.3 μl of G sequencing mixture (750 μM dATP, 750 μM dCTP, 750 μM dGTP, 750 μM dUTP, 2.5 μM ddGTP) were added to the third of the four tubes.

3 µl T-Sequenzierungsmischung (750 µM dATP, 750 µM dCTP, 750 µM dGTP, 750 µM dUTP, 2,5 µM ddTTP) wurden zu dem vierten der vier Röhrchen gegeben.3 μl of T-sequencing mixture (750 μM dATP, 750 μM dCTP, 750 μM dGTP, 750 μM dUTP, 2.5 μM ddTTP) were added to the fourth of the four tubes.

Die Röhrchen wurden geschlossen und in die Thermozyklus-Apparatur gegeben. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit den folgenden Bedingungen gestartet:
The tubes were closed and placed in the thermocycling apparatus. The sequencing reactions were started under the following conditions:

94°C 5 min
37 Zyklen des folgenden:
94°C 10 s
60°C 15 s
70°C 45 s
dann
70°C 5 min
Halten bei 4°C.94 ° C 5 min
37 cycles of the following:
94 ° C 10 s
60 ° C 15 s
70 ° C 45 s
then
70 ° C 5 min
Hold at 4 ° C.

Die Röhrchen wurden aus der Thermozyklus-Apparatur genommen, und 6 µl Beladungsfarbstoff wurden zu jedem Röhrchen (A, C, G und T) gegeben. 2 µl jedes Röhrchens, das den Beladungsfarbstoff enthielt, wurden auf einer MICROGENE BLASTER-Sequenzvorrichtung 20 Minuten bei 50°C bei einer Spannung von 1300 Volt wandern gelassen. Nach dem Durchlauf wurden die Basen bestimmt.The tubes were removed from the thermocycling apparatus and 6 μl Loading dye was added to each tube (A, C, G and T). 2 μl Each tube containing the loading dye was placed on a MICROGENE BLASTER sequence device for 20 minutes at 50 ° C with a Voltage of 1300 volts allowed to wander. After the run, the Bases determined.

BEISPIEL 2EXAMPLE 2 Sequenzierung eines dTTP-haltigen HIV-Amplicons durch CLIP mit dUTPSequencing of a dTTP-containing HIV Amplicon by CLIP with dUTP

CLIP-MuttermischungCLIP masterbatch Sequenzierpuffersequencing buffer 18,5 µl18.5 μl HK-UNGHK-UNG 1,0 µl1.0 μl dTTP-haltiges AmplicondTTP-containing amplicon 5,0 µl5.0 μl AmpliTAQ FS bei 15 E/µlAmpliTAQ FS at 15 U / μl 4,0 µl4.0 μl Steriles WasserSterile water 69,5 µl69.5 μl

wobei
Sequenzierungspuffer: Tris-HCl, 260 mM, pH 8,3 bei 25°C; MgCl₂ in which
Sequencing buffer: Tris-HCl, 260 mM, pH 8.3 at 25 ° C; MgCl ₂

, 32,5 mM in ddH₂ , 32.5 mM in ddH ₂

O
dTTP-haltiges Amplicon: ein 1,3 kB-Amplicon bei einer Konzentration von 100 ng/µl, das die Sequenz der Protease von HIV-1 enthält.
HK-UNG: Thermolabile Uracyl-N-Glycosylase, Epicentre Technologies.O
dTTP-containing amplicon: a 1.3 kb amplicon at a concentration of 100 ng / μl containing the sequence of the HIV-1 protease.
HK-UNG: Thermolabile Uracyl-N-Glycosylase, Epicenter Technologies.

7 µl A-Abbruchsmischung (640 mM dATP, 640 mM dCTP, 640 mM dGTP, 640 mM dUTP, 1 µM ddATP, 163 mM Primer PR170F-Cy5.5, 163 nM Primer PR170F-A-Cy5.5, 131 nM Primer PR543R-Cy5.0, 200 nM Primer PR543R) wurden zu einem dünnwandigen 200 µl-PCR-Röhrchen gegeben.7 μl of A-cutoff mixture (640 mM dATP, 640 mM dCTP, 640 mM dGTP, 640 mM dUTP, 1 μM ddATP, 163 mM primer PR170F-Cy5.5, 163 nM primer PR170F-A-Cy5.5,  131 nM primer PR543R-Cy5.0, 200 nM primer PR543R) became one thin-walled 200 μl PCR tubes.

7 µl C-Abbruchsmischung (640 mM dATP, 640 mM dCTP, 640 mM dGTP, 640 mM dUTP, 2 µM ddCTP, 163 mM Primer PR170F-Cy5.5, 163 nM Primer PR170F-A-Cy5.5, 131 nM Primer PR543R-Cy5.0, 200 nM Primer PR543R) wurden zu einem dünnwandigen 200 µl-PCR-Röhrchen gegeben.7 μl C-terminus mixture (640 mM dATP, 640 mM dCTP, 640 mM dGTP, 640 mM dUTP, 2 μM ddCTP, 163 mM primer PR170F-Cy5.5, 163 nM primer PR170F-A-Cy5.5, 131 nM primer PR543R-Cy5.0, 200 nM primer PR543R) were added a thin-walled 200 μl PCR tube.

7 µl G-Abbruchsmischung (640 mM dATP, 640 mM dCTP, 640 mM dGTP, 640 mM dUTP, 2 µM ddGTP, 163 mM Primer PR170F-Cy5.5, 163 nM Primer PR170F-A-Cy5.5, 131 nM Primer PR543R-Cy5.0, 200 nM Primer PR543R) wurden zu einem dünnwandigen 200 µl-PCR-Röhrchen gegeben.7 μl G-Crush Mixture (640 mM dATP, 640 mM dCTP, 640 mM dGTP, 640 mM dUTP, 2 μM ddGTP, 163 mM primer PR170F-Cy5.5, 163 nM primer PR170F-A-Cy5.5, 131 nM primer PR543R-Cy5.0, 200 nM primer PR543R) were added to a thin-walled 200 μl PCR tube.

7 µl T-Abbruchsmischung (640 mM dATP, 640 mM dCTP, 640 mM dGTP, 640 mM dUTP, 2 µM ddTTP, 163 mM Primer PR170F-Cy5.5, 163 nM Primer PR170F-A-Cy5.5, 131 nM Primer PR543R-Cy5.0, 200 nM Primer PR543R) wurden zu einem dünnwandigen 200 µl-PCR-Röhrchen gegeben, wobei
Primer PR170F-A-Cy5.5: 5'-GAG CCR ATA GAC AAG GAA YTR TAT-3', markiert mit Cy5.5
Primer PR170F-A-Cy5.5: 5'-GAG MCG ATA GAC AAG GRV CTG TAT-3', markiert mit Cy5.5
Primer PR543R-Cy5.5: 5'-ACT TTT GGG CCA TCC ATT CCT-3', markiert mit Cy5.0
Primer PR543R-Cy5.5: 5'-ACT TTT GGG CCA TCC ATT CCT-3', unmarkiert.7 μl T-terminator mixture (640 mM dATP, 640 mM dCTP, 640 mM dGTP, 640 mM dUTP, 2 μM ddTTP, 163 mM PR170F-Cy5.5 primer, 163 nM PR170F-A-Cy5.5 primer, 131 nM PR543R primer -Cy5.0, 200 nM primer PR543R) were added to a thin-walled 200 μl PCR tube, wherein
Primer PR170F-A-Cy5.5: 5'-GAG CCR ATA GAC AAG GAA YTR TAT-3 'labeled with Cy5.5
Primer PR170F-A-Cy5.5: 5'-GAG MCG ATA GAC AAG GRV CTG TAT-3 'labeled with Cy5.5
Primer PR543R-Cy5.5: 5'-ACT TTT GGG CCA TCC ATT CCT-3 'labeled with Cy5.0
Primer PR543R-Cy5.5: 5'-ACT TTT GGG CCA TCC ATT CCT-3 ', unlabeled.

5 µl der CLIP-Muttermischung wurden zu jedem der vier Röhrchen gegeben, welche die Abbruchsmischungen enthielten. Die Röhrchen wurden geschlossen und in die Thermozyklus-Apparatur gegeben. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit den folgenden Bedingungen gestartet:
5 μl of the CLIP mother mix was added to each of the four tubes containing the kill mixes. The tubes were closed and placed in the thermocycling apparatus. The sequencing reactions were started under the following conditions:

37°C 15 min
75°C 15 min
94°C 5 min
30 Zyklen des folgenden:
94°C 20 s
56°C 20 s
70°C 90 s
dann
70°C 5 min
Halten bei 4°C.37 ° C 15 min
75 ° C 15 min
94 ° C 5 min
30 cycles of the following:
94 ° C 20 s
56 ° C 20 s
70 ° C 90 s
then
70 ° C 5 min
Hold at 4 ° C.

Die Röhrchen wurden aus der Thermozyklus-Apparatur genommen, und 12 µl Beladungsfarbstoff wurden zu jedem Röhrchen (A, C, G und T) gegeben. 2 µl jedes Röhrchens, das den Beladungsfarbstoff enthielt, wurden auf einem Clipper (automatisierte Zweifarben-Sequenzapparatur) 35 Minuten bei 54°C bei einer Spannung von 1400 Volt wandern gelassen. Nach dem Durchlauf wurden die Basen in beiden Orientierungen (vorwärts und umgekehrt) bestimmt.The tubes were removed from the thermocycling apparatus and 12 μl Loading dye was added to each tube (A, C, G and T). 2 μl Each tube containing the loading dye was placed on a clipper (automated two-color sequence apparatus) 35 minutes at 54 ° C at a Voltage of 1400 volts allowed to wander. After the run, the Bases determined in both orientations (forward and vice versa).

BEISPIEL 3EXAMPLE 3 Zyklussequenzierungcycle sequencing Sequenzierung von M13 mit dUTPSequencing of M13 with dUTP

Sequenzierungs-MuttermischungSequencing masterbatch HK-UNG, 1/10 verdünntHK-UNG, diluted 1/10 1,0 µl1.0 μl Sequenzierungspuffersequencing buffer 2,0 µl2.0 μl Primer zu 3 µMPrimer to 3 μM 1,0 µl1.0 μl M13 ssDNAM13 ssDNA 1,0 µl1.0 μl Thermo Sequenase® zu 3,2 E/µlThermo Sequenase® at 3.2 E / μl 2,5 µl2.5 μl Steriles WasserSterile water 5,5 µl5.5 μl

wobei
Sequenzierungspuffer: Tris-HCl, 260 mM, pH 8,3 bei 25°C; MgCl₂ in which
Sequencing buffer: Tris-HCl, 260 mM, pH 8.3 at 25 ° C; MgCl ₂

, 39 mM in ddH₂ , 39 mM in ddH ₂

O
Primer M13 Universal-Cy5.5: 5'-GTA AAA CGA, CGG, CCA GT-3', markiert mit Cy5.5
M13 ssDNA: einzelsträngige DNA (M13) zu 200 ng/µl
HK-UNG: Thermolabile Uracyl-N-Glycosylase, Epicentre Technologies.O
Primer M13 Universal Cy5.5: 5'-GTA AAA CGA, CGG, CCA GT-3 ', labeled with Cy5.5
M13 ssDNA: single-stranded DNA (M13) at 200 ng / μl
HK-UNG: Thermolabile Uracyl-N-Glycosylase, Epicenter Technologies.

Aliquote 3 µl von A-Abbruchsmischung (750 µM dATP, 750 µM dCTP, 750 µM dGTP, 750 µM dUTP, 2,5 µM ddATP) in einem dünnwandigen 200 µl-PCR-Röhrchen.Aliquots of 3 μl of A-terminator mixture (750 μM dATP, 750 μM dCTP, 750 μM dGTP, 750 μM dUTP, 2.5 μM ddATP) in a thin-walled 200 ul PCR tube.

Aliquote 3 µl von C-Abbruchsmischung (750 µM dATP, 750 µM dCTP, 750 µM dGTP, 750 µM dUTP, 2,5 µM ddCTP) in einem dünnwandigen 200 µl-PCR-Röhrchen.Aliquots 3 μl of C-terminus mixture (750 μM dATP, 750 μM dCTP, 750 μM dGTP, 750 μM dUTP, 2.5 μM ddCTP) in a thin-walled 200 ul PCR tube.

Aliquote 3 µl von G-Abbruchsmischung (750 µM dATP, 750 µM dCTP, 750 µM dGTP, 750 µM dUTP, 2,5 µM ddGTP) in einem dünnwandigen 200 µl-PCR-Röhrchen.Aliquot 3 μl of G-terminator mixture (750 μM dATP, 750 μM dCTP, 750 μM dGTP, 750 μM dUTP, 2.5 μM ddGTP) in a thin-walled 200 ul PCR tube.

Aliquote 3 µl von T-Abbruchsmischung (750 µM dATP, 750 µM dCTP, 750 µM dGTP, 750 µM dUTP, 2,5 µM ddTTP) in einem dünnwandigen 200 µl-PCR-Röhrchen.Aliquots of 3 μl of T-digestion mixture (750 μM dATP, 750 μM dCTP, 750 μM dGTP, 750 μM dUTP, 2.5 μM ddTTP) in a thin-walled 200 ul PCR tube.

Aliquote 3 µl der Sequenzierungs-Muttermischung in jedem der Terminations­ röhrchen. Man verschließe die Röhrchen und gebe sie in die Thermozy­ klus-Apparatur. Man starte die Sequenzierungsreaktion mit den folgenden Bedingungen:
Aliquots 3 μl of the sequencing masterbatch in each of the termination tubes. Close the tubes and place in the thermocycling apparatus. Start the sequencing reaction with the following conditions:

37°C 15 min
75°C 15 min
94°C 2 min
35 Zyklen des folgenden:
94°C 40 s
50°C 20 s
72°C 60 s
dann
72°C 2 min
Halten bei 4°C.37 ° C 15 min
75 ° C 15 min
94 ° C 2 min
35 cycles of the following:
94 ° C 40 s
50 ° C 20 s
72 ° C 60 s
then
72 ° C 2 min
Hold at 4 ° C.

Man nehme die Röhrchen aus der Thermozyklus-Apparatur und gebe 6 µl Beladungsfarbstoff zu jedem Röhrchen (A, C, G und T). Man lasse 2 µl jedes Röhrchens, das den Beladungsfarbstoff enthält, 35 Minuten auf einer MICROGENE BLASTER-Sequenzierapparatur bei 54°C bei einer Spannung von 1400 Volt wandern. Nach dem Durchlauf analysiere man die Daten, um die Sequenz zu bestimmen.Take the tubes from the thermocycling apparatus and add 6 μl Loading dye to each tube (A, C, G and T). Leave 2 μl each Tube containing the loading dye, 35 minutes on a MICROGENE BLASTER sequencing apparatus at 54 ° C at a strain of Hiking 1400 volts. After the run, analyze the data for the Sequence to determine.

Claims (15)

1. Verfahren zur Bestimmung der Position von mindestens einer ausgewählten Nucleotidspezies innerhalb einer interessierenden Region in einem Ziel-Nucleinsäure-Polymer in einer Probe, umfassend die Schritte: Vereinigen der Probe mit einer Reaktionsmischung, um Kettenverlängerungsprodukte zu synthetisieren, welche die Positionen der ausgewählten Nucleotidspezies innerhalb der interessierenden Region anzeigen, und Auswerten der so erzeugten Produkte, wobei die Reaktionsmischung, die mit der Probe vereinigt wird, ein unkonventionelles Nucleotid und ein erstes Enzym umfaßt wobei das erste Enzym wirksam ist, um Polynucleotide abzubauen, welche das unkonventionelle Nucleotid enthalten.1. Method for determining the position of at least one selected Nucleotide species within a region of interest in one A target nucleic acid polymer in a sample, comprising the steps of: combining the sample with a reaction mixture to chain extension products to synthesize the positions of the selected nucleotide species within the region of interest, and evaluating the so produced products, the reaction mixture containing the sample , an unconventional nucleotide and a first enzyme wherein the first enzyme is effective to break down polynucleotides, which contain the unconventional nucleotide. 2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem Ziel- und Nicht-Ziel-Nuclein­ säure-Polymere in der Probe in im wesentlichen natürlicher relativer Menge vorliegen.The method of claim 1, wherein target and non-target nuclei acidic polymers in the sample in a substantially natural relative amount available. 3. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem die Reaktionsmischung weiter ein thermisch stabiles Polymerase-Enzym umfaßt, welches Didesoxynucleotide in ein sich verlängerndes Nucleinsäure-Polymer mit einer Geschwindigkeit einbaut, die nicht weniger als das 0,4fache der Geschwindigkeit des Einbaus von Desoxynucleotiden beträgt.3. The method of claim 2, wherein the reaction mixture further thermally stable polymerase enzyme comprising dideoxynucleotides in an extending nucleic acid polymer at a rate which is not less than 0.4 times the speed of the Incorporation of deoxynucleotides is. 4. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Reaktionsmischung weiter mindestens zwei Oligonucleotid-Primer umfaßt welche, wenn sie mit der Ziel-DNA hybridisiert werden, so orientiert sind, daß sie eine Ketten­ verlängerung aufeinander zu über die interessierende Region hinweg gestatten. 4. The method of claim 1, wherein the reaction mixture further at least two oligonucleotide primers comprise which, when combined with the Target DNA are hybridized so oriented that they form a chain extension towards each other across the region of interest allow.   5. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:

• (a) Vereinigen der Probe in der Reaktionsmischung mit einem ersten und zweiten Primer, einer Nucleotidtriphosphat-Ausgangsmaterialmischung, einem Ketten-abbrechenden Nucleotidtriphosphat und einem thermisch stabilen Polymerase-Enzym, wobei sich der erste und zweite Primer an den Sinn- bzw. Antisinn-Strang des Ziel-Nucleinsäure-Polymers an Stellen binden, welche die ausgewählte Region flankieren;
• (b) Inkubieren der Reaktionsmischung über einen Zeitraum, der ausreicht, um den Abbau von jeglichen Nucleinsäure-Polymeren, die das unkon­ ventionelle Nucleotid einschließen, durch das erste Enzym zu gestatten;
• (c) Einwirkenlassen einer Mehrzahl von Temperaturzyklen auf die Reaktionsmischung nach dem Inkubationsschritt, wobei jeder derselben mindestens eine Hochtemperatur-Denaturierungsphase und eine Verlängerungsphase bei niedrigerer Temperatur einschließt, wodurch eine Mehrzahl von abgebrochenen Fragmenten erzeugt wird; und
• (d) Auswerten der abgebrochenen Fragmente, die während der zusätzlichen Zyklen erzeugt wurden, um die Positionen der Nucleinsäure, die dem Ketten-abbrechenden Nucleotidtriphosphat entsprechen, innerhalb der ausgewählten Region zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Ziel-Nucleinsäure-Polymer und Nicht-Ziel-Nucleinsäure-Polymer in natürlicher Menge enthält und daß die Polymerase derart ist, daß sie Didesoxynucleotide in ein sich verlängerndes Nucleinsäure-Polymer mit einer Geschwindigkeit einbaut, die nicht weniger als das 0,4fache der Geschwindigkeit des Einbaus von Desoxynucleotiden beträgt.

5. The method of claim 1, comprising the steps of:

• (a) combining the sample in the reaction mixture with a first and second primer, a nucleotide triphosphate starting material mixture, a chain terminating nucleotide triphosphate and a thermally stable polymerase enzyme, wherein the first and second primers are attached to the sense or antisense strand the target nucleic acid polymer bind to sites flanking the selected region;
• (b) incubating the reaction mixture for a time sufficient to allow the degradation of any nucleic acid polymers including the unconventional nucleotide by the first enzyme;
• (c) exposing the reaction mixture after the incubation step to a plurality of temperature cycles, each of which includes at least one high temperature denaturation phase and a lower temperature extension phase, thereby producing a plurality of truncated fragments; and
• (d) evaluating the truncated fragments generated during the additional cycles to determine the positions of the nucleic acid corresponding to the chain terminating nucleotide triphosphate within the selected region, characterized in that the sample is target nucleic acid polymer and not Contains target nucleic acid polymer in a natural amount and that the polymerase is such that it incorporates dideoxynucleotides into a lengthening nucleic acid polymer at a rate not less than 0.4 times the rate of incorporation of deoxynucleotides.

6. Verfahren nach Anspruch 5, in welchem die Ziel- und Nicht-Ziel-Nucle­ insäure-Polymere in der Probe in im wesentlichen natürlicher relativer Menge vorliegen. The method of claim 5, wherein the target and non-target nucleus acidic polymers in the sample in a substantially natural relative Quantity available.   7. Verfahren nach Anspruch 6. in welchem das Molverhältnis des Didesoxy­ nucleotidtriphosphats zu dem entsprechenden Desoxynucleotidtriphosphat in der Reaktionsmischung 1 : 50 bis 1 : 1000 beträgt.7. The method of claim 6 in which the molar ratio of the dideoxy nucleotide triphosphate to the corresponding deoxynucleotide triphosphate in the reaction mixture is 1: 50 to 1: 1000. 8. Verfahren nach Anspruch 6, in welchem das Molverhältnis des Didesoxy­ nucleotidtriphosphats zu dem entsprechenden Desoxynucleotidtriphosphat in der Reaktionsmischung 1 : 100 bis 1 : 300 beträgt.8. The method according to claim 6, wherein the molar ratio of the dideoxy nucleotide triphosphate to the corresponding deoxynucleotide triphosphate in the reaction mixture is 1: 100 to 1: 300. 9. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem mindestens einer der Primer mit einer fluoreszierenden Markierung markiert ist.9. The method of claim 1, wherein at least one of the primer with a fluorescent label is labeled. 10. Verfahren nach Anspruch 9, in welchem die Primer jeweils mit unterschiedlichen fluoreszierenden Markierungen markiert sind.10. The method of claim 9, wherein the primers each with different fluorescent labels are marked. 11. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Enzym eine Glycosylase ist.The method of claim 1, wherein the enzyme is a glycosylase. 12. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das unkonventionelle Nucleotid dUTP ist.12. The method of claim 1, wherein the unconventional nucleotide dUTP is. 13. Verfahren nach Anspruch 12, in welchem das Enzym eine Glycosylase ist.The method of claim 12, wherein the enzyme is a glycosylase. 14. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Reaktionsmischung weiter ein zweites Polymerase-Enzym umfaßt das eine niedrige Affinität für den Einbau von Didesoxynucleotidtriphosphaten, verglichen mit Desoxynucleotidtriphosphaten, aufweist.14. The method of claim 1, wherein the reaction mixture further second polymerase enzyme has a low affinity for the Incorporation of dideoxynucleotide triphosphates compared to Deoxynucleotide triphosphates. 15. Verfahren nach Anspruch 14, in welchem die zweite Polymerase Taq-Polymerase ist.15. The method of claim 14, wherein the second polymerase Taq polymerase is.