DE19911971A1 - New nucleic acid encoding hemocyanin, useful for gene therapy of tumors and for recombinant production of fusion proteins for vaccination - Google Patents
New nucleic acid encoding hemocyanin, useful for gene therapy of tumors and for recombinant production of fusion proteins for vaccinationInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine für ein Hä mocyanin, eine Hämocyanin-Domäne oder ein Fragment mit den immunologischen Ei genschafter wenigstens einer Domäne von Hämocyanin kodierende Nukleinsäurese quenz, diese umfassende Konstrukte, die Nukleinsäuresequenzen oder die Konstrukte umfassende Wirtszellen, Verfahren zum Herstellen von Hämocyanin-Polypeptiden und rekombinante Hämocyanin-Polypeptide.The present invention relates to a nucleic acid molecule comprising one for a ha mocyanin, a hemocyanin domain or a fragment containing the immunological egg at least one domain of hemocyanin encoding nucleic acid quenz, these comprehensive constructs, the nucleic acid sequences or the constructs comprehensive host cells, methods of making hemocyanin polypeptides and recombinant hemocyanin polypeptides.
Hämocyanin ist ein blaues Kupferprotein, das frei gelöst im Blut zahlreicher Mollusken und Arthropoden auftritt und den Sauerstoff transportiert. Von den Mollusken enthalten die Cephalopoden, Chitonen, die meisten Gastropoden sowie einige Bivalvia Hä mocyanin. Hämocyanin ist bei den Arthropoden typisch für Arachniden, Xiphosuren, malakostrake Crustaceen und Scutigera. Zahlreiche Insektenarten weisen Proteine auf, die sich von Hämocyanin ableiten. Hämocyanine liegen extrazellulär vor und flottieren in der Hämolymphe.Hemocyanin is a blue copper protein that is freely dissolved in the blood of numerous mollusks and arthropods occurs and transports oxygen. Contained by the mollusks the cephalopods, chitons, most gastropods as well as some bivalvia ha mocyanin. Hemocyanin is typical of arthropods for arachnids, xiphosures, Malakostrake Crustaceen and Scutigera. Numerous species of insects have proteins, which are derived from hemocyanin. Hemocyanins are extracellular and float in the hemolymph.
Während das Arthropoden-Hämocyanin bei elektronenmikroskopischer Untersuchung einen Durchmesser von maximal 25 nm hat und eine Untereinheit ein Molekulargewicht von 75.000 Da aufweist, sind Molluskencyanine viel größer. So hat z. B. das Hämocya nin von Megathura einen Durchmesser von 35 nm und ist aus 2 Untereinheiten zusam mengesetzt. Jede Untereinheit hat ein Molekulargewicht von ca. 400.000 Da und ist in acht sauerstoffbindende Domänen aufgeteilt, die jeweils ein Molekulargewicht von ca. 50.000 Da haben. Die Domänen unterscheiden sich immunologisch. Diese Domänen können durch limitierte Proteolyse aus der Untereinheit freigesetzt werden.During the arthropod hemocyanin when examined by electron microscopy has a maximum diameter of 25 nm and a subunit has a molecular weight of 75,000 Da, molluscan cyanines are much larger. So z. B. Hemocya nin of Megathura has a diameter of 35 nm and is composed of 2 subunits set. Each subunit has a molecular weight of approximately 400,000 Da and is in divided eight oxygen-binding domains, each with a molecular weight of approx. Have 50,000 da. The domains differ immunologically. These domains can be released from the subunit by limited proteolysis.
Das im Elektronenmikroskop sichtbare Hämocyanin der Gastropoden hat ein Molekular gewicht von ca. 8 Mio. Da und ist ein Di-Dekamer. Im Gegensatz hierzu ist das Hä mocyanin der Cephalopoden als isoliertes Dekamer angeordnet, das sich auch in der Quartärstruktur deutlich vom Hämocyanin der Gastropoden unterscheidet. The hemocyanin of the gastropods visible in the electron microscope has a molecular weight of approx. 8 million Da and is a Di-Decamer. In contrast, the Hä mocyanin the cephalopods arranged as an isolated decamer, which is also in the Quaternary structure clearly distinguishes from the hemocyanin of the gastropods.
Von besonderem immunologischen Interesse ist das Hämocyanin der kalifornischen Schlüssellochschnecke Megathura crenulafa, einer "Keyhole Limpet". Das Hämocyanin wird deshalb auch als Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) bezeichnet. Hämocyanine sind sehr starke Antigene. Die Immunisierung eines Vertebraten führt zu einer bisher wenig verstandenen, unspezifischen Aktivierung des Immunsystems. Durch die allge meine Aktivierung des Immunsystems ist es dann möglich, auch eine Immunreaktion gegenüber anderen, bisher tolerierten Fremdstrukturen zu erreichen. KLH wird vor allem als Hapten-Träger verwendet, um so die Bildung von Antikörpern gegen das Hapten zu erreichen.Hemocyanin from California is of particular immunological interest Keyhole snail Megathura crenulafa, a "keyhole limpet". The hemocyanin is therefore also known as Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH). Hemocyanins are very strong antigens. The immunization of a vertebrate has led to one so far poorly understood, unspecific activation of the immune system. Due to the general my activation of the immune system then it is also possible an immune response compared to other, previously tolerated foreign structures. Above all, KLH will used as a hapten carrier so as to increase the formation of antibodies against the hapten to reach.
Neben Megathura crenulata gehört auch das Seeohr Haliotis tuberculata zur im Hinblick auf die Evolution relativ alten Gruppe der Archaegastropoda. Es ist bekannt, daß auch Haliotis Hämocyanin produziert.In addition to Megathura crenulata, the sea ear Haliotis tuberculata also belongs to the in view on the evolution relatively old group of the Archaegastropoda. It is known that too Haliotis produces hemocyanin.
KLH ist ein Gemisch aus zwei unterschiedlichen Hämocyaninen, die als KLH1 und KLH2 bezeichnet werden. Die Untereinheit des KLH1 ist ein 390 kDa Polypeptid, das aus acht globulären Domänen besteht, die entsprechend ihrer Reihenfolge in der Untereinheit mit 1a bis 1h bezeichnet werden. KLH2 hingegen weist ein Molekulargewicht von 350 kDa auf und enthält nach neuesten Daten ebenfalls 8 Domänen, die als 2a bis 2h bezeich net werden. In vivo bildet jede Art von Untereinheit Homo-Oligomere, wohingegen He tero-Oligomere nicht beobachtet wurden.KLH is a mixture of two different hemocyanins called KLH1 and KLH2 be designated. The KLH1 subunit is a 390 kDa polypeptide consisting of eight globular domains, which according to their order in the subunit 1a to 1h. KLH2, on the other hand, has a molecular weight of 350 kDa and, according to the latest data, also contains 8 domains, which are designated as 2a to 2h be net. In vivo, each type of subunit forms homo-oligomers, whereas He tero oligomers were not observed.
Durch limitierte Proteolyse und gekreuzte Immunelektrophorese der Untereinheit von KLH1 und KLH2 wurden amino-, interne und carboxy-terminale Domänen erhalten, de ren amino-terminale Sequenz bestimmt wurde (Söhngen et al., Eur. J. Biochem. 248 (1997), 602-614; Gebauer et al., Zoology 98(1994), 51-68). Die erhaltenen Sequenzen erlauben jedoch nicht den Entwurf sequenzspezifischer Primer und/oder Sonden, die für eine Hybridisierung mit genomischer DNA Erfolg versprechen. Obwohl beide KLH- Typen seit 1991 bzw. 1994 bekannt sind, konnte daher bisher keine Primärstruktur auf geklärt werden. By limited proteolysis and crossed immunoelectrophoresis of the subunit of KLH1 and KLH2 were obtained amino, internal and carboxy-terminal domains, de amino-terminal sequence was determined (Söhngen et al., Eur. J. Biochem. 248 (1997), 602-614; Gebauer et al., Zoology 98 (1994), 51-68). The sequences obtained however, do not allow the design of sequence specific primers and / or probes for hybridization with genomic DNA promise success. Although both KLH Types that have been known since 1991 and 1994, respectively, could therefore not have a primary structure be clarified.
Auf DNA-Ebene ist bisher in bezug auf Mollusken nur die cDNA-Sequenz der Hä mocyanin-Untereinheit aus dem Cephalopoden Octopus dofleini bekannt (Miller et al., J. Mol. Biol. 278 (1998), 827-842). Octopus dofleini ist phylogenetisch von den Archae gastropoden sehr weit entfernt. Eine Hämocyanin-Gensequenz aus Mollusken ist bisher überhaupt nicht bekannt.At the DNA level, so far only the cDNA sequence of the Ha is relevant to mollusks mocyanin subunit known from the cephalopod Octopus dofleini (Miller et al., J. Mol. Biol. 278 (1998), 827-842). Octopus dofleini is phylogenetic from the archae gastropods very far away. A haemocyanin gene sequence from molluscs is so far not known at all.
Wie von Miller et al. supra, beschrieben, ist es sowohl schwierig, eine einzige funktionel le Domäne (Funktionelle Einheit = Domäne; auch "funktionelle Domäne" genannt) zu isolieren als auch Gewebe zu erhalten, das zur Aufreinigung von mRNA für die cDNA- Sequenzierung geeignet ist.As described by Miller et al. supra, described, it is both difficult to have a single functional le domain (functional unit = domain; also called "functional domain") isolate as well as to obtain tissue which is used for the purification of mRNA for the cDNA Sequencing is suitable.
Bei der Analyse des Hämocyanins aus Megathura crenulata besteht eine weitere Schwierigkeit darin, daß die Versuchstiere ein Alter von 4 bis 8 Jahren erreicht haben müssen, um ihnen erstmals Hämolymphe entnehmen zu können. Nach Entnahme der Hämolymphe wird Hämocyanin bei diesen Tieren nicht nachproduziert. Bisher ist nicht bekannt, wie die Hämocyaninsynthese stimuliert werden könnte. Darüber hinaus ist die Zucht von Megathura äußerst aufwendig, da hierfür spezielle Strömungsbecken erfor derlich sind.There is another one when analyzing the hemocyanin from Megathura crenulata Difficulty in the fact that the test animals have reached the age of 4 to 8 years to be able to take hemolymph from them for the first time. After removing the Hemolymph is not reproduced in these animals. So far is not known how the hemocyanin synthesis could be stimulated. In addition, the Breeding Megathura is extremely complex, since special flow basins are required for this are such.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Wege bereitzustellen, um Hämocyanin und/oder Domänen davon in ausreichender Menge und kostengünstig produzieren zu können. Dies umfaßt die weitere Aufgabe, ein Verfahren anzugeben, mit dem dieses Hämocyanin hergestellt werden kann.It is therefore an object of the present invention to provide means and ways to hemocyanin and / or domains thereof in sufficient quantities and inexpensively to be able to produce. This includes the further task of specifying a method with which this hemocyanin can be produced.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Nukleinsäure-Molekül, umfas
send eine für ein Hämocyanin, eine Hämocyanin-Domäne oder ein funktionelles Frag
ment davon mit den immunologischen Eigenschaften wenigstens einer Domäne eines
Hämocyanins kodierende Nukleinsäuresequenz, wobei die Nukleinsäuresequenz aus
gewählt ist aus
This object is achieved according to the invention by a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence coding for a hemocyanin, a hemocyanin domain or a functional fragment thereof with the immunological properties of at least one domain of a hemocyanin, the nucleic acid sequence being selected from
-
a) der Gruppe der nachfolgend angegebenen DNA-Sequenzen bzw. der ihnen ent
sprechenden RNA-Sequenzen:
in SEQ ID NO: 1 (HtH1 Domäne b),
SEQ ID NO: 2 (HtH1 Domäne c),
SEQ ID NO: 3 (HtH1 Domäne d),
SEQ ID NO: 4 (HtH1 Domäne e),
SEQ ID NO: 5 (HtH1 Domäne f),
SEQ ID NO: 6 (HtH1 Domäne g),
SEQ ID NO: 7 (HtH1 Domäne h),
SEQ ID NO: 8 (partielle HtH2 Domäne b),
SEQ ID NO: 9 (HtH2 Domäne c),
SEQ ID NO: 10 (HtH2 Domäne d),
SEQ ID NO: 11 (HtH2 Domäne e),
SEQ ID NO: 12 (HtH2 Domäne f),
SEQ ID NO: 13 (HtH2 Dömäne g),
SEQ JD NO: 14 (HtH2 Domäne h),
SEQ ID NO: 15 (partielle KLH1 Domäne c),
SEQ ID NO: 16 (KLH1 Domäne d),
SEQ ID NO: 17 (partielle KLH1 Domäne e),
SEQ ID NO: 18 (KLH2 Domäne b),
SEQ ID NO: 19 (KLH2 Domäne c),a) the group of the DNA sequences given below or the RNA sequences corresponding to them:
in SEQ ID NO: 1 (HtH1 domain b),
SEQ ID NO: 2 (HtH1 domain c),
SEQ ID NO: 3 (HtH1 domain d),
SEQ ID NO: 4 (HtH1 domain e),
SEQ ID NO: 5 (HtH1 domain f),
SEQ ID NO: 6 (HtH1 domain g),
SEQ ID NO: 7 (HtH1 domain h),
SEQ ID NO: 8 (partial HtH2 domain b),
SEQ ID NO: 9 (HtH2 domain c),
SEQ ID NO: 10 (HtH2 domain d),
SEQ ID NO: 11 (HtH2 domain e),
SEQ ID NO: 12 (HtH2 domain f),
SEQ ID NO: 13 (HtH2 domain g),
SEQ JD NO: 14 (HtH2 domain h),
SEQ ID NO: 15 (partial KLH1 domain c),
SEQ ID NO: 16 (KLH1 domain d),
SEQ ID NO: 17 (partial KLH1 domain e),
SEQ ID NO: 18 (KLH2 domain b),
SEQ ID NO: 19 (KLH2 domain c), - b) Nukleinsäuresequenzen, die mit dem Gegenstrang einer Nukleinsäuresequenz nach (a) hybridisieren und für ein Polypeptid kodieren, das die immunologischen Ei genschaften wenigstens einer Domäne eines Hämocyanins aufweist;b) Nucleic acid sequences that coexist with a nucleic acid sequence hybridize according to (a) and code for a polypeptide that the immunological egg properties of at least one domain of a hemocyanin;
- c) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des genetischen Codes zu den unter (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen degeneriert sind und für ein Polypeptid kodieren, das die immunologischen Eigenschaften wenigstens einer Domäne eines Hä mocyanins aufweist;c) nucleic acid sequences which, on the basis of the genetic code, correspond to those under (a) and (b) defined DNA sequences are degenerate and code for a polypeptide, that the immunological properties of at least one domain of a ha has mocyanins;
- d) Nukleinsäuresequenzen, die mit einer der unter (a) bis (c) angegebenen Nuklein säuresequenzen hybridisieren und deren Gegenstrang für ein Polypeptid kodiert, das die immunologischen Eigenschaften wenigstens einer Domäne eines Hä mocyanins aufweist;d) Nucleic acid sequences which are linked to one of the nucleic acids specified under (a) to (c) hybridize acid sequences and their opposite strand codes for a polypeptide, that the immunological properties of at least one domain of a ha has mocyanins;
- e) Nukleinsäuresequenzen, die wenigstens 60% homolog zu einer der unter (a) ange gebenen Nukleinsäuresequenzen sind;e) Nucleic acid sequences which are at least 60% homologous to one of the under (a) given nucleic acid sequences;
- f) Varianten der unter (a) bis (e) angegebenen Sequenzen, wobei die Varianten Addi tionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen aufweisen und für ein Polypeptid kodieren, das die immunologischen Eigenschaften wenigstens einer Domäne von Hämocyanin aufweist; undf) Variants of the sequences given under (a) to (e), the variants Addi ions, deletions, insertions or inversions and for a polypeptide encode the immunological properties of at least one domain of Has hemocyanin; and
- g) Kombinationen mehrerer der unter (a) bis (f) angegebenen DNA-Sequenzen.g) combinations of several of the DNA sequences given under (a) to (f).
Im nachfolgenden werden einige Begriffe näher erläutert, um klarzustellen, wie sie im Zusammenhang der vorliegenden Anmeldung verstanden werden sollen.In the following, some terms are explained in more detail to clarify how they are used in Context of the present application should be understood.
Der Begriff "Hämocyanin", so, wie er nachfolgend in der Beschreibung verwendet wird, umfaßt vollständiges Hämocyanin, Hämocyanin-Domänen und/oder Fragmente, Hä mocyanin-Mutanten und Fusionsproteine. In bezug auf die Fusionsproteine sind insbe sondere solche umfaßt, bei denen die Fusion Hämocyanin und Antigene umfaßt.The term "hemocyanin", as used in the description below, includes complete hemocyanin, hemocyanin domains and / or fragments, ha mocyanin mutants and fusion proteins. With regard to the fusion proteins, esp specifically includes those in which the fusion includes hemocyanin and antigens.
Unter "Domänen" werden funktionelle Teilsequenzen der Hämocyanin-Untereinheiten verstanden, die beispielsweise durch limitierte Proteolyse voneinander abgetrennt wer den können. Weiterhin können sie unterschiedliche immunologische Eigenschaften aufweisen.Under "domains" are functional partial sequences of the hemocyanin subunits understood who separated from each other, for example, by limited proteolysis that can. They can also have different immunological properties exhibit.
Mit den "immunologischen Eigenschaften wenigstens einer Domäne von Hämocyanin" ist die Eigenschaft eines Polypeptids gemeint, in gleicher Weise wie wenigstens eine Domäne von Hämocyanin eine immunologische Antwort des Empfängers zu induzieren, der mit dem Polypeptid immunisiert wird. Unter "immunologischer Antwort" werden hier T- und/oder B-Zell-Antworten gegen Hämocyanin-Epitope verstanden, wie beispielswei se eine Antikörperproduktion. Die immunologische Reaktion kann beispielsweise beob achtet werden durch Immunisieren eines Säugers, wie z. B. einer Maus, einer Ratte oder eines Kaninchens mit dem entsprechenden Polypeptid und Vergleich der Immunantwort auf das zur Immunisierung verwendete Polypeptid mit der Immunantwort auf natürliche Hämocyanine.With the "immunological properties of at least one domain of hemocyanin" means the property of a polypeptide, in the same way as at least one Domain of hemocyanin to induce an immunological response of the recipient which is immunized with the polypeptide. Under "immunological response" here Understand T and / or B cell responses to hemocyanin epitopes, such as se an antibody production. The immunological reaction can be observed, for example be respected by immunizing a mammal, such as. B. a mouse, a rat or of a rabbit with the corresponding polypeptide and comparison of the immune response to the polypeptide used for immunization with the immune response to natural Hemocyanins.
Der Begriff "Antigen" umfaßt erfindungsgemäß sowohl Haptene, als auch schwache und starke Antigene. Haptene sind dadurch charakterisiert, daß sie Substanzen niedriger Molekülmasse (kleiner als 4000 Da) sind, jedoch ohne Kopplung an ein Trägermolekül nicht in der Lage sind, eine immunologische Reaktion auszulösen. Schwache Antigene sind Substanzen, die selbst bereits eine immunologische Reaktion auslösen können, deren Potential, eine immunologische Reaktion auslösen zu können, durch Kopplung mit einem Träger-Molekül auf Protein- und/oder DNA-Ebene, noch erhöht werden kann.According to the invention, the term “antigen” encompasses both haptens and weak and strong antigens. Haptens are characterized in that they have lower substances Molecular mass (less than 4000 Da), but without coupling to a carrier molecule are unable to trigger an immunological reaction. Weak antigens are substances that can themselves trigger an immunological reaction, their potential to trigger an immunological reaction through coupling with a carrier molecule at the protein and / or DNA level.
"His-Tag" bedeutet eine Sequenz von wenigstens 6 Histidin-Aminosäuren, die durch entsprechende Klonierung und Fusion mit einer exprimierbaren Sequenz zu einem Fu sionsprotein mit wenigstens 6 His-Resten am NH2-Terminus führt, das leicht durch Komplexierung mit einer Ni2+-Säule aufgereinigt werden kann."His-Tag" means a sequence of at least 6 histidine amino acids which, by appropriate cloning and fusion with an expressible sequence, leads to a fusion protein with at least 6 His residues at the NH 2 terminus, which is easily complexed with a Ni 2 + Column can be cleaned.
"Klonierung" soll alle im Stand der Technik bekannten Klonierungsmethoden umfassen, die hier zum Einsatz kommen könnten, die jedoch nicht alle im einzelnen beschrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören."Cloning" is intended to encompass all cloning methods known in the prior art, which could be used here, but which are not all described in detail because they belong to the natural tools of the specialist.
Unter "rekombinanter Expression in einer geeigneten Wirtszelle" sollen alle im Stand der Technik bekannten Expressionsmethoden in bekannten Expressionssystemen verstan den werden, die hier zum Einsatz kommen könnten, jedoch nicht alle im einzelnen be schrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören."Recombinant expression in a suitable host cell" should all in the state of the Expression methods known in the art are known in known expression systems those that could be used here, but not all in detail are written because they are the natural tools of the specialist belong.
Die im erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül enthaltene Nukleinsäuresequenz kann genomische DNA, cDNA oder synthetische DNA sein, wobei unter synthetischen DNA- Sequenzen auch solche verstanden werden, die modifizierte Internukleosid-Bindungen enthalten. Weiter kann es sich bei den Nukleinsäuresequenzen um RNA-Sequenzen handeln, was z. B. für die Expression mittels rekombinanter Vektorsysteme erforderlich sein kann. Die Nukleinsäuresequenzen gemäß (b) sind beispielsweise erhältlich durch Verwenden einer nachweisbar markierten Sonde, die einer der unter (a) angegebenen Sequenzen oder einem Fragment bzw. deren Gegenstrang entspricht, zum Screening von cDNA-/genomischen DNA-Bibliotheken aus Mollusken oder Arthropoden. Die der cDNA-Bibliothek zugrundeliegende mRNA ist vorzugsweise aus Mollusken-Geweben zu erhalten, die Hämocyanin besonders stark exprimieren, wie z. B. Mantel-Gewebe aus Gastropoden und Branchialdrüsengewebe aus Cephalopoden.The nucleic acid sequence contained in the nucleic acid molecule according to the invention can be genomic DNA, cDNA or synthetic DNA, with synthetic DNA Sequences are also understood to be those containing modified internucleoside bonds contain. Furthermore, the nucleic acid sequences can be RNA sequences act what z. B. required for expression by means of recombinant vector systems can be. The nucleic acid sequences according to (b) can be obtained, for example, from Use a detectably labeled probe that is one of those listed in (a) Sequences or a fragment or its opposite strand corresponds to the screening cDNA / genomic DNA libraries from mollusks or arthropods. The the The mRNA underlying the cDNA library is preferably derived from mollusc tissues get the hemocyanin express particularly strongly, such as. B. sheath fabric Gastropods and branchial glandular tissue from cephalopods.
Die Identifizierung positiver cDNA-/genomischer DNA-Klone erfolgt gemäß Standardver fahren. Vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press.Positive cDNA / genomic DNA clones are identified according to standard ver drive. See Maniatis et al., Molecular Cloning (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die unter (b) oder (d) angegebene Hybridi sierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt. Stringente Hybridisierungsbedin gungen sind z. B. 68°C über Nacht in 0,5 × SSC; 1% Blockierungsreagenz (Boehringer Mannheim); 0,1% Natriumlaurylsarcosinat und nachfolgendem Waschen mit 2 × SSC; 0,1% SDS.In a preferred embodiment, the hybridi indicated under (b) or (d) carried out under stringent conditions. Stringent hybridization conditions are z. B. 68 ° C overnight in 0.5 × SSC; 1% blocking reagent (Boehringer Mannheim); 0.1% sodium lauryl sarcosinate and subsequent washing with 2 × SSC; 0.1% SDS.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuresequenzen bereitgestellt, die wenigstens 60% homolog zu einer der unter (a) angegebenen Nukleinsäurese quenzen sind. Bevorzugt sind die Nukleinsäuresequenzen wenigstens 80% homolog zu einer der unter (a) angegebenen Nukleinsäuresequenzen. Besonders bevorzugt sind die Nukleinsäuresequenzen wenigstens 90% homolog zu einer der unter (a) angege benen Nukleinsäuresequenzen. Insbesondere sind die Nukleinsäuresequenzen wenig stens 95% homolog zu einer der unter (a) angegebenen Nukleinsäuresequenzen.In a preferred embodiment, nucleic acid sequences are provided which are at least 60% homologous to one of the nucleic acids listed under (a) are sequences. The nucleic acid sequences are preferably at least 80% homologous to one of the nucleic acid sequences given under (a). Are particularly preferred the nucleic acid sequences are at least 90% homologous to one of those given under (a) level nucleic acid sequences. In particular, the nucleic acid sequences are few at least 95% homologous to one of the nucleic acid sequences given under (a).
Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck "Homologie" Homologie auf DNA-Ebene, die gemäß bekannter Verfahren, z. B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Basic lo cal alignment search tool, S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) be stimmt werden kann. According to the invention, the term “homology” means homology at the DNA level that according to known methods, e.g. B. the computer-aided sequence comparisons (Basic lo cal alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) be can be voted.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße DNA-Sequenz eine Kombination mehrerer der unter (a) bis (f) angegebenen DNA-Sequenzen, die durch dem Fachmann bekannte Fusion und gegebenenfalls Klonierung erhalten werden kön nen. Diese Kombination sind von besonderem Interesse, da sie besonders immunogen sind. Insbesondere sind Kombinationen bevorzugt, die mehrere oder alle Domänen in der in der Untereinheit natürlicherweise vorkommenden Reihenfolge (a bis h) aufweisen. Besonders bevorzugt sind dabei Ausführungsformen, in denen die für die Domänen kodierenden Nukleinsäuresequenzen direkt im Raster aneinandergekoppelt sind.In a preferred embodiment, the DNA sequence according to the invention is a Combination of several of the DNA sequences specified under (a) to (f), which are characterized by fusion and optionally cloning known to those skilled in the art can be obtained nen. This combination is of particular interest because it is particularly immunogenic are. In particular, combinations are preferred which include several or all of the domains in the order (a to h) naturally occurring in the subunit. Embodiments in which those for the domains are particularly preferred coding nucleic acid sequences are coupled together directly in the grid.
Weiterhin werden Konstrukte bereitgestellt, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäure moleküle umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsge mäße Konstrukt einen zur Expression geeigneten Promotor, wobei die Nukleinsäurese quenz unter der Kontrolle des Promotors steht. Die Wahl des Promotors hängt vom zur Expression verwendeten Expressionssystem ab. Generell sind konstitutive Promotoren bevorzugt, jedoch sind auch induzierbare Promotoren wie z. B. der Metallothionein- Promotor möglich.Furthermore, constructs are provided which are the nucleic acid according to the invention include molecules. In a preferred embodiment, the invention comprises construct construct suitable for expression, the nucleic acid is under the control of the promoter. The choice of promoter depends on Expression used expression system. Generally, constitutive promoters are preferred, but inducible promoters such as. B. the metallothionein Promoter possible.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Konstrukt ferner eine Anti gen-kodierende Nukleinsäuresequenz, die direkt mit der erfindungsgemäßen Hä mocyanin-Nukleinsäure verbunden ist. Die Antigen kodierende Sequenz kann sowohl 5' als auch 3' relativ zur Hämocyanin-Sequenz oder auch an beiden Enden gelegen sein. Sie schließt im gleichen Leseraster entweder unmittelbar an die Hämocyanin- Sequenz an oder ist durch einen Nukleinsäure-Linker unter Wahrung des Leserasters mit ihr verbunden. Durch die Fusion der Antigen-kodierenden Sequenz mit der Hä mocyanin-Sequenz ist die Bildung eines Fusionsproteins beabsichtigt, in dem die Anti gen-kodierende Sequenz kovalent mit der Hämocyanin-Sequenz verbunden ist. Das er findungsgemäße Antigen ist hierbei ein medizinisch relevantes Antigen, das beispiels weise ausgewählt ist aus: Tumorantigenen, Virusantigenen und Antigenen bakterieller oder parasitärer Pathogene. Tumorantigene können hierbei beispielsweise Rb und p53 sein. Vorzugsweise stammen die Virusantigene aus immunologisch relevanten Viren, wie z. B. Influenza-Virus, Hepatitis-Virus und HIV. Pathogenantigene sind unter anderem solche aus Säugerpathogenen, insbesondere humanpathogenen Organismen, wie z. B. Plasmodium. Bakterielle Antigene können z. B. von Klebstella, Pseudomonas, E. coli, Vibrio cholerae, Chlamydia, Streptococcen oder Staphylococcen stammen.In a further preferred embodiment, the construct further comprises an anti gene-coding nucleic acid sequence directly with the Hä mocyanin nucleic acid is connected. The antigen coding sequence can be both 5 'and 3' relative to the hemocyanin sequence or at both ends his. In the same reading frame, it either connects directly to the hemocyanin Sequence on or is by a nucleic acid linker while maintaining the reading frame connected to her. By fusing the antigen coding sequence with the Hä mocyanin sequence is intended to form a fusion protein in which the anti gene coding sequence is covalently linked to the hemocyanin sequence. That he Antigen according to the invention is a medically relevant antigen, for example is wisely selected from: tumor antigens, virus antigens and bacterial antigens or parasitic pathogens. For example, tumor antigens can include Rb and p53 his. The virus antigens preferably originate from immunologically relevant viruses, such as B. influenza virus, hepatitis virus and HIV. Pathogen antigens are among others those from mammalian pathogens, especially human pathogenic organisms, such as. B. Plasmodium. Bacterial antigens can e.g. B. from Klebstella, Pseudomonas, E. coli, Vibrio cholerae, Chlamydia, streptococci or staphylococci.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Konstrukt ferner wenigstens ein Teil eines Vektors, insbesondere regulatorische Regionen, wobei der Vektor ausge wählt ist aus: Bacteriophagen wie λ-Derivaten, Adenoviren, Vacciniaviren, Baculoviren, SV40-Viren und Retroviren, vorzugsweise MoMuLV (Moloney Murine Leukemia Virus).In a further preferred embodiment, the construct further comprises at least part of a vector, in particular regulatory regions, the vector being out choose from: bacteriophages such as λ derivatives, adenoviruses, vaccinia viruses, baculoviruses, SV40 viruses and retroviruses, preferably MoMuLV (Moloney Murine Leukemia Virus).
Ferner ist ein Konstrukt bevorzugt, das zusätzlich eine His-Tag-kodierende DNA- Sequenz umfaßt, die bei Expression des Konstrukts zur Bildung eines Fusionsproteins mit einem His-Tag am NH2-Terminus des Hämocyanins führt, welches die Aufreinigung des Proteins an einer Nickel-Säule durch Chelat-Bildung erleichtert.Furthermore, a construct is preferred which additionally comprises a His-Tag-coding DNA sequence which, when the construct is expressed, leads to the formation of a fusion protein with a His-Tag at the NH 2 terminus of the hemocyanin, which purification of the protein on a nickel Column relieved by chelation.
Ferner stellt die Erfindung Wirtszellen bereit, die das Konstrukt enthalten und die zur Expression des Konstruktes geeignet sind. Im Stand der Technik sind zahlreiche pro karyontische und eukaryontische Expressionssysteme bekannt, wobei die Wirtszellen beispielsweisse ausgewählt sind aus prokaryontischen Zellen wie E. coli oder B. subtilis, aus eukaryontischen Zellen wie Hefezellen, Insektenzellen und Säugerzellen, z. B. CHO- Zellen, COS-Zellen oder HeLa-Zellen, sowie Derivaten davon. Im Stand der Technik sind beispielsweise bestimmte CHO-Produktionslinien bekannt, deren Glykosylierungs muster im Vergleich zu CHO-Zellen verändert sind. Die durch die Verwendung Glykosy lierungs-defizienter oder Glykosylierungs-verringerter Wirtszellen erhaltenen Hämocya nine verfügen möglicherweise über zusätzliche Epitope, die bei vollständiger Glykosylie rung ansonsten dem Immunsystem des Empfängers nicht zugänglich sind, so daß Hä mocyanine mit verringerter Glykosylierung unter Umständen eine erhöhte Immunoge nizität aufweisen.The invention further provides host cells which contain the construct and which are used for Expression of the construct are suitable. In the prior art, there are numerous pro caryotic and eukaryotic expression systems are known, the host cells for example selected from prokaryotic cells such as E. coli or B. subtilis, from eukaryotic cells such as yeast cells, insect cells and mammalian cells, e.g. B. CHO- Cells, COS cells or HeLa cells, as well as derivatives thereof. In the state of the art For example, certain CHO production lines are known, their glycosylation patterns are changed compared to CHO cells. By using Glykosy Hemocya obtained from deficient or glycosylation-reduced host cells nine may have additional epitopes associated with complete glycosyly tion are otherwise not accessible to the immune system of the recipient, so that Hä mocyanins with reduced glycosylation may have an increased immunogen have authenticity.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter ein Verfahren zum Herstellen eines Hämocyanin-Polypeptids. Dazu wird das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül und/oder das Konstrukt in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert und das Protein aus der Wirtszelle oder dem Medium mittels üblicher Verfahren isoliert. The present invention further relates to a method for producing a Hemocyanin polypeptide. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the invention and / or the construct is expressed in a suitable host cell and the protein is expressed the host cell or the medium is isolated by conventional methods.
Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen be kannt; vergleiche Recombinant Gene Expression Protocols in Methods in Molecular Biology, Band 62, Humana Press Totowa New Jersey (1995). Die Expression kann so wohl konstitutiv als auch induzierbar sein, wobei Induktoren wie beispielsweise IPTG und Zn2+ dem Fachmann bekannt sind. Das hergestellte Hämocyanins kann, falls ein His- Tag an den NH2-Terminus des Hämocyanin fusioniert wurde, durch Chelat-Bildung an einer Nickel-Säule aufgereinigt werden. Verfahren zum Aufreinigen von Hämocyanin, insbesondere KLH, finden sich in Harris et al., Micron 26 (1995), 201-212. Vorzugsweise wird das Hämocyanin durch Ionenaustausch-Chromatographie und/oder Gelfiltrations chromatographie aufgereinigt. Die Durchführung dieser Maßnahmen ist dem Fachmann bekannt.Numerous methods for the expression of DNA sequences are known to the person skilled in the art; see Recombinant Gene Expression Protocols in Methods in Molecular Biology, Volume 62, Humana Press Totowa New Jersey (1995). The expression can be constitutive as well as inducible, inducers such as IPTG and Zn 2+ being known to the person skilled in the art. If a His tag has been fused to the NH 2 terminus of the hemocyanin, the hemocyanin produced can be purified by chelation on a nickel column. Methods for the purification of hemocyanin, in particular KLH, can be found in Harris et al., Micron 26 (1995), 201-212. The hemocyanin is preferably purified by ion exchange chromatography and / or gel filtration chromatography. The implementation of these measures is known to the person skilled in the art.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäß hergestellte Hämocyanin modifiziert. Die Modifikationen umfassen hierbei die Di-, Oligo- und Poly merisierung des monomeren Ausgangsprodukts beispielsweise durch Quervernetzung, z. B. durch Dicyclohexylcarbodiimid oder Pegylierung oder Assoziation (self assembly). Die somit hergestellten Di-, Oligo- und Polymere können voneinander durch Gelfiltration abgetrennt werden. Insbesondere beabsichtigt ist die Bildung von Dekameren, Dideka meren oder Multi-Dekameren. Weitere Modifikationen umfassen Seitenketten- Modifikationen, beispielsweise von ε-Amino-Lysin-Resten des Hämocyanins, oder Ami no- bzw. Carboxy-terminale Modifikationen. Besonders bevorzugt ist die Modifikation des Hämocyanins durch kovalente Bindung an ein Antigen, wobei das Antigen stöchio metrisch oder nicht-stöchiometrisch mit dem Hämocyanin umgesetzt sein kann. Das An tigen ist vorzugsweise ausgewählt aus Tumorantigenen, Virusantigenen und Pathoge nenantigenen wie oben ausgeführt. Weitere Modifikationen umfassen posttranslationale Ereignisse, z. B. die Glykosylierung oder die partielle oder vollständige Deglykosylierung des Proteins.In a further preferred embodiment, that which is produced according to the invention Modified hemocyanin. The modifications here include the di, oligo and poly merization of the monomeric starting product, for example by crosslinking, e.g. B. by dicyclohexylcarbodiimide or pegylation or association (self assembly). The di-, oligo- and polymers thus produced can be separated from one another by gel filtration be separated. The formation of decamers, Dideka, is particularly intended mer or multi-decamers. Other modifications include side chain Modifications, for example of ε-amino-lysine residues of hemocyanin, or ami no- or carboxy-terminal modifications. The modification is particularly preferred of hemocyanin by covalent binding to an antigen, the antigen stoichio can be implemented metrically or non-stoichiometrically with the hemocyanin. The To tigen is preferably selected from tumor antigens, virus antigens and pathogens as described above. Other modifications include post-translational ones Events, e.g. B. glycosylation or partial or complete deglycosylation of the protein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erhaltene Hämocyanin bei rekombinanter Expression in Prokaryonten oder Glykosylierungs-defizienten Eukaryonten nicht glykosyliert. Ebenfalls in Betracht gezogen wird erfindungsgemäß Hämocyanin, das durch rekombinante Expression in zur Glykosylierung fähigen Eukaryonten wie Hefezel len, Insektenzellen oder Säugerzellen, wie CHO-Zellen oder HeLa-Zellen, glykosyliert ist.In a preferred embodiment, the hemocyanin obtained is recombinant Expression in prokaryotes or glycosylation-deficient eukaryotes not glycosylated. According to the invention, hemocyanin is also considered by recombinant expression in eukaryotes capable of glycosylation, such as yeast cell len, insect cells or mammalian cells, such as CHO cells or HeLa cells, glycosylated is.
In einer weiteren Ausführungsform werden Hämocyanin-Polypeptide zur Verfügung ge stellt, die eine Aminosäuresequenz umfassen, wobei die Aminosäuresequenz von einer oder mehreren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodiert wird.In a further embodiment, hemocyanin polypeptides are available which comprise an amino acid sequence, the amino acid sequence of one or more of the nucleic acid molecules according to the invention is encoded.
Bevorzugt werden Hämocyanin-Polypeptide zur Verfügung gestellt, die wenigstens eine
aus der folgenden Gruppe ausgewählte Aminosäuresequenz umfassen:
SEQ ID NO: 20 (HtH1 Domäne b),
SEQ ID NO: 21 (HtH1 Domäne c),
SEQ ID NO: 22 (HtH1 Domäne d),
SEQ ID NO: 23 (HtH1 Domäne e),
SEQ ID NO: 24 (HtH1 Domäne f),
SEQ ID NO: 25 (HtH1 Domäne g),
SEQ ID NO: 26 (HtH1 Domäne h),
SEQ ID NO: 27 (partielle HtH2 Domäne b),
SEQ ID NO: 28 (HtH2 Domäne c),
SEQ ID NO: 29 (HtH2 Domäne d),
SEQ ID NO: 30 (HtH2 Domäne e),
SEQ ID NO: 31 (HtH2 Domäne f),
SEQ ID NO: 32 (HtH2 Dömäne g),
SEQ ID NO: 33 (HtH2 Domäne h),
SEQ ID NO: 34 (partielle KLH1 Domäne c),
SEQ ID NO: 35 (KLH1 Domäne d),
SEQ ID NO: 36 (partielle KLH1 Domäne e),
SEQ ID NO: 37 (KLH2 Domäne b),
SEQ ID NO: 38 (KLH2 Domäne c),
oder ein Fragment einer dieser Sequenzen, das die immunologischen Eigenschaften
wenigstens einer Domäne von Hämocyanin aufweist.
Hemocyanin polypeptides are preferably provided which comprise at least one amino acid sequence selected from the following group:
SEQ ID NO: 20 (HtH1 domain b),
SEQ ID NO: 21 (HtH1 domain c),
SEQ ID NO: 22 (HtH1 domain d),
SEQ ID NO: 23 (HtH1 domain e),
SEQ ID NO: 24 (HtH1 domain f),
SEQ ID NO: 25 (HtH1 domain g),
SEQ ID NO: 26 (HtH1 domain h),
SEQ ID NO: 27 (partial HtH2 domain b),
SEQ ID NO: 28 (HtH2 domain c),
SEQ ID NO: 29 (HtH2 domain d),
SEQ ID NO: 30 (HtH2 domain e),
SEQ ID NO: 31 (HtH2 domain f),
SEQ ID NO: 32 (HtH2 domain g),
SEQ ID NO: 33 (HtH2 domain h),
SEQ ID NO: 34 (partial KLH1 domain c),
SEQ ID NO: 35 (KLH1 domain d),
SEQ ID NO: 36 (partial KLH1 domain e),
SEQ ID NO: 37 (KLH2 domain b),
SEQ ID NO: 38 (KLH2 domain c),
or a fragment of one of these sequences, which has the immunological properties of at least one domain of hemocyanin.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Hämocyanin-Polypeptide, erhält lich durch das rekombinante Herstellungsverfahren oder Modifikationen davon, bereit.In a further embodiment, the invention provides hemocyanin polypeptides Lich by the recombinant manufacturing process or modifications thereof.
Bevorzugt sind Hämocyanin-Polypeptide, die jede der Sequenzen SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 umfassen, und Hämocyanin-Polypeptide, die die Sequenzen SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 umfassen. Besonders bevorzugt handelt es sich bei die sen Hämocyanin-Polypeptiden um Hämocyanin 1 oder 2 aus Haliotis tuberculata.Preferred are hemocyanin polypeptides that each of the sequences SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 and hemocyanin polypeptides comprising the sequences SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33. It is particularly preferably the Hemocyanin polypeptides around hemocyanin 1 or 2 from Haliotis tuberculata.
Insbesondere bevorzugt ist Hämocyanin 1 aus Haliotis tuberculata, das ein scheinbares Molekulargewicht von 370 kDa in SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen auf weist. Weiterhin ist insbesondere Hämocyanin 2 aus Haliotis tuberculata bevorzugt, das ein scheinbares Molekulargewicht von 370 kDa in SDS-PAGE PAGE unter reduzieren den Bedingungen aufweist. Die Hämocyanine sind durch das in den Beispielen be schriebene selektive Dissoziationsverfahren aus Gesamt-Hämocyanin aus Haliotis tu berculata erhältlich.Particularly preferred is hemocyanin 1 from Haliotis tuberculata, which is an apparent Molecular weight of 370 kDa in SDS-PAGE under reducing conditions points. Furthermore, hemocyanin 2 from Haliotis tuberculata is particularly preferred, the under reduce an apparent molecular weight of 370 kDa in SDS-PAGE PAGE has the conditions. The hemocyanins are characterized by the be in the examples wrote selective dissociation methods from total hemocyanin from Haliotis tu berculata available.
Weiterhin bevorzugt sind Hämocyanin-Polypeptide, die jede der Sequenzen SEQ ID NO: 34, 35 und 36 umfassen, und Hämocyanin-Polypeptide, die jede der Sequenzen SEQ ID NO: 37 und 38 umfassen.Hemocyanin polypeptides which each of the sequences SEQ ID NO: 34, 35 and 36, and hemocyanin polypeptides, each of the sequences SEQ ID NO: 37 and 38.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei diesen Hämocyanin-Polypeptiden um voll ständiges Hämocyanin 1 (KLH1) oder 2 (KLH2) aus Megathura crenulata.These hemocyanin polypeptides are particularly preferably full permanent hemocyanin 1 (KLH1) or 2 (KLH2) from Megathura crenulata.
Weiterhin wird nicht-glykosyliertes und glykosyliertes Hämocyanin-Polypeptid, erhältlich durch Expression in zur Glykosylierung fähigen bzw. unfähigen Wirtszellen, bereitge stellt. Je nach vorgesehener Verwendung des Hämocyanin-Polypeptids kann das Gly kosylierungsrnuster von Hefe, inbesondere methylotropher Hefe, von COS- oder HeLa- Zellen bevorzugt sein.Furthermore, non-glycosylated and glycosylated hemocyanin polypeptide is available by expression in host cells capable or incapable of glycosylation poses. Depending on the intended use of the hemocyanin polypeptide, the Gly Kosylation patterns of yeast, especially methylotrophic yeast, of COS or HeLa Cells may be preferred.
Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfin dungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle und physiologisch verträgliche Zusatzstoffe, die im Stand der Technik bekannt sind, enthalten. Vorzugsweise werden die pharmazeuti schen Zusammensetzungen zur unspezifischen Immunstimulierung in Form einer Gentherapie eingesetzt, wobei nach Transformation mit einem geeigneten Vektor Hä mocyanin-Polypeptide exprimiert werden und zur Antigenisierung des Gewebes dienen.The invention further relates to pharmaceutical compositions which invent the nucleic acid molecules according to the invention and physiologically compatible additives which are known in the art. Preferably, the pharmaceutical compositions for non-specific immunostimulation in the form of a Gene therapy used, whereby after transformation with a suitable vector Hä mocyanin polypeptides are expressed and serve to antigenize the tissue.
Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemä ßen Nukleinsäuremoleküls, das mit einer Antigen-kodierenden DNA-Sequenz verbun den ist, zur spezifischen Immunisierung gegen dieses Antigen vor. Die Immunisierung beruht hierbei, ohne an diese Theorie gebunden zu sein, auf der unspezifischen Stim mulierung das Immunsystems durch Hämocyanin-Polypeptid-Epitope und die weiterge hende spezifische Immunisierung durch Erkennung von Antigen-Epitopen durch das Immunsystem.In particular, the present invention provides the use of an inventive ß nucleic acid molecule, which is linked to an antigen-coding DNA sequence which is for specific immunization against this antigen. The immunization is based on the unspecific stim, without being bound to this theory mulation of the immune system by haemocyanin polypeptide epitopes and the specific immunization by detection of antigen epitopes by the Immune system.
Eine solche Immunisierung ist besonders wertvoll im Hinblick auf Pathogen-Antigene, ganz besonders aber im Hinblick auf Tumorantigene. Die Anwendbarkeit der erfin dungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorer krankungen ergibt sich auch aus der Kreuzreaktivität der gebildeten Hämocyanin spezifischen Antikörper mit Kohlenhydratresten, die auf der Oberfläche von Tumoren auftreten, wie z. B. dem Thomsen-Friedenreich-Antigen, das bei der Mehrzahl von hu manen Tumoren wie Epithelialkarzinomen, Ovarialkarzinom, Kolonrektalkarzinom, Mammakarzinom, Bronchialkarzinom und Harnblasenkarzinom auftritt.Such immunization is particularly valuable with regard to pathogen antigens, but especially with regard to tumor antigens. The applicability of the inventions pharmaceutical composition according to the invention for the treatment of tumors Diseases also result from the cross-reactivity of the hemocyanin formed specific antibodies with carbohydrate residues on the surface of tumors occur, such as B. the Thomsen-Friedensreich antigen, which in the majority of hu manic tumors such as epithelial carcinoma, ovarian carcinoma, colon rectal carcinoma, Breast carcinoma, bronchial carcinoma and bladder carcinoma occurs.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Behandeln von parasitären Erkrankungen wie Schistosomiasis und für die Kokain- Mißbrauchsvorsorge eingesetzt werden.Furthermore, the pharmaceutical compositions according to the invention for treating parasitic diseases such as schistosomiasis and for ***e Prevention of abuse can be used.
Als weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zu sammensetzungen zur Verfügung gestellt, die ein erfindungsgemäßes Hämocyanin- Polypeptid in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch verträglichen Zu satzmitteln enthalten. Wie oben bereits erwähnt, kann ein solches Hämocyanin-Poly peptid aus einer vollständigen Hämocyanin-Untereinheit, aus einer oder mehreren Do mänen sowie aus einem oder mehreren Fragmenten solcher Domänen bestehen, vor ausgesetzt, daß diese Fragmente noch die immunologischen Eigenschaften wenigstens einer Domäne eines Hämocyanins aufweist. Eine solche pharmazeutische Zusammen setzung eignet sich durch die entweder unspezifische Immunstimulation, die allein auf das Hämocyanin zurückzuführen ist, oder durch die spezifische Immunreaktion auf mit dem Hämocyanin assoziierte Antigene z. B. als Antiparasitenmittel, Antivirusmittel oder Antitumormittel. So kann sie z. B. zum Behandeln von Schistosomiasis, Epithelialkarzi nomen, Ovarialkarzinom, Kolonrektalkarzinom, Mammakarzinom, Bronchialkarzinom und Harnblasenkarzinomen eingesetzt werden, eignet sich jedoch auch zum Behandeln von Bluthochdruck. Die Behandlung von Bluthochdruck wird erreicht, indem eine Immu nisierung mit Hilfe von erfindungsgemäßen Hämocyanin-β-adrenergen-Rezeptorpeptid- Konstrukten und/oder Fusionsproteinen durchgeführt wird.As a further embodiment of the present invention, pharmaceutical additives provided compositions that a hemocyanin invention Polypeptide in combination with one or more physiologically compatible additives means included. As already mentioned above, such a hemocyanin poly peptide from a complete hemocyanin subunit, from one or more Do men and consist of one or more fragments of such domains exposed that these fragments still have the immunological properties at least a domain of a hemocyanin. Such a pharmaceutical association Settlement is suitable by either unspecific immune stimulation, which is based solely on the hemocyanin is due, or by the specific immune response to with the haemocyanin-associated antigens e.g. B. as an anti-parasite agent, anti-virus agent or Antitumor agent. So it can e.g. B. for treating schistosomiasis, epithelial carcinoma noun, ovarian cancer, colon rectal cancer, breast cancer, bronchial cancer and bladder cancer are used, but are also suitable for treatment of hypertension. Treatment of high blood pressure is achieved by using an Immu with the help of hemocyanin-β-adrenergic receptor peptide according to the invention Constructs and / or fusion proteins is carried out.
In einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen als Impfstoffe verwendet. Sie können somit einen wertvollen Bei trag zur Prophylaxe von durch bekannte Pathogene verursachte Erkrankungen leisten. Dies gilt insbesondere für pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen ein Hä mocyanin-Polypeptid an ein Virus, Virusbestandteil, abgetötete Bakterien, Bakterienbe standteile, insbesondere Oberflächenproteine aus Virus- oder Bakterienhüllen, DNA, DNA-Bestandteile, anorganische oder organische Moleküle, z. B. Kohlenhydrate, Pepti de und/oder Glykoproteine gebunden ist.In a further embodiment, the pharmaceutical Compositions used as vaccines. You can thus a valuable case contribute to the prophylaxis of diseases caused by known pathogens. This applies in particular to pharmaceutical compositions in which a ha mocyanin polypeptide to a virus, virus component, killed bacteria, bacterial constituents, in particular surface proteins from virus or bacterial shells, DNA, DNA components, inorganic or organic molecules, e.g. B. carbohydrates, peptides de and / or glycoproteins is bound.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße phar mazeutische Zusammensetzung zur Kokain-Mißbrauchsvorsorge verwendet.According to a further preferred embodiment, the phar according to the invention pharmaceutical composition used for ***e abuse prevention.
Zur Applikation sowohl der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle als auch der Hämocyanin-Polypeptide eignen sich insbesondere Liposomen. Dementsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung Liposomen, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäu remolekül, ein erfindungsgemäßes Konstrukt oder ein erfindungsgemäßes Hämocyanin- Polypeptid umfassen.For the application of both the nucleic acid molecules according to the invention and the Hemocyanin polypeptides are particularly suitable for liposomes. Accordingly The present invention encompasses liposomes which contain a nucleic acid according to the invention remolecule, a construct according to the invention or a hemocyanin according to the invention Include polypeptide.
Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren zum Herstellen von Liposomen, die für pharmazeutische Zwecke verwendbar sind, bekannt. Die Selektivität der die erfindungs gemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Hämocyanin-Polypeptide enthaltenden Liposo men kann durch den zusätzlichen Einbau von Zellerkennungsmolekülen in die Liposo men erhöht werden, die selektiv an Zielzellen binden. Hierzu eignen sich insbesondere Rezeptorliganden, die an Rezeptoren der Zielzellen binden, oder, besonders im Fall von Tumoren, Antikörper, die gegen Oberflächenantigene der jeweils anvisierten Zielzellen gerichtet sind.Various methods for producing liposomes are known to those skilled in the art pharmaceutical purposes are known. The selectivity of the invention liposo containing nucleic acid molecules or hemocyanin polypeptides men can by the additional incorporation of cell recognition molecules in the Liposo that selectively bind to target cells. Are particularly suitable for this Receptor ligands that bind to receptors of the target cells or, especially in the case of Tumors, antibodies against surface antigens of the target cells targeted are directed.
Die erfindungsgemäßen Hämocyanin-Polypeptide sind außerdem als Trägermolekül für Arzneistoffe, wie z. B. Cytostatika, vorgesehen. Die Vergrößerung des Molekulargewich tes verlängert die physiologische Halbwertszeit der Arzneistoffe erheblich, da der Verlust durch Ultrafiltration in der Niere deutlich verringert ist.The hemocyanin polypeptides according to the invention are also a carrier molecule for Drugs such as B. cytostatics provided. The increase in molecular weight tes significantly prolongs the physiological half-life of the drugs because of the loss is significantly reduced by ultrafiltration in the kidney.
Die Zubereitung der Impfstoffe erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfahren; in ei nigen Ausführungsformen ist die zusätzliche Verwendung von Adjuvanzien wie z. B. Freundsches Adjuvanz oder Polysacchariden vorgesehen.The vaccines are prepared by methods known to those skilled in the art; in egg Some embodiments are the additional use of adjuvants such as. B. Freund's adjuvant or polysaccharides.
Die Erfindung stellt ferner Antikörper bereit, die spezifisch mit dem erfindungsgemäßen Hämocyanin-Polypeptid reagieren und erhältlich sind durch Immunisieren eines Ver suchstieres mit einem Hämocyanin-Polypeptid. Polyklonale Antikörper können durch Immunisieren beispielsweise von Kaninchen und anschließendem Gewinnen von Anti seren erhalten werden. Monoklonale Antikörper können gemäß Standardverfahren durch Immunisieren von z. B. Mäusen, Gewinnen und Immortalisieren der Milzzellen und Klonieren der Hybridome, die für Hämocyanin spezifische Antikörper produzieren, erhal ten werden.The invention also provides antibodies specific to that of the invention Hemocyanin polypeptide react and are available by immunizing a ver search animal with a hemocyanin polypeptide. Polyclonal antibodies can by Immunize rabbits, for example, and then gain anti sera can be obtained. Monoclonal antibodies can be made according to standard procedures by immunizing e.g. B. mice, collecting and immortalizing the spleen cells and Cloning of the hybridomas that produce antibodies specific for hemocyanin are obtained be.
Weiterhin wird ein Screening-Verfahren zum Identifizieren von Tumor-spezifischer DNA
in einer Zelle bereitgestellt, das die Schritte umfaßt:
A screening method for identifying tumor-specific DNA in a cell is also provided, which comprises the steps:
- a) das Inkontaktbringen zellulärer DNA und/oder zellulären Proteins mit einer Sonde umfassend das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül und/oder den erfindungs gemäßen Antikörper unda) contacting cellular DNA and / or cellular protein with a probe comprising the nucleic acid molecule according to the invention and / or the invention modern antibodies and
- b) das Nachweisen der spezifischen Bindung.b) the detection of the specific binding.
Vorzugsweise ist der nachzuweisende Tumor ein Harnblasenkarzinom, Epithelialkarzi nom, Ovarialkarzinom, Mammakarzinom, Bronchialkarzinom oder Kolonrektalkarzinom.The tumor to be detected is preferably a bladder carcinoma, epithelial carcinoma nom, ovarian cancer, breast cancer, bronchial cancer or colon rectal cancer.
Es ist beabsichtigt, mit den nachfolgenden Figuren und Beispielen die Erfindung zu er läutern, diese jedoch in keiner Weise einzuschränken. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung und der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die eben falls umfaßt sind.It is intended to accomplish the invention with the following figures and examples refine, but in no way restrict it. The specialist are due the description and examples of other embodiments accessible, just if included.
Fig. 1 zeigt die Charakterisierung und Aufreinigung von Haliotis tuberculata
Hämocyanin (HtH):
Fig. 1 shows the characterization and purification of Haliotis tuberculata hemocyanin (HtH):
- a) Elektronenmikroskopie von negativ gefärbtem Gesamt-HtH, das durch Ultrazen trifugation von Zell-freier Hämolymphe aufgereinigt wurde;a) Electron microscopy of negative stained total HtH by Ultrazen trifugation of cell-free hemolymph was purified;
- b) SDS-Polyacryamid-Gelelektrophorese (7,5% Polyacrylamid) von HtH1 im Ver gleich zu KLH (MW 370 kDa);b) SDS polyacryamide gel electrophoresis (7.5% polyacrylamide) of HtH1 in Ver equal to KLH (MW 370 kDa);
- c) Native Polyacrylamid-Gelektrophorese (5% Polyacrylamid) der HtH- Untereinheiten-Präparation, wobei die Anode am unteren Rand liegt;c) Native polyacrylamide gel electrophoresis (5% polyacrylamide) of HtH Subunit preparation, with the anode at the bottom;
- d) Gekreuzte Immunelektrophorese der beiden HtH-Untereinheiten unter Verwen dung von anti-HtH-Antikörpern aus Kaninchen;d) Crossed immunoelectrophoresis of the two HtH subunits using anti-HtH antibody from rabbits;
- e) Elektronenmikroskopie der verbleibenden HtH1-Didekamere (weiße Pfeile) nach der selektiven Dissoziation von HtH2 (schwarze Pfeile);e) Electron microscopy of the remaining HtH1 didecamers (white arrows) the selective dissociation of HtH2 (black arrows);
- f) Elutionsprofil der Gelfiltrationschromatographie (Biogel A15m) in Gegenwart von Ammoniummolybdat/Polyethylenglykol-Lösung (pH 5,9) nach der selektiven Dis soziation von HtH2 in seine Untereineinheit und nachfolgender Anreicherung von HtH1 durch Ultrazentrifugation;f) Elution profile of gel filtration chromatography (Biogel A15m) in the presence of Ammonium molybdate / polyethylene glycol solution (pH 5.9) after the selective dis association of HtH2 into its subunit and subsequent enrichment of HtH1 by ultracentrifugation;
- g) Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (6,5% Polyacrylamid) von durch Gelchromatographie aufgereinigten HtH1- und HtH2-Untereinheiten im Vergleich zum Ausgangsmaterial;g) Native polyacrylamide gel electrophoresis (6.5% polyacrylamide) by Gel chromatography compared purified HtH1 and HtH2 subunits to the starting material;
- h) Gekreuzte Immunelektrophorese von chromatographisch aufgereinigten HtH- Untereinheiten; und h) Crossed immunoelectrophoresis of chromatographically purified HtH Subunits; and
- i) Gekreuzte Immunelektrophorese der aufgereinigten HtH-Untereinheiten unter Verwendung von anti-KLH-Antikörpern aus Kaninchen, die für KLH1 bzw. KLH2 spezifisch sind.i) Crossed immunoelectrophoresis of the purified HtH subunits under Use of anti-KLH antibodies from rabbits for KLH1 and KLH2 are specific.
Fig. 2 zeigt die Untersuchung der Untereinheiten-Organisation von HtH1, wobei für die
lmmunelektrophorese anti-HtH1-Antikörper aus Kaninchen verwendet wurden
und die Anode sich auf der linken Seite befand:
FIG. 2 shows the investigation of the subunit organization of HtH1, anti-HtH1 antibodies from rabbits being used for immunoelectrophoresis and the anode being on the left side:
- a) Gekreuzte Immunelelektrophorese nach limitierter Proteolyse von HtH1 mit Hilfe von Elastase;a) Crossed immunoelectrophoresis after limited proteolysis of HtH1 with the help of elastase;
- b) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (7,5% Polyacrylamid) von Elastase gespaltener HtH1-Untereinheit;b) SDS polyacrylamide gel electrophoresis (7.5% polyacrylamide) from Elastase cleaved HtH1 subunit;
- c) Gekreuzte Immunelektrophorese der Elastase-Spaltprodukte der HtH1- Untereinheit;c) Crossed immunoelectrophoresis of the elastase cleavage products of HtH1- Subunit;
- d) Gekreuzte Immunelelektrophorese nach limitierter Proteolyse von HtH1 mit Hilfe von VB Protease;d) Crossed immunoelectrophoresis after limited proteolysis of HtH1 with the help from VB Protease;
- e) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (7,5% Polyacrylamid) von V8 Protease gespaltener HtH1-Untereinheit unde) SDS polyacrylamide gel electrophoresis (7.5% polyacrylamide) of V8 protease split HtH1 subunit and
- f) (k, m, o) Gekreuzte Immunelelektrophorese nach limitierter Proteolyse von HtH1 mit Hilfe der drei angegebenen Proteasen.f) (k, m, o) Crossed immunoelectrophoresis after limited proteolysis of HtH1 using the three specified proteases.
Fig. 3 zeigt die Auftrennung von proteolytischen Spaltprodukten der Untereinheit HtH1 mit Hilfe von HPLC. FIG. 3 shows the separation of proteolytic cleavage products of the HtH1 subunit using HPLC.
Fig. 4 zeigt die cDNA-Sequenz von HtH1 in Verbindung mit der Intronstruktur. Fig. 4 shows the cDNA sequence of HtH1 in connection with the intron structure.
Fig. 5 zeigt die abgeleitete Primärstruktur von HtH1. Fig. 5 shows the deduced primary structure of HtH1.
Fig. 6 zeigt die cDNA-Sequenz von HtH2 in Verbindung mit der Intronstruktur. Figure 6 shows the cDNA sequence of HtH2 in connection with the intron structure.
Fig. 7 zeigt die abgeleitete Primärstruktur von HtH2. Fig. 7 shows the deduced primary structure of HtH2.
Fig. 8 zeigt die cDNA-Sequenz von KLH1 in Verbindung mit der Intronstruktur. Fig. 8 shows the cDNA sequence of KLH1 in connection with the intron structure.
Fig. 9 zeigt die abgeleitete Primärstruktur von KLH 1. Fig. 9 shows the deduced primary structure of KLH. 1
Fig. 10 zeigt die cDNA-Sequenz von KLH2 in Verbindung mit der Intronstruktur. Figure 10 shows the cDNA sequence of KLH2 in connection with the intron structure.
Fig. 11 zeigt die abgeleitete Primärstruktur von KLH2. Fig. 11 shows the deduced primary structure of KLH2.
Individuen des europäischen Seeohrs Haliotis tuberculata aus dem Bereich der fran zösischen Atlantikküste wurden von S. M. E. L (Blainville sur Mer, Frankreich) und der Firma Biosyn (Fellbach, Deutschland) bereitgestellt. Die Tiere wurden in einem 300 l Seewasser-Aquarium bei 17°C gehalten und mit Braunalgen gefüttert. Zur Entnahme der Hämolyrnphe wurden die Seeohren in einem verschlossenen Plastiksack auf Eis gestellt. Nach einer Stunde waren große Volumina an Hämolymphe durch ihre Haut se zemiert worden. Es stellte sich heraus, daß das durch dieses Verfahren erhaltene Hä mocyanin identisch ist mit dem Hämocyanin, das durch Einschneiden einer Mulde in den Fuß heruntergekühlter Meeresschnecken unter Verwendung einer Skalpellklinge ge sammelt werden konnte. Die Blutzellen wurden von der Hämolymphe durch Zentrifuga tion bei 800 g über 30 min bei 4°C abgetrennt. Das gesamte Hämocyanin wurde sofort danach durch präparative Ultrazentrifugation bei 30000 g über 4 Stunden bei 4°C se dimentiert. Der Überstand wurde verworfen und das blaue Hämocyanin-Pellet wurde über Nacht in "Stabilisierungs-Puffer" (0,05 M Tris, 5 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,15 M NaCl, 1 mM PMSF, pH 7,4) suspendiert und bei 4°C gelagert.Individuals of the European abalone Haliotis tuberculata from the area of the French Atlantic coast were provided by SME L (Blainville sur Mer, France) and the company Biosyn (Fellbach, Germany). The animals were kept in a 300 l seawater aquarium at 17 ° C. and fed with brown algae. To remove the hemolyrnphe, the abalones were placed on ice in a sealed plastic bag. After an hour, large volumes of hemolymph had been cut through her skin. It was found that the hemocyanin obtained by this method is identical to the hemocyanin that could be collected by cutting a trough in the foot of chilled marine gastropods using a scalpel blade. The blood cells were separated from the hemolymph by centrifugation at 800 g for 30 min at 4 ° C. All of the hemocyanin was then immediately separated by preparative ultracentrifugation at 30,000 g for 4 hours at 4 ° C. The supernatant was discarded and the blue hemocyanin pellet was placed in "stabilization buffer" (0.05 M Tris, 5 mM CaCl 2 , 5 mM MgCl 2 , 0.15 M NaCl, 1 mM PMSF, pH 7.4) overnight ) suspended and stored at 4 ° C.
Intaktes HtH1 wurde unter Verwendung des von Harris et al., 1995, supra, beschriebe nen Verfahrens aus dem gesamten HtH durch selektive Dissoziation von HtH2 in Am moniummolybdat/Polyethylenglykol (1%/0,2%)-Lösung, pH 5,9 und nachfolgender Ultra zentrifugatiori erhalten. Das entstandene, teilweise aufgereinigte HtH1-Pellet wurde auf gelöst und durch Gelfiltration auf einer Biogel A15m-Vorrichtung zur Homogenität aufge reinigt. Der letzte Schritt ergab geringe Mengen von aufgereinigtem HtH2. Natives HtH1 und HtH2 wurde durch Dialyse gegen "Dissoziationspuffer" (0,13 M Glycin/NaOH, pH 9,6) bei 4°C über Nacht quantitativ in die Untereinheiten dissoziiert; die Gegenwart von EDTA war nicht erforderlich. 1 mM PMSF wurde bei jeder Stufe der Aufreinigung hinzu gefügt, um die Proteolyse zu hemmen.Intact HtH1 was described using that of Harris et al., 1995, supra NEN procedure from the entire HtH by selective dissociation of HtH2 in Am monium molybdate / polyethylene glycol (1% / 0.2%) solution, pH 5.9 and subsequent Ultra obtained centrifugation. The resulting, partially purified HtH1 pellet was opened dissolved and applied by gel filtration on a Biogel A15m device for homogeneity cleans. The last step resulted in small amounts of purified HtH2. Native HtH1 and HtH2 was dialyzed against "dissociation buffer" (0.13 M glycine / NaOH, pH 9.6) quantitatively dissociated into the subunits at 4 ° C overnight; the presence of EDTA was not required. 1 mM PMSF was added at each stage of the purification added to inhibit proteolysis.
Konventionelles "negative staining" wurde mit dem Einzel-Tropfen-Verfahren (Harris und Horne in Harris, J. R. (Herausgeber) Electron microscopy in biology, (1991), IRL Press Oxford, S. 203-228) durchgeführt. Kohlenstoffträger-Filme wurde anfänglich über 20 Se kunden glühentladen, um sie hydrophil und für das Protein adsorptiv zu machen. Man läßt die Proteinproben an den Kohlenstoffilmen über 60 Sekunden adsorbieren. Sodann werden die Puffersalze durch sequentielles Waschen mit vier aufeinanderfolgenden 20 µl Wassertropfen entfernt. Die Gitter werden schließlich mit einem 20 µl Tropfen 5% wäßrigen Ammoniummolybdats, enthaltend 1% Trehalose (pH 7,0) negativ gefärbt und bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Für die elektronenmikroskopische Untersu chung wird ein Zeiss EM 900 Transmissionselektronenmikroskop verwendet.Conventional "negative staining" was carried out using the single drop method (Harris and Horne in Harris, J.R. (Editor) Electron microscopy in biology, (1991), IRL Press Oxford, pp. 203-228). Carbon carrier films were initially over 20 Se Discharge customers to make them hydrophilic and adsorptive for the protein. Man allows the protein samples to adsorb on the carbon films over 60 seconds. Then the buffer salts by sequential washing with four consecutive 20 µl water drops removed. Finally, the grids are covered with a 20 µl drop of 5% aqueous ammonium molybdate containing 1% trehalose (pH 7.0) and colored let dry at room temperature. For the electron microscopic investigation a Zeiss EM 900 transmission electron microscope is used.
SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wurde gemäß des Verfahrens von Laemmli (Nature 227 (1970), 670-685) durchgeführt. Zur nativen PAGE wurde ein alka lisches System gemäß Markl et al. (1979) J. Comp. Physiol. 133 B, 167-175 mit einem 0,33 M Tris/Borat, pH 9,6 als Gelpuffer und 0,065 M Tris/Borat, pH 9,6 als Elektroden puffer verwendet. Gekreuzte und "crossed-line" Immunelektrophorese (IE) wurden ge mäß Weeke (Scand. J. Immunol. 2 (1973), Suppl. 1, 47-56) bzw. Kroll (Scand. J. Immu nol. 2, Suppl. 1 (1973), 79-81) durchgeführt. Kaninchenantikörper wurden von Charles River Deutschland (Kisslegg, Deutschland) gegen dissozüertes Gesamt-HtH und aufge reinigtes HtH1 erzeugt. Das Immunisierungsverfahren wurde durchgeführt gemäß Markt und Winter (J. Comp. Physiol. 159B (1989), 139-151).SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was carried out according to the procedure of Laemmli (Nature 227 (1970), 670-685). An alka system according to Markl et al. (1979) J. Comp. Physiol. 133 B, 167-175 with one 0.33 M Tris / Borate, pH 9.6 as gel buffer and 0.065 M Tris / Borate, pH 9.6 as electrodes buffer used. Crossed and "crossed-line" immunoelectrophoresis (IE) were carried out according to Weeke (Scand. J. Immunol. 2 (1973), Suppl. 1, 47-56) and Kroll (Scand. J. Immu nol. 2, Suppl. 1 (1973), 79-81). Rabbit antibodies were developed by Charles River Germany (Kisslegg, Germany) against dissociated total HtH and up purified HtH1 generated. The immunization procedure was carried out according to the market and Winter (J. Comp. Physiol. 159B (1989), 139-151).
Die limitierte Proteolyse wurde bei 37°C in 0,13 M Glycin/NaOH, pH 9,6 durch Hinzufü gen eines der nachstehenden Enzyme (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), die in 0,1 M NH4HCO3, pH 8,0 gelöst waren, durchgeführt: Staphylococcus aureus V8-Protease Typ XVII (8400), Papain Typ II aus Papaya-Milch (P-3125), Rinder-Pankreas-Elastase Typ IV (E-0258), Chymotrypsin und Trypsin. Die Hämocyanin-Konzentration lag zwischen 1 und 10 mg/ml. Die Endkonzentration des Enzyms betrug 2% (Gewicht/Gewicht). Die Proteolyse wurde nach 5 Stunden durch Einfrieren auf -20°C beendet. Das HPLC- Verfahren wurde auf einer Vorrichtung von Applied Biosystems (BAt, Bensheim, Deutschland) durchgeführt, die mit einem Modell-1000S-Dioden-Array-Detektor ausge stattet war. Die proteolytischen Fragmente wurden auf kleine Mono-Q-Anionaus tauscher-Säule aufgetragen (Pharmacia, Freiburg, Deutschland), dis mit 0,02 M Tris/HCl, pH 8,0 äquilibriert worden war und mit einem linearen Natriumchlorid- Gradienten (0,0 M-0,5 M CaCl) im gleichen Puffer bei einer Flußrate von 1 ml/min elu iert wurden. Alternativ wurden die proteolytischen Fragmente durch Ausschneiden der Banden aus nativen PAGE-Gelen (Markl et al., 1979) J. Comp. Physiol. 133 B, 167-175 isoliert, nachdem sie zuvor mit dem Roti-White-System (Roth, Karlsruhe, Deutschland) gemäß Fernandez-Patron et al. (1995) Anal. Biochem. 224, 203-211 invers-gefärbt wor den waren. Zur nachfolgenden Spaltung mit einem zweiten Enzym wurden die isolierten Fragmente zuerst Übernacht gegen 0,13 M Glycin/NaOH, pH 9,6 dialysiert, um NaCl zu entfernen.The limited proteolysis was carried out at 37 ° C. in 0.13 M glycine / NaOH, pH 9.6 by adding one of the following enzymes (Sigma, Deisenhofen, Germany), which was dissolved in 0.1 M NH 4 HCO 3 , pH 8, 0 were carried out: Staphylococcus aureus V8 protease type XVII (8400), papain type II from papaya milk (P-3125), bovine pancreatic elastase type IV (E-0258), chymotrypsin and trypsin. The hemocyanin concentration was between 1 and 10 mg / ml. The final concentration of the enzyme was 2% (w / w). The proteolysis was stopped after 5 hours by freezing to -20 ° C. The HPLC method was carried out on a device from Applied Biosystems (BAt, Bensheim, Germany) which was equipped with a model 1000S diode array detector. The proteolytic fragments were applied to a small Mono-Q anion exchange column (Pharmacia, Freiburg, Germany), which had been equilibrated with 0.02 M Tris / HCl, pH 8.0 and with a linear sodium chloride gradient (0, 0 M-0.5 M CaCl) were eluted in the same buffer at a flow rate of 1 ml / min. Alternatively, the proteolytic fragments were cut by cutting the bands from native PAGE gels (Markl et al., 1979) J. Comp. Physiol. 133 B, 167-175 isolated after having previously been used with the Roti-White system (Roth, Karlsruhe, Germany) according to Fernandez-Patron et al. (1995) Anal. Biochem. 224, 203-211 were inversely colored. For subsequent cleavage with a second enzyme, the isolated fragments were first dialyzed overnight against 0.13 M glycine / NaOH, pH 9.6 to remove NaCl.
Die durch das HPLC-Verfahren erhaltenen Proteine wurden in SDS-enthaltendem Pro benpuffer denaturiert und durch SDS-PAGE (Laemmli, 1970, supra; 7,5% Polyacryla mid) aufgetrennt. Um die Blockierung des NH2-Terminus zu verhindern wurde 0,6% (Gewicht/Gewicht) Thioglykolsäure zum Kathodenpuffer (Walsh et al., Biochemistry 27 (1988), 6867-6876) hinzugefügt. Die Proteinbanden wurden durch Elektro-Transfer auf ProBlot-Membranen (Applied Biosystems, Deutschland) in einer vertikalen Blotting- Kammer übertragen (25 mM Borat-Puffer, pH 8, 8, enthaltend 2 mM EDTA; 10 min/100 mA, 15 min/200 mA, 12 h/300 mA). Der Nachweis der einzelnen Polypeptide auf den Membranen wurde mit der Ponceau-S-Färbung durchgeführt. Die interessierenden Po lypeptid-Banden wurden ausgeschnitten und in einer 477A-Protein-Sequenzier-Vor richtung von Applied Biosystems sequenziert. Die Mengen der auf die Sequenziervor richtung aufgatragenen Polypeptide lag im unteren pmol-Bereich.The proteins obtained by the HPLC method were denatured in SDS-containing sample buffer and separated by SDS-PAGE (Laemmli, 1970, 7.5% Polyacryla mid). In order to prevent blocking of the NH 2 terminus, 0.6% (weight / weight) thioglycolic acid was added to the cathode buffer (Walsh et al., Biochemistry 27 (1988), 6867-6876). The protein bands were transferred by electro-transfer to ProBlot membranes (Applied Biosystems, Germany) in a vertical blotting chamber (25 mM borate buffer, pH 8, 8, containing 2 mM EDTA; 10 min / 100 mA, 15 min / 200 mA, 12 h / 300 mA). The detection of the individual polypeptides on the membranes was carried out using the Ponceau S staining. The polypeptide bands of interest were excised and sequenced in a 477A protein sequencer from Applied Biosystems. The amounts of the polypeptides applied to the sequencing device were in the lower pmol range.
Eine Lambda-cDNA-Expressionsbibliothek wurde aus Poly(A+)-RNA aus Haliotis Man telgewebe unter Verwendung des Vektors Lambda ZAP Express® gemäß den Herstel leranweisungen (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) hergestellt. Die Klone wurden unter Verwendung von HtH-spezifischen Kaninchenantikörpern isoliert. Die Nukleo tidsequenzierung wurde auf beiden Strängen unter Verwendung des Taq Dye deoxy Terminator®-Systems durchgeführt. Die Anordung der Sequenzen wurde mit der Soft ware CLUSTAL W (1.7)® und TREEVIEW® (Thompson et al., Nucl. Acids Res. 22 (1994), 4673-4680) durchgeführt.A lambda cDNA expression library was prepared from poly (A + ) RNA from Haliotis man tissue using the vector Lambda ZAP Express® according to the manufacturer's instructions (Stratagene, Heidelberg, Germany). The clones were isolated using HtH-specific rabbit antibodies. Nucleotide sequencing was performed on both strands using the Taq Dye deoxy Terminator® system. The sequences were arranged using the CLUSTAL W (1.7) ® and TREEVIEW® software (Thompson et al., Nucl. Acids Res. 22 (1994), 4673-4680).
Die Hämolymphe wurde aus adulten Seeohren gewonnen. Die Blutzellen wurden durch Zentrifugation entfernt und das Hämocyanin wurde sodann durch Ultrazentrifugation sedimentiert. Das blaue Hämocyanin-Pellet wurde in "Stabilisierungspuffer" (pH 7,4) wieder aufgelöst und in der Elektronenmikroskopie untersucht (Fig. 1a). Es bestand hauptsächlich aus typischen Di-Dekameren, begleitet von einem kleinen Anteil an De kameren und Tridekameren. Die Denaturierung in 2% SDS in Gegenwart reduzierender Substanzen und anschließender SDS-PAGE-Trennung ergab eine einzige Bande, die dem Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 370 kDa entsprach, wel ches nur geringfügig unterhalb des scheinbaren Untereinheiten-Gewichts von KLH (Fig. 1b) liegt. Die vollständige Dissoziation der Oligomere wie der Di-Dekamere in die nativen Polypeptide (Untereinheiten) wurde erreicht durch Übernacht-Dialyse von HtH gegen "Dissoziationspuffer" (pH 9,6). Natives PAGE-Verfahren, das auf diese Proben angewendet wurde, ergab eine Haupt- und eine Neben-Komponente (Fig. 1c). Die ge kreuzte Immunelektrophorese (gekreuzte IE) unter Verwendung von gegen aufgereinig tes Gesamt-HtH-erzeugten polyklonalen Kaninchen-Antikörpern zeigte zwei Komponen ten, die immunologisch unterschiedlich sind, jedoch die klassische Reaktion einer teil weise immunlogischen Identität aufweisen (Fig. 1d). Ihre präparative Isolierung (Fig. 1e-i) zeigte, daß sie die Untereinheiten von zwei unterschiedlichen HtH-Typen darstel len, bezeichnet als HtH1 und HtH2, und die Muster der nativen PAGE- und gekreuzten IE-Verfahren konnten jeder einzelnen zugeordnet werden (Fig. 1c, d).The hemolymph was obtained from adult abalones. The blood cells were removed by centrifugation and the hemocyanin was then sedimented by ultracentrifugation. The blue hemocyanin pellet was redissolved in "stabilization buffer" (pH 7.4) and examined in electron microscopy ( FIG. 1a). It mainly consisted of typical di-decamers, accompanied by a small proportion of de-camers and tridecamers. Denaturation in 2% SDS in the presence of reducing substances and subsequent SDS-PAGE separation resulted in a single band which corresponded to the polypeptide with an apparent molecular weight of 370 kDa, which was only slightly below the apparent subunit weight of KLH ( FIG. 1b ) lies. The complete dissociation of the oligomers such as the di-decamers into the native polypeptides (subunits) was achieved by overnight dialysis of HtH against "dissociation buffer" (pH 9.6). Native PAGE method applied to these samples gave a major and minor component ( Figure 1c). Crossed immunoelectrophoresis (crossed IE) using polyclonal rabbit antibodies raised against purified total HtH showed two components that are immunologically different, but have the classic response of a partially immunological identity ( FIG. 1d). Their preparative isolation ( Fig. 1e-i) showed that they represent the subunits of two different HtH types, designated HtH1 and HtH2, and the patterns of the native PAGE and crossed IE methods could be assigned to each one ( Fig . 1c, d).
Die Auftrennung von HtH1 und HtH2 wurde gemäß des Verfahrens zur selektiven Dis soziation gemäß Harris et al., 1995, supra, durchgeführt. In Ammoniummolybdat/Poly ethylenglykol war HtH1 im Oligomeren-Zustand (Di-Dekamere) vollständig stabil, wohin gegen HtH2 vollständig in die Untereinheiten dissoziierte (Fig. 1e). Dies ermöglichte die quantitative Sedimentation von HtH1 in der Ultrazentrifuge, wohin gegen der größte Teil des HtH2 im Überstand verblieb. Aus dem wieder aufgelösten Pellet wurden große Mengen an HtH1 durch Gelfiltrationschromatographie zur Homogenität aufgereinigt, welche auch geringe Mengen an reinem HtH2 ergab (Fig. 1f). Die Fraktionen wurden durch native PAGE (Fig. 1g) und gekreuzte IE (Fig. 1h, i) untersucht. Das Verfahren der selektiven Dissoziation von HtH2 entfernte sämtliche Tri-Dekamere aus den Proben, welches nahelegt, daß die letzteren aus HtH2, jedoch nicht aus HtH1 aufgebaut sind (Fig. 1e). Das selektive Dissoziationsverhalten von HtH2 und auch die Fähigkeit, Ag gregate zu bilden, die größer als in vivo-Di-Dekamere sind, entspricht den Eigenschaf ten von KLH2. Umgekehrt ähnelt die Stabilität von HtH1 unter diesen Bedingungen und seine Unfähigkeit, sich zu größeren Aggregaten als Di-Dekameren zu assemblieren, dem Verhalten von KLH1. Diese Verwandtschaft wird weiter belegt durch die Reaktion von Anti-KLH1 bzw. Anti-KLH2 Antikörpern gegen die beiden HtH-Typen (Fig. 1j-m). The separation of HtH1 and HtH2 was carried out according to the method for selective dissociation according to Harris et al., 1995, supra. In ammonium molybdate / polyethylene glycol, HtH1 was completely stable in the oligomeric state (di-decamers), whereas HtH2 completely dissociated into the subunits ( FIG. 1e). This enabled quantitative sedimentation of HtH1 in the ultracentrifuge, whereas most of the HtH2 remained in the supernatant. Large amounts of HtH1 were purified from the redissolved pellet by gel filtration chromatography to give homogeneity, which also gave small amounts of pure HtH2 ( FIG. 1f). The fractions were examined by native PAGE ( Fig. 1g) and crossed IE ( Fig. 1h, i). The method of selective dissociation of HtH2 removed all tri-decamers from the samples, which suggests that the latter are made up of HtH2 but not HtH1 ( Fig. 1e). The selective dissociation behavior of HtH2 and also the ability to form aggregates that are larger than in vivo di-decamers correspond to the properties of KLH2. Conversely, the stability of HtH1 under these conditions and its inability to assemble into larger aggregates than di-decamers is similar to the behavior of KLH1. This relationship is further demonstrated by the reaction of anti-KLH1 and anti-KLH2 antibodies against the two types of HtH ( Fig. 1j-m).
Die acht funktionellen Einheiten (FU's, häufig als "funktionelle Domänen" bezeichnet), die eine Mollusken-Hämocyanin-Untereinheit bilden, unterscheiden sich in der Primär struktur und weisen keine immunologische Kreuz-Reaktivität auf wie sich aus gekreuz ter IE ergibt. Im Fall der aufgereinigten HtH1 Untereinheit (Fig. 1g, h) wurden geringe Konzentraticmen fünf unterschiedlicher Proteasen (Elastase, V8-Protease, Papain, Trypsin und Chymotrypsin) verwendet, welche die Peptid-Bindungen zwischen benach barten FU's von KLH1 und KLH2 gespalten hatten (Gebauer et al., 1994, supra, Söhn gen et al., 1997, supra). Die Spaltprodukte wurden durch gekreuzte IE und SDS-PAGE (Fig. 2) untersucht. Elastase-Behandlung erzeugt acht einzelne FU's, abgeleitet aus der Anzahl an unterschiedlichen Immunpräzipitations-Gipfeln in der gekreuzten IE (Fig. 2a) und mit dem scheinbaren Molekulargewicht von ca. 50 kDa des Hauptteils der Spaltpro dukte in SDS-PAGE (Fig. 2b). Ein weiterer Präzipitationsgipfel wurde als FU-Dimer er kannt, welches durch unvollständige Spaltung des Segments ab (Fig. 2a) entstand. Durch HPLC-Verfahren mit einer Mono-Q-Säule (Fig. 3a) wurden zwei der Elastase- Spaltprodukte in einer ausreichenden Reinheit erhalten, um durch "crossed-line-IE" ihre klare Zuordnung zu zwei der acht Präzipitationsgipfel (Fig. 2c, d) zu ermöglichen. Die anderen vier Proteasen wiesen unterschiedliche Spaltmuster auf, die aus Gemischen einzelner FU's und größerer Fragmente, enthaltend zwei, drei oder mehrere FU's be standen (z. B. Fig. 2e, f). Viele von ihnen waren durch das HPLC-Verfahren in ausrei chender Menge angereichert (Fig. 3b-e), um ihre Identifikation in ihren entsprechenden SDS-PAGE- und gekreuzten IE-Mustem zu ermöglichen. Eine Anzahl dieser Kompo nenten wurde N-terminal durch Blot-Transfer von SDS-Gelen auf ProBlot®-Membrane (Tabelle I) sequenziert. Die Resultate wurden mit N-terminalen Sequenzen verglichen, die aus dem scheinbar orthologen Protein in Megathura crenulata, KLH 1 (Tabelle I), er halten worden waren, von dem die vollständige FU-Anordnung verfügbar ist (Söhngen et al., 1997, s upra; vgl. Fig. 5b). Das Ergebnis des gesamten Ansatzes führte zur Be stimmung de- vollständigen FU-Anordnung innerhalb der HtH1-Untereinheit (Fig. 2a).The eight functional units (FUs, often referred to as "functional domains"), which form a mollusc-hemocyanin subunit, differ in the primary structure and have no immunological cross-reactivity, as can be seen from crossed IE. In the case of the purified HtH1 subunit (FIGS . 1g, h), low concentrations of five different proteases (elastase, V8 protease, papain, trypsin and chymotrypsin) were used, which had cleaved the peptide bonds between neighboring FUs of KLH1 and KLH2 ( Gebauer et al., 1994, supra, Söhn gen et al., 1997, supra). The cleavage products were examined by crossed IE and SDS-PAGE ( Fig. 2). Elastase treatment produces eight individual FUs, derived from the number of different immunoprecipitation peaks in the crossed IE ( Fig. 2a) and with the apparent molecular weight of approx. 50 kDa of the majority of the fission products in SDS-PAGE ( Fig. 2b) . Another precipitation summit was known as FU dimer, which resulted from incomplete splitting of the segment ( Fig. 2a). By HPLC with a Mono-Q column ( FIG. 3a), two of the elastase cleavage products were obtained in a sufficient purity in order to use "crossed-line IE" to clearly assign them to two of the eight precipitation peaks ( FIG. 2c, d) enable. The other four proteases had different cleavage patterns, which consisted of mixtures of individual FUs and larger fragments containing two, three or more FUs (e.g. FIGS. 2e, f). Many of them were enriched by the HPLC method in sufficient amounts ( Fig. 3b-e) to enable their identification in their corresponding SDS-PAGE and crossed IE mustems. A number of these components were sequenced N-terminally by blot transfer from SDS gels to ProBlot® membrane (Table I). The results were compared to N-terminal sequences obtained from the apparently orthologous protein in Megathura crenulata, KLH 1 (Table I), from which the complete FU arrangement is available (Söhngen et al., 1997, s upra; see Fig. 5b). The result of the entire approach led to the determination of the complete FI arrangement within the HtH1 subunit ( FIG. 2a).
Insbesondere ergab die Spaltung der HtH1-Untereinheit (1-abcdefgh) mit V8-Protease vier Präzipitationsgipfel in der gekreuzten IE (Fig. 2e). Das SDS-PAGE-Verfahren zeigte fünf unterschiedliche Fragmente (Fig. 2f): 220 kDa (5 FU's), 185 kDa (4 FU's), 100 kDa (2 FU's), 55 kDa (1 FU) und 46 kDa (1 FU). Das 100 kDa-Fragment wurde durch das HPLC-Verfahren (Fig. 3b) isoliert und durch N-terminale Sequenzierung als 1-ab identi fiziert, da die Sequenz identisch zu derjenigen der intakten Untereinheit war (Tabelle I). In dem "crossed-line" IE-Verfahren verschmolz 1-ab mit drei Präzipitationsgipfeln des Elastase-Spaltmusters. Aufgrund der Auswertung ergab sich, daß sie die Fragmente 1- ab, 1-a bzw. 1-b darstellen (Fig. 2g). Jedoch verblieb es unklar, welcher Gipfel 1-a und welcher 1-b clarstellt. In einem zweiten Schritt wurde das HPLC-aufgereinigte 1-ab durch Elastase in seine Komponenten-FU's gespalten, aus denen eine durch das native PA- GE-Gel-Streifenverfahren eluiert werden konnte und dem Elastase-Muster durch das "crossed-line" IE-Verfahren (Fig. 2h) zugeordnet und N-terminal sequenziert wurde. Diese Komponente wies die gleiche N-terminale Sequenz wie die gesamte Untereinheit auf und war deshalb identisch zu 1-a. Somit ist die zweite FU des 100 kDa; Fragments 1- b (Fig. 2a; Tabelle I). Ebenso wurden HPLC-aufgereinigtes 1-c und 1-h erhalten (Fig. 3b), durch N-terminale-Sequenzähnlichkeiten zu den entsprechenden FU's in KLH1 (Tabelle I) identifiziert und durch das "crossed-line" IE-Verfahren ihren entsprechenden Präzipitation sgipfeln in dem Elastase-Musterzugeordnet (Fig. 2i, j). Weiterhin wurden 1- a, 1-b, 1-c und 1-h identifiziert (Fig. 2a). Unter Verwendung von Papain zur Untereinhei ten-Spaltung wurden fünf unterschiedliche Gipfel in dem gekreuzten IE-Verfahren (Figur k) erhalten. Aus einer solchen Probe wurde ein 100 kDa-Fragment (2 FU's) durch das HPLC-Verfahren (Fig. 3c) aufgereinigt, welches gemäß des "crossed-line" IE-Verfahrens das bereits identifizierte FU 1-h und eine der vier noch nicht identifizierten FU's enthielt und deshalb 1-gh darstellen muß (Figs. 2k, 3c). Tatsächlich wies dieses Fragment eine N-terminale Sequenz auf, die Ähnlichkeiten zu KLH1-g (Tabelle I) zeigte. Zur weiteren Bestätigung wurde das HPLC-aufgereinigte Fragment 1-gh mit Elastase in seine Be standteil-FU's gespalten, aus denen 1-g aufgereinigt und durch N-terminale Sequenzie rung identifiziert wurde. Es wurde durch "crossed-line" IE-Verfahren seinem Gipfel in dem Elastase-Spaltmuster zugeordnet (Fig. 21).In particular, cleavage of the HtH1 subunit (1-abcdefgh) with V8 protease gave four precipitation peaks in the crossed IE ( Fig. 2e). The SDS-PAGE method showed five different fragments ( FIG. 2f): 220 kDa (5 FU's), 185 kDa (4 FU's), 100 kDa (2 FU's), 55 kDa (1 FU) and 46 kDa (1 FU) . The 100 kDa fragment was isolated by the HPLC method ( FIG. 3b) and identified as 1-ab by N-terminal sequencing since the sequence was identical to that of the intact subunit (Table I). In the "crossed-line" IE process, 1-ab merged with three precipitation peaks of the elastase splitting pattern. The evaluation showed that they represent fragments 1-ab, 1-a and 1-b ( FIG. 2g). However, it remained unclear which summit 1-a and which 1-b clarifies. In a second step, the HPLC-purified 1-ab was split by elastase into its component drives, from which one could be eluted by the native PAGE gel strip method and the elastase pattern by the "crossed-line" IE -Procedure ( Fig. 2h) was assigned and N-terminal sequenced. This component had the same N-terminal sequence as the entire subunit and was therefore identical to 1-a. Thus the second FU of the 100 kDa; Fragments 1-b ( Fig. 2a; Table I). HPLC-purified 1-c and 1-h were also obtained ( FIG. 3b), identified by N-terminal sequence similarities to the corresponding FUs in KLH1 (Table I) and by the "crossed-line" IE method of their corresponding precipitation peaks associated with the elastase pattern ( Figures 2i, j). Furthermore, 1- a, 1-b, 1-c and 1-h were identified ( Fig. 2a). Using papain for subunit cleavage, five different peaks were obtained in the crossed IE method (Figure k). A 100 kDa fragment (2 FU's) was purified from such a sample by the HPLC method ( FIG. 3c), which according to the "crossed-line" IE method does not yet identify the FU 1-h and one of the four FUs identified and must therefore represent 1-gh (Figs. 2k, 3c). In fact, this fragment had an N-terminal sequence that showed similarities to KLH1-g (Table I). For further confirmation, the HPLC-purified fragment 1-gh was cleaved with elastase into its constituent FU's, from which 1-g was purified and identified by N-terminal sequencing. It was assigned to its peak in the elastase cleavage pattern by the crossed-line IE method ( Fig. 21).
Das 220 kDa-Fragment aus der V8-Protease-Spaltung (Fig. 2e, f) wurde HPLC-auf gereinigt (Fig. 3b) und fusionierte im "crossed-line" IE-Verfahren mit 1-h, 1-g und drei noch nicht identifizierten Gipfeln des Elastase-Spaltmusters. Weiterhin wurde das 185 kDa-Fragment in ausreichender Reinheit erhalten (Fig. 2e, f; 3b), und es wurde gezeigt, daß sie die gleichen Komponenten mit Ausnahme von 1-h enthielten. Dies legte nahe, daß das 22 kDa und das 185 kDa-Fragment 1-defgh bzw. 1-defg sind. Tatsächlich war die N-terminale Sequenz praktisch identisch und zeigte weiterhin Ähnlichkeit zu KLH1-d (Tabelle I). Die Spaltung der HtH1-Untereinheit mit Trypsin ergab eine Vielzahl an Kom ponenten in dem Molekulargewichtsbereich von ein bzw. zwei FU's (Fig. 2 m). Mehrere der Komponenten wurden in HPLC-Fraktionen angereichert (Fig. 3d). Ein 100 kDa- Fragment erwies sich als besonders nützlich, da es die gleich N-terminale Sequenz wie das Fragment 1-defg aus der V8-Protease-Spaltung aufwies (Tabelle I); deshalb sollte das 100 kDa-Fragment 1-de darstellen. In dem "crossed-lined" IE-Verfahren fusionierte diese Komponente mit zwei der drei noch nicht identifizierten FU-Gipfeln des Elastase- Spaltmusters (Fig. 2n), weiches deshalb 1-d und 1-e darstellen sollte, und somit eine einzige Möglichkeit für 1-f übrig ließ. Das "crossed-line" IE-Verfahren zeigte auch, daß in der 1-de Fraktion weiterhin FU 1-f vorhanden war (Fig. 2n). Die Identifikation von 1-f bestätigte durch Spaltung der Untereinheit mit Chymotrypsin (Fig. 20) und nachfolgen dem HPLC-Verfahren (Fig. 3e). Diese Spaltung ergab unter anderem ein 95 kDa- Fragment (2 FU's) welches im "crossed-line"-IE-Verfahren mit 1-g und einem zweiten Gipfel (Fig. 2p) fusionierte und deshalb entweder 1-gh (welches ausgeschlossen werden konnte, da 1-h bereits identifiziert war), oder 1-lg (welches sinnvoll erscheint aufgrund des weiterer betreffenden Peaks, der zu dem verbleibenden Kandidaten identisch war) sein könnte. Tatsächlich zeigte dieses Fragment eine neue N-terminale Sequenz, wel che in gewisser Weise zu KLH 1-f ähnlich ist (Tabelle I). Das letzte Problem bestand nun darin, die zwei verbleibenden FU-Gipfel 1-d bzw. 1-e zuzuordnen. Dies wurde unter Verwendung von HPLC-isolierten FU's aus Proben gelöst, in denen die Untereinheit mit Elastase gespalten worden war. (Fig. 2c, d; 3a). Die saurere Komponente in dem ge kreuzten IE-Verfahren war 1-d abgeleitet aus seiner N-terminalen Sequenz, welche identisch ist mit der von 1-defgh (Fig. 2c; Tabelle 1), wohingegen die basischere Kompo nente des 1-d/1-g-Paares eine neue N-terminale Sequenz (Tabelle I) aufwies und des halb 1-e (Fig. 2a) sein mußte. Somit war die Struktur der funktionellen Einheiten der Untereinheü. HtH1 aufgeklärt. The 220 kDa fragment from the V8 protease cleavage ( FIG. 2e, f) was purified by HPLC ( FIG. 3b) and fused with 1-h, 1-g and three in the "crossed-line" IE method peaks of the elastase splitting pattern that have not yet been identified. Furthermore, the 185 kDa fragment was obtained in sufficient purity ( Fig. 2e, f; 3b) and was shown to contain the same components except 1-h. This suggested that the 22 kDa and 185 kDa fragments are 1-defgh and 1-defg, respectively. In fact, the N-terminal sequence was practically identical and continued to show similarity to KLH1-d (Table I). The cleavage of the HtH1 subunit with trypsin gave a large number of components in the molecular weight range of one or two FUs ( FIG. 2 m). Several of the components were enriched in HPLC fractions ( Fig. 3d). A 100 kDa fragment proved to be particularly useful because it had the same N-terminal sequence as the 1-defg fragment from the V8 protease cleavage (Table I); therefore the 100 kDa fragment should represent 1-de. In the "crossed-lined" IE method, this component merged with two of the three as yet unidentified FU peaks of the elastase split pattern ( FIG. 2n), which should therefore represent 1-d and 1-e, and thus a single possibility left for 1-f. The "crossed-line" IE method also showed that FU 1-f was still present in the 1-de fraction ( FIG. 2n). The identification of 1-f was confirmed by cleaving the subunit with chymotrypsin ( Fig. 20) and following the HPLC method ( Fig. 3e). This cleavage resulted, inter alia, in a 95 kDa fragment (2 FU's) which fused in the "crossed-line" IU method with 1-g and a second peak ( FIG. 2p) and therefore either 1-gh (which could be excluded) , since 1-h was already identified), or 1-lg (which seems reasonable due to the further relevant peak, which was identical to the remaining candidate). In fact, this fragment showed a new N-terminal sequence, which is somewhat similar to KLH 1-f (Table I). The last problem now was to assign the two remaining FU summits 1-d and 1-e. This was solved using HPLC-isolated FU's from samples in which the subunit had been cleaved with elastase. ( Fig. 2c, d; 3a). The more acidic component in the crossed IE method was 1-d derived from its N-terminal sequence, which is identical to that of 1-defgh ( Fig. 2c; Table 1), whereas the more basic component of 1-d / 1 g pair had a new N-terminal sequence (Table I) and which had to be half 1-e ( Fig. 2a). Thus the structure of the functional units was the subunit. HtH1 cleared up.
Vergleich der Molekulargewichte und N-terminalen Sequenzen der biochemisch isolier ten funktionellen Einheiten (FU's) aus HtH1 und KLH1. Die unterschiedlichen FU's, jede mit einer intakten binukleären Kupfer-Bindungsstelle, wurden durch limitierte Proteolyse als globuläre Segmente aus ihrer größeren Einheit freigesetzt; vgl. Abschnitt "Isolierung und Analyse der Einheiten aus HtH 1". Die KLH 1-Daten wurden aus Söhngen et al., su pra, entnommen. Die Zuordnung als tatsächliche Einheit erfolgte aufgrund des Moleku largewichtes und des immunologischen Verhaltens (vgl. Fig. 2). Das ungewöhnlich niedrige Molekulargewicht von isoliertem HtH1-d könnte bedeuten, daß ein großes Pep tid C-terminal abgespalten wurde.Comparison of the molecular weights and N-terminal sequences of the biochemically isolated functional units (FUs) from HtH1 and KLH1. The different FU's, each with an intact binuclear copper binding site, were released from their larger unit as globular segments by limited proteolysis; see. Section "Isolation and analysis of the units from HtH 1". The KLH 1 data were taken from Söhngen et al., See below. The assignment as an actual unit was based on the molecular weight and the immunological behavior (see FIG. 2). The unusually low molecular weight of isolated HtH1-d could mean that a large peptide was cleaved at the C-terminal.
- 1. Zur Klonierung der cDNA von Hämocyanin wurde mRNA aus dem Mantelgewebe des jeweiligen Mollusken isoliert. Der erste cDNA-Strang wurde durch reverse Trans kription mii: Oligo(dT) als Primer erhalten. Der zweite Strang wurde durch konventio nelle Synthese mit random Primern erhalten. Die so erhaltene cDNA wurde in einen Lambda-Expressionsvektor kloniert unter Bildung einer cDNA-Expressionsbibliothek. Unter Verwendung eines anti-Hämocyanin-Antikörpers wurde die Bibliothek unter geeigneten Bedingungen abgesucht, wobei positive Klone erhalten wurden. Diese positiven Klone wurden isoliert, sequenziert und charakterisiert.1. For cloning the cDNA of hemocyanin, mRNA was removed from the mantle tissue of each mollusk isolated. The first strand of cDNA was reverse trans kription mii: Oligo (dT) obtained as a primer. The second strand was through konventio nell synthesis with random primers obtained. The cDNA thus obtained was put into a Lambda expression vector cloned to form a cDNA expression library. Using an anti-hemocyanin antibody, the library was created under searched appropriate conditions, whereby positive clones were obtained. This positive clones were isolated, sequenced and characterized.
- 2. Aus dem N-terminalen Bereich eines erhaltenen positiven Klons wurde eine cDNA- Sonde hergestellt, mit der die cDNA-Bibliothek abgesucht wurde. Die erhaltenen po sitiven Klone werden wiederum isoliert, sequenziert und charakterisiert.2. From the N-terminal region of a positive clone obtained, a cDNA Manufactured probe with which the cDNA library was searched. The po received Site clones are isolated, sequenced and characterized.
- 3. Um noch weiter 5' gelegene Sequenzen zu erhalten, wurde eine weitere Expressi onsbibliothek aus cDNA hergestellt, die mit Hilfe einer Kombination von Hämocyanin spezifischen und "random"-Primem erhalten wurde. Diese cDNA-Bibliothek wurde mit cDNA-Sonden, die den "N-terminalen" Bereichen der unter (2.) erhaltenen positiven Klone entsprechen, abgesucht. Die erhaltenen positiven Klone wurden isoliert, se quenziert und charakterisiert.3. In order to obtain further 5 'sequences, another expressi was Library made from cDNA using a combination of hemocyanin specific and "random" primem was obtained. This cDNA library was created with cDNA probes covering the "N-terminal" regions of the positive obtained under (2.) Match clones, searched. The positive clones obtained were isolated, se quenziert and characterized.
Genomische DNA wurde gemäß Standardverfahren isoliert. Die PCR-Reaktion wurde mit Hilfe von Hämocyaninspezifischen Primern durchgeführt, um die Genabschnitte der interessierenden Hämocyanine zu amplifizieren. Die erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden in einen geeigneten Vektor (beispielsweise pGem T oder pGem T easy (Promega, Mannheim) kloniert, sequenziert und charakterisiert. Genomic DNA was isolated according to standard procedures. The PCR reaction was with the help of hemocyanin-specific primers to the gene segments of the to amplify the hemocyanins of interest. The amplification products obtained were converted into a suitable vector (for example pGem T or pGem T easy (Promega, Mannheim) cloned, sequenced and characterized.
Mit einem cDNA-Klon, der die kodierende Sequenz für HtH-1d enthält, wurde eine PCR- Reaktion durchgeführt, um spezifisch die kodierende Sequenz der Domäne 1d zu amplifizieren. Als Primer wurden synthetisch hergestellte Oligonukleotide verwendet.A PCR was carried out with a cDNA clone which contains the coding sequence for HtH-1d. Reaction carried out to specifically encode the coding sequence of domain 1d amplify. Synthetically produced oligonucleotides were used as primers.
Primer 1 (stromaufwärts) umfaßt sechs Nukleotide des Endes der Domäne HtH-1c, eine SacI-Schnittstelle und 12 Nukleotide des Endes der Domäne HtH-1d.Primer 1 (upstream) comprises six nucleotides from the end of the HtH-1c domain, one SacI site and 12 nucleotides of the end of the HtH-1d domain.
Primer 2 (stromabwärts) umfaßt sechs Nukleotide des Anfangs der Domäne HtH1-e, ei ne Sa/I-Schnittstelle und eine HtH1-d spezifische Sequenz.Primer 2 (downstream) comprises six nucleotides of the beginning of the HtH1-e, ei domain ne Sa / I interface and a HtH1-d specific sequence.
2 min 95°C
30 sec 95°C
30 sec 55°C
1 min 72°C
35 Zyklen
10 min 72°C2 min 95 ° C
30 sec 95 ° C
30 sec 55 ° C
1 min 72 ° C
35 cycles
10 min 72 ° C
Das Amplifikat wurde in dem pGEM T easy PCR Klonierungsvektor (Promega) in XL-1 Blue (Stratadene) kloniert. Nach Isolation des rekombinanten Plasmids und Restriktion mit SacI und Sa/I konnte die cDNA der Domäne 1d isoliert werden. Der Expressionsvek tor pQE30 (Qiagen) wurde ebenfalls mit den entsprechenden Enzymen restringiert.The amplificate was in the pGEM T easy PCR cloning vector (Promega) in XL-1 Blue (Stratadene) cloned. After isolation of the recombinant plasmid and restriction the cDNA of domain 1d could be isolated with SacI and Sa / I. The expression vector tor pQE30 (Qiagen) was also restricted with the corresponding enzymes.
Anschließend wurde die Ligation zwischen der HtH-1d-cDNA (restringiert mit SacI und Sa/I) und pQE (restringiert mit SacI und Sa/I) durchgeführt. Somit ist eine gerichtete Klonierung cer cDNA, kodierend für HtH-1d, in einen Expressionsvektor möglich. Die Expression von HtH1-d in pQE in XL-1 Blue erfolgt gemäß Herstelleranleitung. Die Ex pression weiterer HtH1-, HtH2- oder KLH1- oder KLH2-Domänen kann analog erfolgen. The ligation between the HtH-1d cDNA (restricted with SacI and Sa / I) and pQE (restricted with SacI and Sa / I). So is a directed Cloning cer cDNA, coding for HtH-1d, possible in an expression vector. The Expression of HtH1-d in pQE in XL-1 Blue is carried out according to the manufacturer's instructions. The ex Pression of further HtH1, HtH2 or KLH1 or KLH2 domains can take place analogously.
Claims (44)
- a) der Gruppe der nachfolgend angegebenen DNA-Sequenzen bzw. der ihnen ent
sprechenden RNA-Sequenzen:
in SEQ ID NO: 1 (HtH1 Domäne b),
SEQ ID NO: 2 (HtH1 Domäne c),
SEQ ID NO: 3 (HtH1 Domäne d),
SEQ ID NO: 4 (HtH1 Domäne e),
SEQ ID NO: 5 (HtH1 Domäne f),
SEQ ID NO: 6 (HtH1 Domäne g),
SEQ ID NO: 7 (HtH1 Domäne h),
SEQ ID NO: 8 (partielle HtH2 Domäne b),
SEQ ID NO: 9 (HtH2 Domäne c),
SEQ ID NO: 10 (HtH2 Domäne d),
SEQ ID NO: 11 (HtH2 Domäne e),
SEQ ID NO: 12 (HtH2 Domäne f),
SEQ ID NO: 13 (HtH2 Dömäne g),
SEQ ID NO: 14 (HtH2 Domäne h),
SEQ ID NO: 15 (partielle KLH1 Domäne c),
SEQ ID NO: 16 (KLH1 Domäne d),
SEQ ID NO: 17 (partielle KLH1 Domäne e),
SEQ ID NO: 18 (KLH2 Domäne b),
SEQ ID NO: 19 (KLH2 Domäne c),
(b) Nukleinsäuresequenzen, die mit dem Gegenstrang einer Nukleinsäuresequenz nach (a) hybridisieren und für ein Polypeptid kodieren, das die immunologischen Ei genschaften wenigstens einer Domäne eines Hämocyanins aufweist; - b) Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund des genetischen Codes zu den unter (a) und
- c) definierten DNA-Sequenzen degeneriert sind und für ein Polypeptid kodieren, das die immunologischen Eigenschaften wenigstens einer Domäne eines Hä mocyanins aufweist;
- d) Nukleinsäuresequenzen, die mit einer der unter (a) bis (c) angegebenen Nuklein säuresequenzen hybridisieren und deren Gegenstrang für ein Polypeptid kodiert, das die immunologischen Eigenschaften wenigstens einer Domäne eines Hä mocyanins aufweist'
- e) Nukleinsäuresequenzen, die wenigstens 60% homolog zu einer der unter (a) ange gebenen Nukleinsäuresequenzen sind;
- f) Varianten der unter (a) bis (d) angegebenen Sequenzen, wobei die Varianten ge genüber den unter (a) bis (d) angegebenen Sequenzen Additionen, Deletionen, In sertionen oder Inversionen aufweisen und für ein Polypeptid kodieren, das die im munologischen Eigenschaften wenigstens einer Domäne von Hämocyanin aufweist; und
- g) Kombinationen mehrerer der unter (a) bis (f) angegebenen DNA-Sequenzen.
- a) the group of the DNA sequences given below or the RNA sequences corresponding to them:
in SEQ ID NO: 1 (HtH1 domain b),
SEQ ID NO: 2 (HtH1 domain c),
SEQ ID NO: 3 (HtH1 domain d),
SEQ ID NO: 4 (HtH1 domain e),
SEQ ID NO: 5 (HtH1 domain f),
SEQ ID NO: 6 (HtH1 domain g),
SEQ ID NO: 7 (HtH1 domain h),
SEQ ID NO: 8 (partial HtH2 domain b),
SEQ ID NO: 9 (HtH2 domain c),
SEQ ID NO: 10 (HtH2 domain d),
SEQ ID NO: 11 (HtH2 domain e),
SEQ ID NO: 12 (HtH2 domain f),
SEQ ID NO: 13 (HtH2 domain g),
SEQ ID NO: 14 (HtH2 domain h),
SEQ ID NO: 15 (partial KLH1 domain c),
SEQ ID NO: 16 (KLH1 domain d),
SEQ ID NO: 17 (partial KLH1 domain e),
SEQ ID NO: 18 (KLH2 domain b),
SEQ ID NO: 19 (KLH2 domain c),
(b) nucleic acid sequences which hybridize with the opposite strand of a nucleic acid sequence according to (a) and code for a polypeptide which has the immunological properties of at least one domain of a hemocyanin; - b) nucleic acid sequences which, on the basis of the genetic code, correspond to those under (a) and
- c) defined DNA sequences are degenerate and code for a polypeptide which has the immunological properties of at least one domain of a hemocyanin;
- d) nucleic acid sequences which hybridize with one of the nucleic acid sequences given under (a) to (c) and whose opposite strand codes for a polypeptide which has the immunological properties of at least one domain of a hemocyanin '
- e) nucleic acid sequences which are at least 60% homologous to one of the nucleic acid sequences given under (a);
- f) Variants of the sequences given under (a) to (d), the variants having additions, deletions, insertions or inversions compared to the sequences given under (a) to (d) and coding for a polypeptide which encodes the immunological Has properties of at least one domain of hemocyanin; and
- g) combinations of several of the DNA sequences given under (a) to (f).
SEQ ID NO:20 (HtH1 Domäne b),
SEQ ID NO: 21 (HtH1 Domäne c),
SEQ ID NO: 22 (HtH1 Domäne d),
SEQ ID NO: 23 (HtH1 Domäne e),
SEQ ID NO: 24 (HtH1 Domäne f),
SEQ ID NO: 25 (HtH1 Domäne g),
SEQ ID NO: 26 (HtH1 Domäne h),
SEQ ID NO: 27 (partielle HtH2 Domäne b),
SEQ ID NO: 28 (HtH2 Domäne c),
SEQ ID NO: 29 (HtH2 Domäne d),
SEQ ID NO: 30 (HtH2 Domäne e),
SEQ ID NO: 31 (HtH2 Domäne f),
SEQ ID NO: 32 (HtH2 Dömäne g),
SEQ ID NO: 33 (HtH2 Domäne h),
SEQ ID NO: 34 (partielle KLH1 Domäne c),
SEQ ID NO: 35 (KLH1 Domäne d),
SEQ ID NO: 36 (partielle KLH1 Domäne e),
SEQ ID NO: 37 (KLH2 Domäne b),
SEQ ID NO: 38 (KLH2 Domäne c),
oder ein Fragment einer dieser Sequenzen, das die immunologischen Eigenschaften wenigstens einer Domäne eines Hämocyanins aufweist.21. The hemocyanin polypeptide according to claim 20, comprising at least one amino acid sequence selected from the following group:
SEQ ID NO: 20 (HtH1 domain b),
SEQ ID NO: 21 (HtH1 domain c),
SEQ ID NO: 22 (HtH1 domain d),
SEQ ID NO: 23 (HtH1 domain e),
SEQ ID NO: 24 (HtH1 domain f),
SEQ ID NO: 25 (HtH1 domain g),
SEQ ID NO: 26 (HtH1 domain h),
SEQ ID NO: 27 (partial HtH2 domain b),
SEQ ID NO: 28 (HtH2 domain c),
SEQ ID NO: 29 (HtH2 domain d),
SEQ ID NO: 30 (HtH2 domain e),
SEQ ID NO: 31 (HtH2 domain f),
SEQ ID NO: 32 (HtH2 domain g),
SEQ ID NO: 33 (HtH2 domain h),
SEQ ID NO: 34 (partial KLH1 domain c),
SEQ ID NO: 35 (KLH1 domain d),
SEQ ID NO: 36 (partial KLH1 domain e),
SEQ ID NO: 37 (KLH2 domain b),
SEQ ID NO: 38 (KLH2 domain c),
or a fragment of one of these sequences, which has the immunological properties of at least one domain of a hemocyanin.
- a) das Inkontaktbringen zellulärer DNA und/oder zellulären Proteins mit einer Sonde umfassend die Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und/oder des Antikörpers gemäß Anspruch 42 und
- b) das Nachweisen der spezifischen Bindung.
- a) contacting cellular DNA and / or cellular protein with a probe comprising the nucleic acid sequence according to one of claims 1 to 6 and / or the antibody according to claim 42 and
- b) the detection of the specific binding.
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1999
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| Firmenkatalog Calbiochem 2000/2001, S. 271,272 * |
| Immunologie Spektrum 30/90, Boehringer Mannheim GmbH * |
| Sonderdruck aus Forschungsmagazin 1/1995, S.50-59 * |
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