DE19910102A1

DE19910102A1 - Protein conjugates, methods, vectors, proteins and DNA for their production, their use, as well as drugs and vaccines containing the same

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Publication number: DE19910102A1
Application number: DE19910102A
Authority: DE
Inventors: Markus Fischer; Adelbert Bacher
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-03-08
Filing date: 1999-03-08
Publication date: 2000-09-28
Anticipated expiration: 2019-03-09
Also published as: EP1181377A2; WO2000053229A2; DE19910102B4; WO2000053229A3; AU4104000A

Abstract

Die Erfindung betrifft Proteinkonjugate, Verfahren, Vektoren, Proteine und DNA zu deren Herstellung sowie deren Verwendung sowie Arzneimittel oder Impfstoffe mit einem Gehalt derselben. Sie dient zur Herstellung supramolekularer Partikel, welche eine oder mehrere unterschiedliche, willkürlich bestimmbare Struktureinheiten in großer Anzahl auf der Oberfläche eines einzelnen, etwa kugelförmigen Proteinmoleküls präsentieren. DOLLAR A Ikosaedrische Lumazinsynthasen werden als Trägerproteine für Peptide bzw. Proteine eingesetzt. Ein DNA-Fragment, welches für ein Peptidmolekül kodiert, wird unter Verwendung molekularbiologischer Verfahren mit einem DNA-Fragment, welches für eine ikosaedrische Lumazinsynthase kodiert, fusioniert. Das DNA-Fragment wird in einen Klonierungsvektor inseriert und in einen geeigneten Wirtsstamm transformiert. Auf dem Wege der Genexpression wird ein Polypeptid produziert. Bei der Verwendung von bestimmten Peptidstrukturen als Fusionspartner erfolgt im Wirtsstamm eine posttranslationale Veränderung derselben. Das chimäre Peptid wird gereinigt und bei Bedarf chemisch verändert. Des weiteren können durch Vermischung ikosaedrische Moleküle hergestellt werden, die bis zu 120 unterschiedliche Peptidmotive auf deren Oberfläche enthalten. Die entstandenen Verbindungen eignen sich als Hilfsmittel zur Durchführung von Analysenverfahren (ELISA, Biosensoren) oder zur Herstellung von Impfstoffen.The invention relates to protein conjugates, methods, vectors, proteins and DNA for their production and their use as well as pharmaceuticals or vaccines containing the same. It is used to produce supramolecular particles that present one or more different, arbitrarily determinable structural units in large numbers on the surface of a single, approximately spherical protein molecule. DOLLAR A Icosahedral lumazine synthases are used as carrier proteins for peptides or proteins. A DNA fragment which codes for a peptide molecule is fused to a DNA fragment which codes for an icosahedral lumazine synthase using molecular biological methods. The DNA fragment is inserted into a cloning vector and transformed into a suitable host strain. A polypeptide is produced by gene expression. When certain peptide structures are used as fusion partners, the host strain undergoes a post-translational change. The chimeric peptide is purified and chemically modified if necessary. Furthermore, icosahedral molecules can be produced by mixing, which contain up to 120 different peptide motifs on their surface. The resulting compounds are suitable as aids for carrying out analytical procedures (ELISA, biosensors) or for the production of vaccines.

Description

Die Erfindung betrifft Proteinkonjugate, Verfahren, Vektoren, Proteine und DNA zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung, sowie Arzneimittel oder Impfstoffe mit einem Gehalt derselben. Die vorliegende Erfindung dient zur Herstellung supramolekularer Partikel, welche eine oder mehrere unterschiedliche, willkürlich bestimmbare Struktureinheiten in großer Anzahl auf der Oberfläche eines einzelnen, etwa kugelförmigen Proteinmoleküls präsentieren.The invention relates to protein conjugates, methods, vectors, proteins and DNA for their Manufacture and its use, as well as drugs or vaccines with a content the same. The present invention serves to produce supramolecular particles which one or more different, arbitrarily determinable structural units in large Present the number on the surface of a single, approximately spherical protein molecule.

Eigenschaften der Lumazinsynthase und auf Lumazinsynthase basierender artefizieller ProteinkonjugateProperties of lumazine synthase and artificial lumazine synthase based Protein conjugates

6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase (im Folgenden als Lumazinsynthase bezeichnet) kataly siert den vorletzten Schritt der Vitamin-B₂-Biosynthese in Mikroorganismen und Pflanzen. Lumazinsynthasen aus bestimmten Bakterien (z. B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aquifex aeolicus) bilden hochsymmetrische, ikosaedrische Komplexe aus 60 Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von ca. 1 MDalton (Bacher und Ladenstein, 1991; Bacher et al., 1980; La denstein et al., 1986, 1988, 1994; Mörtl et al., 1996). Röntgenstrukturen der Kapsidhülle der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis sind bekannt (Ladenstein et al., 1988, 1994; Ritsert et al., 1995). Das Protein aus Bacillus subtilis kann unter Verwendung von Harnstoff denaturiert und anschließend renaturiert werden. Die Effizienz der Renaturierung läßt sich durch die Zugabe eines Liganden (Substratanalogon), beispielsweise 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)-2,4- (1H,3H)-pyrimidindion oder 5-Nitroso-6-(D-ribitylamino)-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion, erhöhen. Die Faltung des renaturierten Proteins ist identisch mit der Faltung der nativen Lumazinsynthase. In Gegenwart des genannten Liganden ist die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis bis pH 10 stabil. Die Umgebung des Inhibitormoleküls ist aufgrund der Röntgenstruktur bekannt. Die Bindungsstelle dieses Liganden wird aus Segmenten benachbarter Monomeren gebildet (Bacher et al., 1986; Ritsert et al., 1995). Diese Konstellation erklärt den unterstützenden Einfluß des Liganden bei der Renaturierung des hochmolekularen Proteinkomplexes.6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase (hereinafter referred to as lumazine synthase) catalyzes the penultimate step of vitamin B ₂ biosynthesis in microorganisms and plants. Lumazine synthases from certain bacteria (e.g. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aquifex aeolicus) form highly symmetrical, icosahedral complexes of 60 subunits with a molecular weight of approx. 1 MDalton (Bacher and Ladenstein, 1991; Bacher et al., 1980; La denstein et al., 1986, 1988, 1994; Mörtl et al., 1996). X-ray structures of the capsid envelope of the lumazine synthase from Bacillus subtilis are known (Ladenstein et al., 1988, 1994; Ritsert et al., 1995). The protein from Bacillus subtilis can be denatured using urea and then renatured. The efficiency of the renaturation can be increased by adding a ligand (substrate analog), for example 5-nitro-6- (D-ribitylamino) -2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione or 5-nitroso-6- (D-ribitylamino) ) -2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione. The folding of the renatured protein is identical to the folding of the native lumazine synthase. In the presence of the ligand mentioned, the lumazine synthase from Bacillus subtilis is stable up to pH 10. The environment of the inhibitor molecule is known due to the X-ray structure. The binding site of this ligand is formed from segments of neighboring monomers (Bacher et al., 1986; Ritsert et al., 1995). This constellation explains the supporting influence of the ligand in the renaturation of the high molecular weight protein complex.

Lumazinsynthasen aus verschiedenen Mikroorganismen können in rekombinanten Stämmen von Escherichia coli und Bacillus subtilis effizient exprimiert werden. Die rekombinanten Pro teine können in hoher Ausbeute isoliert werden.Lumazine synthases from various microorganisms can be found in recombinant strains can be efficiently expressed by Escherichia coli and Bacillus subtilis. The recombinant pro teins can be isolated in high yield.

Sowohl der N- als auch der C-Terminus liegen an der Oberfläche des ikosaedrischen Kapsidmoleküls. Für Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde dies erstmals durch Röntgenstrukturanalyse gezeigt (Ladenstein et al., 1988). Durch DNA-Synthese konnte ein optimal an die Kodonverwendung von Fscherichia coli angepasstes Gen zur Expression der thermostabilen Lumazinsynthase aus dem thermophilen Mikroorganismus Aquifex aeolicus erhalten werden. Das Protein kann in hohen Mengen rekombinant erhalten werden. Es ist bei einer Temperatur von 80°C mindestens eine Woche stabil. Daß bei Aquifex aeolicus dieselben strukturellen Verhältnisse wie bei der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis vorliegen, folgt aus der Tatsache, daß Fusionsproteine mit Verlängerung des C-terminalen und/oder N- terminalen Endes zu ikosaedrischen Kapsiden assoziieren können, bzw. daß auch chimäre Proteine, bestehend aus Teilen der Lumazinsynthasen aus Aquifex aeolicus und Bacillus subtilis hergestellt werden können. Es ist folglich von einer sehr ähnlichen Quartärstruktur auszugehen.Both the N and the C terminus lie on the surface of the icosahedral Capsid molecule. For lumazine synthase from Bacillus subtilis, this was done for the first time X-ray structure analysis shown (Ladenstein et al., 1988). Through DNA synthesis one could gene optimally adapted to the codon use of Fscherichia coli for the expression of the thermostable lumazine synthase from the thermophilic microorganism Aquifex aeolicus be preserved. The protein can be obtained recombinantly in large amounts. It is at stable at a temperature of 80 ° C for at least one week. That Aquifex aeolicus the same structural relationships as in the case of lumazine synthase from Bacillus subtilis follow from the fact that fusion proteins with extension of the C-terminal and / or N- terminally associated to icosahedral capsids, or that chimeric Proteins consisting of parts of the lumazine synthases from Aquifex aeolicus and Bacillus can be produced subtilis. It is therefore of a very similar quaternary structure going out.

Ikosaedrische Lumazinsynthasen können an ihrer Oberfläche mit Struktureinheiten funktionalisiert werden. Als Struktureinheiten (Biomoleküle) kommen vorzugsweise Oligo- oder Polypeptide mit frei wählbaren Segmenten in Betracht. Die präsentierten Proteine (konjugierte Biomoleküle) sind mit dem Trägerprotein kovalent verbunden (Lumazinsynthase- Konjugat). Unter einem Trägerprotein im Sinne der Erfindung versteht man eine natürliche (unveränderte) oder eine modifizierte Lumazinsynthase, bei der die Primärstruktur verändert wurde. Es können dabei eine oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht und/oder entfernt und/oder zugefügt und/oder verändert vorliegen. Der Erhalt der ursprünglichen katalytischen Aktivität der Lumazinsynthase ist hierbei nicht erforderlich. Vielmehr können z. B. auch katalytisch inaktive, modifizierte Proteine für alle erfindungsgemäßen Anwendungen eingesetzt werden.Icosahedral lumazine synthases can have structural units on their surface be functionalized. The structural units (biomolecules) are preferably oligo or polypeptides with freely selectable segments. The presented proteins (conjugated biomolecules) are covalently linked to the carrier protein (lumazine synthase Conjugate). A carrier protein in the sense of the invention means a natural one (unchanged) or a modified lumazine synthase, in which the primary structure changes has been. One or more amino acids can be exchanged and / or removed and / or added and / or changed. Preserving the original catalytic Activity of the lumazine synthase is not necessary. Rather, z. Belly Catalytically inactive, modified proteins used for all applications according to the invention become.

Die Anzahl der konjugierten Biomoleküle auf der Oberfläche des Trägerproteins kann sich über einen weiten Bereich erstrecken, wobei erfindungsgemäß die Oberfläche mit bis zu 60 (an einem Terminus) bzw. 120 (an beiden Termini) bzw. 180 (an beiden Termini plus Schleifen insertion) identischen oder in ihrer Struktur verschiedenen Peptidmotiven dekoriert sein kann. Proteinuntereinheiten auf der strukturellen Grundlage von Lumazinsynthase können außerdem auch zu noch größeren, etwa sphärischen Partikeln und zu tubulären Strukturen assembliert werden. Diese Assoziate können weit über 60 Untereinheiten enthalten. Sie besitzen allerdings nicht die strenge, geometrische Regelmäßigkeit der ikosaedrischen, 60-meren Lumazinsynthase-Moleküle.The number of conjugated biomolecules on the surface of the carrier protein can vary extend over a wide range, the surface according to the invention having up to 60 ( one term) or 120 (on both terms) or 180 (on both terms plus loops insertion) may be decorated with identical or different peptide motifs in their structure. Protein subunits based on the structure of lumazine synthase can also also assembled into even larger, for example spherical, particles and tubular structures become. These associations can contain well over 60 subunits. However, you own not the strict, geometric regularity of the icosahedral, 60-mers Lumazine synthase molecules.

Die Länge der präsentierten Peptidsegmente kann über einen weiten Bereich variieren, erfin dungsgemäß vorzugsweise über 1-500 Aminosäuren, wobei die Peptidmotive sowohl un verändert als auch modifiziert vorliegen können.The length of the peptide segments presented can vary over a wide range According to the invention preferably over 1-500 amino acids, the peptide motifs both un changed as well as modified.

Erfindungsgemäße Proteine können auch eine oder mehrere Aminosäureanaloga oder nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten, die auf biologischem Wege (z. B. mittels Sup pressor-tRNA-Techniken, etc.) oder auf chemischen Wege (z. B. über Kopplungsreagenzien, etc.) in die Sequenz eingeführt werden. Ebenso können Modifikationen (z. B. Glykosylierung, etc.) oder Derivatisierung (z. B. Biotinylierung, etc.) vorliegen.Proteins of the invention may or may not have one or more amino acid analogs contain naturally occurring amino acids that are produced biologically (e.g. by means of Sup pressor-tRNA techniques, etc.) or by chemical means (e.g. via coupling reagents, etc.) are introduced into the sequence. Modifications (e.g. glycosylation, etc.) or derivatization (e.g. biotinylation, etc.).

Die zugrunde liegende genetische Information für die Spezifikation der artefiziell in die Struktur der Lumazinsynthaseuntereinheit eingebrachten Peptidabschnitte kann sich dabei von wenigen Codons bis zu mehreren Genen erstrecken, abhängig davon, ob ein Oligopeptid, ein Polypeptid oder ein aus mehreren Untereinheiten bestehendes Protein kodiert werden soll. Die Oberfläche einer Lumazinsynthase kann auch auf chemischem Wege modifiziert werden, so daß deren Außenperipherie mit einer Vielzahl an Funktionsbereichen kovalent verknüpft ist. Die Herstellung von heterooligomeren Lumazinsynthase-Konjugaten erfolgt über einen Dissoziationsschritt und einen nachfolgenden Faltungs/Reassoziationsschritt. Die nach der Denaturierung monomer vorliegenden chimären Proteine können beliebig gemischt werden. Da die rekombinierten Untereinheiten jeweils einen konstanten Lumazinsynthaseanteil besitzen, ist eine Renaturierung der Lumazinsynthase Kernstruktur unter Ausbildung der natürlichen ikosaedrischen Struktur möglich. The underlying genetic information for the specification of the artificially in the The structure of the lumazine synthase subunit introduced peptide sections can differ from a few codons extend to several genes, depending on whether an oligopeptide Polypeptide or a protein consisting of several subunits is to be encoded. The surface of a lumazine synthase can also be modified chemically, so that their outer periphery is covalently linked to a variety of functional areas. The production of heterooligomeric lumazine synthase conjugates takes place via a Dissociation step and a subsequent folding / reassociation step. The after the Denaturation of monomeric chimeric proteins can be mixed as desired. There the recombined subunits each have a constant lumazine synthase content a renaturation of the lumazine synthase core structure with formation of the natural icosahedral structure possible.

Immunologische Analysenverfahren auf der Basis des ELISA-TestsystemsImmunological analysis methods based on the ELISA test system

Antikörper binden mit hoher Spezifität an bestimmte Zielstrukturen (Antigene). Es wurden Testverfahren entwickelt, die auf dem Nachweis spezifischer Antikörper-Antigen-Komplexe basieren. Um festzustellen, ob ein Antikörper an sein Zielantigen gebunden hat, gibt es ver schiedene Möglichkeiten. Der enzymgekoppelte Immunnachweis (enzyme-linked immuno absorbent assay, ELISA) ist eines dieser Verfahren. Der ELISA kann im Prinzip zur Bestim mung jedes Antigens, Haptens oder Antikörpers ausgearbeitet werden, seine Anwendung hat er heute vor allem in der klinischen Biochemie gefunden. Man mißt damit beispielsweise häma tologische Faktoren sowie die Konzentrationen von Serumproteinen wie z. B. Immunglobuline, onkofötale Proteine und Hormone wie z. B. Insulin. Bei der Diagnostik infektiöser Erkrankungen werden bakterielle Toxine, Mikroorganismen wie Candida albicans, Rotaviren, Herpesviren, HIV oder Hepatitis-B-Oberflächenantigen auf diese Weise nachgewiesen. Desweiteren werden immunchemische Analyseverfahren zur Antikörperbestimmung, zwecks Diagnose abgelaufener oder ablaufender Infektionskrankheiten (z. B. mit HIV, Hepatitis), angewendet.Antibodies bind with high specificity to certain target structures (antigens). There were Test method developed based on the detection of specific antibody-antigen complexes based. To determine whether an antibody has bound to its target antigen, there are ver different options. The enzyme-linked immuno-detection (enzyme-linked immuno absorbent assay (ELISA) is one of these methods. In principle, the ELISA can be used to determine Any antigen, hapten or antibody must be worked out today he found mainly in clinical biochemistry. It is used to measure heme, for example tological factors and the concentrations of serum proteins such. B. immunoglobulins, oncofetal proteins and hormones such as B. insulin. When diagnosing infectious Diseases are bacterial toxins, microorganisms such as Candida albicans, rotaviruses, Herpes viruses, HIV or hepatitis B surface antigen detected in this way. Furthermore, immunochemical analysis methods for antibody determination, purpose Diagnosis of past or ongoing infectious diseases (e.g. with HIV, hepatitis), applied.

Ein ELISA-Protokoll besteht im allgemeinen aus folgenden Teilschritten.An ELISA protocol generally consists of the following sub-steps.

1. Die Probe, die ein spezifisches Molekül oder einen bestimmten Organismus enthalten soll, wird an einen festen Träger gebunden (z. B. Mikrotiterplatte aus Kunststoff).1. The sample that is to contain a specific molecule or a particular organism is bound to a solid support (e.g. plastic microtiter plate).
2. Der Nachweis eines Antigens (Protein, Peptid, Hapten-Konjugat, etc.) erfolgt durch die spezifische Bindung eines spezifischen Antikörpers (primärer Antikörper), der gegen das be treffende Antigen aus 1. gerichtet ist. Hierbei kann der primäre Antikörper selbst markiert sein (z. B. radioaktiv) und daher unmittelbar lokalisiert werden (z. B. Autoradiographie). Alternativ kann entsprechend dem folgenden Absatz weitergearbeitet werden.2. The detection of an antigen (protein, peptide, hapten conjugate, etc.) is carried out by the specific binding of a specific antibody (primary antibody) against the be striking antigen from 1st is directed. Here the primary antibody can be labeled be (e.g. radioactive) and therefore localized immediately (e.g. autoradiography). Alternatively, you can continue working according to the following paragraph.
3. Häufig erfolgt stattdessen die Zugabe eines zweiten Antikörpers (sekundärer Antikörper), der spezifisch an den primären Antikörper, aber nicht an das Antigen aus 1., bindet. Dieser zweite Antikörper ist häufig chemisch mit einem Enzym gekoppelt (Indikatorsystem), welches eine Umwandlung eines farblosen Substrates in ein farbiges Produkt katalysiert (z. B. Alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, etc.). Der zweite Antikörper ist meistens gegen den konstanten Abschnitt des ersten Antikörpers gerichtet. Nicht gebundene sekundäre Antikörper werden durch Waschen entfernt.3. Often a second antibody (secondary antibody) is added instead, that binds specifically to the primary antibody but not to the antigen from 1. This second antibody is often chemically coupled with an enzyme (indicator system), which catalyzes a conversion of a colorless substrate into a colored product (e.g. alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, etc.). The second antibody is mostly directed against the constant section of the first antibody. Not bound secondary antibodies are removed by washing.
4. Zugabe eines farblosen Substrats und dessen Umwandlung in ein farbiges Produkt.4. Add a colorless substrate and convert it to a colored product.

Erfolgt keine Bindung des primären Antikörpers an die in der Probe vorhandenen Antigene, so wird der primäre Antikörper im ersten Waschschritt entfernt. Folglich kann der enzym markierte sekundäre Antikörper ebenfalls nicht binden, d. h. der Testansatz bleibt farblos. Ist die betreffende antigene Struktur vorhanden, so kann der primäre Antikörper binden und an diesen der sekundäre Antikörper. Das an den zweiten Antikörper gekoppelte Enzym katalysiert die Farbreaktion, deren Produkt sich leicht nachweisen läßt (z. B. photometrisch, etc.). Die gemessene Menge der Enzymaktivität ist dem Gehalt an spezifischem Antigen bzw. Antikörper proportional (aus: Glick; B., Pasternak, J., Molekulare Biotechnologie, Spektrum Akademischer Verlag, 1995, S. 201 ff).If the primary antibody is not bound to the antigens present in the sample, then the primary antibody is removed in the first washing step. Consequently, the enzyme also does not bind labeled secondary antibodies, i. H. the test batch remains colorless. Is If the relevant antigenic structure is present, the primary antibody can bind and attach this is the secondary antibody. The enzyme coupled to the second antibody catalyzes the color reaction, the product of which can be easily detected (e.g. photometric, etc.). The The amount of enzyme activity measured is the content of specific antigen or antibody proportional (from: Glick; B., Pasternak, J., Molecular Biotechnology, Spectrum Academic publisher, 1995, p. 201 ff).

Bei der Durchführung von Bindungstests bedarf es eines Indikatorsystems (z. B. Meerrettich- Peroxidase), welches eine Sichtbarmachung der abgelaufenen Immunreaktion erlaubt. Die Vi sualisierung beruht auf einer stabilen Verknüpfung zwischen dem untersuchten Reaktanten (Antigen oder Antikörper) und einem Indikatorsystem. Als Indikatoren (Amplifikatoren) werden eingesetzt: Fluoreszenzfarbstoffe, Lumineszenzfarbstoffe, Radioaktivität, Enzyme, etc. Die Indikatoren können kovalent oder nicht-kovalent an die jeweiligen Reaktanten gebunden vorliegen. Als stabile nicht-kovalente Verknüpfungen zwischen Indikator und gesuchtem Reaktionspartner dienen z. B. die Antigen-Antikörper-Bindung, die Biotin-Avidin-Bindung oder die Lektin-Bindung.When carrying out binding tests, an indicator system is required (e.g. horseradish Peroxidase), which allows the expired immune reaction to be visualized. The Vi sualization is based on a stable link between the reactants investigated (Antigen or antibody) and an indicator system. As indicators (amplifiers) are used: fluorescent dyes, luminescent dyes, radioactivity, enzymes, etc. The indicators can be covalently or non-covalently bound to the respective reactants available. As stable, non-covalent links between the indicator and the sought Reaction partners serve e.g. B. the antigen-antibody binding, the biotin-avidin binding or lectin binding.

Bei der direkten Methode ist der Primärantikörper mit dem Indikator kovalent verbunden. Die indirekte Anordnung umgeht die Markierung des Primärantikörpers. Der Primärantikörper wird durch einen Antikörper, der mit einem Indikator markiert ist, detektiert. Dieser Sekundär antikörper, der aus einer anderen Tierspezies gewonnen wird, bindet an alle Primärantikörper jeder beliebigen Spezifität aus der ersten Spezies.In the direct method, the primary antibody is covalently linked to the indicator. The indirect arrangement bypasses the labeling of the primary antibody. The primary antibody is detected by an antibody that is labeled with an indicator. This secondary Antibody derived from another animal species binds to all primary antibodies any specificity from the first species.

Eine weitere Möglichkeit der Detektion stellt eine Methode dar, bei der drei Antikörper nacheinander zum Einsatz kommen. Der Primärantikörper aus Spezies A wird von einem nicht- markierten Sekundärantikörper aus Spezies B, der im Überschuß vorliegt detektiert.Another method of detection is a method using three antibodies are used one after the other. The primary antibody from species A is derived from a non- labeled secondary antibody from species B, which is present in excess.

Anschließend folgt die Zugabe eines Tertiärantikörpers aus Spezies A, der mit einem Indikator verknüpft ist. Der Sekundärantikörper (Verbindungsantikörper) wirkt als Brücke zwischen Primär- und Tertiärantikörper. Durch die Verwendung mehrerer hintereinandergeschalteter Antikörper wird eine Steigerung der Empfindlichkeit vermittelt.This is followed by the addition of a tertiary antibody from species A, with an indicator is linked. The secondary antibody (connection antibody) acts as a bridge between Primary and tertiary antibodies. By using several cascaded Antibodies are given an increase in sensitivity.

Die Sichtbarmachung des gebundenen Primärantikörpers kann alternativ durch andere Bin dungssysteme erfolgen. Ein geeignetes System stellt die Avidin-Biotin-Complex-Bindung dar (ABC-System). Hierbei muß der Primär- oder der Sekundärantikörper biotinyliert vorliegen. Die Indikatoren liegen ebenfalls biotinyliert vor und werden an das tetravalente Avidin unter Absättigung dreier Bindungsstellen gebunden. Die vierte Avidinbindungsstelle kann an den biotinylierten Primär- oder Sekundärantikörper binden. Sind die verwendeten Indikatoren mehrfach biotinyliert, ergeben sich sehr große Avidin-Enzym-Komplexe, die die Empfindlich keit des Testsystems erhöhen (Anstelle von Avidin kann auch Streptavidin verwendet werden). (aus Bioanalytik, F. Lottspeich, H. Zorbas, Spektrum Akademischer Verlag, 1998, S. 91 ff) Bei diesem Verfahren besteht das Problem einer weiteren Steigerung der Empfindlichkeit.The visualization of the bound primary antibody can alternatively by other bin systems. A suitable system is the avidin-biotin complex binding (ABC system). The primary or secondary antibody must be biotinylated. The indicators are also biotinylated and are subordinate to the tetravalent avidin Saturation of three binding sites bound. The fourth avidin binding site can be linked to the bind biotinylated primary or secondary antibodies. Are the indicators used Multiple biotinylated, there are very large avidin-enzyme complexes that are sensitive Increase the speed of the test system (streptavidin can also be used instead of avidin). (from Bioanalytik, F. Lottsspeich, H. Zorbas, Spektrum Akademischer Verlag, 1998, p. 91 ff) This method has the problem of further increasing sensitivity.

Signalamplifikation durch den Einsatz einer derivatisierten, multimeren Lumazinsynthase in Lösung oder auf einer beliebigen Oberfläche:Signal amplification through the use of a derivatized, multimeric lumazine synthase in Solution or on any surface:

1. Durch Zwischenschaltung eines biotinylierten multimeren Lumazinsyndiase-Konjugats (Linkerprotein) zwischen Primärantikörper und Indikator1. By interposing a biotinylated multimeric lumazine syndiase conjugate (linker protein) between the primary antibody and the indicator

Eine Lumazinsynthase, die bis zu 60 Biotinmoleküle (z. B. über einen kurzen Abstandshalter an die Lumazinsynthase gebunden, um eine mögliche sterische Hinderung zu vermeiden) auf ihrer Oberfläche enthält, nimmt dabei aufgrund ihrer sphärischen; multimeren Struktur eine besondere Stellung ein. Die Bindung zwischen Antikörper und Linkerprotein bzw. zwischen Linkerprotein und Indikator erfolgt dabei unter Verwendung einer Avidinbrücke oder einer Streptavidinbrücke. Alternativ dazu, können auch Avidin- oder Streptavidin-markierte Primärantikörper bzw. Indikatoren zum Ein satz kommen. An 59 der 60 Biotinmoleküle auf dem multimeren Linkerprotein können Indikatormoleküle gebunden werden, wobei lediglich ein Biotinmolekül zur Vermittlung einer Bindung zwischen Primärantikörper und Linkerprotein notwendig ist. Durch die resultierende mehrfache Bindung von farbreaktionvermittelndem Enzym, wird eine extreme Signalverstärkung erreicht, wobei die Signalstärke proportional zur Antigenkonzentration ansteigt.A lumazine synthase that up to 60 biotin molecules (e.g. bound to the lumazine synthase via a short spacer, to avoid possible steric hindrance) on their surface due to their spherical; multimeric structure. The connection between antibody and linker protein or between linker protein and indicator using an avidin bridge or a streptavidin bridge. Alternatively, Avidin or streptavidin-labeled primary antibodies or indicators can also be used sentence come. 59 of the 60 biotin molecules on the multimeric linker protein can Indicator molecules are bound, with only one biotin molecule to mediate one Binding between the primary antibody and linker protein is necessary. By the resulting multiple binding of color reaction mediating enzyme becomes extreme Signal amplification achieved, the signal strength being proportional to the antigen concentration increases.

2. Durch Einsatz von heterooligomeren biotinylierten Lumazinsynthase-Konjugaten2. By using heterooligomeric biotinylated lumazine synthase conjugates

Durch die erfindungsgemäße Reassoziation von unterschiedlichen Lumazinsynthase-Varianten (beispielsweise eine Kombination von 1-3 Antigen-enthaltenen Lumazinsynthasemonomeren mit bis zu 59 biotinylierten Lumazinsynthasemonomeren), wird ein heterooligomeres Lumazinsynthase-Konjugat erzeugt, welches sowohl einen Reaktanden (z. B. Antigen) als auch mehrere Biotin-Moleküle enthält. An die Biotin-Moleküle können Streptavidin- oder Avidin vermittelt (oder auch über einen Anti-Biotin-Antikörper) Indikatormoleküle gebunden werden. Exemplarisch sollen im folgenden zwei Einsatzmöglichkeiten besprochen werden: A) Ein Lumazinsynthase-Konjugat, welches 1-5 kurze Peptide von antigen wirksamen viralen oder bakteriellen Oberflächenproteinen (antigene Determinanten) und bis zu 60 Biotinmoleküle kovalent gebunden enthält, dient als Detektionsmolekül für immobilisierte Antikörper, die aus einem Patientenserum oder anderen Flüssigkeiten stammen. B) Charakteristische Antikörper gegen bestimmte Infektionskrankheiten werden mit Hilfe spezieller immobilisierter Epitope (Teile von Oberflächenproteinen der betreffenden pathogenen Organismen; antigene Determinanten) aus der jeweiligen Körperflüssigkeit gefischt. Ein Lumazinsynthase-Konjugat, welches ebenfalls 1-5 Kopien des oben bezeichneten Epitops und bis zu 60 Biotinmoleküle kovalent gebunden enthält, dient als Detektionsmolekül für die, an das immobilisierte Epitop gebundenen, Antikörper. Eine Farbreaktion wird in beiden Fällen (A und B) durch ein beliebiges streptavidingekoppeltes Enzym, welches einen Komplex mit der biotinylierten Lumazinsynthase eingeht, erreicht. Durch die Zwischenschaltung dieses mehrfach biotinylierten Linkerproteins (Lumazinsynthase-Konjugat) und der dadurch bedingten mehrfachen Bindung von farbreaktionvermittelndem Enzym, wird eine Signalverstärkung erreicht.By the reassociation of different lumazine synthase variants according to the invention (For example, a combination of 1-3 antigen-containing lumazine synthase monomers with up to 59 biotinylated lumazine synthase monomers), becomes a heterooligomeric Lumazine synthase conjugate which produces both a reactant (e.g. antigen) and contains several biotin molecules. Streptavidin or avidin can be attached to the biotin molecules mediated (or via an anti-biotin antibody) indicator molecules are bound. Two possible uses will be discussed as examples: A) On Lumazine synthase conjugate, which is 1-5 short peptides of antigenic viral or effective bacterial surface proteins (antigenic determinants) and up to 60 biotin molecules contains covalently bound, serves as a detection molecule for immobilized antibodies that are made up of a patient's serum or other liquids. B) Characteristic antibodies against certain infectious diseases with the help of special immobilized epitopes (Parts of surface proteins of the pathogenic organisms in question; antigens Determinants) fished from the respective body fluid. A lumazine synthase conjugate, which also contains 1-5 copies of the epitope described above and up to 60 biotin molecules covalently bound, serves as a detection molecule for the, to the immobilized epitope bound, antibody. A color reaction is indicated by a in both cases (A and B) any streptavidine-coupled enzyme that complexes with the biotinylated Lumazine synthase received, reached. By interposing this multi-biotinylated Linker protein (lumazine synthase conjugate) and the resulting multiple binding of color reaction mediating enzyme, signal amplification is achieved.

3. Durch Einsatz von heterooligomeren, nicht biotinylierten, Lumazinsynthase-Konjugaten3. By using heterooligomeric, non-biotinylated, lumazine synthase conjugates

Durch die erfindungsgemäße Reassoziation von unterschiedlichen Lumazinsynthase-Varianten wird ein heterooligomeres Lumazinsynthase-Konjugat erzeugt, welches sowohl einen Reaktanden (z. B. Antigen, welches spezifisch Antikörper aus einem Patientenserum binden kann) in einfacher Ausführung, als auch Epitope in mehrfacher Ausführung, welche von Indikator-markierten Antikörpern erkannt werden, enthält. Auch hierbei wird, durch die mögliche mehrfache Bindung von Antikörper-Indikator-Komplexen an das multimere Protein, eine Signalverstärkung erreicht.Through the reassociation of different lumazine synthase variants according to the invention a heterooligomeric lumazine synthase conjugate is generated, which both a Reactants (e.g. antigen, which specifically bind antibodies from a patient's serum can) in single execution, as well as epitopes in multiple execution, which by Indicator-labeled antibodies are recognized contains. Here too, the possible multiple binding of antibody-indicator complexes to the multimeric protein, signal amplification achieved.

BiosensorenBiosensors

Klassische biochemische Analysenverfahren, wie z. B. der Immunassay, basieren auf chemischen Reaktionssystemen in flüssigem Zustand. Eine mögliche Alternative bietet die Anwendung von Festphasenmeßapparaturen oder Biosensoren. In den letzten Jahren findet die Verwendung von Biosensoren als schnelle und empfindliche Testsysteme zum Nachweis verschiedenster Stoff und Molekülklassen immer mehr Anwendung. Ein Biosensor besteht aus mindestens drei Bestandteilen: biologischer Rezeptor, Wandler und angegliederte Elektronik. In einem Immunsensor kann der biologische Rezeptor ein Antikörper oder ein Antigen sein, der auf verschiedene Arten an den Wandler gekoppelt ist. In beiden genannten Variationen ermöglichen die Sensoren die Messung sich spezifisch ausbildender Antigen-Antikörper- Komplexe.Classic biochemical analysis methods, such as B. the immunoassay, are based on chemical reaction systems in liquid state. A possible alternative is the Use of solid phase measuring devices or biosensors. In recent years, the Use of biosensors as fast and sensitive test systems for detection different substance and molecular classes more and more application. A biosensor consists of at least three components: biological receptor, transducer and associated electronics. In an immune sensor, the biological receptor can be an antibody or an antigen which is coupled to the converter in different ways. In both variations mentioned the sensors enable the measurement of specifically developing antigen-antibody Complexes.

Für den Einsatz als chemische Sensoren in Flüssigkeiten, beispielsweise Seren, sind vor allem Volumenschwinger geeignet. Zu ihnen gehören die Schwingquarze, die auf einer speziell be handelten Oberfläche (je nach Testprinzip) mit antigenen Proteinen oder monoklonalen Anti körpern beschichtet werden. Legt man an diese Quarze eine elektrische Wechselspannung an, so wird der Kristall zu elastischen Schwingungen angeregt, deren Amplitude ein Maximum erreicht, wenn die elektrische Frequenz mit einer der mechanischen Eigenfrequenzen des je weiligen Quarzes übereinstimmt. Diese Schwingungen lassen sich mit geeigneten Meßsystemen erfassen. Gibt man einen mit Antigenen beschichteten Quarzkristall in eine Lösung, die spezi fisch bindende Antikörper enthält, so lagern sich diese an seine Oberfläche an und verändern seine Masse. Dadurch wird eine Veränderung seiner Schwingfrequenz erreicht und zeigt so die Bindung eines Antikörpers an. Neben diesen piezoelektrischen Immunsensoren versucht man, Meßtechniken zu entwickeln, deren Funktionsweise derjenigen von potentiometrischen Elek troden gleicht, die also Ähnlichkeit zu pH-Meßgeräten haben. In diesem Fall zielt man darauf ab, die Veränderung des Potentials zu bestimmen, die bei der Ausbildung der Antigen-Anti körper-Komplexe auf einer dünnen equilibrierten Silicagelschicht an der Oberfläche der pH- Glasmembran entsteht. Eine weitere Möglichkeit der immunsensorischen Messung besteht in der Immobilisierung von Proteinen (Antikörper oder Antigene) auf der Oberfläche einer opti schen Faser. Die bei diesem Verfahren am häufigsten genutzten optischen Phänomene sind interferierende Wellen und Oberflächenplasmone. Eine interferierende Welle wird gebildet, wenn Licht, das an einer optischen Faser entlang strahlt, intern reflektiert wird. Diese interfe rierende Welle ist die elektromagnetische Energie, die an der Schnittstelle von Faseroptik und Flüssigkeit entsteht. Die Energie wird absorbiert, wenn absorbierende Moleküle an der Schnitt stelle auftreten, so daß der Grad der Absorption proportional zu der Menge des absorbieren den Materials der Schnittstelle ist. Die Ausbildung von Antigen-Antikörper-Komplexen, wobei das Antigen oder der Antikörper an die Faseroberfläche gebunden vorliegt, kann so nach gewiesen werden. Bei der "Surface plasmon resonance" wird ein metallbeschichtetes Glas als optische Einrichtung benutzt, bei der ein intern vollständig reflektierter Lichtstrahl eine indu zierte elektromagnetische Oberflächenwelle oder Plasmon hervorruft. Eine nachweisbare Oberflächenplasmonresonanz tritt bei einem bestimmten Einfallswinkel des Lichts auf, der ent scheidend vom Refraktionsindex des Mediums, welches an den Metallfilm angrenzt, abhängt. Somit können Veränderungen in dieser Schicht, wie sie z. B. nach der Ausbildung von Antigen- Antikörper-Komplexen zu erwarten sind, gemessen werden.For use as chemical sensors in liquids, for example serums, are mainly Volume transducer suitable. These include the quartz crystals, which are placed on a special traded surface (depending on the test principle) with antigenic proteins or monoclonal anti bodies are coated. If you apply an electrical alternating voltage to these crystals, so the crystal is excited to elastic vibrations, the amplitude of which is a maximum reached when the electrical frequency with one of the mechanical natural frequencies of each quartz matches. These vibrations can be measured with suitable measuring systems to capture. If you put a quartz crystal coated with antigens in a solution that spec contains fish-binding antibodies, they attach themselves to its surface and change its mass. This causes a change in his oscillation frequency and thus shows that Binding of an antibody. In addition to these piezoelectric immune sensors, To develop measuring techniques, the functioning of which of potentiometric elec troden is similar, so they have a similarity to pH measuring devices. In this case, aim at it starting to determine the change in potential in the formation of the antigen-anti body complexes on a thin equilibrated silica gel layer on the surface of the pH Glass membrane is created. Another option for immunosensitive measurement is in the immobilization of proteins (antibodies or antigens) on the surface of an opti fiber. The optical phenomena most frequently used in this method are interfering waves and surface plasmons. An interfering wave is formed when light that shines along an optical fiber is internally reflected. This interfe rier wave is the electromagnetic energy at the interface of fiber optics and Liquid arises. The energy is absorbed when absorbing molecules at the cut place occur so that the degree of absorption is proportional to the amount of absorb the material of the interface. The formation of antigen-antibody complexes, whereby the antigen or the antibody is bound to the fiber surface, so can be directed. In the "Surface plasmon resonance", a metal-coated glass is used as used optical device in which an internally completely reflected light beam indu decorated electromagnetic surface wave or plasmon. A detectable Surface plasmon resonance occurs at a certain angle of incidence of light that ent depends largely on the refractive index of the medium that is adjacent to the metal film. Changes in this layer, such as e.g. B. after the formation of antigen Antibody complexes are expected to be measured.

Zu den potentiometrischen Immunsensoren sind die ionensensitiven Feldeffekttransistoren zu zählen. Eine Rezeptor (Antikörper, Antigen oder sonstiger Rezeptor) wird dabei auf dem Halbleitertor des Transistors verankert. Die Bindung eines Analyten an die Rezeptorschicht ruft eine Veränderung in der Ladungsverteilung und damit eine Schaltung des Feldeffekttransistors hervor. (Aus Modrow S., Falke D., Molekulare Virologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, S. 108; Liddell E., Weeks L, Antikörper- Techniken, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, S. 154 ff). Auch bei diesen Sensorverfahren besteht der Wunsch nach Steigerung der Empfindlichkeit.The ion-sensitive field effect transistors are added to the potentiometric immune sensors counting. A receptor (antibody, antigen or other receptor) is on the Semiconductor gate of the transistor anchored. The binding of an analyte to the receptor layer calls a change in the charge distribution and thus a switching of the Field effect transistor emerges. (From Modrow S., Falke D., Molecular Virology, Spectrum Academic publisher, Heidelberg, Berlin, Oxford, p. 108; Liddell E., Weeks L, Antibody Techniques, Spectrum Academic Publishing House, Heidelberg, Berlin, Oxford, pp. 154 ff). Also at With these sensor methods there is a desire to increase the sensitivity.

Signalamplifikation durch den Einsatz derivatisierter, multimerer Lumazinsynthasemoleküle auf einer signalvermittelnden Oberfläche:
Artefizielle Proteinmoleküle auf der Grundlage der Lumazinsynthase können beim Aufbau eines Biosensors als Trägerprotein z. B. zur Präsentation von antigen wirksamen Fängerpeptiden, zum Nachweis von Antikörpern gegen bestimmte Infektionen dienen. Durch die erfindungsgemäße Ausbildung von gemischten Lumazinsynthase-Konjugaten können die jeweiligen Peptide zusammen mit einem bindungsvermittelnden Biotinmolekül in eine ikosaedrische Struktur eingebaut werden. Auf diese Weise können bis zu 59 identische oder verschiedene antigen wirksame Peptide (z. B. Domänen von viralen Oberflächenproteinen) in Verbindung mit einem Biotinmolekül, auf einem ikosaedrischen Molekül präsentiert werden. Durch Verwendung mehrerer verschiedener multimerer Lumazinsynthase-Konjugate läßt sich eine repräsentative Peptidbibliothek auf einem einzigen Sensor plazieren. Die Bindung der multimeren Lumazinsynthase-Konjugate an die Oberfläche eines Wandlers läßt sich beispielsweise über eine Streptavidin/Biotin-Kopplung ermöglichen.Signal amplification by using derivatized, multimeric lumazine synthase molecules on a signal-mediating surface:
Artificial protein molecules based on the lumazine synthase can be used in the construction of a biosensor as a carrier protein. B. for the presentation of antigenic capture peptides, for the detection of antibodies against certain infections. The inventive formation of mixed lumazine synthase conjugates enables the respective peptides to be incorporated into an icosahedral structure together with a binding-promoting biotin molecule. In this way up to 59 identical or different antigenic active peptides (e.g. domains of viral surface proteins) can be presented on an icosahedral molecule in connection with a biotin molecule. By using several different multimeric lumazine synthase conjugates, a representative peptide library can be placed on a single sensor. The binding of the multimeric lumazine synthase conjugates to the surface of a transducer can be made possible, for example, via a streptavidin / biotin coupling.

Die Empfindlichkeit eines derartigen Testsystems wird durch das Anbieten mehrerer antigener Determinanten erheblich gesteigert, da dadurch nicht nur ein, sondern mehrere gegen einen bestimmten Erreger gebildeter Antikörper erfasst werden. Desweiteren ist kein fundiertes De tailwissen über Proteinabschnitte erforderlich, die zur Bindung von Antikörpern beitragen, da mit begrenztem Aufwand mehrere Proteine des betreffenden Erregers auf dem Sensor präsen tiert werden können. Da die Streptavidin/Biotin-Kopplung für alle Epitoppräsentationen ver wendet werden kann, benötigt man zum Aufbau eines Biosensors immer die gleichen, nämlich Avidin oder Streptavidin beschichtete Oberflächen, d. h. die instrumentelle Ausstattung muß nicht verändert werden. Die jeweiligen individuellen, epitoppräsentierenden oder biotinylierten Lumazinsynthase-Untereinheiten können leicht auf rekombinantem Wege hergestellt werden. Dies hat wesentliche Vorteile bei der Entwicklung bzw. der Evaluierung derartiger Nachweis verfahren. The sensitivity of such a test system is enhanced by offering several antigens Determinants significantly increased, because it means not only one, but several against one specific pathogen formed antibodies are detected. Furthermore, there is no sound De requires knowledge of protein segments that contribute to the binding of antibodies because present several proteins of the relevant pathogen on the sensor with limited effort can be tiert. Since the streptavidin / biotin coupling ver for all epitope presentations can be used, you always need the same to set up a biosensor, namely Avidin or streptavidin coated surfaces, i.e. H. the instrumentation must cannot be changed. The individual, epitope-presenting or biotinylated Lumazine synthase subunits can easily be produced by recombinant means. This has significant advantages in the development or evaluation of such evidence method.

Durch die Anwesenheit von bis zu 59 Fängerpeptiden in einem Molekül kann die Oberfläche eines Sensor-Chips (z. B. Feldeffekttransistor, Oberflächenplasmon-Wandleroberfläche, etc.) extrem vergrößert werden und dadurch eine enorme Empfindlichkeitssteigerung erreicht werden. Stabilitätsprobleme und Unspezifitäten sind bei der Verwendung eines thermostabilen Trägerproteins und des Biotin/Streptavidin-Systems nicht zu erwarten.Due to the presence of up to 59 capture peptides in one molecule, the surface a sensor chip (e.g. field effect transistor, surface plasmon transducer surface, etc.) be extremely enlarged and thereby achieve an enormous increase in sensitivity become. Stability problems and nonspecificities are when using a thermostable Carrier protein and the biotin / streptavidin system are not expected.

Ebenso können auch kleine Moleküle durch einfache chemische Kopplung an die Oberfläche gebunden werden. Als Kopplungsorte stehen hierfür singuläre, exponierte reaktive Aminosäuren auf der Oberfläche des sphärischen Proteins zur Verfügung.Small molecules can also be attached to the surface by simple chemical coupling be bound. The coupling sites for this are singular, exposed reactive Amino acids are available on the surface of the spherical protein.

Prinzipieller Aufbau eines Schichtsystems auf der Basis einer multimeren Lumazinsynthase:
Eine funktionalisierte Lumazinsynthase ist mit 60 gleichen bzw. unterschiedlich modifizierten Untereinheiten über einen Anker (Peptid, Fettsäure, etc.) mit einer Oberfläche (beispielsweise Wandleroberfläche oder sonstige beliebige Oberfläche, die sich schon auf einem Wandler befindet) verbunden. Die Detektionempfindlichkeit für Fremdmolekülbindung auf der Oberfläche der Lumazinsynthase wird dabei durch eine hohe Anzahl funktioneller Gruppen (beispielsweise Epitope zur Antikörpererkennung, Antikörper zur Detektion von Fremdmolekülen in Lösung oder sonstiger Rezeptoren) erhöht.Basic structure of a layer system based on a multimeric lumazine synthase:
A functionalized lumazine synthase with 60 identical or differently modified subunits is connected via an anchor (peptide, fatty acid, etc.) to a surface (for example a transducer surface or any other surface that is already on a transducer). The detection sensitivity for foreign molecule binding on the surface of the lumazine synthase is increased by a large number of functional groups (for example epitopes for antibody detection, antibodies for the detection of foreign molecules in solution or other receptors).

Herstellung von Impfstoffen (in vitro)Vaccine production (in vitro)

Impfungen führen zu einer immunologischen Resistenz gegen Krankheitserreger. Impfstoffe dienen überwiegend zur Prävention, das heißt, sie sollen bei den immunisierten Personen einen Schutz aufbauen, der sie bei Kontakt mit dem jeweiligen Erreger vor der Infektion und somit vor der Erkrankung schützt. Der injizierte oder oral verabreichte Impfstoff führt im Organis mus zur Bildung von Antikörpern und/oder zu einer zellulären Immunantwort. Infolgedessen wird bei einer künftigen Exposition der infektiöse Organismus abgetötet oder neutralisiert, so daß die Krankheit nicht ausbricht.Vaccinations lead to immunological resistance to pathogens. Vaccines serve mainly for prevention, that is, they should unite in the immunized persons Build up protection against contact with the respective pathogen from infection and thus protects against the disease. The injected or orally administered vaccine leads in the organ for the formation of antibodies and / or for a cellular immune response. Consequently the future infectious organism is killed or neutralized, so that the disease doesn't break out.

Infektionen mit Bakterien, Viren, Pilzen und Protozoen sind weltweit ein Hauptfaktor der Morbidität und Mortalität. Durch die zunehmende Resistenzentwicklung gegen so gut wie alle verfügbaren Antibiotika ist auch in Industrieländern eine Verschärfung der Morbiditätssituation zu erwarten. Die Entwicklung neuartiger Impfstoffe ist auch deshalb von größter medizinischer Bedeutung.Bacterial, viral, fungal and protozoan infections are a major factor worldwide Morbidity and mortality. Due to the increasing development of resistance to almost everyone Available antibiotics is also exacerbating the morbidity situation in industrialized countries expected. The development of novel vaccines is therefore of the greatest medical importance Importance.

Als Impfstoffe kommen unter anderem attenuierte Viren zur Anwendung. Attenuierte Viren ähneln den krankheitserzeugenden Erregern, sie unterscheiden sich von ihnen jedoch im Hin blick auf das Virulenzverhalten; sie verursachen nur eine begrenzte bzw. abgeschwächte Infektion und induzieren dadurch die Bildung von neutralisierenden Antikörpern und cyto toxischen T-Zellen. Die molekulare Basis der Attenuierung sind Mutationen im Genom von Wildtypviren. Attenuierte Viren verleihen meist einen sehr guten Impfschutz, der über mehrere Jahre erhalten bleibt, sie bergen jedoch das Risiko, daß sie im Verlauf der abgeschwächten In fektion zur Wildtypform zurückmutieren können.Attenuated viruses, among others, are used as vaccines. Attenuated viruses are similar to the pathogens causing disease, but differ in their outlines look at the virulence behavior; they only cause a limited or weakened Infection and thereby induce the formation of neutralizing antibodies and cyto toxic T cells. The molecular basis of attenuation are mutations in the genome of Wild type viruses. Attenuated viruses usually give a very good vaccination protection, which over several Years is retained, but there is a risk that they will decrease in the course of the weakened In mutation back to wild type form.

Eine weitere Möglichkeit zur Immunisierung bei Mensch und Tier besteht in der Präsentation von antigen wirksamen Teilen von viralen Oberflächenproteinen auf anderen, nicht pathogen wirkenden Viren, z. B. Pflanzenviren. Die Genfragmente, die für eine antigene Determinante (z. B. Oberflächenprotein) des pathogen wirkende Virus kodieren werden in das Genom des nicht pathogen wirkenden Virus eingebaut (Dalsgaard et al., 1997). Das Fremdprotein wird zusammen mit einem viralen Protein auf der Oberfläche des nicht pathogen wirkenden Virus präsentiert. Es können jedoch nicht beliebig große DNA-Fragmente in das Virusgenom integriert werden. Daher muß man genau wissen, welche Proteine des Virus, gegen dessen Infektion ein Impfschutz erzeugt werden soll, für die Auslösung einer schützenden Immunantwort wichtig sind. Ein derartiger Impfstoff kann nicht die Breite einer Immunantwort erzeugen, die beim Ablauf einer Infektion mit dem Wildtypvirus oder seiner attenuierten Variante entsteht. Bei dieser Art von rekombinanten Impfviren beschränkt sich die immunologische Reaktion auf ein ausgewähltes Protein.Another possibility for immunization in humans and animals is the presentation of antigenic active parts of viral surface proteins on others, not pathogenic acting viruses, e.g. B. Plant viruses. The gene fragments necessary for an antigenic determinant (e.g. surface protein) of the pathogenic virus are encoded in the genome of the non-pathogenic virus incorporated (Dalsgaard et al., 1997). The foreign protein is together with a viral protein on the surface of the non-pathogenic virus presents. However, DNA fragments of any size cannot enter the virus genome to get integrated. Therefore, one must know exactly which proteins of the virus, against which Infection should be created to trigger a protective Immune responses are important. Such a vaccine cannot be the breadth of an immune response generate that when an infection with the wild-type virus or its attenuated Variant arises. This type of recombinant vaccine virus limits immunological response to a selected protein.

Impfstoffe, die aus synthetischen Peptiden mit einer Länge von 15 bis 30 Aminosäuren beste hen, stellen eine Vakzineform dar, die sich heute in der Erprobung befindet. Hier werden ein zelne Epitope viraler Proteine, welche die Bildung von neutralisierenden Antikörpern bewir ken, ausgewählt und chemisch synthetisiert. Voraussetzung ist auch in diesem Fall ein fundier tes Detailwissen über die Proteinabschnitte, die eine virusneutralisierende Immunantwort her vorrufen können. Aufgrund der hohen genetischen Variabilität der meisten Viren und der un terschiedlichen Fähigkeit einzelner Individuen, bestimmte Proteinregionen immunologisch zu erkennen, müßten in einem auf synthetischen Peptiden basierenden Impfstoff mehrere verschie dene Epitope miteinander kombiniert werden. Da es abgesehen von Aluminiumhydroxid kein geeignetes beim Menschen einsetzbares Adjuvans, das die Immunantwort in ausreichender Weise verstärken kann, gibt, ist bislang noch kein Impfstoff verfügbar, der auf synthetischen Peptiden beruht: (Aus Modrow S., Falke D., Molekulare Virologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, S. 87 ff)Vaccines made from synthetic peptides 15 to 30 amino acids long hen, represent a vaccine form that is currently being tested. Here will be a individual epitopes of viral proteins which cause the formation of neutralizing antibodies ken, selected and chemically synthesized. In this case too, a prerequisite is sound tes detailed knowledge of the protein segments that produce a virus-neutralizing immune response can call. Due to the high genetic variability of most viruses and the un different ability of individual individuals to immunologically target certain protein regions would recognize several in a synthetic peptide-based vaccine whose epitopes are combined. Since there is no other than aluminum hydroxide suitable adjuvant which can be used in humans and which has an adequate immune response Way, there is as yet no vaccine available that is synthetic Peptides is based on: (From Modrow S., Falke D., Molecular Virology, Spectrum Academic Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, p. 87 ff)

Im Gegensatz zu kurzen Peptiden eignen sich hochmolekulare Moleküle, u. a. Proteine und trägerfixierte Peptide, da sie ohne die Verwendung von Hilfsstoffen verabreicht werden können, aber dennoch eine gute Immunität liefern, vorzüglich als Impfstoffe. Das redundante Vorkommen antigener Determinanten in hoher Anzahl, wie sie z. B. bei Viren oder Bakterien zu beobachten sind, auf dem immunogenen hochmolekularen Molekül begünstigt dabei die erwünschte hohe Antigenität d. h. die präventive Immunantwort. Als Trägerprotein eignet sich hierfür, insbesondere wegen ihrer ikosaedrischen Struktur, die Lumazinsynthase. Die Lumazinsynthase besteht aus mindestens 60 Untereinheiten, d. h. mindestens 60 gleichartige oder verschiedene antigene Determinanten lassen sich in einem Molekül präsentieren. Die Lumazinsynthase ist hochmolekular aufgebaut und hat eine mit einigen Viren vergleichbare Oberflächenstruktur, d. h. eine hohe Antigenität ist zu erwarten. Derartige Impfstoffe sind frei von viralen Genen und sie lassen sich mit relativ geringem Aufwand in hohen Mengen herstellen. Da große Teile der Virusproteine präsentiert werden können, ist in diesem Fall kein fundiertes Detailwissen über die Proteinabschnitte, die eine virusneutralisierende Immunantwort hervorrufen können, erforderlich.In contrast to short peptides, high-molecular molecules are suitable. a. Proteins and carrier-fixed peptides because they are administered without the use of excipients can, but still provide good immunity, especially as vaccines. The redundant Occurrence of antigenic determinants in large numbers, as z. B. viruses or bacteria are observed, the immunogenic high-molecular molecule favors the desired high antigenicity d. H. the preventive immune response. Suitable as a carrier protein for this, in particular because of its icosahedral structure, the lumazine synthase. The Lumazine synthase consists of at least 60 subunits, i.e. H. at least 60 of the same kind or different antigenic determinants can be presented in one molecule. The Lumazine synthase has a high molecular structure and is comparable to some viruses Surface structure, d. H. high antigenicity is to be expected. Such vaccines are free of viral genes and they can be found in large quantities with relatively little effort produce. Since large parts of the virus proteins can be presented, there is none in this case in-depth detailed knowledge of the protein segments that are virus-neutralizing Can elicit an immune response.

Die gentechnisch hergestellten Proteine, welche Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, beruhen auf der kovalenten Verknüpfung einer Wildtyp-Lumazinsynthasesequenz oder einer modifizierten Lumazinsynthase mit Teilstrukturen von Viren, Bakterien, Pilzen, Protozoen oder Toxinen. Die Verknüpfung kann dabei am N-Terminus und/oder am C-Terminus der Lu mazinsynthase erfolgen. Außerdem können die zu präsentierenden Peptide an geeigneten Stel len der Lumazinsynthaseuntereinheit so in die Sequenz eingefügt werden, daß sie in Form einer Schleife auf der Oberfläche des Multi-Untereinheiten-Proteins präsentiert werden. Damit kann eine gegebene immunologische Determinante in einer definierten hohen Anzahl, z. B. erfin dungsgemäß bevorzugt 60-fach oder 120-fach, auf einem ikosaedrischen Molekül aus 60 Un tereinheiten mit der Triangulationszahl T = 1, präsentiert werden. Außerdem können auch hö hermolekulare Assoziate hergestellt werden, welche mehr als 100 Untereinheiten enthalten (Triangulationszahl T = 2 oder höher) und damit eine noch größere Anzahl Epitope präsentie ren können.The genetically engineered proteins which are the subject of the present invention are based on the covalent linkage of a wild-type lumazine synthase sequence or modified lumazine synthase with substructures of viruses, bacteria, fungi, protozoa or toxins. The link can be made at the N-terminus and / or at the C-terminus of the Lu magazine synthase. In addition, the peptides to be presented can be placed in a suitable position len of the lumazine synthase subunit are inserted into the sequence so that they are in the form of a Loop are presented on the surface of the multi-subunit protein. So that can a given immunological determinant in a defined high number, e.g. B. invented according to the invention preferably 60 times or 120 times, on an icosahedral molecule of 60 Un units with the triangulation number T = 1 are presented. In addition, high hermolecular associates are prepared which contain more than 100 subunits (Triangulation number T = 2 or higher) and thus present an even larger number of epitopes can.

Die erfindungsgemäße Assoziation von Untereinheiten mit unterschiedlichen, gentechnisch aufgepfropften Peptid- oder Proteinsequenzen bietet auch die Möglichkeit zur Herstellung von Proteinmolekülen, welche mehrere unterschiedliche antigene Sequenzen auf einem gegebenen Molekül präsentieren können. The association according to the invention of subunits with different, genetic engineering grafted peptide or protein sequences also offers the possibility of producing Protein molecules that have several different antigenic sequences on a given Can present molecule.

DNA-ImpfstoffDNA vaccine

Seit dem Beginn der 90er Jahre wird auch die Möglichkeit zum Einsatz von DNA als Impfstoff untersucht. Die verwendeten Nukleinsäuren enthalten Gene oder Teile von Genen eines pathogenen Organismus, die ein immunogenes Protein spezifizieren. Für die Entwicklung dieser Vakzine ist detailliertes Wissen über die immunologisch wichtigen Komponenten von großem Nutzen. Die verwendeten Gene kodieren überwiegend für die Oberflächenkomponenten eines Erregers oder auch für Teile von bakteriellen Toxinen. Sie werden zusammen mit regulatorischen Elementen zur Kontrolle ihrer Expression in ein Vektorsystem integriert und als gereinigte DNA intramuskulär injiziert und dort exprimiert. Insbesondere in Muskelzellen ist die DNA über lange Zeiträume als Episom nachweisbar, da sie offensichtlich nur sehr langsam abgebaut wird. Wenn die entsprechenden Gene exprimiert werden, kann der Organismus sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Immunantwort entwickeln. Diese Form der Impfstoffe wurde bisher im Tiersystem erprobt.Since the beginning of the 90s there has also been the possibility of using DNA as a vaccine examined. The nucleic acids used contain genes or parts of genes of one pathogenic organism that specify an immunogenic protein. For the development This vaccine is detailed knowledge of the immunologically important components of great benefit. The genes used mainly code for Surface components of a pathogen or for parts of bacterial toxins. she are used together with regulatory elements to control their expression Integrated vector system and injected intramuscularly as purified DNA and expressed there. In muscle cells in particular, DNA can be detected as an episome over long periods of time because it is obviously only slowly degrading. If the appropriate genes are expressed the organism can have both a humoral and a cellular immune response develop. This form of vaccine has so far been tested in the animal system.

Genkonstrukte, welche Fusionsproteine bestehend aus Proteinkomponenten pathogener Mikoorganismen und aus Lumazinsynthase spezifizieren, sind grundsätzlich als DNA-Impfstoff geeignet. Ein DNA-Vakzin, bestehend aus einem Gen kodierend für eine Lumazinsynthase (partikelbildende Komponente) und einem ausgewählten Gen des Erregers kann intrazellulär exprimiert werden und kann so eine relativ lang anhaltende Produktion des Immunsystem stimulierenden Antigens gewährleisten. Nach den bisherigen Erfahrungen mit Lumazinsynthase aus verschiedenen Organismen sollte der Zusammenbau des Ikosaeders in vivo ohne Hilfsmoleküle (vgl. Chaperonine) möglich sein.Gene constructs, which are fusion proteins consisting of pathogenic protein components Specifying microorganisms and from lumazine synthase are basically a DNA vaccine suitable. A DNA vaccine consisting of a gene coding for a lumazine synthase (particle-forming component) and a selected gene of the pathogen can be intracellular can be expressed and thus a relatively long-lasting production of the immune system ensure stimulating antigen. Based on previous experience with lumazine synthase assembly of the icosahedron in vivo without different organisms Auxiliary molecules (see chaperonins) may be possible.

Orale Impfstoffe auf pflanzlicher BasisOral plant-based vaccines

Ist bekannt, gegen welche immunologisch wichtige Proteinkomponente des Erregers eine schützende Immunantwort induziert wird, kann das für dieses Peptid kodierende Gen in einen eukaryoten Expressionsvektor eingebracht werden. Nach Transformation von Pflanzenzellen mit dieser DNA können transgene Pflanzen erhalten werden, welche das betreffende Gen exprimieren. Durch Verzehr von Teilen dieser transgenen Pflanze wird auch die ausgewählte Proteinkomponente in den Körper aufgenommen und kann dort eine Immunantwort induzieren.It is known against which immunologically important protein component of the pathogen a protective immune response is induced, the gene coding for this peptide into a eukaryotic expression vector can be introduced. After transformation of plant cells This DNA can be used to obtain transgenic plants which contain the gene in question express. Eating parts of this transgenic plant will also make the selected one Protein component is absorbed into the body and there can be an immune response induce.

Als partikelbildendes Protein eignet sich insbesondere die Lumazinsynthase, an die Teile von immunologisch wirksamen Proteinen des Erregers fusioniert sind. Durch Verwendung einer thermostabilen, partikelbildenden Lumazinsynthase (z. B. aus Aquifex aeolicus) als Trägerprotein kann sogar ein kochfester Impfstoff erzeugt werden.The lumazine synthase to which parts of immunologically active proteins of the pathogen are fused. By using a thermostable, particle-forming lumazine synthase (e.g. from Aquifex aeolicus) as Carrier protein can even produce a boil-proof vaccine.

Multifunktional derivatisierte Immuntherapeutika auf der Basis der multimeren LumazinsynthaseMultifunctional derivatized immunotherapeutics based on multimers Lumazine synthase

Impfstoffe sollen die Vermehrung eines Krankheitserregers und damit eine Infektion verhindern. In einigen Fällen ist es schwierig, einen zuverlässigen Impfstoff zu entwickeln, da der pathogene Organismus für Antikörper nicht zugänglich ist, oder wie im Fall der erworbenen Immunschwäche (AIDS) zu wenig über den Erreger (HIV) bekannt ist. Die Zielzellen von HIV sind Helfer-T-Lymphozyten (Helferzellen) des Immunsystems, wobei die wichtigsten Funktionen dieser Zellen gestört werden. Wenn HIV in eine Helferzelle eindringt, ist das Virus vor dem immunologischen Angriff geschützt. Im weiteren Verlauf der Krankheit kann die infizierte Zelle durch die Produktion und die Freisetzung von HIV-Partikeln zerstört werden. Eine infizierte Zelle kann dabei zu einer "Fabrik" für die Produktion weiterer Viruspartikel werden. Die Konsequenz einer HIV-Infektion ist vor allem, daß das Immunsystem keinen Schutz mehr vor gewöhnlichen Infektionskrankheiten bieten kann. Der erste Schritt bei einer HIV-Infektion ist die Wechselwirkung eines 120 kDalton-Glykoproteins (gp 120) aus der Virushülle und dem CD4-Rezeptor an der Oberfläche der Helferzellen. Vaccines are said to multiply a pathogen and thereby cause an infection prevent. In some cases, it is difficult to develop a reliable vaccine because the pathogenic organism is not accessible to antibodies, or as in the case of acquired immune deficiency (AIDS) is too little known about the pathogen (HIV). The Target cells of HIV are helper T lymphocytes (helper cells) of the immune system, whereby the main functions of these cells are disrupted. When HIV enters a helper cell the virus is protected from the immunological attack. As the disease progresses the infected cell can be destroyed by the production and release of HIV particles become. An infected cell can become a "factory" for the production of others Become virus particles. The main consequence of an HIV infection is that this Immune system can no longer offer protection against common infectious diseases. The The first step in HIV infection is the interaction of a 120 kDalton glycoprotein (gp 120) from the virus envelope and the CD4 receptor on the surface of the helper cells.

Antikörper gegen CD4 blockieren in vitro die HIV-Infektion von Helferzellen. Auch bei einem Überschuß an freiem CD4-Protein geht die Infektionsrate in vitro zurück. Die Entwicklung eines Fusionsproteins aus einem Teil des CD4-Proteins und aus dem Fc-Anteil eines Immunglobulins stellt den Versuch dar, sowohl den Schutz der Helferzellen als auch die Abtötung des Virus zu erreichen. Das Fusionsprotein wird CD4-Immunadhäsin genannt. Das Molekül bindet an gp120 und blockiert das HIV; beides sind Funktionen des CD4-Anteils. Die Fähigkeit des Fusionsproteins, an Zellen mit Fc-Rezeptoren zu binden, und die lange Halbwertszeit im Plasma sind hingegen auf den Immunglobulinanteil zurückzuführen. Nach der Bindung des Immunadhäsins an das freie Virus oder an HIV-infizierte Zellen kommt es zu einer antikörperabhängigen, zellvermittelnden cytotoxischen Reaktion, die zur Zerstörung des Virus oder der HIV-infizierten Zelle führt. (aus: Glick, B., Pasternak, J., Molekulare Biotechnologie, Spektrum Akademischer Verlag, 1995, S. 245).Antibodies against CD4 block HIV infection of helper cells in vitro. Even with one Excess free CD4 protein reduces the infection rate in vitro. The development a fusion protein from part of the CD4 protein and from the Fc portion of one Immunoglobulin represents the attempt to protect both the helper cells and the To kill the virus. The fusion protein is called CD4 immunoadhesin. The Molecule binds to gp120 and blocks HIV; both are functions of the CD4 component. The The ability of the fusion protein to bind to cells with Fc receptors, and the long Half-life in plasma, however, is due to the immunoglobulin content. After The immunoadhesin binds to the free virus or to HIV-infected cells an antibody - dependent, cell - mediating cytotoxic reaction that destroys the Virus or HIV-infected cell leads. (from: Glick, B., Pasternak, J., Molecular Biotechnologie, Spektrum Akademischer Verlag, 1995, p. 245).

Durch die Verwendung einer multimeren derivatisierten Lumazinsynthase könnte sich die Effizienz dieser Strategie verbessern lassen. Es kann eine funktionalisierte Lumazinsynthase zur Verwendung kommen, die sowohl über CD4-Protein-Anteile, als auch über Fc-Anteile verfügt. Da pro Molekül nicht nur eine funktionelle Einheit, sondern viele dieser Einheiten, vorhanden sind, sollte sich die Effizienz erheblich steigern lassen.By using a multimerized derivatized lumazine synthase, the Let the efficiency of this strategy improve. It can be a functionalized lumazine synthase Use come that has both CD4 protein shares, as well as Fc shares. Because there is not just one functional unit per molecule, but many of these units efficiency should increase significantly.

Anstelle des CD4-Anteils könnte man in das multimere Protein auch Antikörper (z. B. speziell entwickelte "Single-chain-Antikörper"), die beispielsweise spezifisch gegen einen Tumormarker (z. B. gegen das Teratocarcinom-Antigen) gerichtet sind, einführen und dieses funktionalisierte Fusionsprotein zur Krebstherapie einsetzen.Instead of the CD4 portion, one could also insert antibodies (e.g. specifically developed "single-chain antibodies") that, for example, specifically against one Tumor markers (e.g. against the teratocarcinoma antigen) are directed and insert this Use functionalized fusion protein for cancer therapy.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit ist die Kombination eines Antikörpers gegen einen Tumormarker mit Metallothionein. Die multimere Lumazinsynthase ist dabei mit einem Anti- Tumor-Antikörper und bis zu 59 Metallothionein-Molekülen dekoriert. Die Metallothioneinmoleküle wiederum werden mit radioaktiven Elementen (mit relativ kurzer Halbwertszeit), welche für eine Strahlentherapie geeignet sind (beispielweise Technetium 99) beladen. Im Laufe der Therapie bindet der Proteinkomplex über seinen Antikörper-Anteil an den Tumor und führt dabei die Strahlenquelle direkt an das Tumorgewebe heran. Ähnliche Konstrukte können auch für diagnostische Zwecke, z. B. zur radioaktiven Detektion einer möglichen Krebserkrankung, eingesetzt werden.Another application is the combination of an antibody against one Tumor markers with metallothionein. The multimeric lumazine synthase is coated with an Tumor antibodies and up to 59 metallothionein molecules decorated. The Metallothionein molecules in turn are made with radioactive elements (with a relatively short Half-life), which are suitable for radiation therapy (e.g. Technetium 99) loaded. In the course of therapy, the protein complex binds via its antibody portion the tumor and leads the radiation source directly to the tumor tissue. Similar Constructs can also be used for diagnostic purposes, e.g. B. for radioactive detection of a possible cancer.

Verwendung von Lumazinsynthase-Konjugaten bei der Charakterisierung und Reinigung von AntikörpernUse of lumazine synthase conjugates in the characterization and purification of Antibodies

Die Grundlage der Fremdpeptide bilden DNA-Sequenzen, die für ein bestimmtes Epitop (antigene Determinante) kodieren. Die Sequenz der zusätzlichen Peptidsegmente kann durch entsprechende Wahl der DNA-Sequenz exakt bestimmt werden. Es können aber auch Peptidsequenzen eingebaut werden, die in ihrer gesamten Länge oder in Teilabschnitten eine stochastische Aminosäuresequenz besitzen. Eine vielfältige, zufallsorientierte Variabilität dieser Peptide kann durch den Einsatz von synthetischen Oligonukleotiden, die über einen zufällig (randomisiert) generierten Sequenzabschnitt verfügen, erreicht werden, so daß repräsentative Peptidbibliotheken entstehen. Diese zufällige generierten Peptide werden erfindungsgemäß auf der Oberfläche der Lumazinsynthase präsentiert und sind somit auch für eine Antikörperbindung zugänglich.The basis of the foreign peptides is formed by DNA sequences that are required for a specific epitope encode (antigenic determinant). The sequence of the additional peptide segments can by corresponding choice of the DNA sequence can be determined exactly. But it can also Peptide sequences are incorporated, which in their entire length or in sections have a stochastic amino acid sequence. A diverse, randomly oriented variability of these Peptides can be created by using synthetic oligonucleotides that are random (randomized) generated sequence section have to be achieved, so that representative Peptide libraries are created. According to the invention, these randomly generated peptides are based on the surface of the lumazine synthase and are therefore also for one Antibody binding accessible.

Die erhaltenen Lumazinsynthase-Varianten (mit einer zufallsorientierten Variabilität des Fremdpeptids) können z. B. zur Charakterisierung von Antikörper-Bindungsstellen verwendet werden. Durch die Isolierung von Antigen-Antikörper-Komplexen mit anschließender Sequenzierung des gebundenen Peptidanteils (N-terminale Edman-Sequenzierung oder Sequenzbestimmung mittels Massenspektroskopie), kann die Selektivität der Bindungsstelle eines Antikörpers charakterisiert werden. The lumazine synthase variants obtained (with a randomly oriented variability of the Foreign peptides) can e.g. B. used to characterize antibody binding sites become. By isolating antigen-antibody complexes with subsequent Sequencing of the bound peptide portion (N-terminal Edman sequencing or Sequence determination using mass spectroscopy), the selectivity of the binding site of an antibody can be characterized.

Des weiteren kann gezielt nach Antikörpern, die über eine bestimmte Antigenerkennung (Antigensequenz in diesem Fall bekannt) verfügen, gesucht werden. Durch den Einsatz von Misch-Konjugaten, d. h. Lumzinsynthase-Konjugaten, die sowohl über ein gewünschtes Fremdpeptid (in mehrfacher Ausführung), als auch über einen biotinylierten Anteil (in einfacher Ausführung) verfügen, können selektiv Antikörper aus einer Mischpopulation gereinigt werden. Die Verwendung von Streptavidin oder Avidin gekoppelt an eine feste Phase bietet sich hierfür an. Die Reinigung kann erfindungsgemäß aber auch auf der Basis von anderen Affinitätsmaterialien erfolgen. Die Elution der Antikörper erfolgt durch bekannte Standardmethoden.Furthermore, it can target antibodies that have a specific antigen recognition (Antigen sequence known in this case). Through the use of Mixed conjugates, i.e. H. Luminesin synthase conjugates that have both a desired Foreign peptide (in multiple execution), as well as over a biotinylated portion (in simple Version), antibodies can be selectively purified from a mixed population become. The use of streptavidin or avidin coupled to a solid phase provides sign up for this. According to the invention, however, cleaning can also be based on others Affinity materials are made. The antibodies are eluted by known Standard methods.

Lösung der beschriebenen technischen ProblemeSolution of the technical problems described

Die Lösung der oben beschriebenen technischen Probleme wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt. Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Lumazinsynthase-Molekülen als Trägerprotein für Fremdproteine, Peptide und/oder sonstige organisch-chemische Moleküle. Ferner ist Gegenstand dieser Erfin dung ein Verfahren zum selektiven, rekombinanten Einbau der obengenannten Fremdproteine, bzw. Peptide sowohl in Schleifen (loops) oder erfindungsgemäß vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus von Lumazinsynthasen. Das Verfahren beinhaltet eine in vivo Asso ziation von unterschiedlichen Lumazinsynthase-Konjugaten auf dem Wege einer Koexpression der betreffenden Gene in einer Zelle. Ferner beinhaltet das Verfahren die Möglichkeit der in vitro Reassoziation von individuell gestalteten Lumazinsynthase-Konjugaten zu sphärischen Partikeln auf dem Wege der Denaturierung/Renaturierung von monomeren Untereinheiten, die sowohl mit als auch ohne die Verwendung eines faltungsunterstützenden Liganden durch geführt werden kann.The solution to the technical problems described above is provided by the achieved embodiments characterized. Subject of the invention is the use of lumazine synthase molecules as carrier protein for foreign proteins, Peptides and / or other organic chemical molecules. This inven also concerns a process for the selective, recombinant incorporation of the above-mentioned foreign proteins, or peptides both in loops or, according to the invention, preferably at the N-terminus and / or at the C-terminus of lumazine synthases. The method includes an in vivo asso ziation of different lumazine synthase conjugates by coexpression of the genes in question in a cell. The method also includes the possibility of in vitro reassociation of individually designed lumazine synthase conjugates into spherical ones Particles on the way of denaturing / renaturing monomeric subunits, the both with and without the use of a folding-supporting ligand can be performed.

Bereitgestellt werden Lumazinsynthase-Konjugate, die über ein biotinylierfähiges Peptid (Tucker und Grisshammer, 1996; Schatz, 1993; Cronan, 1990) am C-Terminus verfügen.Lumazine synthase conjugates are provided which have a biotinylatable peptide (Tucker and Grisshammer, 1996; Schatz, 1993; Cronan, 1990) at the C-terminus.

Desweiteren wird ein artefizielles Lumazinsynthase-Molekül bereitgestellt, welches an seinem C-Terminus über eine gut zugängliche basische Aminosäure (Lysin) verfügt. Ferner wird ein Lumazinsynthase-Molekül bereitgestellt, welches über ein, gut zugängliches Cysteinmolekül am C-Terminus verfügt. Beide Varianten eignen sich zur chemischen Kopplung von organischen Molekülen. Die Kopplung kann z. B. erfolgen durch Herstellung einer Säureamidbindung oder einer Disulfidbindung zwischen Protein und Kopplungskomponente. Die chemische Kopplung nach dem Amidprinzip kann auch erfolgen an Lysinreste, die natürlicherweise auf der Oberfläche von Lumazinsynthasemolekülen vorkommen.Furthermore, an artificial lumazine synthase molecule is provided, which on its C-Terminus has an easily accessible basic amino acid (lysine). Furthermore, a Lumazine synthase molecule is provided, which is a, easily accessible cysteine molecule at the C-terminus. Both variants are suitable for the chemical coupling of organic molecules. The coupling can e.g. B. done by making a Acid amide bond or a disulfide bond between protein and coupling component. Chemical coupling according to the amide principle can also be carried out on lysine residues occur naturally on the surface of lumazine synthase molecules.

Desweiteren wird eine thermostabile ikosaedrische Lumazinsynthase (aus Aquifex aeolicus) bereitgestellt, die sich unter anderem als Trägerprotein zur Herstellung von besonders stabilen Lumazinsynthase-Konjugaten eignet.Furthermore, a thermostable icosahedral lumazine synthase (from Aquifex aeolicus) Provided, which among other things as a carrier protein for the production of particularly stable Lumazine synthase conjugates are suitable.

Das Verfahren zur Herstellung von Lumazinsynthase-Konjugaten beinhaltet folgende Teil schritte:The process for the preparation of lumazine synthase conjugates includes the following part steps:

I. Präparation des Fusions-VektorsI. Preparation of the fusion vector

A) Gewinnung einer DNA, die ein Gen für eine Lumazinsynthase enthält (z. B. durch Isolierung aus einem Organismus, durch PCR-Amplifikation mit natürlich vorkommender RNA oder DNA als Matrix, oder durch DNA-Synthese)A) Obtaining a DNA which contains a gene for a lumazine synthase (e.g. by isolation from an organism, by PCR amplification with naturally occurring RNA or DNA as a matrix, or by DNA synthesis)
B) Einführung von geeigneten Restriktionsschnittstellen zur späteren Insertion von Fremd- DNA in das Lumazinsynthasegen; Anpassung der Lumazinsynthasesequenz an besondere Anforderungen mit Hilfe bekannter molekularbiologischer oder biochemischer Mutagene semethoden; Insertion der DNA in einen Klonierungsvektor unter Verwendung bekannter molekularbiologischer Methoden. (Alternativ hierzu kann der für das Fremdpeptid kodie rende DNA-Abschnitt direkt unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und syntheti scher Oligonukleotide mit dem Lumazinsynthasegen fusioniert werden, wobei II.D gewähr leistet sein muß)B) Introduction of suitable restriction interfaces for later insertion of foreign DNA into the lumazine synthase gene; Adaptation of the lumazine synthase sequence to special ones Requirements with the help of known molecular biological or biochemical mutagens methods; Insertion of the DNA into a cloning vector using known ones molecular biological methods. (Alternatively, the code for the foreign peptide DNA segment directly using the polymerase chain reaction and syntheti shear oligonucleotides are fused to the lumazine synthase gene, II.D grant must be achieved)
C) Transformation von Wirtszellen mit dem entstandenen PlasmidC) Transformation of host cells with the resulting plasmid
D) Selektion der Transformanden mit Hilfe von Antibiotika oder anderen SelektionsverfahrenD) Selection of the transformants using antibiotics or other selection methods
E) Analyse der Transformanden mit Hilfe molekularbiologischer und biochemischer Verfahren, wie z. B. Restriktionskartierung, Sequenzierung, Messung einer enzymatischen Aktivität, etc.E) analysis of the transformants using molecular biological and biochemical methods, such as B. restriction mapping, sequencing, measurement of an enzymatic activity, Etc.

II. Insertion einer für ein Fremdpeptid kodierenden DNAII. Insertion of a DNA coding for a foreign peptide

A) Klonierung der Fremd-DNA mit Hilfe molekularbiologischer Methoden oder synthetische Herstellung einer DNA unter Verwendung chemischer VerfahrenA) Cloning the foreign DNA using molecular biological methods or synthetic Preparation of a DNA using chemical methods
B) Analyse der DNA unter Verwendung molekularbiologischer VerfahrenB) Analysis of the DNA using molecular biological methods
C) Präparation der für das fusionierende Fremdpeptid kodierenden DNAC) Preparation of the DNA coding for the fusing foreign peptide
D) Insertion der präparierten DNA an das 5'- und/oder an das 3'-Ende und/oder in eine Schlei fenregion des Lumazinsynthasegens im unter I. präparierten Vektor, so daß eine Fusion des Fremdgens mit dem Lumazinsynthasegen stattfindet. Die Klonierung hat so zu erfolgen, daß alle verwendeten Leserahmen im korrekten Leseraster eingebaut sind, damit die fusionierten Gen-Fragmente gemeinsam als Fusionsprotein translatiert werden.D) Insertion of the prepared DNA at the 5 'and / or at the 3' end and / or in a loop region of the lumazine synthase gene in the vector prepared under I., so that a fusion of the Foreign gene with the lumazine synthase gene takes place. The cloning must be carried out in such a way that all reading frames used are installed in the correct reading frame so that the merged Gene fragments are translated together as a fusion protein.
E) Transformation von Wirtszellen mit dem entstandenen PlasmidE) Transformation of host cells with the resulting plasmid
F) Selektion der Transformanden mit Hilfe von Antibiotika oder anderen SelektionsverfahrenF) Selection of the transformants using antibiotics or other selection methods
G) Analyse der Transformanden mit Hilfe molekularbiologischer und biochemischer Verfahren, wie z. B. Restriktionskartierung, Sequenzierung, Messung der enzymatischen Aktivität, etc.G) analysis of the transformants using molecular biological and biochemical methods, such as B. restriction mapping, sequencing, measurement of enzymatic activity, etc.

III. Expression und Reinigung der hybriden PolypeptideIII. Expression and purification of the hybrid polypeptides

A) Fermentation des Wirtsstammes mit der fusionierten artefiziellen DNA unter Verwendung bekannter mikrobiologischer Methoden.A) Using the fermentation of the host strain with the fused artificial DNA known microbiological methods.
B) Expression der fusionierten artefiziellen DNA in den transformierten Wirtszellen als chimä res Protein. Die Expression der artefiziellen DNA kann eine beabsichtigte posttranslationale Veränderung des chimären Proteins in vivo, z. B. Phosphorylierung, Glycosylierung, Biotinylierung, etc. einschließen.B) Expression of the fused artificial DNA in the transformed host cells as chima res protein. Expression of the artificial DNA can be an intended post-translational Change in chimeric protein in vivo, e.g. B. phosphorylation, glycosylation, Include biotinylation, etc.
C) Präparation eines Zellextraktes mit dem fusionierten PolypeptidC) Preparation of a cell extract with the fused polypeptide
D) Reinigung des Fusionsproteins mittels chromatographischer oder sonstiger MethodenD) Purification of the fusion protein using chromatographic or other methods
E) Falls erforderlich: Solubilisierung und in vitro Faltung (Renaturierung)E) If necessary: solubilization and in vitro folding (renaturation)
F) Falls erforderlich: Chemische Modifizierung der Oberfläche von Lumazinsynthase-VariantenF) If necessary: chemical modification of the surface of lumazine synthase variants
G) Falls erforderlich: In vitro Assoziation unter Kombination unterschiedlicher Lumazinsynthase-VariantenG) If necessary: In vitro association with a combination of different Lumazine synthase variants

Weitere Erläuterung des VerfahrensFurther explanation of the procedure

Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung können eine Vielzahl verschiedener Vektoren zur Anwendung kommen. Extrachromosomale (episomale) Vektoren (z. B. Plasmide), Integrationsvektoren (z. B. Lambda-Vektoren), Agrobalderjum tumafaciens-basierte Vektoren für Pflanzen (z. B. Ti-Plasmid). Erfindungsgemäß bevorzugt sind Plasmidvektoren. Verwendete Plasmide können aus natürlichen Quellen isoliert oder synthetisch hergestellt worden sein. Das ausgewählte Plasmid sollte mit dem betreffenden Wirtsstamm kompatibel sein. Dazu sollte es u. a. über einen geeigneten, zum Wirtsstamm passenden Replikationsursprung verfügen. Ferner sollte die Kapazität des Vektors sowohl für die verwendete Lumazinsynthase-Variante als auch für das fusionierte Fremdpeptid ausreichend sein. Desweiteren sind auf dem Plasmidvektor singuläre Schnittstellen zur Klonierung von DNA-Fragmenten erforderlich. Der Plasmidvektor sollte über geeignete Selektionsmechanismen, wie z. B. über ein Resistenzgen verfügen. Die Selektion ist notwendig, um Wirtszellen mit oder ohne Plasmid unterscheiden zu können. Falls Escherichia coli als Wirtstamm ausgewählt wird, so sind erfindungsgemäß Vektoren, die über eine Promotorsequenz aus dem Bakteriophagen T5 oder T7, über eine Operatorsequenz, bevorzugt die Operatorsequenz aus dem Escherichia coli Lactose-Operon (lacI), über eine Klonierungskassette mit mehreren singulären Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen und eine effiziente Terminationssequenz verfügen, bevorzugt. Ferner sollte der Vektor über einen Replikationsursprung verfügen, der eine hohe Kopienzahl der extrachromosomalen DNA in der Wirtszelle erlaubt.Using the present invention, a variety of different vectors can be used Application come. Extrachromosomal (episomal) vectors (e.g. plasmids), Integration vectors (e.g. lambda vectors), Agrobalderjum tumafaciens-based vectors for plants (e.g. Ti plasmid). Plasmid vectors are preferred according to the invention. Used Plasmids can be isolated from natural sources or made synthetically. The selected plasmid should be compatible with the host strain in question. It should do that u. a. have a suitable origin of replication that matches the host strain. Further should be the capacity of the vector for both the lumazine synthase variant used as well be sufficient for the fused foreign peptide. Furthermore, are on the plasmid vector unique interfaces required for cloning DNA fragments. The plasmid vector should have suitable selection mechanisms, such as. B. have a resistance gene. The Selection is necessary in order to distinguish host cells with or without a plasmid. If Escherichia coli is selected as the host strain, vectors according to the invention are the via a promoter sequence from bacteriophage T5 or T7, via an operator sequence, preferably the operator sequence from the Escherichia coli lactose operon (lacI), via a Cloning cassette with several unique interfaces for restriction endonucleases and have an efficient termination sequence, preferred. Furthermore, the vector should have a Origin of replication have a high copy number of extrachromosomal DNA in the Host cell allowed.

Prokaryotische Expressionssysteme sind im allgemeinen gut geeignet zur rekombinanten Herstellung von erfindungsgemäßen Proteinkonjugaten. In einigen Fällen können jedoch posttranslationale Veränderungen notwendig sein, die in prokaryonten Organismen nicht eingeführt werden können. Eukaryote Proteine können beispielsweise in Prokaryoten nicht glykosyliert oder phosphoryliert werden. Vorzugsweise werden daher eukaryote Fremdproteine (fusioniert an die Lumazinsynthase), welche eine derartige posttranslationale Modifikation benötigen, unter der Kontrolle eines starken Promotors (z. B. AOX1) in niedrigen Eukaryoten (z. B. Pichia pastoris) oder unter der Kontrolle eines für Säugerzellen spezifischen Promotors (z. B. Ratten-Preproinsulin-Gengromotor) in Säugetierzellen (z. B. COS7-Affen- Nieren-Zellen) oder eines für Insektenzellen (z. B. Baculovirus, Autographa californica) spezifischen Promotors (z. B. Polyhedrinpromotor) exprimiert. Die verwendeten Vektoren sollten zu diesen genannten Wirtsstämmen kompatibel sein.Prokaryotic expression systems are generally well suited for recombinant Production of protein conjugates according to the invention. In some cases, however post-translational changes may be necessary that are not in prokaryotic organisms can be introduced. Eukaryotic proteins, for example, cannot in prokaryotes be glycosylated or phosphorylated. Therefore, eukaryotes are preferred Foreign proteins (fused to the lumazine synthase), which is such a post-translational Need modification, under the control of a strong promoter (e.g. AOX1) in low Eukaryotes (e.g. Pichia pastoris) or under the control of a specific for mammalian cells Promotors (e.g. rat preproinsulin gene motor) in mammalian cells (e.g. COS7 monkeys Kidney cells) or one for insect cells (e.g. baculovirus, Autographa californica) specific promoter (e.g. polyhedrin promoter). The vectors used should be compatible with these host strains.

Zur Herstellung von oralen Impfstoffen auf pflanzlicher Basis bieten sich z. B. Vektorsysteme auf der Basis des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens an. Als Alternative zur Genübertragung bei Pflanzen (z. B. bei monokotylen Pflanzen, wie Reis, Weizen, Mais, etc.) eignen sich physikalische Methoden (z. B. Beschuß mit Mikroprojektilen (Biolistik)).For the production of oral plant-based vaccines, there are e.g. B. Vector systems based on the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. As an alternative to Gene transmission in plants (e.g. in monocotyledonous plants such as rice, wheat, maize, etc.) physical methods are suitable (e.g. bombardment with microprojectiles (biolistics)).

Es können sowohl natürlich vorkommende Proteine als auch synthetische Proteine, die in der Natur nicht vorkommen, an das Trägerprotein (Lumazinsynthase) fusioniert werden. Als DNA- Quellen kommen z. B. Viren, prokaryote (Eubakterien, Archaea) und eukaryote Organismen (Pflanzen, Tiere) in Frage. Die zu fusionierende DNA kann auch synthetisch, unter Verwendung hierfür üblicher Methoden, hergestellt werden. Ferner kann die DNA auch mit Hilfe von Reverser Transkriptase aus mRNA hergestellt werden.There can be both naturally occurring proteins and synthetic proteins that are in the Nature does not occur, to the carrier protein (lumazine synthase) are fused. As a DNA Sources come e.g. B. viruses, prokaryotes (eubacteria, archaea) and eukaryotic organisms (Plants, animals) in question. The DNA to be fused can also be synthetic, under The usual methods for this can be produced. The DNA can also be used with Using reverse transcriptase to be made from mRNA.

Die rekombinant erzeugten Plasmid-Vektoren werden zur Transformation von Wirtszellen verwendet. Erfindungsgemäß bevorzugt sind gut charakterisierte Bakterienzellen. Die Wirts zellen können auch eukaryote Zellen sein. Verwendete Wirtsstämme sollten über die zur Expression des fusionierten Polypeptides notwendige enzymatische Ausstattung verfügen. Transformationstechniken sind dem Fachmann bekannt. Protokolle hierfür sind bei Maniatis et al. (1982) beschrieben. Nach der Transformation erfolgt eine Analyse der Transformanden. Die Plasmide werden isoliert und mit Hilfe molekularbiologischer Methoden, wie Restriktionsanalyse, DNA-Sequenzierung, charakterisiert.The recombinantly generated plasmid vectors are used to transform host cells used. According to the invention, well-characterized bacterial cells are preferred. The hosts cells can also be eukaryotic cells. Host strains used should be used for Expression of the fused polypeptide have the necessary enzymatic equipment. Transformation techniques are known to the person skilled in the art. Protocols for this are available from Maniatis et al. (1982). After the transformation, the transformants are analyzed. The Plasmids are isolated and using molecular biological methods such as Restriction analysis, DNA sequencing, characterized.

Die Expression einer klonierten DNA-Sequenz in einer prokaryoten oder eukaryoten Wirts zelle ist aus dem Stand der Technik bekannt. Die Kultivierung der transformierten Wirtszelle bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung von rekombinanten Fusionsproteinen findet unter solchen Bedingungen statt, die für die Expression der DNA-Sequenz förderlich sind. Der Zellaufschluß nach der Expression kann durch alle hierfür üblichen Methoden ausgeführt werden. Die aufgeschlossenen Zellen werden unter Verwendung bekannter Trennverfahren in eine lösliche und eine unlösliche Fraktion getrennt.Expression of a cloned DNA sequence in a prokaryotic or eukaryotic host cell is known from the prior art. Cultivation of the transformed host cell in the method according to the invention for the production of recombinant fusion proteins takes place under conditions conducive to the expression of the DNA sequence are. The cell disruption after expression can be done by all the usual methods be carried out. The disrupted cells become known using Separation process separated into a soluble and an insoluble fraction.

Sollte sich das Fusionsprotein in Form von Einschlußkörpern in der unlöslichen Fraktion befin den, so wird der nach einer Zentrifugation verbliebene Zellrückstand gewaschen und an schließend durch Zugabe eines Solubilisierungsmittels, gelöst. Die Solubilisierung erfolgt be vorzugt in Gegenwart von reduzierenden Agenzien. Die unlöslichen Stoffe werden mittels be kannter Methoden abgetrennt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß der Renaturierungsschritt in Gegenwart eines Stabilisierungsmittels (5-Nitro-6-(D- ribitylamino)2,4(1H,3H)-pyrimidindion) durchgeführt werden kann.If the fusion protein is in the form of inclusion bodies in the insoluble fraction the cell residue that remains after centrifugation is washed and turned on finally dissolved by adding a solubilizing agent. The solubilization takes place preferably in the presence of reducing agents. The insoluble substances are by means of be known methods separated. The method according to the invention is characterized in that that the renaturation step in the presence of a stabilizing agent (5-nitro-6- (D- ribitylamino) 2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione) can be carried out.

Die Reinigung der Fusionsproteine kann mit Hilfe bekannter chromatographischer oder anderer biochemischer Methoden erfolgen.The purification of the fusion proteins can be carried out using known chromatographic or other biochemical methods.

Durch die molekularbiologische Einführung einer reaktiven Aminosäure, erfindungsgemäß bevorzugt eines Lysin- und/oder eines Cysteinrestes, gekoppelt an einen flexiblen Peptidlinker, wird eine kovalente Ankopplung von Molekülen auf chemischen Wege ermöglicht bzw. erleichtert. Die Kopplung kann erfindungsgemäß auf verschiedene Arten erfolgen. Als Beispiele sollen hier genannt werden: a) Bisimid-Ester sind in Wasser gut löslich und können unter milden Reaktionsbedingungen (pH 7,0-pH 10,0) mit der ε-Aminogruppe eines Lysinrestes reagieren. Die resultierende Amidbindung ist stabil. Auf diese Weise aktivierte Lumazinsynthasen können zur Kopplung mit anderen Peptiden verwendet werden. b) Carbodiimide gehören zu einer Verbindungsgruppe, die mit der allgemeinen Formel R- N=C=N-R' zu beschreiben sind. R und R' können durch aliphatische oder aromatische Reste repräsentiert werden. Carbodiimide reagieren bevorzugt mit der ε-Aminogruppe von Lysin. c) m-Maleimido-benzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) ist ein gut untersuchtes heterobifunktionelles Reagenz. In neutraler wässriger Lösung reagiert MBS zunächst in einer Acylierungsreaktion mit Aminogruppen zum aktivierten N-hydroxysuccinimidester. Ein zweites Peptid kann dann mittels Addition eines Thiolrestes an die Doppelbindung des Esters gebunden werden. d) N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) ist ein heterobifunktionelles Reagenz, welches unter milden Bedingungen mit Aminogruppen des Zielproteins reagieren kann. Die 2-Pyridyldisulfid-Struktur kann dann mit aliphatischen Thiolen oder einem Cystein eines weiteren Peptids über eine Thiol-Disulfidaustauschreaktion reagieren. Die Kopplungsreaktion kann im pH-Bereich von 5-9 erfolgen und der Reaktionsfortschritt kann photometrisch verfolgt werden. Es sind keine Reaktionen mit anderen funktionellen Gruppen bekannt.Through the molecular biological introduction of a reactive amino acid, according to the invention preferably a lysine and / or a cysteine residue, coupled to a flexible peptide linker, enables covalent coupling of molecules by chemical means or facilitated. According to the invention, the coupling can take place in various ways. As Examples should be mentioned here: a) Bisimide esters are readily soluble in water and can under mild reaction conditions (pH 7.0-pH 10.0) with the ε-amino group one Lysine residues react. The resulting amide bond is stable. Activated in this way Lumazine synthases can be used to couple with other peptides. b) Carbodiimides belong to a connecting group which has the general formula R- N = C = N-R 'are to be described. R and R 'can by aliphatic or aromatic radicals be represented. Carbodiimides react preferentially with the ε-amino group of lysine. c) m-Maleimido-benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS) is a well-studied heterobifunctional reagent. In neutral aqueous solution, MBS initially reacts in one Acylation reaction with amino groups to the activated N-hydroxysuccinimide ester. On second peptide can then be added to the double bond of the ester by adding a thiol residue be bound. d) N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) is a heterobifunctional reagent, which under mild conditions with amino groups of Target protein can react. The 2-pyridyl disulfide structure can then be modified with aliphatic thiols or react a cysteine of another peptide via a thiol disulfide exchange reaction. The coupling reaction can take place in the pH range of 5-9 and the reaction progress can be monitored photometrically. There are no reactions with other functional ones Known groups.

Die erfindungsgemäße Herstellung von in vitro reassoziierten Lumazinsynthase-Konjugaten erfolgt über einen Dissoziationsschritt und einen nachfolgenden Faltungs/Reassoziationsschritt. Die Dissoziation kann erfolgen durch Behandlung mit denaturierenden Agentien, z. B. Harnstoff oder Guanidinchlorid, durch Änderung des pH-Werts, durch Wärmebehandlung oder andere Verfahren. Die nach der Denaturierung monomer vorliegenden chimären Proteine setzen sich jeweils aus einer konstanten Region, einer Lumazinsynthase (bzw. einer modifizierten Lumazinsynthase) und einer variablen Region (ein beliebiges fusioniertes Peptid) zusammen. Die monomeren Untereinheiten können anschließend beliebig gemischt werden. Da die rekombinierten Untereinheiten jeweils einen konstanten Lumazinsynthaseanteil besitzen, ist eine Renaturierung der Lumazinsynthase Kernstruktur unter Ausbildung der natürlichen ikosaedrischen Struktur möglich. Die Renaturierung kann dabei in Gegenwart eines Stabilisierungsmittels (bevorzugt 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)2,4(1 H,3 H)-pyrimidindion) erfolgen. The production according to the invention of in vitro reassociated lumazine synthase conjugates takes place via a dissociation step and a subsequent folding / reassociation step. The dissociation can be done by treatment with denaturing agents, e.g. B. Urea or guanidine chloride, by changing the pH, by heat treatment or other procedures. The chimeric proteins present in monomer after denaturation each consist of a constant region, a lumazine synthase (or a modified lumazine synthase) and a variable region (any fused peptide) together. The monomeric subunits can then be mixed as required. There the recombined subunits each have a constant lumazine synthase content a renaturation of the lumazine synthase core structure with formation of the natural icosahedral structure possible. The renaturation can take place in the presence of a Stabilizing agent (preferably 5-nitro-6- (D-ribitylamino) 2,4 (1 H, 3 H) -pyrimidinedione) respectively.

Die in vivo Kombination von verschiedenen Lumazinsynthase-Varianten erfolgt auf dem Wege der Coexpression der jeweiligen Gene, die für das gewünschte Fusionspolypeptid kodieren. Die betreffenden Gene können sich hierbei auf der chromosomalen DNA des Wirtsstammes und/oder auf einem oder mehreren Plasmidvektoren befinden. Durch eine Abstimmung der Expression der in vivo zu assoziierenden Lumazinsynthase-Varianten läßt sich ein bestimmtes Mischungsverhältnis, d. h. bestimmte Kombinations-Varianten einstellen.The in vivo combination of different lumazine synthase variants takes place on the way the coexpression of the respective genes which code for the desired fusion polypeptide. The The genes in question can be found on the chromosomal DNA of the host strain and / or are located on one or more plasmid vectors. By voting the Expression of the lumazine synthase variants to be associated in vivo can be determined Mixing ratio, d. H. set certain combination variants.

In den Zeichnungen bedeuten:In the drawings:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines ELISA-Protokolls zum Nachweis eines bestimmten Antigens oder eines bestimmten Antikörpers. Das Antigen ist an die Mikrotiterplatte gebunden. Das Enzym (E) ist an den sekundären Antikörper gekoppelt. Das farblose Substrat wird durch das Enzym (E) zu einem farbigen Produkt umgesetzt. Fig. 1 is a schematic representation of an ELISA protocol for the detection of a specific antigen or a specific antibody. The antigen is bound to the microtiter plate. The enzyme (E) is coupled to the secondary antibody. The colorless substrate is converted into a colored product by the enzyme (E).

Fig. 2 beschreibt die Detektion eines Antigens mittels eines biotinmarkierten primären Antikörpers. Ein Lumazinsynthase-Konjugat (verstärkendes Linkermolekül), welches bis zu 60 Biotinmoleküle kovalent gebunden enthält ist über eine Streptavidin- oder eine Avidinbrücke (SA) an den biotinylierten primären Antikörper gebunden. Die Farbreaktion wird durch ein beliebiges streptavidingekoppeltes Enzym (E), welches einen Komplex mit der biotinylierten Lumazinsynthase eingeht, erreicht. Durch die Zwischenschaltung eines 60-fach biotinylierten Linkerproteins (Lumazinsynthase-Konjugat) und der dadurch bedingten mehrfachen Bindung von farbreaktionvermittelndem Enzym, wird eine extreme Signalverstärkung erreicht, wobei die Signalstärke proportional zur Antigenkonzentration ist. FIG. 2 describes the detection of an antigen by means of a biotin-labeled primary antibody. A lumazine synthase conjugate (reinforcing linker molecule), which contains up to 60 biotin molecules covalently bound, is bound to the biotinylated primary antibody via a streptavidin or an avidin bridge (SA). The color reaction is achieved by any streptavidin-coupled enzyme (E), which enters into a complex with the biotinylated lumazine synthase. By interposing a 60-fold biotinylated linker protein (lumazine synthase conjugate) and the resulting multiple binding of the color reaction mediating enzyme, extreme signal amplification is achieved, the signal strength being proportional to the antigen concentration.

Fig. 3 beschreibt den Einsatz eines Lumazinsynthase-Mischkonjugates bei der Diagnostik von Infektionskrankheiten.
A) Ein Lumazinsynthasemolekül, welches 1-5 kurze Peptide von antigen wirksamen viralen oder bakteriellen Oberflächenproteinen (antigene Determinanten) und bis zu 60 Biotinmoleküle kovalent gebunden enthält, dient als Detektionsmolekül für immobilisierte Antikörper, die aus einem Patientenserum oder anderen Flüssigkeiten stammen.
B) Charakteristische Antikörper gegen bestimmte Infektionskrankheiten werden mit Hilfe spe zieller immobilisierter Epitope (Teile von Oberflächenproteinen der betreffenden pathogenen Organismen; antigene Determinanten) aus der jeweiligen Körperflüssigkeit gefischt. Ein Lu mazinsynthasemolekül, welches ebenfalls 1-5 Kopien des oben bezeichneten Epitops und bis zu 60 Biotinmoleküle kovalent gebunden enthält, dient als Detektionsmolekül für diese nun im mobilisierten Antikörper.
Eine Farbreaktion wird in beiden Fällen durch ein beliebiges streptavidingekoppeltes Enzym (E), welches einen Komplex mit der biotinylierten Lumazinsynthase eingeht, erreicht. Durch die Zwischenschaltung eines mehrfach biotinylierten Linkerproteins (Lumazinsynthase-Konju gat) und der dadurch bedingten mehrfachen Bindung von farbreaktionvermittelndem Enzym, wird eine Signalverstärkung erreicht.
Nicht gebundene Antikörper werden in einem ersten Waschschritt entfernt. Erfolgt keine Bin dung an die immobilisierten Epitope, so wird der Komplex aus Lumazinsynthase-Konjugat und Antikörper nicht gebildet. Überschüssiges Lumazinsynthase-Konjugat wird in einem zweiten Waschschritt entfernt, so daß der Testansatz farblos bleibt. Fig. 3 describes the use of a lumazine-Mischkonjugates in the diagnosis of infectious diseases.
A) A lumazine synthase molecule, which contains 1-5 short peptides of antigenically active viral or bacterial surface proteins (antigenic determinants) and up to 60 biotin molecules covalently bound, serves as a detection molecule for immobilized antibodies that come from a patient's serum or other liquids.
B) Characteristic antibodies against certain infectious diseases are fished from the respective body fluid with the help of special immobilized epitopes (parts of surface proteins of the pathogenic organisms in question; antigenic determinants). A lucine synthase molecule, which likewise contains 1-5 copies of the epitope described above and up to 60 biotin molecules covalently bound, serves as a detection molecule for these now in the mobilized antibody.
A color reaction is achieved in both cases by any streptavidin-coupled enzyme (E), which enters into a complex with the biotinylated lumazine synthase. Signal amplification is achieved by the interposition of a multi-biotinylated linker protein (lumazine synthase conjugate) and the resulting multiple binding of the color reaction-mediating enzyme.
Antibodies that are not bound are removed in a first washing step. If there is no binding to the immobilized epitopes, the complex of lumazine synthase conjugate and antibody is not formed. Excess lumazine synthase conjugate is removed in a second washing step, so that the test batch remains colorless.

Fig. 4 beschreibt eine schematische Darstellung einer Versuchsanordnung zur Reinigung von Antikörpern mit einer spezifischen Antigenerkennung. Ein Lumzinsynthase-Konjugat, das sowohl über ein gewünschtes Fremdpeptid (in mehrfacher Ausführung), als auch über einen biotinylierten Anteil (in einfacher Ausführung) verfügt, wird an über seinen Biotinanteil an immobilisiertes Streptavidin gebunden. Die Streptavidinmoleküle sind an eine feste Phase gekoppelt. Die Antikörpermischpopulation wird auf eine Säule mit immobilisiertem Streptavidin gegeben (oder mit Streptavidinmaterial gemischt), wobei die Antikörper mit der gewünschten Spezifität an den Fremdpeptidanteil auf dem Lumazinsynthase-Konjugat binden. Fig. 4 is a schematic representation describes an experimental arrangement for the purification of antibodies to a specific antigen recognition. A lumine synthase conjugate which has both a desired foreign peptide (in a multiple version) and a biotinylated portion (in a single version) is bound to immobilized streptavidin via its biotin portion. The streptavidin molecules are coupled to a solid phase. The mixed antibody population is placed on a column of immobilized streptavidin (or mixed with streptavidin material), the antibodies binding to the foreign peptide portion on the lumazine synthase conjugate with the desired specificity.

Der Waschprozeß des Streptavidin-Lumazinsynthase-Konjugat-Antikörper-Komplex und die anschließende Elution der spezifischen Antikörper erfolgt durch bekannte Standardmethoden.The washing process of the streptavidin-lumazine synthase conjugate-antibody complex and the the specific antibodies are then eluted by known standard methods.

Fig. 5 zeigt eine schematische Darstellung des Aufbaus eines Biosensors, der prinzipiell aus mindestens drei Teilen bestehen kann: 1. Der biologische Rezeptor, 2. Die Wandler-Einheit, 3. Die angegliederte Elektronik. Der biologische Rezeptor kann auf unterschiedliche Weise an den Wandler bzw. Transduktor gebunden vorliegen. Fig. 5 is a schematic diagram showing the structure of a biosensor which may in principle consist of at least three parts: 1. The biological receptor 2. The converter unit 3. The affiliated electronics. The biological receptor can be bound to the transducer or transducer in different ways.

Fig. 6 zeigt schematisch eine funktionalisierte Lumazinsynthase mit 60 gleichen bzw. unterschiedlich modifizierten Untereinheiten, die über einen Anker (Peptid, Fettsäure, sonstige funktionelle Gruppen) mit einer Oberfläche (beispielsweise Wandleroberfläche, Membran, sonstige Oberflächen, etc.) verbunden ist. Die Detektionsempfindlichkeit für Fremdmolekülbindung auf der Oberfläche der Lumazinsynthase wird durch eine hohe Anzahl funktioneller Gruppen (beispielsweise Epitope zur Antikörpererkennung, Antikörper zur Detektion von Fremdmolekülen in Lösung oder sonstige Rezeptoren) erhöht. Fig. 6 shows schematically a functionalized lumazine synthase with 60 same or differently modified subunits via an anchor (peptide, fatty acid, other functional groups) with a surface (such as transducer surface, membrane, other surfaces, etc.) is connected. The detection sensitivity for foreign molecule binding on the surface of the lumazine synthase is increased by a high number of functional groups (for example epitopes for antibody recognition, antibodies for the detection of foreign molecules in solution or other receptors).

Fig. 7 zeigt schematisch einen möglichen Aufbau eines Feldeffekttransistors unter Einbeziehung einer multimeren, funktionalisierten Lumazinsynthase. Eine Veränderung der Oberflächenladung an der Torelektrode, die durch die Bindung eines Fremdmoleküls an die Oberfläche der Lumazinsynthase eintritt, moduliert dabei den Stromfluß durch den Feldeffekttransistor. Fig. 7 shows schematically a possible structure of a field effect transistor including a multimeric, functionalized lumazine synthase. A change in the surface charge on the gate electrode, which occurs due to the binding of a foreign molecule to the surface of the lumazine synthase, modulates the current flow through the field effect transistor.

Fig. 8 zeigt einen Sequenzvergleich von Lumazinsynthasen aus folgenden Organismen: 1. Mycobacterium avium; 2. Mycobacterium tuberculosis; 3. Corynebacterium ammoniagenes; 4. Chlorobium tepidum; 5. Aquifex aeolicus; 6. Thermotoga maritima; 7. Bacillus subtilis; 8. Bacillus amyloliquefaciens; 9. A. pleuropneumoniae; 10. Streptococcus pneumoniae; 11. Staphylococcus aureus; 12. Vibrio cholerae; 13. Photobacterium phosporeum; 14. S. putrefaciens; 15. Photobacterium leiognathi; 16. Shigella flexneri; 17. Escherichia coli; 18. Haemophilus influenzae; 19. Dehalospirillum multivorans; 20. Helicobacter pylori; 21. Deinococcus radiodurans; 22. Synechocystis sp.; 23. Porphyromonas gingivalis; 24. Arabidopsis thaliana; 25. Methanococcus jannaschii; 26. Archaeoglobus fulgidus; 27. Methanobacterium thermoautotrophicum; 28. Chlamydia trachomatis; 29. Saccharomyces cerevisiae; 30. Brucella abortus. Die Proteinsequenzen wurden durch Übersetzung der zugrundeliegenden DNA-Sequenzen erhalten. Die gezeigte Sequenzmenge wurde erhalten durch Datenbanksuche unter Verwendung der Suchalgorithmen nach Altschul et al. (1997) und der Sequenz der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis als Suchmatrize. Fig. 8 shows a sequence comparison of lumazine synthases of the following organisms: 1. Mycobacterium avium; 2. Mycobacterium tuberculosis; 3. Corynebacterium ammoniagenes; 4. Chlorobium tepidum; 5. Aquifex aeolicus; 6. Thermotoga maritima; 7. Bacillus subtilis; 8. Bacillus amyloliquefaciens; 9. A. pleuropneumoniae; 10. Streptococcus pneumoniae; 11. Staphylococcus aureus; 12. Vibrio cholerae; 13. Photobacterium phosporeum; 14. S. putrefaciens; 15. Photobacterium leiognathi; 16. Shigella flexneri; 17. Escherichia coli; 18. Haemophilus influenzae; 19. Dehalospirillum multivorans; 20. Helicobacter pylori; 21. Deinococcus radiodurans; 22. Synechocystis sp .; 23. Porphyromonas gingivalis; 24. Arabidopsis thaliana; 25. Methanococcus jannaschii; 26. Archaeoglobus fulgidus; 27. Methanobacterium thermoautotrophicum; 28. Chlamydia trachomatis; 29. Saccharomyces cerevisiae; 30. Brucella abortus. The protein sequences were obtained by translating the underlying DNA sequences. The sequence set shown was obtained by database search using the search algorithms according to Altschul et al. (1997) and the sequence of the lumazine synthase from Bacillus subtilis as a search template.

Fig. 9 zeigt die Aufsicht auf eine pentamere Untereinheit der ikosaedrischen Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. Der Ligand 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)-2,4-(1H,3H)- pyrimidindion bindet in der Kontaktstelle zwischen zwei monomeren Untereinheiten (Ladenstein et al., 1988, 1994; Ritsert et al, 1995). Fig. 9 shows the plan view on a pentameric subunit of icosahedral lumazine synthase from Bacillus subtilis. The ligand 5-nitro-6- (D-ribitylamino) -2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione binds in the contact point between two monomeric subunits (Ladenstein et al., 1988, 1994; Ritsert et al, 1995).

Fig. 10 zeigt ein Modell der ikosaedrischen Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. Eine von 12 pentameren Untereinheiten ist durch die Verwendung unterschiedlicher Grautöne hervorgehoben. Sowohl der N- als auch der C-Terminus liegen an der Oberfläche und sind frei zugänglich. Fig. 10 shows a model of the icosahedral lumazine synthase from Bacillus subtilis. One of 12 pentameric subunits is highlighted by the use of different shades of gray. Both the N and the C terminus lie on the surface and are freely accessible.

Fig. 11 zeigt die in den Ausführungsbeispielen verwendeten Expressionsvektoren. SD, ribosomale Bindungsstelle; MCS, Klonierungskassette mit singulären Schnittstellen; t₀, t₁, Terminatorsequenzen; (cat), nicht aktives Gen für die Chloramphenicolacetyltransferase (verschobener Leserahmen); (Δcat), inaktives Gen für die Chloramphenicolacetyltransferase (Deletion); Restriktionsschnittstellen sind durch Buchstaben gekennzeichnet: B, BamHI; E, EcoRI; H, HindIII; N, NcoI; P, PstI; S. SalI. Translationsstart im Vektor pNCO113 bei Position 113 und an Position 233 bei p602/-CAT. Fig. 11 shows the expression vectors used in the embodiments. SD, ribosomal binding site; MCS, cloning cassette with unique interfaces; t ₀ , t ₁ , terminator sequences; (cat), non-active gene for chloramphenicol acetyl transferase (shifted reading frame); (Δcat), inactive gene for chloramphenicol acetyl transferase (deletion); Restriction interfaces are identified by letters: B, BamHI; E, EcoRI; H, Hind III; N, NcoI; P, PstI; S. SalI. Translation start in vector pNCO113 at position 113 and at position 233 at p602 / -CAT.

Fig. 12 beschreibt die 1. PCR zur Einführung einer Mutation am Beispiel des Austausches der Aminosäure Cystein an Position 93 gegen Serin im Gen der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. Im ersten Schritt der gerichteten Mutagenese werden zuerst zwei getrennte PCR- Ansätze, mit den Oligonukleotidepaarungen PNCO-M1/C93S und PNCO-M2/RibH-3 und dem Expressionsplasmid pNCO-BS-LuSy als Matrize, durchgeführt. Fragment A enthält die beabsichtigte Mutation und eine intakte Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease EcoRI. Fragment B repräsentiert das gesamte, aber unmutiert vorliegende ribH-Gen (Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis). In diesem Fragment ist die 5'-Klonierungsschnittstelle deletiert. (R: ribosomale Bindungsstelle) Fig. 12 describes the 1st PCR to introduce a mutation at the example of the replacement of the amino acid cysteine at position 93 to serine in the gene of lumazine synthase from Bacillus subtilis. In the first step of directed mutagenesis, two separate PCR approaches are first carried out, with the oligonucleotide pairings PNCO-M1 / C93S and PNCO-M2 / RibH-3 and the expression plasmid pNCO-BS-LuSy as a template. Fragment A contains the intended mutation and an intact recognition sequence for the restriction endonuclease EcoRI. Fragment B represents the entire but unmutated ribH gene (lumazine synthase from Bacillus subtilis). The 5 'cloning interface is deleted in this fragment. (R: ribosomal binding site)

Fig. 13 beschreibt die 2. PCR bei der Einführung einer Mutation. Im zweiten Schritt der Mutagenese wird die eingeführte Mutation, die sich jetzt noch am Ende 3'-Ende des durch PCR generierten Gen-Fragmentes befindet, durch überlappende Verlängerung, in das gesamte Gen eingeführt. Fig. 13 describes the 2nd PCR with the introduction of a mutation. In the second step of the mutagenesis, the introduced mutation, which is now still at the 3 'end of the gene fragment generated by PCR, is introduced into the entire gene by overlapping extension.

Fig. 14 beschreibt die 3. PCR zur Einführung einer Mutation. Die 3. PCR dient der Vermehrung des verlängerten Codonstranges von Fragment A. Fig. 14 describes the 3rd PCR for introduction of a mutation. The 3rd PCR is used to multiply the extended codon strand of fragment A.

In den Fig. 15 bis 24, 26 bis 28 und 30 und 31 ist die Sequenz der jeweils verwendeten Lumazinsynthase durch Fettdruck gekennzeichnet. Die Linkerregionen sind unterstrichen. Erkennungssequenzen für die jeweiligen Restriktionsendonukleasen sind kursiv und unterstrichen. Fusionierte Sequenzen, bzw. Aminosäuren, die nicht zur Linkersequenz gezählt werden, sind punktiert unterstrichen. Die Aminosäurensequenz ist im Einbuchstaben-Code angegeben.In Figs. 15 to 24, 26 to 28 and 30 and 31, the sequence of the lumazine synthase used in each case is indicated in bold. The left regions are underlined. Recognition sequences for the respective restriction endonucleases are in italics and underlined. Fused sequences or amino acids that are not included in the linker sequence are underlined with dots. The amino acid sequence is given in the one-letter code.

Fig. 15 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-N-BS-LuSy zur Fusion von Fremdproteinen an den N-Terminus der Lumazinsynthase. Fig. 15 shows the structure of the vector pNCO-N-BS-lusy to the fusion of foreign proteins to the N-terminus of the lumazine synthase.

Fig. 16 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-C-BS-LuSy zur Fusion von Fremdproteinen an den C-Terminus der Lumazinsynthase. Fig. 16 shows the structure of the vector pNCO-C-BS-lusy to the fusion of foreign proteins to the C-terminus of the lumazine synthase.

Fig. 17 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR. Fig. 17 shows the structure of the vector pNCO-BS-lusy-EC-DHFR.

Fig. 18 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-N-VP2-BS-LuSy im Bereich des N-Terminus. Fig. 18 shows the structure of the vector pNCO-N-VP2-BS-lusy in the region of the N-terminus.

Fig. 19 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-C-VP2-BS-LuSy im Bereich des C-Terminus. Fig. 19 shows the structure of the vector pNCO-C-VP2-BS-lusy in the region of the C-terminus.

Fig. 20 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-C-Biotag-BS-LuSy im Bereich des C- Terminus. Fig. 20 shows the structure of the vector pNCO C Biotag-BS-lusy in the region of the C-terminus.

Fig. 21 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-Lys165-BS-LuSy im Bereich des C-Terminus. Fig. 21 shows the structure of the vector pNCO-Lys165-BS-lusy in the region of the C-terminus.

Fig. 22 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-Cys167-BS-LuSy im Bereich des C-Terminus. Fig. 22 shows the structure of the vector pNCO-Cys167-BS-lusy in the region of the C-terminus.

Fig. 23 zeigt die Struktur des Vektors pFLAG-MAC-BS-LuSy im Bereich des N-Terminus. Fig. 23 shows the structure of the vector pFLAG-MAC-BS-lusy in the region of the N-terminus.

Fig. 24 zeigt die Struktur des Vektors pNCO-C-His6-BS-LuSy im Bereich des C-Terminus. Fig. 24 shows the structure of the vector pNCO-C-His6-BS-lusy in the region of the C-terminus.

Fig. 25 zeigt die Konstruktion der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus (Decker et al., 1998) unter Verwendung von 11 synthetischer Oligonukleotide (AQUI-1 bis AQUI-11) und einer 6-stufigen Polymerase-Kettenreaktion. Figs. 25 (1998 Decker et al.) Synthetic oligonucleotides using 11 shows the construction of thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus (AQUI-1 to AQUI-11) and a 6-stage polymerase chain reaction.

Fig. 26 zeigt die Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, an den C-Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus. (Peptid ist über einen Linker mit 3 Alaninresten an den C-Terminus des Trägerproteins gebunden) Fig. 27 zeigt die Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, über einen Linker aus 6 Histidin- und 3 Alaninresten an den C- Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus. FIG. 26 shows the coupling of an artificial 13 amino acid long, in vivo biotinylatable peptide to the C-terminus of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus. (Peptide is linked via a linker with 3 alanine residues to the C-terminus of the carrier protein) . FIG. 27 shows the coupling of an artificial 13 amino acid long, in vivo biotinylatable peptide, via a linker of 6 histidine and 3 alanine residues to the C-terminus the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus.

Fig. 28 zeigt die Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, über einen Linker bestehend aus 6 Histidinresten und der Sequenz Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ala an den C-Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus. Fig. 28, the coupling of a artefiziellen 13 amino acids is long in vivo biotinylierfähigen peptide via a linker consisting of 6 histidine residues and the sequence Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ala at the C-terminus of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus.

Fig. 29 zeigt die Herstellung eines chimären Proteins bestehend aus einem Teil der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis und einem Teil der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus. (RBS: ribosomale Bindungsstelle) Fig. 29 shows the production of a chimeric protein consisting of a portion of the lumazine synthase from Bacillus subtilis and a part of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus. (RBS: ribosomal binding site)

Fig. 30 zeigt den 5'-Bereich des Vektors pNCO-AA-BglII-LuSy bzw. des Vektors pNCO- AA-BglII-LuSy-(BamHI) zur Fusion von Fremdgenen an das 5'-Ende der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus. Die neu in die Sequenz eingeführte Erkennungssequenz für die singuläre Restriktionsendonuklease BglII ist eingezeichnet. Fig. 30 shows the 5 'region of the vector pNCO-AA-BglII lusy or vector pNCO- AA-BglII LuSy- (BamHI) to the fusion of foreign genes to the 5'-end of the lumazine synthase from Aquifex aeolicus. The newly introduced recognition sequence for the unique restriction endonuclease BglII is shown.

Fig. 31 zeigt den 3'-Bereich des Vektors pNCO-AA-LuSy-(BamHI) bzw. des Vektors pNCO-AA-BglII-LuSy-(BamHI) zur Fusion von Fremdgenen an das 3'-Ende der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus. An den C-Terminus des Trägerproteins ist ein Peptid mit der Sequenz GSVDLQPSLIS fusioniert. Fig. 31 shows the 3 'region of the vector pNCO AA LuSy- (BamHI) or the vector pNCO-AA-BglII LuSy- (BamHI) to the fusion of foreign genes at the 3'-end of the lumazine synthase from Aquifex aeolicus . A peptide with the sequence GSVDLQPSLIS is fused to the C-terminus of the carrier protein.

Die angeführten DNA-Sequenzprotokolle erläutern den Aufbau, der in den Beispielen angeführten Plasmide. In den Sequenzprotokollen sind die Erkennungssequenzen der jeweiligen verwendeten Restriktionsendonukleasen kursiv und unterstrichen; die exprimierten Fusionsproteine sind jeweils fettgedruckt und Linkersequenzen sind punktiert unterstrichen; auf Ausnahmen in der Zeichenformatierung wird hingewiesen.The listed DNA sequence protocols explain the structure of the examples plasmids listed. In the sequence listing, the recognition sequences are the restriction endonucleases used in italics and underlined; who expressed Fusion proteins are in bold and linker sequences are underlined; exceptions to the character formatting are pointed out.

SEQ ID No. 1 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO113. (Vektor zur Expression von Genen in Escherichia coli; Stüber et al., 1990)SEQ ID No. 1 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO113. (Vector for Expression of genes in Escherichia coli; Stüber et al., 1990)

SEQ ID No. 2 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors p602/-CAT (Schaukelvektor zur Expression von Genen in Escherichia coli und Bacillus subtilis; Henner, 1990; LeGrice, 1990)SEQ ID No. 2 shows the DNA sequence of the expression vector p602 / -CAT (swing vector for the expression of genes in Escherichia coli and Bacillus subtilis; Henner, 1990; LeGrice, 1990)

SEQ ID No. 3 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmides pNCO-BS-LuSy. (Expressionsplasmid mit der unveränderten Lumazinsynthase aus Bacillus snbtilis zur Expression in Escherichia coli)SEQ ID No. 3 shows the DNA sequence of the expression plasmid pNCO-BS-LuSy. (Expression plasmid with the unchanged lumazine synthase from Bacillus snbtilis for Expression in Escherichia coli)

SEQ ID No. 4 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmides p602-BS-LuSy. (Expressionsplasmid mit der unveränderten Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis zur Expression in Escherichia coli und Bacillus subtilis)SEQ ID No. 4 shows the DNA sequence of the expression plasmid p602-BS-LuSy. (Expression plasmid with the unchanged lumazine synthase from Bacillus subtilis for Expression in Escherichia coli and Bacillus subtilis)

SEQ ID No. 5 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmides pNCO-BS-LuSy-C93S. (Expressionsplasmid mit einer veränderten Lumazinsynthase-Variante, wobei die Aminosäure Cystein an Position 93 durch die Aminosäure Serin ausgetauscht wurde)SEQ ID No. 5 shows the DNA sequence of the expression plasmid pNCO-BS-LuSy-C93S. (Expression plasmid with a modified lumazine synthase variant, the amino acid Cysteine at position 93 was replaced by the amino acid serine)

SEQ ID No. 6 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmides pNCO-BS-LuSy-C139S. (Expressionsplasmid mit einer veränderten Lumazinsynthase-Variante, wobei die Aminosäure Cystein an Position 139 durch die Aminosäure Serin ausgetauscht wurde)SEQ ID No. 6 shows the DNA sequence of the expression plasmid pNCO-BS-LuSy-C139S. (Expression plasmid with a modified lumazine synthase variant, the amino acid Cysteine at position 139 was replaced by the amino acid serine)

SEQ ID No. 7 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmides pNCO-BS-LuSy-C93/139S. (Expressionsplasmid mit einer veränderten Lumazinsynthase-Variante, wobei die Aminosäure Cystein an den Positionen 93 und 139 durch die Aminosäure Serin ausgetauscht wurde)SEQ ID No. 7 shows the DNA sequence of the expression plasmid pNCO-BS-LuSy-C93 / 139S. (Expression plasmid with a modified lumazine synthase variant, the amino acid Cysteine at positions 93 and 139 by which the amino acid serine was replaced)

SEQ ID No. 8 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-N-BS-LuSy zur Fusion von Fremdpeptiden an den N-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis.SEQ ID No. 8 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-N-BS-LuSy for fusion of foreign peptides to the N-terminus of lumazine synthase from Bacillus subtilis.

SEQ ID No. 9 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-C-BS-LuSy zur Fusion von Fremdpeptiden an den C-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis.SEQ ID No. 9 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-C-BS-LuSy for fusion of foreign peptides to the C-terminus of lumazine synthase from Bacillus subtilis.

SEQ ID No. 10 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-EC-DHFR-BS-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei die Dihydrofolatreduktase an den N-Terminus der Lumazinsynthase fusioniert vorliegt)SEQ ID No. 10 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-EC-DHFR-BS-LuSy. Expression plasmid for expressing a fusion protein consisting of the Dihydrofolate reductase from Escherichia coli and lumazine synthase from Bacillus subtilis, the dihydrofolate reductase being fused to the N-terminus of the lumazine synthase)

SEQ ID No. 11 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-EC-MBP-BS-Lusy. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus dem maltosebindenden Protein aus Escherichia coli und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei das maltosebindende Protein an den N-Terminus der Lumazinsynthase fusioniert vorliegt)SEQ ID No. 11 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-EC-MBP-BS-Lusy. (Expression plasmid for expressing a fusion protein consisting of the maltose-binding protein from Escherichia coli and lumazine synthase from Bacillus subtilis, where the maltose-binding protein is fused to the N-terminus of the lumazine synthase)

SEQ ID No. 12 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR. Die Linkersequenz zwischen der Lumazinsynthase und der Dihydrofolatreduktase ist punktiert unterstrichen. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei die Dihydrofolatreduktase an den C-Terminus der Lumazinsynthase fusioniert vorliegt)SEQ ID No. 12 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR. The linker sequence between the lumazine synthase and the dihydrofolate reductase is dotted underlined. Expression plasmid for expressing a fusion protein consisting of the Dihydrofolate reductase from Escherichia coli and lumazine synthase from Bacillus subtilis, the dihydrofolate reductase being fused to the C-terminus of the lumazine synthase)

SEQ ID No. 13 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-N-VP2-BS-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der VP2-Domäne des "Minc enteritis Virus" und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei sich die VP2- Domäne am N-Terminus befindet; das ehemalige Starteodon der Lumazinsynthase ist unterstrichen)SEQ ID No. 13 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-N-VP2-BS-LuSy. (Expression plasmid for expressing a fusion protein consisting of the VP2 domain of the "Minc enteritis virus" and the lumazine synthase from Bacillus subtilis, the VP2- Domain located at the N-terminus; is the former starodon of lumazine synthase underlined)

SEQ ID No. 14 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-C-VP2-BS-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der VP2-Domäne des "Minc enteritis Virus" und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei sich die VP2- Domäne am C-Terminus befindet)SEQ ID No. 14 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-C-VP2-BS-LuSy. (Expression plasmid for expressing a fusion protein consisting of the VP2 domain of the "Minc enteritis virus" and the lumazine synthase from Bacillus subtilis, the VP2- Domain located at the C-terminus)

SEQ ID No. 15 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-N/C-VP2-BS-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus der VP2-Domäne des "Minc enteritis Virus" und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei sich die VP2- Domäne sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus befindet; das ehemalige Startcodon der Lumazinsynthase ist unterstrichen)SEQ ID No. 15 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-N / C-VP2-BS-LuSy. (Expression plasmid for expressing a fusion protein consisting of the VP2 domain of the "Minc enteritis virus" and the lumazine synthase from Bacillus subtilis, the VP2- Domain is located at both the N-terminus and the C-terminus; the former start codon the lumazine synthase is underlined)

SEQ ID No. 16 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-C-Biotag-BS-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus einem 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptid und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei sich das fusionierte Peptid am C-Terminus befindet)SEQ ID No. 16 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-C-Biotag-BS-LuSy. (Expression plasmid for expressing a fusion protein, consisting of a 13th Amino acids long, in vivo biotinylatable peptide and lumazine synthase from Bacillus subtilis, with the fused peptide at the C-terminus)

SEQ ID No. 17 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-Lys165-BS-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression einer veränderten Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, bei der der C-Terminus verlängert wurde und mit einem Lysinrest endet; das Codon für Lysin (AAA) ist unterstrichen)SEQ ID No. 17 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-Lys165-BS-LuSy. (Expression plasmid for expressing an altered lumazine synthase from Bacillus subtilis, in which the C-terminus has been extended and ends with a lysine residue; the codon for lysine (AAA) is underlined)

SEQ ID No. 18 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-Cys167-BS-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression einer veränderten Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, bei der der C-Terminus verlängert wurde und mit einem Cysteinrest endet; das Codon für Cystein (TGC) ist unterstrichen)SEQ ID No. 18 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-Cys167-BS-LuSy. (Expression plasmid for expressing an altered lumazine synthase from Bacillus subtilis, where the C-terminus has been elongated and ends with a cysteine residue; the codon for Cysteine (TGC) is underlined)

SEQ ID No. 19 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pFLAG-MAC-BS-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus einem 12 Aminosäuren langen Epitop, welches von einem monoklonalen Antikörper erkannt wird, und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei sich das fusionierte Peptid am N-Terminus befindet; das ehemalige Startcodon der Lumazinsynthase ist unterstrichen)SEQ ID No. 19 shows the DNA sequence of the expression vector pFLAG-MAC-BS-LuSy. (Expression plasmid for expressing a fusion protein, consisting of a 12th Amino acid long epitope which is recognized by a monoclonal antibody, and the lumazine synthase from Bacillus subtilis, the fused peptide being at the N-terminus located; the former start codon of lumazine synthase is underlined)

SEQ ID No. 20 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-C-His6-BS-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus einem 6 Aminosäuren langen Peptid (6 × Histidin) und der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis, wobei sich das fusionierte Peptid am C-Terminus befindet; das Peptid ist unterstrichen)SEQ ID No. 20 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-C-His6-BS-LuSy. (Expression plasmid for expressing a fusion protein, consisting of a 6th Amino acid long peptide (6 × histidine) and lumazine synthase from Bacillus subtilis, wherein the fused peptide is at the C-terminus; the peptide is underlined)

SEQ ID No. 21 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-AA-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression der unveränderten, thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus; die DNA-Sequenz wurde an die Codon-Verwendung von Escherichia coli angepasst; die DNA wurde vollsynthetisch hergestellt)SEQ ID No. 21 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-AA-LuSy. (Expression plasmid for expression of the unchanged, thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus; the DNA sequence was linked to the codon use of Escherichia coli customized; the DNA was made fully synthetic)

SEQ ID No. 22 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-C-Biotag-AA-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression eines Fusionsproteins, bestehend aus einem 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptid und der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus, wobei sich das fusionierte Peptid am C-Terminus befindet; das Peptid ist über einen Linker mit 3 Alaninresten mit dem C-Terminus des Trägerproteins verbunden)SEQ ID No. 22 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-C-Biotag-AA-LuSy. (Expression plasmid for expressing a fusion protein, consisting of a 13th Amino acids long, in vivo biotinylatable peptide and lumazine synthase from Aquifex aeolic, with the fused peptide at the C-terminus; the peptide is over one Linker with 3 alanine residues connected to the C-terminus of the carrier protein)

SEQ ID No. 23 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-His6-C-Biotag AA- Lusy. (Expressionsplasmid zur Expression der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus mit C- terminal, über einen Linker aus 6 Histidin- und 3 Alaninresten gekoppeltem, in vivo biotinylierfähigem Peptid)SEQ ID No. 23 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-His6-C-Biotag AA- Lusy. (Expression plasmid for expressing the lumazine synthase from Aquifex aeolicus with C- terminal, coupled via a linker of 6 histidine and 3 alanine residues, in vivo biotinylatable peptide)

SEQ ID No. 24 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-His6-GLY2-SER-GLY- C-Biotag-AA-LuSy. (Expressionsplasmid zur Expression der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus mit C-terminal, über einen Linker bestehend aus der Aminosäurenfolge HHHHHHGGSGAAA gekoppeltem, in vivo biotinylierfähigem Peptid)SEQ ID No. 24 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-His6-GLY2-SER-GLY- C-Biotag-AA-LuSy. (Expression plasmid for expressing the lumazine synthase from Aquifex aeolicus with C-terminal, via a linker consisting of the amino acid sequence HHHHHHGGSGAAA coupled, in vivo biotinylatable peptide)

SEQ ID No. 25 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-BS-LuSy-AgeI-AA- Lusy. (Expressionsplasmid zur Expression eines chimären Proteins bestehend aus einem Teil Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis und einem Teil der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus; der Anteil der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis ist fettgedruckt, der Anteil der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus ist doppelt unterstrichen)SEQ ID No. 25 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-BS-LuSy-AgeI-AA- Lusy. (Expression plasmid for expressing a chimeric protein consisting of one part Lumazine synthase from Bacillus subtilis and part of the thermostable lumazine synthase Aquifex aeolicus; the proportion of lumazine synthase from Bacillus subtilis is in bold; The proportion of lumazine synthase from Aquifex aeolicus is underlined twice)

SEQ ID No. 26 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-AA-BglII-LuSy. (Vektor zur Fusion von Fremdpeptiden an den N-Terminus bzw. an das 5'-Ende der thermostabilen. Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus unter Verwendung der Restriktionsendonuklease BGlII).SEQ ID No. 26 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-AA-BglII-LuSy. (Vector for the fusion of foreign peptides to the N-terminus or to the 5 'end of the thermostable. Lumazine synthase from Aquifex aeolicus using the Restriction endonuclease BGlII).

SEQ ID No. 27 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-AA-LuSy-(BamHI) (Vektor zur Fusion von Fremdpeptiden an den C-Terminus bzw. an das 3'-Ende der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus unter Verwendung der Restriktionsendonuklease BamHI)SEQ ID No. 27 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-AA-LuSy- (BamHI) (Vector for the fusion of foreign peptides to the C-terminus or to the 3 'end of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus using the Restriction endonuclease BamHI)

SEQ ID No. 28 zeigt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pNCO-AA-BglII-LuSy- (BamHI). (Vektor zur Fusion von Fremdpeptiden an den N- und an den C-Terminus bzw. an das 5'- und an das 3'-Ende der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen BglII und BamHI)SEQ ID No. 28 shows the DNA sequence of the expression vector pNCO-AA-BglII-LuSy- (BamHI). (Vector for the fusion of foreign peptides at the N- and at the C-terminus respectively the 5 'and at the 3' end of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus below Use of restriction endonucleases BglII and BamHI)

Die verwendeten Bakterienstämme werden bei der DSM gemäß Budapester Vertrag hinterlegt. Die Hinterlegungsnummern werden nachgereicht.The bacterial strains used are deposited with the DSM in accordance with the Budapest Treaty. The deposit numbers will be submitted later.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.The invention is explained in more detail below with the aid of examples.

Die in den Ausführungsbeispielen verwendeten Stämme von Bacillus subtilis und Escherichia coli sind im folgenden mit Genotyp und Literaturstelle aufgeführt.
The strains of Bacillus subtilis and Escherichia coli used in the exemplary embodiments are listed below with their genotype and literature reference.

Die verwendeten Oligonukleotide 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019910102 00004 99880wurden von den Firmen Gibco BRL, Eggenstein und MWG- Biotech, Ebersberg im Rahmen einer Auftragssynthese hergestellt. The oligonucleotides used 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019910102 00004 99880 were from Gibco BRL, Eggenstein and MWG- Biotech, Ebersberg manufactured as part of a custom synthesis.

Beispiel 1example 1 Heterologe Expression des Gens der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis in Escherichia coli XL1Heterologous expression of the gene of lumazine synthase from Bacillus subtilis in Escherichia coli XL1

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden RibH-1 (5' gag gag aaa tta acc atg aat atc ata caa gga aat tta g 3'), welches am 3'-Ende zum 5'-Ende des Lumazinsynthasegens komplementär ist und am 5'-Ende für einen Teil einer optimierten ribosomalen Bindungsstelle kodiert, und RibH-2 (5' tat tat gga tcc cca tgg tta ttc gaa aga acg gtt taa gtt tg 3'), welches am 3'-Ende zum Gen der Lumazinsynthase komplementär ist und hinter dem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Endonuklease BamHI (G*GATCC) einführt, aus dem Plasmid pRF2 (Perkins et al., 1991), welches das gesamte RIB-Operon aus Bacillus subtilis enthält, amplifiziert (Mullis et al., 1986).
10 µl PCR-Puffer (75 mM Tris/HCl, pH 9.0; 20 mM (NH₄)₂SO₄; 0.01% (w/v) Tween 20)
6 µl Mg²⁺ [1,5 mM]
8 µl dNTP's [je 200 µM]
1 µl RibH-1 [0,5 µM]
1 µl RibH-2 [0,5 µM]
1 µl pRF2 [10 ng]
1 µl Goldstar-Taq-Polymerase [0,5 U] (Eurogentec, Seraing, Belgien)
72 µl H₂O_bidest A) The gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was with the oligonucleotides RibH-1 (5 'gag gag aaa tta acc atg aat atc ata caa gga aat tta g 3'), which at the 3 'end to the 5' end of the Lumazine synthase gene is complementary and codes at the 5 'end for part of an optimized ribosomal binding site, and RibH-2 (5' tat tat gga tcc cca tgg tta ttc gaa aga acg gtt taa gtt tg 3 '), which at the 3' end is complementary to the gene of lumazine synthase and introduces a recognition sequence for the endonuclease BamHI (G * GATCC) behind the stop codon, amplified from the plasmid pRF2 (Perkins et al., 1991), which contains the entire RIB operon from Bacillus subtilis (Mullis et al., 1986).
10 µl PCR buffer (75 mM Tris / HCl, pH 9.0; 20 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ; 0.01% (w / v) Tween 20)
6 µl Mg ²⁺ [1.5 mM]
8 µl dNTP's [200 µM each]
1 µl RibH-1 [0.5 µM]
1 µl RibH-2 [0.5 µM]
1 µl pRF2 [10 ng]
1 µl Goldstar Taq polymerase [0.5 U] (Eurogentec, Seraing, Belgium)
72 µl H ₂ O _bidist

Der Ansatz wurde im Thermocycler (GeneAmp®PCR System 2400; Perkin Elmer) bei folgenden Bedingungen durchgeführt:
1. 5,0 min 95°C
2. 0,5 min 94°C
3. 0,5 min 50°C
4. 0,8 min 72°C
5. 7,0 min 72°C
6. abkühlen auf 4°C
Die Schritte 2.-4. wurden 20 × wiederholt.The approach was carried out in a thermal cycler (GeneAmp®PCR System 2400; Perkin Elmer) under the following conditions:
1. 5.0 min 95 ° C
2. 0.5 min 94 ° C
3. 0.5 min 50 ° C
4. 0.8 min 72 ° C
5. 7.0 min 72 ° C
6. cool to 4 ° C
Steps 2.-4. were repeated 20 times.

B) Der PCR-Ansatz wurde mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, die DNA durch Fär bung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht und und das Fragment mit einer Länge von 498 bp mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten. Das Gelstück wurde ge wogen und mit der 5-fachen Menge an 6 M NaJ-Lösung versetzt. Nach Aufschmelzen des Gelstückes wurde zu dieser Lösung Glasmilch (Geneclean II-Kit, Bio101; San Diego, CA) zugegeben (2 µl Glasmilch pro 1 µg DNA). Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde die Sus pension zentrifugiert (Eppendorfzentrifuge, 8000 Umin^-1, 2 min, 4°C), der Überstand ver worfen und die Glasmilch mit 500 µl NEW-Waschlösung (Zusammensetzung vom Herstel ler nicht angegeben) suspendiert, zentrifugiert (s.o.) und der Überstand anschließend voll ständig entfernt. Die Elution der DNA erfolgte mit 30 µl bidestilliertem Wasser (45°C, 15 min). Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte fluorometrisch unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffes Bisbenzimid H 33258 (Höchst, Frankfurt). In Gegenwart von DNA liegt das Absorptionsmaximum dieses Farbstoffes bei 365 nm, das Emissionsmaximum bei 458 nm. Das verwendete Fluorometer arbeitet mit einer Quecksilberlampe und benutzt zur Anregung eine Wellenlänge von 365 nm in einer Bandbreite von 100 nm. Die Messung der Emission erfolgt mittels eines Photomultipliers bei 460 nm in einer Bandbreite von 10 nm. Die Nulleichung erfolgte mit 2 ml TNE-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl), der 0,1 µg/ml Farbstoff enthielt. Anschließend wurden 2 µl eines Eich standards mit bekannter DNA Konzentration (Plasmid-DNA) zugeben und diese Konzen tration am Fluorometer eingestellt. Nachdem der Nullpunkt des Gerätes mit Puf fer/Farbstoff-Lösung überprüft worden war, wurden 2 µl der DNA-Probe unbekannter Konzentration zugegeben und die Konzentration in µg/µl abgelesen.B) The PCR mixture was separated by means of agarose gel electrophoresis, the DNA was visualized by staining with ethidium bromide under UV light and the fragment with a length of 498 bp was cut out of the gel with a scalpel. The gel piece was weighed and 5 times the amount of 6 M NaJ solution was added. After the gel piece had melted, glass milk (Geneclean II kit, Bio101; San Diego, CA) was added to this solution (2 μl glass milk per 1 μg DNA). After 30 min incubation on ice, the Sus pension centrifuged (Eppendorf centrifuge, 8000 rpm ^-1, 2 min, 4 ° C), suspended the supernatant ver designed and the glass of milk with 500 ul NEW-wash solution (composition of the manu facturer not shown), centrifuged (see above) and the supernatant then completely removed. The DNA was eluted with 30 μl of double-distilled water (45 ° C., 15 min). The DNA concentration was determined fluorometrically using the fluorescent dye bisbenzimide H 33258 (Höchst, Frankfurt). In the presence of DNA, the absorption maximum of this dye is 365 nm, the emission maximum is 458 nm. The fluorometer used works with a mercury lamp and uses a wavelength of 365 nm in a bandwidth of 100 nm for excitation. The emission is measured using a photomultiplier at 460 nm in a bandwidth of 10 nm. The equilibrium was carried out with 2 ml of TNE buffer (100 mM Tris / HCl pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl), which contained 0.1 µg / ml of dye. Then 2 ul of a calibration standard with known DNA concentration (plasmid DNA) was added and this concentration was adjusted on a fluorometer. After the zero point of the device had been checked with a buffer / dye solution, 2 μl of the DNA sample of unknown concentration were added and the concentration was read in μg / μl.

C) 10 ng der isolierten DNA aus B) dienten anschließend als Matrize für eine 2. Polymerase kettenreaktion mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-1 (5' ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta acc atg 3'), welches die ribosomale Bindungsstelle vervollständigt und unmittelbar vor der ribosomalen Bindungsstelle eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease EcoRI (G*AATTC) in das DNA-Fragment einführt, und RibH-2:
10 µl PCR-Puffer
6 µl Mg²⁺ [1,5 mM]
8 µl dNTP's [je 200 µM]
1 µl EcoRI-RBS [0,5 µM]
1 µl RibH-2 [0,5 µM]
1 µl DNA aus der 1.PCR [10 ng]
1 µl Goldstar-Taq-Polymerase [0,5 U] (Eurogentec, Seraing, Belgien)
72 µl H₂O_bidest C) 10 ng of the isolated DNA from B) then served as a template for a second polymerase chain reaction with the oligonucleotides EcoRI-RBS-1 (5 'ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta acc atg 3'), which is the ribosomal Binding site is completed and immediately before the ribosomal binding site introduces a recognition sequence for the restriction endonuclease EcoRI (G * AATTC) into the DNA fragment, and RibH-2:
10 µl PCR buffer
6 µl Mg ²⁺ [1.5 mM]
8 µl dNTP's [200 µM each]
1 µl EcoRI-RBS [0.5 µM]
1 µl RibH-2 [0.5 µM]
1 µl DNA from the 1st PCR [10 ng]
1 µl Goldstar Taq polymerase [0.5 U] (Eurogentec, Seraing, Belgium)
72 µl H ₂ O _bidist

Der Ansatz wurde im Thermocycler (GeneAmp®PCR System 2400; Perkin Elmer) bei folgenden Bedingungen durchgeführt:
1. 5,0 min 95°C
2. 0,5 min 94°C
3. 0,5 min 50°C
4. 0,8 min 72°C
5. 7,0 min 72°C
6. abkühlen auf 4°C
Die Schritte 2.-4. wurden 30 × wiederholt.The approach was carried out in a thermal cycler (GeneAmp®PCR System 2400; Perkin Elmer) under the following conditions:
1. 5.0 min 95 ° C
2. 0.5 min 94 ° C
3. 0.5 min 50 ° C
4. 0.8 min 72 ° C
5. 7.0 min 72 ° C
6. cool to 4 ° C
Steps 2.-4. were repeated 30 times.

D) Der PCR-Ansatz wurde mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das Fragment mit einer Länge von 516 bp wie unter B) beschrieben gereinigt.D) The PCR mixture was separated by means of agarose gel electrophoresis and the fragment cleaned with a length of 516 bp as described under B).

E) Das isolierte DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI verdaut.
30,0 µl Fragment aus D)
2,5 µl EcoRI [62,5 U]
3,0 µl BamHI [60 U]
24,0 µl OPAU (10 ×; 500 mM Kaliumacctat; 100 mM Magnesiumacctat; 100 mM; Tris-Acetat, pH 7,5)
60,5 µl H₂O_bidest
Die Restriktionsenzyme wurden von der Firma Pharmacia Biotech (Freiburg) bezo gen. Der Ansatz wurde 180 min bei 37°C inkubiert und wie unter B) beschrieben ge reinigt und zur Ligation eingesetzt.E) The isolated DNA fragment was digested with the restriction endonucleases EcoRI and BamHI.
30.0 µl fragment from D)
2.5 µl EcoRI [62.5 U]
3.0 µl BamHI [60 U]
24.0 µl OPAU (10 ×; 500 mM potassium acetate; 100 mM magnesium acetate; 100 mM; Tris acetate, pH 7.5)
60.5 µl H ₂ O _bidist
The restriction enzymes were obtained from Pharmacia Biotech (Freiburg). The mixture was incubated at 37 ° C. for 180 min and purified as described under B) and used for ligation.

F)Der Expressionsvektor pNCO113 wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI verdaut.
25,0 µl pNCO113 [5 µg]
2,5 µl EcoRI [62,5 U]
3,0 µl BamHI [60 U]
24,0 µl OPAU (10 ×)
65,5 µl H₂O_bidest
Der Ansatz wurde ebenfalls 180 min bei 37°C inkubiert und das entstandene DNA- Fragment mit einer Länge von 3387 bp wie unter B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.F) The expression vector pNCO113 was digested with the restriction endonucleases EcoRI and BamHI.
25.0 µl pNCO113 [5 µg]
2.5 µl EcoRI [62.5 U]
3.0 µl BamHI [60 U]
24.0 µl OPAU (10 ×)
65.5 µl H ₂ O _bidist
The mixture was also incubated at 37 ° C. for 180 min and the resulting DNA fragment with a length of 3387 bp was purified as described under B) and used for ligation.

G) Ligation der DNA-Fragmente aus E) und F) in einem molaren Verhältnis von 3 : 1. (Sgamarella, 1979)
1 µl Expressionsvektor aus F) [50 fmol]
2 µl DNA-Fragment aus E) [150 fmol]
4 µl H₂O_bidest mischen, 10 min auf 55°C erwärmen und dann 5 min auf Eis stellen
2 µl T₄-Puffer (5 ×; 250 mM Tris/HCl, pH 7.6; 50 mM MgCl₂; 5 mM ATP; 5 mM DTT; 25% (w/v) Poly ethylenglycol-8000)
1 µl T₄-Ligase [1 U] (Gibco BRL, Eggenstein)G) Ligation of the DNA fragments from E) and F) in a molar ratio of 3: 1 (Sgamarella, 1979)
1 µl expression vector from F) [50 fmol]
2 µl DNA fragment from E) [150 fmol]
_Mix 4 µl H ₂ O _bidest , warm to 55 ° C for 10 min and then put on ice for 5 min
2 µl T ₄ buffer (5 ×; 250 mM Tris / HCl, pH 7.6; 50 mM MgCl ₂ ; 5 mM ATP; 5 mM DTT; 25% (w / v) polyethylene glycol-8000)
1 µl T ₄ ligase [1 U] (Gibco BRL, Eggenstein)

Der Ansatz wurde über Nacht bei 4°C inkubiert und das Plasmid pNCO-BS-LuSy er halten.The mixture was incubated at 4 ° C. overnight and the plasmid pNCO-BS-LuSy er hold.

H) Herstellung elektrokompetenter Escherichia coli XL1-Zellen (Dower et al., 1988): 1 Liter LB-Medium wurde 1 : 100 mit einer bei 28°C gewachsenen Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C im Schüttelinkubator bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 0,5 bis 0,7 (frühe bis mittlere logarithmische Phase) bebrühtet. Die Bakterienkultur wurde zum Anhalten des Zellwachstums 15 min auf Eis gestellt und danach zur Gewinnung der Zellmasse zentrifugiert (Sorvall-GS-3-Rotor, 2300 U/min^-1, 4°C, 15 min). Das Zellpellet wurde dann in 1 l eiskalter und steriler 10%iger Glycerinlösung suspendiert und abermals zentrifugiert. Es folgten zwei weitere Waschschritte (500 ml 10%ige Glycerinlösung; 20 ml 10%ige Glycerinlösung) mit anschließender Zentrifugation. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde der Rückstand in 2-3 ml 10%iger Glycerinlösung aufgenommen und auf Eis gestellt. Elektroporationszelle und Küvettenhalter wurden 15 min auf Eis vorgekühlt. In einem vorgekühlten 0,5 ml Eppendorf-Gefäß wurden 40 µl der vorbereiteten Zellsuspension mit 1- 2 µl des Ligationsansatzes aus G) vermischt und anschließend in die vorgekühlte Elektroporationszelle (0,1 cm) pipettiert. Die Elektroporation wurde bei 25 µF, 1,8 kV, 200 Ω (BioRad, München) durchgeführt, wobei die Zeitkonstante der Elektroporation bei 4-5 msec lag. Unmittelbar nach dem Elektroporationsvorgang wurde die Zellsuspension mit 1 ml SOC-Medium (2% Pepton; 0,5% Hefe-Extrakt; 10 mM NaCl; 2.5 mM KCl; 10 mM MgCl₂; 10 mM MgSO₄; 20 mM Glucose) versetzt und in ein steriles 10 ml Gefäß überführt. Zur phänotypischen Expression wurden die Zellen 1 h bei 37°C im Schüttler bebrühtet und anschließend in 20 µl und 200 µl Portionen auf LB-Amp-Platten (21 g/l Agar; 10 g/l Caseinhydrolysat; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l NaCl; 150 mg/l Ampicillin) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert und der Expressionsstamm XL1-pNCO-BS-LuSy erhalten.H) Production of electrocompetent Escherichia coli XL1 cells (Dower et al., 1988): 1 liter LB medium was inoculated 1: 100 with an overnight culture grown at 28 ° C and at 37 ° C in a shaking incubator to an optical density (600 nm) from 0.5 to 0.7 (early to middle log phase). The bacterial culture was placed on ice for 15 min to stop the cell growth and then centrifuged to obtain the cell mass (Sorvall-GS-3 rotor, 2300 rpm ^-1 , 4 ° C, 15 min). The cell pellet was then suspended in 1 liter of ice-cold and sterile 10% glycerol solution and centrifuged again. This was followed by two further washing steps (500 ml of 10% glycerol solution; 20 ml of 10% glycerol solution) with subsequent centrifugation. After the last centrifugation step, the residue was taken up in 2-3 ml of 10% glycerol solution and placed on ice. The electroporation cell and cuvette holder were precooled on ice for 15 min. In a pre-cooled 0.5 ml Eppendorf tube, 40 ul of the prepared cell suspension were mixed with 1-2 ul of the ligation mixture from G) and then pipetted into the pre-cooled electroporation cell (0.1 cm). The electroporation was carried out at 25 μF, 1.8 kV, 200 Ω (BioRad, Munich), the time constant of the electroporation being 4-5 msec. Immediately after the electroporation process, 1 ml of SOC medium (2% peptone; 0.5% yeast extract; 10 mM NaCl; 2.5 mM KCl; 10 mM MgCl ₂ ; 10 mM MgSO ₄ ; 20 mM glucose) was added to the cell suspension and transferred to a sterile 10 ml tube. For phenotypic expression, the cells were incubated for 1 h at 37 ° C in a shaker and then in 20 µl and 200 µl portions on LB-Amp plates (21 g / l agar; 10 g / l casein hydrolyzate; 5 g / l yeast extract; 5 g / l NaCl; 150 mg / l ampicillin) and incubated overnight at 37 ° C. and the expression strain XL1-pNCO-BS-LuSy was obtained.

I) Die Isolierung der Expressionsplasmide (pNCO-BS-LuSy) aus den unter H) erhaltenen Expressionsstämmen (XL1-pNCO-BS-LuSy) wurde nach Birnboim und Doly (1979) durch geführt. Zellen aus einer 100 ml Übernacht-Kultur (10 g/l Caseinhydrolysat; 5 g/l, Hefe extrakt; 5 g/l NaCl; 150 mg/l Ampicillin) wurden in 4 ml Puffer S1 (50 mM Tris/HCl, 10 mM EDTA, 100 µg Rnase A/ml, pH 8,0) suspendiert und anschließend mit 4 ml Puffer S2 (200 mM NaOH, 1% SDS) versetzt. Nach vorsichtigem Umschwenken des Probengefäßes und einer 5 minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Mischung mit 4 ml Puffer S3 (2,6 M KAc, pH 5,2) versetzt, gemischt und 20 min auf Eis gestellt. Nach Zentrifugation (SS34-Rotor, 17000 Umin^-1, 4°C, 30 min) wurde der Überstand unter Verwendung von Nucleobond®AX100 Säulen (Macherey und Nagel, Düren) gereinigt. Das Säulenmaterial wurde mit 2 ml Puffer N2 (0.9 M KCl; 100 mM Tris-Phosphat, pH 6,3; 15% (v/v) Ethanol) äquilibriert und anschließend der Überstand aufgetragen. Nach Auswaschung von Ver unreinigungen mit 8 ml Puffer N3 (1,3 M KCl, pH 6.3) wurde die DNA mit 2 ml Puffer N5 (1,3 M KCl, pH 8.0) eluiert. Aus dem Eluat wurde die DNA mit 0,7-fachen Volumen Iso propanol gefällt, 2× mit eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen, in der Vakuumzentrifuge getrocknet und in 200 µl bidestilliertem Wasser aufgenommen.I) The isolation of the expression plasmids (pNCO-BS-LuSy) from the expression strains obtained under H) (XL1-pNCO-BS-LuSy) was carried out according to Birnboim and Doly (1979). Cells from a 100 ml overnight culture (10 g / l casein hydrolyzate; 5 g / l, yeast extract; 5 g / l NaCl; 150 mg / l ampicillin) were added to 4 ml buffer S1 (50 mM Tris / HCl, 10 mM EDTA, 100 μg RNase A / ml, pH 8.0) and then mixed with 4 ml buffer S2 (200 mM NaOH, 1% SDS). After carefully swirling the sample vessel and incubating at room temperature for 5 minutes, the mixture was mixed with 4 ml of buffer S3 (2.6 M KAc, pH 5.2), mixed and placed on ice for 20 min. After centrifugation (SS34 rotor, 17000 rpm ^-1, 4 ° C, 30 min), the supernatant using Nucleobond®AX100 columns (Macherey and Nagel, Duren) was purified. The column material was equilibrated with 2 ml of buffer N2 (0.9 M KCl; 100 mM Tris-phosphate, pH 6.3; 15% (v / v) ethanol) and the supernatant was then applied. After washing out impurities with 8 ml of buffer N3 (1.3 M KCl, pH 6.3), the DNA was eluted with 2 ml of buffer N5 (1.3 M KCl, pH 8.0). The DNA was precipitated from the eluate with 0.7 times the volume of isopropanol, washed twice with ice-cold 70% ethanol, dried in a vacuum centrifuge and taken up in 200 μl of double-distilled water.

J) Die Sequenzierung der Plasmid-DNA (pNCO-BS-LuSy) wurde nach der Kettenabbruch methode von Sanger et al. (1971) mit markierten Terminatoren und Taq-DNA-Polymerase durchgeführt. Der Sequenzieransatz enthielt 1 µg Plasmid-DNA aus I), 10 pmol Sequenzie roligonukleotid Seq-1 (5' gtg agc gga taa caa ttt cac aca g 3'), 10 µl Terminator Premix™ (dNTP's, ddNTP's, markierte ddNTP's und Taq-DNA-Polymerase) von ABI (Weiterstadt) und wurde mit bidest. Wasser auf ein Endvolumen von 21 µl aufgefüllt (lichtgeschützt durchgeführt, da markierte ddNTP's lichtempfindlich sind). Die Reaktion wurde in einer GeneAmpPCR System 2400 Maschine von Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut, USA) mit folgendem Programm durchgeführt:
15 s/96°C (Denaturierung der DNA)
15 s/50°C (Annealing des Primers)
4 min/72°C (Vermehrung der DNA)
Die Polymerasereaktion wurde 25 mal hintereinander durchgeführt.J) The sequencing of the plasmid DNA (pNCO-BS-LuSy) was carried out according to the chain termination method of Sanger et al. (1971) with labeled terminators and Taq DNA polymerase. The sequencing mixture contained 1 µg of plasmid DNA from I), 10 pmol of roligonucleotide Seq-1 (5 'gtg agc gga taa caa ttt cac aca g 3'), 10 µl Terminator Premix ™ (dNTP's, ddNTP's, labeled ddNTP's and Taq- DNA polymerase) from ABI (Weiterstadt) and was with bidest. Water to a final volume of 21 µl (protected from light, as marked ddNTP's are sensitive to light). The reaction was carried out in a GeneAmpPCR System 2400 machine from Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut, USA) with the following program:
15 s / 96 ° C (denaturation of the DNA)
15 s / 50 ° C (annealing of the primer)
4 min / 72 ° C (increase of DNA)
The polymerase reaction was carried out 25 times in succession.

Nach der Polymerase-Reaktion wurden 80 µl bidest. Wasser zum Ansatz gegeben und zweimal mit je 100 µl Phenol/Chloroform/Amylalkohol-Mischung (25 : 24 : 1) von ABI (Weiterstadt) ausgeschüttelt, wobei die schwerere, rötlich gefärbte, Chloroform enthaltende Phase verworfen wurde. Das Ausfällen der DNA erfolgte mit 300 µl absolutem Ethanol in Anwesenheit von 10 µl einer 3 M Natriumacetat-Lösung. Die DNA wurde anschließend durch Zentrifugation (Eppendorf-Rotor, 14000 Umin^-1, RT, 30 min) pelletiert, der Rück stand mit eiskalter 70%iger Ethanol-Lösung gewaschen und in der Vakuumzentrifuge ge trocknet. Das trockene DNA-Pellet wurde in einer Mischung aus 1 µl 50 mM EDTA, pH 8,0 und 5 µl Formamid aufgenommen und zur Denaturierung der DNA 2 min auf 95°C er hitzt und danach sofort auf Eis gekühlt. 1,5 µl dieser Proben wurden dann auf ein 4,75 %iges Polyacrylamid-Sequenziergel aufgetragen. Zur Erstellung des Sequenziergels wurden 13,3 ml UltraPureSequagel™Sequencing-System-Konzentrat von National Diagnostics (Atlanta, Georgia, USA) mit 49,7 ml UltraPureSequagel™Sequencing-System-Diluent vermischt und mit einer Spatelspitze von Amberlite MB-1 entionisiert. Die Suspension wurde anschließend filtriert (0,2 µm Filter) und 7 ml UltraPureSequagel™Sequencing-Sys tem-Puffer zugegeben. Nachdem 10 min unter Wasserstrahl-Vakuum entgast worden war, wurden 210 µl einer 10%igen Ammoniumperoxodisulfat-Lösung und 25 µl TEMED zuge geben und in einen vorbereiteten Gelträger gegossen. Die Auftrennung der markierten DNA-Fragmente erfolgte in TBE-Puffer (1 M Tris-Base, pH 8,3; 0,85 M Borsäure; 10 mM EDTA) in einem Zeitraum von 7 h auf einem Prism™377-DNA-Sequencer von Perkin- Elmer-ABI (Weiterstadt).After the polymerase reaction, 80 ul were distilled. Water was added to the mixture and extracted twice with 100 μl phenol / chloroform / amyl alcohol mixture (25: 24: 1) from ABI (Weiterstadt), the heavier, reddish-colored phase containing chloroform being discarded. The DNA was precipitated with 300 μl of absolute ethanol in the presence of 10 μl of a 3 M sodium acetate solution. The DNA was then pelleted by centrifugation (Eppendorf rotor, 14000 rpm ^-1, RT, 30 min), the rear stand with ice-cold 70% ethanol solution and dried in the vacuum centrifuge ge dried. The dry DNA pellet was taken up in a mixture of 1 μl 50 mM EDTA, pH 8.0 and 5 μl formamide and heated to 95 ° C. for 2 minutes to denature the DNA and then immediately cooled on ice. 1.5 ul of these samples were then applied to a 4.75% polyacrylamide sequencing gel. To create the sequencing gel, 13.3 ml of UltraPureSequagel ™ sequencing system concentrate from National Diagnostics (Atlanta, Georgia, USA) were mixed with 49.7 ml of UltraPureSequagel ™ sequencing system diluent and deionized with a spatula tip from Amberlite MB-1. The suspension was then filtered (0.2 μm filter) and 7 ml of UltraPureSequagel ™ sequencing system buffer was added. After degassing under a water jet vacuum for 10 min, 210 μl of a 10% ammonium peroxodisulfate solution and 25 μl of TEMED were added and poured into a prepared gel carrier. The labeled DNA fragments were separated in TBE buffer (1 M Tris base, pH 8.3; 0.85 M boric acid; 10 mM EDTA) over a period of 7 h on a Prism ™ 377 DNA sequencer from Perkin- Elmer-ABI (Weiterstadt).

K) Expressionsplasmide, die ein korrekt eingebautes Gen für die Lumazinsynthase enthielten wurden anschließend in LB-AMP-Medium (10 g/l Caseinhydrolysat; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l NaCl; 150 mg/l Ampicillin) kultiviert. Anzuchten wurden in einem Volumen von 25 ml in 100 ml Erlenmeyerkolben durchgeführt. Es wurde zunächst eine Übernachtkultur (ca. 15 ml) Zellen aus H), welche aus einer Einzelkolonie stammten, angeimpft. Die Hauptkultur wurde 1 : 50 (v/v) mit der Übernachtkultur angeimpft. Das Wachstum von Flüssigkulturen wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) gegen unbewachsenes Me dium als Nullwert verfolgt. Die Expressionsstämme wurden bis zu einer OD₆₀₀ von 0,7 an gezogen und dann die Transkription des Lumazinsynthasegens mit [PTG (Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid) in einer Konzentration von 2 mM induziert. Nach erfolgter Fermen tation (nach Induktion weitere 5 h) wurden die Zellen mittels Zentrifugation (5000 Umin^-1, 4°C, 15 min) geerntet, mit Saline gewaschen (20% des Volumens der Hauptkultur; Saline: 0.9% NaCl-Lsg.) und bei -20°C bis zu einer weiteren Verwendung gelagert.K) Expression plasmids which contained a correctly inserted gene for the lumazine synthase were then cultivated in LB-AMP medium (10 g / l casein hydrolyzate; 5 g / l yeast extract; 5 g / l NaCl; 150 mg / l ampicillin). Cultivation was carried out in a volume of 25 ml in 100 ml Erlenmeyer flasks. An overnight culture (approx. 15 ml) cells from H), which came from a single colony, was inoculated first. The main culture was inoculated 1:50 (v / v) with the overnight culture. The growth of liquid cultures was monitored by measuring the optical density at 600 nm (OD ₆₀₀ ) against ungrowth medium as a zero value. The expression strains were raised to an OD ₆₀₀ of 0.7 and then the transcription of the lumazine synthase gene was induced with [PTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) in a concentration of 2 mM. After Fermen tation (after induction a further 5 hours), the cells collected by centrifugation were (5,000 rpm ^-1, 4 ° C, 15 min) harvested with saline washed (20% of the volume of the main culture; Saline: 0.9% NaCl solution. ) and stored at -20 ° C until further use.

L) Der Aufschluß der Zellen aus K) erfolgte unter Verwendung einer Ultraschall-erzeugenden Apparatur (Branson-Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dunbury, Con necticut). Zum Aufschluß wurde das gewaschene Zellpellet in 800 µl Aufschlußpuffer (50 mM K-Phosphat, pH 7,0; 10 mM EDTA; 10 mM Na₂SO₃; 0,3 mM PMSF; 0,02% Na triumazid) suspendiert und 10 min auf Eis gekühlt. Die Zellsuspension wurde dann 8 sec mit der Nadelsonde des Ultraschallgerätes bei Stufe 4, 5 behandelt. Anschließend wurde die Suspension 5 min auf Eis gekühlt und nochmals einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Die Zellsuspension wurde anschließend zentrifugiert (Eppendorff-Zentrifuge; 15000 Umin^-1 4°C, 15 min) und der Überstand (Rohextrakt) zur weiteren Verarbeitung eingesetzt.L) The cells from K) were disrupted using an ultrasound-producing apparatus (Branson-Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dunbury, Connecticut). For the digestion, the washed cell pellet was suspended in 800 μl digestion buffer (50 mM K-phosphate, pH 7.0; 10 mM EDTA; 10 mM Na ₂ SO ₃ ; 0.3 mM PMSF; 0.02% sodium azide) and 10 min chilled on ice. The cell suspension was then treated for 8 seconds with the needle probe of the ultrasound device at step 4, 5. The suspension was then cooled on ice for 5 minutes and subjected to an ultrasound treatment again. The cell suspension was then centrifuged (Eppendorff centrifuge; 15000 Umin ^-1 4 ° C, 15 min) and the supernatant (crude extract) used for further processing.

M) Zur Überprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges (Lumazinsynthase), wurde eine denaturierende Polyacrylamidelektrophorese nach Laemmli (1970) durchgeführt. Routinemäßig wurden Gele mit 4% Acrylamid im Sammelgel und 16 % Acrylamid im Trenngel angefertigt (Acrylamidstammlösung: 38,8% (w/v) Acrylamid; 1,2% (w/v) N,N'-Methylenbisacrylamid). Die Rohextrakte aus L) wurden 1 : 2; 1 : 5 oder 1 : 10 mit Protein-Auftragspuffer (20% Glycerin; 4% 2-Mercaptoethanol; 4% (w/v) SDS; 0,05% Bromphenolblau) verdünnt und 15 min auf siedendem Wasserbad gekocht. Nach dem Abkühlen wurden die verbliebenen unlöslichen Bestandteile der Proben in einer Eppen dorfzentrifuge pelletiert (15000 Umin^-1, 5 min. 4°C) und 8 µl des klaren Überstandes auf das Sammelgel aufgetragen. Als Molekulargewichtsstandard diente Dalton Mark VII-L von Sigma (Deisenhofen) mit Proteinbanden bei 66, 44, 36, 29, 24, 20 Und 14 kDa (Im Folgen den als Markerproteine bezeichnet). Die Elektrophorese wurde bei konstant 20 mV je SDS- Gel durchgeführt. Die Anfärbung der Proteinbanden erfolgte anschließend unter Verwen dung von Coomassie-Färbelösung (40% Methanol; 10% Essigsäure; 0,2% (w/v) Coo massie Blue R 250). Zur Entfärbung des nicht mit Proteinmatrix versetzten Acrylamidgels wurde eine Coomassie-Entfarbelösung verwendet (40% Methanol; 10% Essigsäure (tech.); 50% Wasser). Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-BS-LuSy konnte eine Pro teinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 16 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-BS-LuSy-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beob achtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 10% bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).M) To check the expression rate or the size of the monomeric protein strand (lumazine synthase), a denaturing polyacrylamide electrophoresis according to Laemmli (1970) was carried out. Gels were routinely prepared with 4% acrylamide in the bulk gel and 16% acrylamide in the separating gel (acrylamide stock solution: 38.8% (w / v) acrylamide; 1.2% (w / v) N, N'-methylenebisacrylamide). The crude extracts from L) were 1: 2; Diluted 1: 5 or 1:10 with protein application buffer (20% glycerol; 4% 2-mercaptoethanol; 4% (w / v) SDS; 0.05% bromophenol blue) and boiled on a boiling water bath for 15 min. After cooling the remaining insolubles were the samples in a centrifuge Eppen village pelleted (15000 rpm ^-1, 5 min. 4 ° C) and 8 ul of the clear supernatant to the stacking gel applied. Dalton Mark VII-L from Sigma (Deisenhofen) was used as the molecular weight standard with protein bands at 66, 44, 36, 29, 24, 20 and 14 kDa (hereinafter referred to as marker proteins). The electrophoresis was carried out at a constant 20 mV per SDS gel. The protein bands were then stained using Coomassie staining solution (40% methanol; 10% acetic acid; 0.2% (w / v) Coo massie Blue R 250). A Coomassie decolorization solution was used to decolorize the acrylamide gel not containing the protein matrix (40% methanol; 10% acetic acid (tech.); 50% water). In the crude extract of the XL1-pNCO-BS-LuSy strain, a protein band with a molecular weight of approx. 16 kDa could be observed, which could not be seen in a comparison strain without pNCO-BS-LuSy expression plasmid. The observed band corresponded to a share of approx. 10% based on all soluble proteins (estimated).

N) Die Überprüfung der Funktionalität der 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase erfolgte un ter Verwendung der natürlichen Substrate (5-Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidin dion und L-3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat; Bacher et al., 1997). Der Ansatz enthielt 100 mM K-Phosphat-Puffer pH 7,0, 4 mM EDTA, 0,6 mM 5-Amino-6-ribitylamino- 2,4(1H,3H)-pyrimidindion (PYR; hergestellt durch katalytische Hydrierung von 5-Nitro-6- ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion), 2 mM DTT, 1 mM L-3,4-Dihydroxy-2-butanon-4- phosphat (DHP) und Rohextrakt aus L). Die Mischung wurde zuerst ohne PYR 3 min vorinkubiert und die Enzymreaktion dann durch Zugabe von PYR gestartet. Der Testansatz wurde bei 37°C inkubiert. Von der Mischung wurden nach unterschiedlichen Zeitintervallen (2, 5 und 10 min) Portionen entnommen, die Reaktion durch Zugabe von TCA (15% in Wasser) abgestoppt und zentrifugiert (15000 Umin^-1, 5 min. RT). Die Auswertung erfolgte mittels HPLC an der reversen Phase Nucleosil 10C₁₈ (4 × 250 mm). Die Konzentration des gebildeten 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazins wurde durch Fluoreszenzdetektion (Anregung: 407 nm; Emission: 487 nm) bestimmt. Der Elutionspuffer enthielt 7% Methanol und 30 mM Ameisensäure. Als Standard diente chemisch synthetisiertes 6,7-Dimethyl-8- ribityllumazin. Eine Einheit (1 U) 6.7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase katalysiert bei 37°C die Bildung von 1 nmol 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin je Stunde. Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-BS-LuSy konnte eine Volumenaktivität von ca. 15600 U/ml gemessen werden. Nach Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration nach O) (13 mg/ml) konnte eine spezifische Aktivität von ca. 1200 U/mg berechnet werden.N) The functionality of the 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase was checked using the natural substrates (5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidine dione and L-3,4- Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate; Bacher et al., 1997). The mixture contained 100 mM K-phosphate buffer pH 7.0, 4 mM EDTA, 0.6 mM 5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione (PYR; prepared by catalytic hydrogenation of 5 -Nitro-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H) -pyrimidinedione), 2 mM DTT, 1 mM L-3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate (DHP) and crude extract from L). The mixture was first preincubated without PYR for 3 min and the enzyme reaction was then started by adding PYR. The test batch was incubated at 37 ° C. Were obtained from the mixture after different time intervals (2, 5, and 10 min) removed portions, the reaction stopped by the addition of TCA (15% in water) and centrifuged (15000 rpm ^-1, 5 min. RT). The evaluation was carried out by means of HPLC on the reverse phase Nucleosil 10C ₁₈ (4 × 250 mm). The concentration of the 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine formed was determined by fluorescence detection (excitation: 407 nm; emission: 487 nm). The elution buffer contained 7% methanol and 30 mM formic acid. The standard used was chemically synthesized 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine. One unit (1 U) of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase catalyzes the formation of 1 nmol of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine per hour at 37 ° C. A volume activity of approx. 15600 U / ml was measured in the crude extract of the XL1-pNCO-BS-LuSy strain. After determining the total protein concentration according to O) (13 mg / ml), a specific activity of approx. 1200 U / mg could be calculated.

O) Die Bestimmung des Proteins im Rohextrakt erfolgte nach einer Variante der Methode von Bradford (Read und Northcote, 1981; Compton und Jones, 1985). Das Farbstoffreagenz wurde durch Auffüllen von 0,1 g Serva Blue G, 100 ml 16 M Phosphorsäure und 47 ml Et hanol in Wasser gewonnen, filtriert und im Dunkeln bei 4°C aufbewahrt. Die Rohextrakte wurden mit einem Puffer, der 2,0 g Na₂HPO₄, 0,6 g KH₂PO₄, 7,0 g NaCl und 0,2 g Na triumazid pro Liter Wasser enthielt, 50-fach verdünnt. Zu 50 µl dieser Lösung wurden 950 µl Reagenz gegeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Extinktion bei 595 nm gegen eine Leerprobe aus 50 µl Puffer auf 950 µl Reagenz bestimmt. Für jede Probe erfolgte eine Dreifachbestimmung. Die Ergebnisse wurden mittels einer mit BSA (Rinderserumalbumin) als Standard erhaltenen Eichgeraden in Proteinkonzentrationen umgerechnet.O) The protein in the crude extract was determined using a variant of the Bradford method (Read and Northcote, 1981; Compton and Jones, 1985). The dye reagent was obtained by filling up with 0.1 g Serva Blue G, 100 ml 16 M phosphoric acid and 47 ml ethanol in water, filtered and stored in the dark at 4 ° C. The crude extracts were diluted 50-fold with a buffer containing 2.0 g Na ₂ HPO ₄ , 0.6 g KH ₂ PO ₄ , 7.0 g NaCl and 0.2 g sodium azide per liter water. 950 μl of reagent were added to 50 μl of this solution and incubated for 15 min at room temperature. The absorbance at 595 nm was then determined against an empty sample from 50 μl buffer to 950 μl reagent. A triple determination was carried out for each sample. The results were converted into protein concentrations using a calibration line obtained with BSA (bovine serum albumin) as the standard.

P) Für die Negativkontrastierung wurden Trägernetzchen verwendet, die mit Formvar/Kohle beschichtet waren. Diese wurden jeweils vor der Verwendung neu beglimmt (vgl. Standard protokolle zur Durchführung von Negativkontrastierung am Elektronenmikroskop). Etwa 10 µl Proteinlösung (≈ 1 mg/ml) wurden auf das Netzchen gegeben. Der Teil, der nach 1 min noch nicht an das Trägermaterial adsorbiert war, wurde entfernt. Anschließend wurde die proteinhaltige Schicht mehrmals abwechselnd mit Uranylacetatlösung (2% in Wasser) und bidest. Wasser benetzt. Der letzte Tropfen Uranylacetat wurde ca. 30 sec auf dem Prä parat belassen. Abschließend wurde das Trägernetzchen mit Filterpapier getrocknet und in die Trägerapparatur des Elektronenmikroskops eingesetzt (Transmissions-Elektronen mikroskop JEM-100CX, Jeol, Japan). Negativkontrastierungen zeigten hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.P) For the negative contrast carrier networks were used, those with Formvar / coal were coated. These were re-glued before each use (see standard protocols for performing negative contrasting on an electron microscope). Approximately 10 µl protein solution (≈ 1 mg / ml) was added to the net. The part after 1 min was not yet adsorbed on the carrier material was removed. Then was the protein-containing layer several times alternating with uranyl acetate solution (2% in water) and bidest. Water wetted. The last drop of uranyl acetate was applied to the pre Leave ready. Finally, the carrier net was dried with filter paper and in the carrier equipment of the electron microscope (transmission electrons microscope JEM-100CX, Jeol, Japan). Negative contrasts showed hollow, spherical ones Particles with an outside diameter of approx. 15 nm and an inside diameter of approx. 5 nm.

Q) Die Western-Blot Analyse wurde nach der Methode von Sambrook et al. (1989) durch geführt. Ausgehend von einem denaturierenden SDS-Polyacrylamidgel (16%) erfolgte die Übertragung der denaturierten Proteine über einen Zeitraum von 2 Stunden bei einer kon stanten Stromstärke von 40 mA. Nach erfolgter Transformation der Proteine auf die Mem brane, wurde diese kurz in Antikörper-Waschpuffer-A (20 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3 mM KCl; 0.05% Tween 20) gewaschen und anschließend in Antikörper-Waschpuffer-B (mit 3% Milchpulver) 1 Stunde inkubiert. Danach wurde die Membran übernacht mit 10 µl Anti-sRFS (Kaninchen Rohserum mit polyklonalen Antikörpern gegen die Lumazin synthase; 1 : 10 verdünnt in 1 mg/l BSA) in einem Gesamtvolumen von 5 ml Antikörper- Waschpuffer-C (mit 1% Milchpulver) geschwenkt. Nach der Inkubation wurde die Mem bran 3 × mit je 5 ml Antikörper-Waschpuffer-A gewaschen. Die gespülte Membran wurde anschließend 1 Stunde mit 20 µl Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat (in 50% Glycerin) in Antikörper-Waschpuffer-C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen erfolgte die Detektion von Lumazinsynthase enthaltenden Banden via Zugabe von 3,3'-Diaminobenzidm (6 mg in 10 ml Antikörper-Waschpuffer-A) und 10 µl Wasserstoffperoxid (30%ig). Nach Entwick lung der Membran konnte die Lumazinsynthase bei einem Molekulargewicht von ca. 16,2 kDa detektiert werden.Q) The Western blot analysis was carried out according to the method of Sambrook et al. (1989) by guided. Starting from a denaturing SDS polyacrylamide gel (16%), the Transfer of the denatured proteins over a period of 2 hours at a con constant current of 40 mA. After the transformation of the proteins to the mem brane, this was briefly dissolved in antibody wash buffer A (20 mM Tris, pH 7.4; 150 mM NaCl; 3 mM KCl; 0.05% Tween 20) and then in antibody wash buffer B (with 3% milk powder) incubated for 1 hour. The membrane was then overnight with 10 ul Anti-sRFS (rabbit raw serum with polyclonal antibodies against the Lumazin synthase; 1:10 diluted in 1 mg / l BSA) in a total volume of 5 ml antibody Wash buffer-C (with 1% milk powder) swirled. After the incubation, the mem bran washed 3 × with 5 ml antibody wash buffer A each. The rinsed membrane was then 1 hour with 20 µl anti-rabbit IgG-HRP conjugate (in 50% glycerol) in Antibody Wash Buffer C incubated. After washing three times, the detection was carried out of bands containing lumazine synthase via the addition of 3,3'-diaminobenzide (6 mg in 10 ml antibody wash buffer A) and 10 µl hydrogen peroxide (30%). After Develop The lumazine synthase was able to develop the membrane with a molecular weight of approx. 16.2 kDa can be detected.

R) Die Reinigung der Lumazinsynthase aus dem Stamm XL1-pNCO-BS-LuSy erfolgte in zwei Schritten: Der Kultivierung der Escherichia coli Zellen erfolgte nach K), jedoch in einem Volumen von 1 l. Zum Aufschluß wurde das gewaschene Zellpellet in 32 ml Aufschluß puffer suspendiert und 10 min auf Eis gekühlt. Die Zellsuspension wurde dann 15 mal mit der Nadelsonde des Ultraschallgerätes (Branson-Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dunbury, Connecticut) bei Stufe 5 behandelt. Anschließend wurde die Suspen sion 5 min auf Eis gekühlt. Der Vorgang wurde insgesamt 4 mal wiederholt. Die auf geschlossenen Zellsuspension wurde anschließend zentrifugiert (Sorvall SS34-Rotor; 15000 Umin^-1; 4°C) und der klare Überstand auf eine Anionenaustauschersäule (DEAE-Cellulose DE52; 2 × 15 cm, Whatman Ltd., Maidstone, GB) aufgetragen. Die Säule wurde zunächst mit 100 ml Puffer A (50 mM K-Phosphat, 10 mM EDTA, 10 mM Natriumsumsulfit, 0,02% Natriumazid, pH 7,0) gespült und die Lumazinsynthase anschließend unter Durchführung eines Elutionsgradienten (101 ml bis 200 ml 15% Puffer B; 201 ml bis 500 ml 18% Puffer B; 501 ml bis 650 ml 100% Puffer B) unter Einbeziehung von Puffer B (1 M K-Phosphat, 10 mM EDTA, 10 mM Natriumsulfit, 0,02% Natriumazid, pH 7,0) eluiert (Flußrate: 1 ml/min). Die Lumazinsynthase konnte bei ca. 250 mM K-Phosphat eluiert werden. Die Fraktionen wurden anschließend nach N) auf Lumazinsynthaseaktivität getestet. Aktive Fraktionen wurden vereinigt und gegen Puffer A in einem Verhältnis 1 : 1000 dialysiert (18 h, 4°C). Das Dialysat wurde anschließend unter Verwendung einer Ultrazentrifuge konzen triert (Beckman LE 70 mit Festwinkelrotor 70Ti; 32000 Umin^-1, 18 h, 4°C). Die zu ca. 75 % angereicherte konzentrierte Proteinlösung wurde auf eine mit Puffer A equilibrierte Gel filtrationssäule (Sepharose-6B, 2 × 180 cm, Pharmacia Biotech, Freiburg) aufgetragen und mit Puffer A eluiert (Flußrate: 0,5 ml/min). Die Lumazinsynthase eluierte kurz nach der Ausschlußgrenze. Die Fraktionen wurden anschließend nach N) auf Lumazinsynthaseaktivi tät getestet und anschließend unter Verwendung einer Ultrazentrifuge konzentriert (Beckman LE 70 mit Festwinkelrotor 70Ti; 32000 Umin^-1, 18 h, 4°C). Die Reinheits überprüfung erfolgte nach M) (SDS-PAGE), wobei nur noch eine Proteinbande bei ca. 16 kDa zu beobachten war. Nach Bestimmung der enzymatischen Aktivität nach N) und der Proteinkonzentration nach O) konnte eine spezifische Aktivität von 12400 U/mg berechnet werden. Negativkontrastierungen nach P) zeigten hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.R) The purification of the lumazine synthase from the strain XL1-pNCO-BS-LuSy was carried out in two steps: The cultivation of the Escherichia coli cells was carried out according to K), but in a volume of 1 l. For the digestion, the washed cell pellet was suspended in 32 ml digestion buffer and cooled on ice for 10 min. The cell suspension was then treated 15 times with the needle probe of the ultrasound device (Branson Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dunbury, Connecticut) at level 5. The suspension was then cooled on ice for 5 min. The process was repeated 4 times in total. The closed cell suspension was then centrifuged (Sorvall SS34 rotor; 15000 rpm ^-1 ; 4 ° C.) and the clear supernatant was applied to an anion exchange column (DEAE cellulose DE52; 2 × 15 cm, Whatman Ltd., Maidstone, GB). The column was first rinsed with 100 ml of buffer A (50 mM K-phosphate, 10 mM EDTA, 10 mM sodium sulfite, 0.02% sodium azide, pH 7.0) and the lumazine synthase was then subjected to an elution gradient (101 ml to 200 ml 15% buffer B; 201 ml to 500 ml 18% buffer B; 501 ml to 650 ml 100% buffer B) including buffer B (1 M K-phosphate, 10 mM EDTA, 10 mM sodium sulfite, 0.02% sodium azide , pH 7.0) eluted (flow rate: 1 ml / min). The lumazine synthase could be eluted at approximately 250 mM K-phosphate. The fractions were then tested for lumazine synthase activity according to N). Active fractions were pooled and dialyzed against buffer A in a ratio of 1: 1000 (18 h, 4 ° C.). The dialysate was then concentrated using an ultracentrifuge (Beckman LE 70 with fixed-angle rotor 70Ti; 32000 Umin ^-1 , 18 h, 4 ° C). The approximately 75% enriched concentrated protein solution was applied to a gel filtration column (Sepharose-6B, 2 × 180 cm, Pharmacia Biotech, Freiburg), equilibrated with buffer A and eluted with buffer A (flow rate: 0.5 ml / min). The lumazine synthase eluted shortly after the exclusion limit. The fractions were then tested for lumazine synthase activity according to N) and then concentrated using an ultracentrifuge (Beckman LE 70 with fixed-angle rotor 70Ti; 32000 Umin ^-1 , 18 h, 4 ° C). The purity was checked according to M) (SDS-PAGE), whereby only one protein band was observed at approx. 16 kDa. After determining the enzymatic activity according to N) and the protein concentration according to O), a specific activity of 12400 U / mg could be calculated. Negative contrasts according to P) showed hollow, spherical particles with an outside diameter of approx. 15 nm and an inside diameter of approx. 5 nm.

S) Zur Überprüfung der Quartärstruktur des gereinigten Proteins wurde eine native Elektro phorese unter Verwendung von 3,5%igen Polyacrylamidflachgelen durchgeführt. 5,7 ml Acrylamidstammlösung (38,8% (w/v) Acrylamid; 1,2% (w/v) N,N'-Methylenbisacryl amid), 46 ml Gelpuffer (0,2 M Na-Phosphat, pH 7,2), 13 ml H₂O_bidest 300 µl Ammoium peroxodisulfatlösung (10% (w/v) in Wasser), 65 µl TEMED (N,N,N',N'-Tetramethyl ethylendiamin) und 5 mg Bromphenolblau wurden gemischt und in einen Gelgießstand (Pharmacia Biotech, Freiburg) unter Verwendung einer Trägerfolie (GelBond® PAG Film, FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) gegossen und über Nacht bei Raumtemperatur polymerisiert. Auf das Gel wurden 20 µl Proteinlösung in einer Konzentration von 0,2-1 mg/ml gegeben. Als Elektrodenpuffer wurde der Gelpuffer verwendet. Das Gel wurde bei konstant 100 mA unter Temperaturkontrolle (10°C) entwickelt. Die Anfärbung bzw. Ent färbung erfolgte wie unter M) beschrieben. Die gereinigte Lumazinsynthase war als diskrete Bande auf dem nativen Gel zu sehen und zeigte dasselbe Laufverhalten wie eine aus Wildtyp Bacillus subtilis gereinigte Probe.S) To check the quaternary structure of the purified protein, a native electrophoresis was carried out using 3.5% polyacrylamide flat gels. 5.7 ml acrylamide stock solution (38.8% (w / v) acrylamide; 1.2% (w / v) N, N'-methylenebisacryl amide), 46 ml gel buffer (0.2 M Na phosphate, pH 7, 2), 13 ml H ₂ O _bidest 300 μl ammonium peroxodisulfate solution (10% (w / v) in water), 65 μl TEMED (N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine) and 5 mg bromophenol blue were mixed and mixed in a gel casting stand (Pharmacia Biotech, Freiburg) was cast using a carrier film (GelBond® PAG Film, FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) and polymerized overnight at room temperature. 20 µl protein solution in a concentration of 0.2-1 mg / ml was added to the gel. The gel buffer was used as the electrode buffer. The gel was developed at a constant 100 mA under temperature control (10 ° C). The staining or Ent staining was carried out as described under M). The purified lumazine synthase was seen as a discrete band on the native gel and showed the same running behavior as a sample purified from wild-type Bacillus subtilis.

T) Zur Überprüfung der Quartärstnuktur bzw. der Beurteilung der strukturellen Homogenität der gereinigten Lumazinsynthase wurde eine Sedimentationsanalyse an der analytischen Ul trazentrifuge (Optima XLA mit Rotor AN60 Ti, Beckman Instruments, München), durch geführt (Laue et al., 1992). Zur Bestimmung der Sedimentationsgeschwindigkeit wurde die Lumazinsynthase bei 45000 Umin^-1 zentrifugiert. Alle 5 min wurde die radiale Absorptionsänderung bei 280 nm gemessen und damit der Sedimentationsverlauf des Proteins verfolgt. Rekombinante Lumazinsynthase sedimentierte als homogene, symmetrische Grenzschicht, d. h. bei der Probe handelte es sich um eine einzige Molekülspezies. Aus dem zeitlichen Sedimentationsfortschritt während der einzelnen Messungen wurde eine mittlere Sedimentationskonstante S_20,w von 26,3 S bestimmt.T) In order to check the quaternary structure or to assess the structural homogeneity of the purified lumazine synthase, a sedimentation analysis was carried out on the analytical ultracentrifuge (Optima XLA with rotor AN60 Ti, Beckman Instruments, Munich) (Laue et al., 1992). To determine the rate of sedimentation the lumazine was centrifuged at 45,000 rpm ^-1. The radial absorption change at 280 nm was measured every 5 minutes and the sedimentation course of the protein was thus monitored. Recombinant lumazine synthase sedimented as a homogeneous, symmetrical boundary layer, ie the sample was a single molecular species. An average sedimentation constant S _{20, w} of 26.3 S was determined from the temporal progress of the sedimentation during the individual measurements.

U) Die genaue Bestimmung des nativen Molekulargewichts der Lumazinsynthase und die ent gültige Bestätigung des Aggregationsgrades erfolgte mit der analytischen Ultrazentrifuge nach der Sedimentationsgleichgewichtsmethode. Die radiusabhängige Konzentrations messung erfolgte über die Messung der Absorption bei 280 nm. Die Proben waren konzen triertes Protein (nach Sepharose-6B), das auf SDS-Polyacrylamidgelen nur noch eine einzi ge Bande (16,2 kDa) zeigte. Die Absorption der verwendeten Proben betrug etwa 0,3 bei 280 nm. 150 µl Probe wurden in den Probensektor einer Meßzelle gegeben und mit 15 µl Öl (Fluorochemical FC 43, Beckman) unterschichtet. Der Referenzsektor wurde mit 200 µl Puffer A (siehe R)) befüllt. Die Enzymprobe wurde bei 3000 Umin^-1 und 4°C solange zen trifugiert, bis sich das Gleichgewicht zwischen Zentrifugation und Rückdiffusion eingestellt hatte. Die Auswertung der Daten erfolgte mit der Software XLA-Data-Analysis (Teilprogramm Origin-single; Beckman Instruments). Das partielle spezifische Volumen des Proteins wurde näherungsweise nach Cohn und Edsall (1943) aus den partiellen spezifischen Volumina der Aminosäuren und Addition einer Temperaturkorrektur errechnet. Für die Lumazinsynthase wurde eine Molekülmasse von 925 kDa bei 4°C erhalten und damit die Aggregation zu einem 60-mer bestätigt.U) The exact determination of the native molecular weight of the lumazine synthase and the final confirmation of the degree of aggregation was carried out with the analytical ultracentrifuge using the sedimentation equilibrium method. The radius-dependent concentration measurement was carried out by measuring the absorption at 280 nm. The samples were concentrated protein (according to Sepharose-6B) which only showed a single band (16.2 kDa) on SDS-polyacrylamide gels. The absorption of the samples used was approximately 0.3 at 280 nm. 150 μl of sample were placed in the sample sector of a measuring cell and underlaid with 15 μl of oil (Fluorochemical FC 43, Beckman). The reference sector was filled with 200 µl buffer A (see R)). The enzyme sample was trifugiert zen at 3000 rpm and 4 ° C ^-1 as long, had to be adjusted, the balance between back diffusion and centrifugation. The data was evaluated using the XLA data analysis software (Origin single program; Beckman Instruments). The partial specific volume of the protein was calculated approximately according to Cohn and Edsall (1943) from the partial specific volumes of the amino acids and addition of a temperature correction. A molecular mass of 925 kDa at 4 ° C. was obtained for the lumazine synthase and thus the aggregation to a 60-mer was confirmed.

Beispiel 2Example 2 Homologe Expression der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis im Bacillus subtilis Stamm BR151-pBL1Homologous expression of the lumazine synthase from Bacillus subtilis in the Bacillus subtilis strain BR151-pBL1

Im Vergleich zur heterologen Expression in Escherichia coli kann bei der homologen Expres sion in Bacillus subtilis eine höhere Ausbeute an Lumazinsynthase erzielt werden.In comparison to the heterologous expression in Escherichia coli, the homologous express sion in Bacillus subtilis a higher yield of lumazine synthase can be achieved.

A) Analog Beispiel 1A)-E), wobei anstelle des Oligonukleotids EcoRI-RBS-1 Oligonukleotid EcoRI-RBS-2 (5' ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg 3') verwendet wurde.A) Analogous to Example 1A) -E), but instead of the oligonucleotide EcoRI-RBS-1 Oligonucleotide EcoRI-RBS-2 (5 'ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg 3') was used.

B) Der Expressionsvektor p602/-CAT wurde analog Beispiel 1F) verdaut. Das entstandene DNA-Fragment mit einer Länge von 5269 bp wie unter Beispiel 1B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.B) The expression vector p602 / -CAT was digested analogously to Example 1F). The resulting DNA fragment with a length of 5269 bp purified as described under Example 1B) and used for ligation.

C) Die Ligation erfolgte analog Beispiel 1G), wobei das Expressionsplasmid p602-BS-LuSy erhalten wurde.C) The ligation was carried out analogously to Example 1G), the expression plasmid p602-BS-LuSy was obtained.

D) Die Transformation von Escherichia coli XL1-Zellen erfolgte analog Beispiel 1H), jedoch wurden anstelle LB-AMP-Platten, LB-KAN-Selektivagarplatten (21 g/l Agar; 10 g/l Ca seinhydrolysat; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l NaCl; 15 mg/l Kanamycin) verwendet, da der Vektor p602/-CAT über eine Kanamycin-Resistenz anstelle der Ampicillin-Resistenz verfügt.D) The transformation of Escherichia coli XL1 cells was carried out analogously to Example 1H), however instead of LB-AMP plates, LB-KAN selective agar plates (21 g / l agar; 10 g / l Ca his hydrolyzate; 5 g / l yeast extract; 5 g / l NaCl; 15 mg / l kanamycin) used as the vector p602 / -CAT has kanamycin resistance instead of ampicillin resistance.

E) Die Isolierung der Expressionsplasmide erfolgte analog Beispiel 1I), jedoch wurden die Zellen auf LB-KAN-Flüssigmedium (10 g/l Caseinhydrolysat; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l NaCl; 15 mg/l Kanamycin) angezogen.E) The expression plasmids were isolated analogously to Example 1I), but the Cells on LB-KAN liquid medium (10 g / l casein hydrolyzate; 5 g / l yeast extract; 5 g / l NaCl; 15 mg / l kanamycin).

F) Die Sequenzierung erfolgte analog Beispiel 1J) jedoch mit Sequenzieroligonukleotid Seq-2 (5' gta taa tag att caa att gtg agc gg 3').F) The sequencing was carried out analogously to Example 1J), but with sequencing oligonucleotide Seq-2 (5 'gta taa day att caa att gtg agc gg 3').

G) Die Kultivierung der Expressionsstämme erfolgte analog Beispiel 1K), jedoch unter Ver wendung von LB-KAN-Flüssigmedium.G) The expression strains were cultivated analogously to Example 1K), but with Ver Use of LB-KAN liquid medium.

H) Der Aufschluß der Zellen wurde analog Beispiel 1L) durchgeführt.H) The disruption of the cells was carried out analogously to Example 1L).

I) Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese des Escherichia coli Stammes XL1-p602-BS- LuSy (durchgeführt gemäß Beispiel 1M)) zeigte eine diskrete Proteinbande bei ca. 16 kDa, die einer Expressionsrate von ca. 30% bezogen auf die gesamte lösliche Proteinfraktion entsprach.I) SDS polyacrylamide gel electrophoresis of the Escherichia coli strain XL1-p602-BS- LuSy (carried out according to Example 1M)) showed a discrete protein band at approx. 16 kDa, an expression rate of about 30% based on the total soluble protein fraction corresponded.

J) Die Uberprüfung der Funktionalität gemäß Beispiel 1N) und der Gesamtproteinkonzentra tion gemäß Beispiel 1O) ergab eine spezifische Aktivität von ca. 3700 U/mg.J) Checking the functionality according to Example 1N) and the total protein concentration tion according to Example 10) gave a specific activity of approx. 3700 U / mg.

K) Die Herstellung elektrokompetenter Bacillus subtilis Zellen erfolgte nach einer modifizier ten Vorschrift von Brigidi et al. (1989). 500 ml LB-ERY-Flüssigmedium (10 g/l Casein hydrolysat; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l NaCl; 15 mg/l Erythromycin) wurden 1 : 100 mit einer Bacillus subtilis Zellen (BR151[pBLI]) enthaltenden Übernacht-Kultur angeimpft und bei 32°C bis zu einer optischen Dichte (578 nm) von 0,6 bebrühtet. Zum Abstoppen des Zell wachstums wurden die Zellen 30 min auf Eis gestellt und anschließend zur Gewinnung der Zellmasse zentrifugiert (Sorvall-GSA-Rotor, 2300 Umin^-1 4°C, 15 min). Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet mit 300 ml eiskaltem, sterilem 1 mM HEPES-Puffer (1 mM (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure in Wasser, pH 7,0) gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Sediment wurde zweimal in je 200 ml PEB-Puffer (272 mM Saccharose; 1 mM MgCl₂; 7 mM K-Phosphat, pH 7,4) gewaschen und zentrifugiert. Das Zellpellet wurde abschließend in 16 ml PEB-Puffer suspendiert und auf Eis gekühlt. Elektroporations zelle und Zellenhalter wurden 15 min auf Eis vorgekühlt. 800 µl Zellsuspension wurde in einem vorgekühlten Eppendorf-Gefäß mit 500-1500 ng Plasmid-DNA (p602-BS-LuSy aus E)) vermischt und 10 min auf Eis inkubiert. Nach Überführung der inkubierten Suspension in die Elektroporationszelle (4 mm) wurde die Elektroporation bei 25 µF und 2,5 kV in einer Elektroporationsapparatur (Gene Pulse, BioRad, München) durchgeführt. Anschlie ßend wurde die Zellsuspension für weitere 10 min auf Eis inkubiert. Zur Expression des Phänotyps (Kanamycin-Resistenz) wurden die transformierten Zellen in 6 ml LB-ERY-Me dium (s.o.) pipettiert und 2 h bei 32°C bebrühtet. Anschließend wurden 25 ml LB-ERY- KAN-Medium (10 g/l Caseinhydrolysat; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l NaCl; 15 mg/l Erythromy cin; 15 mg/ml Kanamycin) mit 1 ml des Transformationsansatzes beimpft und für 4-8 h bei 32°C im Schüttelinkubator bebrühtet. Parallel dazu wurden Portionen von 100 µl, 200 µl und 400 µl des Transformationsansatzes direkt auf LB-ERY-KAN-Selektivagarplatten (21 g/l Agar; 10 g/l Caseinhydrolysat; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l NaCl; 15 mg/l Erythromycin; 15 mg/ml Kanamycin) ausplattiert. Portionen der Flüssigkultur wurden nach 2, 4, 6 und 8 h auf LB-ERY-KAN-Platten ausplattiert.K) The production of electro-competent Bacillus subtilis cells was carried out according to a modified regulation by Brigidi et al. (1989). 500 ml LB-ERY liquid medium (10 g / l casein hydrolyzate; 5 g / l yeast extract; 5 g / l NaCl; 15 mg / l erythromycin) were 1: 100 with a Bacillus subtilis cell (BR151 [pBLI]) containing overnight - Inoculated culture and brewed at 32 ° C to an optical density (578 nm) of 0.6. To stop the cell growth, the cells were placed on ice for 30 minutes and then centrifuged to obtain the cell mass (Sorvall GSA rotor, 2300 rpm ^-1 4 ° C., 15 minutes). The supernatant was discarded, the cell pellet washed with 300 ml of ice-cold, sterile 1 mM HEPES buffer (1 mM (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid in water, pH 7.0) and centrifuged again. The sediment was washed twice in 200 ml of PEB buffer (272 mM sucrose; 1 mM MgCl ₂ ; 7 mM K-phosphate, pH 7.4) were washed and centrifuged, and the cell pellet was finally suspended in 16 ml PEB buffer and cooled on ice Cell holders were precooled on ice for 15 min, 800 μl of cell suspension were mixed in a precooled Eppendorf tube with 500-1500 ng plasmid DNA (p602-BS-LuSy from E)) and incubated on ice for 10 min. After transferring the incubated suspension into the electroporation cell (4 mm), the electroporation was carried out at 25 μF and 2.5 kV in an electroporation apparatus (Gene Pulse, BioRad, Munich). The cell suspension was then incubated on ice for a further 10 min. To express the phenotype (kanamycin resistance), the transformed cells were pipetted into 6 ml LB-ERY medium (see above) and brewed at 32 ° C. for 2 h. Then 25 ml LB-ERYKAN medium (10 g / l casein hydrolyzate; 5 g / l yeast extract; 5 g / l NaCl; 15 mg / l erythromy cin; 15 mg / ml kanamycin) were inoculated with 1 ml of the transformation mixture and Brewed for 4-8 h at 32 ° C in a shaking incubator. In parallel, portions of 100 µl, 200 µl and 400 µl of the transformation batch were placed directly on LB-ERY-KAN selective agar plates (21 g / l agar; 10 g / l casein hydrolyzate; 5 g / l yeast extract; 5 g / l NaCl; 15 mg / l erythromycin; 15 mg / ml kanamycin). Portions of the liquid culture were plated onto LB-ERY-KAN plates after 2, 4, 6 and 8 h.

L) Die erhaltenen Bacillus subtilis Stämme BR151-pBL1-p602-BS-LuSy wurden unter Ver wendung der Polymerase-Kettenreaktion auf Anwesenheit des Expressionsplasmides ge testet. Zur Analytik der Transformanden wurden jeweils PCR-Ansätze (vgl. Beispiel 1A) jedoch ohne Matrizen-DNA und entsprechend mehr Wasser) vorgelegt und darin unter Verwendung von sterilen Zahnstochern frisches Zellmaterial (von den erhaltenen Kolonien) suspendiert. Nach erfolgter Suspendierung wurde eine Kopie der jeweiligen Transformande auf einer LB-ERY-KAN-Selektivagarplatte angelegt. Bei allen getesteten Kolonien wurde ein DNA-Fragment mit einer Länge von 498 bp erhalten.L) The Bacillus subtilis strains BR151-pBL1-p602-BS-LuSy obtained were analyzed under Ver application of the polymerase chain reaction to the presence of the expression plasmid tests. PCR approaches were used to analyze the transformants (see Example 1A) however without template DNA and correspondingly more water) and submitted under Use of sterile toothpicks fresh cell material (from the colonies obtained) suspended. After the suspension, a copy of the respective transformande was made placed on an LB-ERY-KAN selective agar plate. For all colonies tested received a DNA fragment with a length of 498 bp.

M) Die Kultivierung der Zellen erfolgte auf LB-ERY-KAN-Flüssigmedium (10 g/l Casein hydrolysat; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l NaCl; 15 mg/l Erythromycin; 15 mg/ml Kanamycin) ge mäß Beispiel 1K), jedoch wurde die Fermentation bei 32°C durchgeführt und die Wachstumsphase nach Induktion mit IPTG betrug 18 h.M) The cells were cultivated on LB-ERY-KAN liquid medium (10 g / l casein hydrolyzate; 5 g / l yeast extract; 5 g / l NaCl; 15 mg / l erythromycin; 15 mg / ml kanamycin) ge according to Example 1K), but the fermentation was carried out at 32 ° C and the The growth phase after induction with IPTG was 18 h.

N) Der Aufschluß der Zellen erfolgte analog Beispiel 1L).N) The cells were disrupted analogously to Example 1L).

O) Die Überprüfung der Expressionsrate anhand einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese erfolgte analog Beispiel 1M) und ergab eine Expressionsrate von ca. 40-50% bezogen auf die gesamte lösliche Proteinfraktion.O) Checking the expression rate using an SDS polyacrylamide gel electrophoresis was carried out analogously to Example 1M) and gave an expression rate of approximately 40-50% based on the total soluble protein fraction.

P) Die Überprüfung der Funktionalität bzw. der Proteinkonzentration wurde gemäß Beispiel 1 N) und O) durchgeführt. Im Rohextrakt des Expressionsstammes BR151-pBL1-p602-BS- LuSy konnte eine spezifische Aktivität von 4000 U/mg gemessen werden.P) The functionality or the protein concentration was checked in accordance with Example 1 N) and O) performed. In the crude extract of the expression strain BR151-pBL1-p602-BS- LuSy was able to measure a specific activity of 4000 U / mg.

Q) Die Durchführung der Negativkontrastierung erfolgte nach Beispiel 1P), wobei hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurch messer von ca. 5 nm zu beobachten waren.Q) The negative contrast was carried out according to Example 1P), hollow, spherical particles with an outer diameter of approx. 15 nm and an inner diameter 5 nm were observed.

R) Die Western-Blot-Analyse wurde nach Beispiel 1Q) durchgeführt und ergab ein vergleich bares Ergebnis.R) The Western blot analysis was carried out according to Example 1Q) and gave a comparison cash result.

S) Da die Expressionsrate im verwendeten Bacillus subtilis Stamm BR151-pBL1-p602-BS- LuSy deutlich höher lag als im Escherichia coli Stamm XLI-pNCO-BS-LuSy konnte die Reinigung mit einer einzigen Säule (Sepharose-6B, 2 × 180 cm, Pharmacia Biotech, Frei burg) durchgeführt werden. Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach M), jedoch in einem Volumen von 1 l. Der Aufschluß erfolgte nach Beispiel 1R) in 32 ml Aufschlußpuffer, je doch wurden dem Aufschlußpuffer 30 mg Lysozym zugesetzt. Es erfolgte zunächst eine In kubation der Zellsuspension (37°C, 60 min) an die sich der Ultraschall-Aufschluß gemäß Beispiel 1R) anschloß. Die aufgeschlossenen Zellsuspension wurde anschließend zentrifu giert (Sorvall SS34-Rotor; 15000 Umin^-1; 4°C), filtriert (Porenweite 0,22 µm) und der klare Überstand auf eine mit Puffer A (gemäß Beispiel 1R)) equilibrierte Gelfiltrationssäule auf getragen und mit Puffer A eluiert (Flußrate: 0,5 ml/min). Die Lumazinsynthase wurde vom Säulenmaterial nicht retardiert. Die Fraktionen wurden anschließend nach Beispiel 1N) auf Lumazinsynthaseaktivität getestet und anschließend unter Verwendung einer Ultrazentri fuge konzentriert (Beckman LE 70 mit Festwinkelrotor 70Ti; 32000 Umin^-1, 18 h, 4°C). Die Reinheitsüberprüfung erfolgte nach Beispiel 1M) (SDS-PAGE), wobei nur eine Pro teinbande bei ca. 16 kDa zu beobachten war. Nach Bestimmung der enzymatischen Aktivi tät und der Proteinkonzentration (gemäß Beispiel 1N) und O)) konnte eine spezifische Ak tivität von 12400 U/mg berechnet werden. Negativkontrastienangen (gemäß Beispiel 1P)) zeigten hohle, sphärische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.S) Since the expression rate in the Bacillus subtilis strain BR151-pBL1-p602-BS-LuSy used was significantly higher than in the Escherichia coli strain XLI-pNCO-BS-LuSy, cleaning with a single column (Sepharose-6B, 2 × 180 cm , Pharmacia Biotech, Freiburg). The cells were cultivated according to M), but in a volume of 1 l. The digestion was carried out according to Example 1R) in 32 ml digestion buffer, but 30 mg lysozyme were added to the digestion buffer. There was first an incubation of the cell suspension (37 ° C., 60 min) to which the ultrasound digestion according to Example 1R) followed. The digested cell suspension was then centrifuged (Sorvall SS34 rotor; 15000 rpm ^-1 ; 4 ° C), filtered (pore size 0.22 µm) and the clear supernatant was applied to a gel filtration column equilibrated with buffer A (according to Example 1R) and eluted with buffer A (flow rate: 0.5 ml / min). The lumazine synthase was not retarded by the column material. The fractions were then tested for lumazine synthase activity according to Example 1N) and then concentrated using an ultracentrifuge (Beckman LE 70 with fixed-angle rotor 70Ti; 32000 Umin ^-1 , 18 h, 4 ° C.). The purity was checked according to Example 1M) (SDS-PAGE), with only one protein band being observed at approx. 16 kDa. After determining the enzymatic activity and the protein concentration (according to Example 1N) and O)), a specific activity of 12400 U / mg could be calculated. Negative contrast lengths (according to Example 1P)) showed hollow, spherical particles with an outer diameter of approximately 15 nm and an inner diameter of approximately 5 nm.

T) Die Überprüfung der Quartärstruktur der gereinigten Lumazinsynthase erfolgte gemäß Bei spiel 1S) bis U) und ergab ein vergleichbares Ergebnis.T) The quaternary structure of the purified lumazine synthase was checked in accordance with game 1S) to U) and gave a comparable result.

Beispiel3Example3 Ersatz der Aminosäure Cystein an der Positionen 93 durch die Aminosäure Serin in der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilisReplacement of the amino acid cysteine at position 93 with the amino acid serine in the Bacillus subtilis lumazine synthase

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden PNCO-M2 (5' aga tat ttt cat taa aga gga gaa 3'), welches am 3'-Ende an einen Teil der ri bosomalen Bindungsstelle bindet und am 5'-Ende einen nicht bindenden Sequenzabschnitt zur Deletion der vektoriellen EcoRI-Schnittstelle enthält und RibH-3 (5' tat tat gga tcc tta ttc aaa tga gcg gtt taa att tg 3') aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (Beispiel 1) amplifiziert.
10 µl PCR-Puffer
6 µl Mg²⁺ [1,5 mM]
8 µl dNTP's [je 200 µM]
1 µl PNCO-M2 [0,5 µM]
1 µl RibH-3 [0,5 µM)
1 µl pNCO-BS-LuSy [10 ng]
1 µl Goldstar-Taq-Polymerase [0,5 U] (Eurogentec, Seraing, Belgien)
72 µl H₂O_bidest
Der Ansatz wurde im Thermocycler (GeneAmp® PCR System 2400; Perkin Elmer) bei folgenden Bedingungen durchgeführt:
1. 5,0 min 95°C
2. 0,5 min 94°C
3. 0,5 min 50°C
4. 0,5 min 72°C
5. 7,0 min 72°C
6. abkühlen auf 4°C
Die Schritte 2.-4. wurden 20 × wiederholt.A) The gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was linked with the oligonucleotides PNCO-M2 (5 'aga tat ttt cat taa aga gga gaa 3'), which binds at the 3 'end to a part of the ri bosomal binding site and at the 5' -End contains a non-binding sequence section for deletion of the vectorial EcoRI interface and amplifies RibH-3 (5 'tat tat gga tcc tta ttc aaa tga gcg gtt taa att tg 3') from the plasmid pNCO-BS-LuSy (Example 1) .
10 µl PCR buffer
6 µl Mg ²⁺ [1.5 mM]
8 µl dNTP's [200 µM each]
1 µl PNCO-M2 [0.5 µM]
1 µl RibH-3 [0.5 µM)
1 µl pNCO-BS-LuSy [10 ng]
1 µl Goldstar Taq polymerase [0.5 U] (Eurogentec, Seraing, Belgium)
72 µl H ₂ O _bidist
The approach was carried out in a thermal cycler (GeneAmp® PCR System 2400; Perkin Elmer) under the following conditions:
1. 5.0 min 95 ° C
2. 0.5 min 94 ° C
3. 0.5 min 50 ° C
4. 0.5 min 72 ° C
5. 7.0 min 72 ° C
6. cool to 4 ° C
Steps 2.-4. were repeated 20 times.

B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B) gereinigt, wobei ein Fragment mit 505 bp er halten wurde.B) The PCR mixture was purified according to Example 1B), a fragment with 505 bp was holding.

C) Ein Teil des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligo nukleotiden PNCO-M1 (5' gtg agc gga taa caa ttt cac aca g 3'), welches im Bereich der EcoRI-Schnittstelle im Expressionsvektor bindet und diese Erkennungssequenz unberührt läßt und C93S (5' gca gct tca ttc gaa aca taa tcg taa tg 3'), welches die Mutation und die Schnittstelle BstBI (aminosäurenkonservativ) zur Detektion der Mutation einführt, aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (Beispiel 1) amplifiziert. Die Durchführung der PCR und die Rei nigung des Fragmentes (256 bp) erfolgte analog A) und B).C) Part of the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was linked to the oligo nucleotides PNCO-M1 (5 'gtg agc gga taa caa ttt cac aca g 3'), which is in the range of EcoRI interface binds in the expression vector and this recognition sequence is not affected leaves and C93S (5 'gca gct tca ttc gaa aca taa tcg taa tg 3'), which shows the mutation and the Interface BstBI (amino acid conservative) for the detection of the mutation from which Plasmid pNCO-BS-LuSy (Example 1) amplified. Carrying out the PCR and the Rei The fragment (256 bp) was purified analogously to A) and B).

D) Verlängerung des DNA-Fragmentes (256 bp) aus C) durch Kombination mit DNA-Frag ment (505 bp, repräsentiert die gesamte Genlänge) aus B) und Durchführung einer PCR. Bei diesem PCR-Ansatz dienen die eingesetzten PCR-Fragmente aus B) und C) selbst als Primer für die Polymerasereaktion. Um eine effiziente Verlängerung zu erreichen wurden beide Fragmente in äquimolaren Mengen (je 500 fmol) eingesetzt.
10 µl Puffer
6 µl Mg²⁺ [1,5 mM]
8 µl dNTP's [je 200 µM]
1 µl DNA-Fragment aus B) (500 fmol)
1 µl DNA-Fragment aus C) (500 fmol)
1 µl Goldstar-Taq-Polymerase [0,5 U]
73 µl H₂O_bidest
Der Ansatz wurde im Thermocycler (GeneAmp®PCR System 2400; Perkin Elmer) bei folgenden Bedingungen durchgeführt:
1. 5,0 min 95°C
2. 0,5 min 94°C
3. 0,5 min 65°C
4. 0,5 min 72°C
5. 7,0 min 72°C
6. abkühlen auf 4°C
Die Schritte 2.-4. wurden 20 × wiederholt.D) Extension of the DNA fragment (256 bp) from C) by combination with DNA fragment (505 bp, representing the entire gene length) from B) and carrying out a PCR. In this PCR approach, the PCR fragments from B) and C) used themselves serve as primers for the polymerase reaction. In order to achieve an efficient extension, both fragments were used in equimolar amounts (500 fmol each).
10 µl buffer
6 µl Mg ²⁺ [1.5 mM]
8 µl dNTP's [200 µM each]
1 µl DNA fragment from B) (500 fmol)
1 µl DNA fragment from C) (500 fmol)
1 µl Goldstar Taq polymerase [0.5 U]
73 µl H ₂ O _bidist
The approach was carried out in a thermal cycler (GeneAmp®PCR System 2400; Perkin Elmer) under the following conditions:
1. 5.0 min 95 ° C
2. 0.5 min 94 ° C
3. 0.5 min 65 ° C
4. 0.5 min 72 ° C
5. 7.0 min 72 ° C
6. cool to 4 ° C
Steps 2.-4. were repeated 20 times.

E) Eine ungereinigte Portion des PCR-Ansatzes aus D) diente als DNA-Matrize für einen PCR-Ansatz mit der Primerkombination PNCO-M1/RibH-3. Der PCR-Ansatz wurde ge mäß A) durchgeführt, wobei jedoch die PCR-Schritte 25 × wiederholt wurden.E) An unpurified portion of the PCR mixture from D) served as a DNA template for one PCR approach with the primer combination PNCO-M1 / RibH-3. The PCR approach was ge carried out according to A), but the PCR steps were repeated 25 times.

F) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B) gereinigt, wobei ein Fragment mit 528 bp er halten wurde.F) The PCR mixture was purified according to Example 1B), a fragment with 528 bp was holding.

G) Die Weiterverarbeitung erfolgte gemäß Beispiel 1E) bis I). Die eingeführte Mutation wurde durch Verdau des Plasmids pNCO-BS-LuSy-C93S mit der Restriktionsendonuklease BstBI (TT*CGAA) diagnostiziert (Fragmente mit 3698 bp und 181 bp).G) The further processing was carried out according to Example 1E) to I). The introduced mutation was by digesting the plasmid pNCO-BS-LuSy-C93S with the restriction endonuclease BstBI (TT * CGAA) diagnosed (3698 bp and 181 bp fragments).

H) Die Sequenzierung erfolgte gemäß Beispiel 1J).H) The sequencing was carried out according to Example 1J).

I) Proteinchemische Arbeiten wurden gemäß Beispiel 1K) bis S) durchgeführt, wobei kein signifikanter Unterschied zur Wildtyp-Lumazinsynthase erkennbar wurde.I) Protein chemistry work was carried out according to Example 1K) to S), but none significant difference to the wild-type lumazine synthase was recognizable.

Beispiel 4Example 4 Ersatz der Aminosäure Cystein an der Positionen 139 durch die Aminosäure Serin in der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilisReplacement of the amino acid cysteine at position 139 with the amino acid serine in the lumazine synthase from Bacillus subtilis

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde analog Beispiel 3A) mit den Oligonukleotiden PNCO-M2 und RibH-3 aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (Beispiel 1) amplifiziert und gereinigt.A) The gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was analogous to Example 3A) with the Oligonucleotides PNCO-M2 and RibH-3 from the plasmid pNCO-BS-LuSy (Example 1) amplified and purified.

B) Ein Teil des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde analog Beispiel 3B) mit den Oligonukleotiden PNCO-M1 und C139S (5' ggc aga aac agc tga atc tac acc ttt gtt g 3'), welches die Mutation und die Schnittstelle PvuII (aminosäurenkonservativ) zur De tektion der Mutation einführt, aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (Beispiel 1) amplifiziert. Die Durchführung der PCR und die Reinigung des Fragmentes (394 bp) erfolgte analog Beispiel 3A) und B).B) Part of the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was analogous to Example 3B) with the oligonucleotides PNCO-M1 and C139S (5 'ggc aga aac agc tga atc tac acc ttt gtt g 3 '), which the mutation and the interface PvuII (amino acid conservative) to De tection of the mutation introduces, amplified from the plasmid pNCO-BS-LuSy (Example 1). The PCR was carried out and the fragment (394 bp) was purified analogously Example 3A) and B).

C) Das weitere molekularbiologische Vorgehen entsprach Beispiel 3D) bis H). Die eingeführte Mutation wurde durch Verdau des Plasmids pNCO-BS-LuSy-C139S mit der Restriktions endonuklease Pvull (CAG*CTG) diagnostiziert (Fragmente mit 3539 bp und 340 bp).C) The further molecular biological procedure corresponded to example 3D) to H). The introduced Mutation was by digesting the plasmid pNCO-BS-LuSy-C139S with the restriction endonuclease Pvull (CAG * CTG) diagnosed (fragments with 3539 bp and 340 bp).

D) Das weitere biochemische Vorgehen entsprach Beispiel 1K) bis S) wobei kein signifikanter Unterschied zur Wildtyp-Lumazinsynthase erkennbar wurde. D) The further biochemical procedure corresponded to Examples 1K) to S), but not a significant one Difference to wild-type lumazine synthase was recognizable.

Beispiel 5Example 5 Ersatz der Aminosäure Cystein an den Positionen 93 und 139 durch die Aminosäure Serin in der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilisReplacement of the amino acid cysteine at positions 93 and 139 with the amino acid Serine in the lumazine synthase from Bacillus subtilis

A) Der Herstellung der Doppelmutante pNCO-BS-LuSy-C93/139S erfolgte analog zu Beispiel 4, jedoch wurde als DNA-Matrize das Plasmid pNCO-BS-LuSy-C93S verwendet.A) The double mutant pNCO-BS-LuSy-C93 / 139S was produced analogously to Example 4, but the plasmid pNCO-BS-LuSy-C93S was used as the DNA template.

B) Nach erfolgter biochemischer Charakterisierung (gemäß Beispiel 1K) bis S)) konnte kein signifikanter Unterschied zum Wildtyp-Enzym festgestellt werden.B) After biochemical characterization (according to Example 1K) to S)) none significant difference to the wild-type enzyme can be found.

Konstruktion von Expressionsvektoren zur N-terminalen und C-terminalen Fusion von Fremdproteinen an die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilisConstruction of expression vectors for the N-terminal and C-terminal fusion of Foreign proteins to the lumazine synthase from Bacillus subtilis

Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung von Escherichia coli Expressionsvektoren zur Fusion von Genen oder synthetisch hergestellter DNA-Fragmenten an das 5'-Ende bzw. an das 3'-Ende des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. Die Vektoren enthalten die erfindungsgemäß bevorzugten Vektorelemente, wie Promotor aus dem Bakteriophagen T5, eine lac-Operatorsequenz, einen Ampicillinresistenzmarker und einen zu Escherichia coli kompatiblen Replikationsursprung.The following examples describe the production of Escherichia coli expression vectors for the fusion of genes or synthetically produced DNA fragments at the 5 'end or at the 3 'end of the Bacillus subtilis lumazine synthase gene. The vectors included the vector elements preferred according to the invention, such as promoter from the bacteriophage T5, a lac operator sequence, an ampicillin resistance marker and one for Escherichia coli compatible origin of replication.

Beispiel 6Example 6 Vektor zur Fusion von Fremd-DNA an das 5'-Ende des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilisVector for fusion of foreign DNA to the 5 'end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden N1 (5' act atg gcg gcg gcg cgt agc tgc gcg gcc gct atg aat atc ata caa gga aat tta g 3'), welches eine NotI-Schnittstelle unmittelbar vor dem Startcodon erzeugt und RibH-4 (3' tat tat gga tcc aaa tta ttc aaa tga gcg gtt taa att tg 3') aus dem Plasmid pRF2 (siehe Beispiel 1) amplifiziert. Die PCR wurde analog Beispiel 1A) durchgeführt.A) The gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was with the oligonucleotides N1 (5 'act atg gcg gcg gcg cgt agc tgc gcg gcc gct atg aat atc ata caa gga aat tta g 3'), which created a NotI interface immediately before the start codon and RibH-4 (3 'tat tat gga tcc aaa tta ttc aaa tga gcg gtt taa att tg 3 ') from the plasmid pRF2 (see Example 1) amplified. The PCR was carried out analogously to Example 1A).

B) Die Reinigung erfolgte analog Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit 513 bp erhalten wurde.B) The purification was carried out analogously to Example 1B), a 513 bp DNA fragment being obtained has been.

C) 10 ng der isolierten DNA aus B) dienten anschließend als Matrize für eine 2. PCR mit den Oligonukleotiden N2 (5' ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg gcg gcg gcg cgt agc tgc 3'), welches in 5'-Richtung eine ribosomale Bindungsstelle und eine Erkennungssequenz für die Endonuklease EcoRI einführt, und RibH-4.C) 10 ng of the isolated DNA from B) then served as a template for a 2nd PCR with the Oligonucleotides N2 (5 'ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg gcg gcg gcg cgt agc tgc 3 '), which has a ribosomal binding site and a recognition sequence in the 5' direction introduces EcoRI for the endonuclease, and RibH-4.

D) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1B), E) bis J). Es wird das Plasmid pNCO-N-BS-LuSy erhalten.D) The further procedure was carried out analogously to Example 1B), E) to J). It becomes the plasmid pNCO-N-BS-LuSy obtained.

Beispiel 7Example 7 Vektor zur Fusion von Fremd-DNA an das 3'-Ende des Gens für die Lumazinsynthase aus Batillus subtilisVector for fusion of foreign DNA to the 3 'end of the lumazine synthase gene from Batillus subtilis

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-2 (vgl. Beispiel 2A)) und C2 (5' ttt tcg gga tcc ttt taa act gtt tgc ggc cgc taa ttc aaa tga gcg gtt taa att tg 3'), welches eine NotI-Schnittstelle hinter dem letzten kodierenden Basentriplett des Gens für die Lumazinsynthase und in 3'-Richtung eine BamHI-Schnittstelle im Abstand von 13 Nukleotiden einführt, aus dem Plasmid pNCO-BS- LuSy (vgl. Beispiel 1) amplifiziert. Das ehemalige Stopcodon des Lumazinsynthase-Gens wird durch das für die Aminosäure Leucin kodierende Basentriplett TTA ersetzt.A) The gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was with the oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see Example 2A)) and C2 (5 'ttt tcg gga tcc ttt taa act gtt tgc ggc cgc taa ttc aaa tga gcg gtt taa att tg 3 '), which has a NotI interface behind the last one coding base triplet of the gene for the lumazine synthase and in the 3 'direction one BamHI site at 13 nucleotides from the plasmid pNCO-BS- LuSy (see Example 1) amplified. The former stop codon of the lumazine synthase gene is replaced by the base triplet TTA coding for the amino acid leucine.

B) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1B), E) bis J). Es wird das Plasmid pNCO-C-BS-LuSy erhalten. B) The further procedure was carried out analogously to Example 1B), E) to J). It becomes the plasmid pNCO-C-BS-LuSy obtained.

Fusion von vollständigen Proteinen an den N-Terminus bzw. an den C-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilisFusion of complete proteins to the N-terminus or to the C-terminus of the Bacillus subtilis lumazine synthase

Die folgenden Beispiele beschreiben die Fusion eines intakten vollständigen Gens an das 5'- Ende bzw. an das 3'-Ende des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis. Die Bei spiele illustrieren die Durchführbarkeit der Fusion von vollständigen, biologisch aktiven Pro teinen an den N-Terminus als auch an den C-Terminus der ikosaedrischen Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis.The following examples describe the fusion of an intact complete gene to the 5'- End or at the 3 'end of the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis. The bei games illustrate the feasibility of fusing full, biologically active pro join the N-terminus as well as the C-terminus of the icosahedral lumazine synthase from Bacillus subtilis.

Beispiel 8Example 8 Fusion der Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli an den N-Terminus der Lumazin synthase aus Bacillus subtilisFusion of dihydrofolate reductase from Escherichia coli to the N-terminus of Lumazin synthase from Bacillus subtilis

A) Das Gen für die Dihydrofolatreduktase (DHFR) wurde mittels PCR aus isolierter chromo somaler-DNA (Escherichia coli RR28) unter Verwendung der Oligonukleotide EC-DHFR- 1 (5' gag gag aaa tta act atg atc agt ctg att gcg g 3'), welches am 3'-Ende zum 5'-Ende des DHFR-Gens komplementär ist und am 5'-Ende für einen Teil einer optimierten ribosomalen Bindungsstelle kodiert, und EC-DHFR-2 (5' cta gcc gta aat tct ata gcg gcc gca cgc cgc tcc aga atc 3'), welches am 3'-Ende zum Gen der DHFR komplementär ist und unmittelbar hin ter dem letzten codierenden Basentriplett eine Erkennungssequenz für die Endonuklease NotI einführt, amplifiziert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1A), wobei ca. 50 ng chromosomale DNA eingesetzt wurde.A) The gene for dihydrofolate reductase (DHFR) was isolated by PCR from isolated chromo somaler DNA (Escherichia coli RR28) using the oligonucleotides EC-DHFR- 1 (5 'gag gag aaa tta act atg atc agt ctg att gcg g 3'), which at the 3 'end to the 5' end of the DHFR gene is complementary and at the 5 'end for part of an optimized ribosomal Binding site, and EC-DHFR-2 (5 'cta gcc gta aat tct ata gcg gcc gca cgc cgc tcc aga atc 3 '), which is complementary at the 3' end to the gene of the DHFR and immediately towards it a recognition sequence for the endonuclease after the last coding base triplet NotI introduces, amplifies. The PCR was carried out analogously to Example 1A), with about 50 ng of chromosomal DNA was used.

B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 513 bp erhalten wurde.B) The PCR mixture was purified according to Example 1B), with a DNA fragment with a length of 513 bp was obtained.

C) Die Durchführung einer zweiten PCR erfolgte analog Beispiel 1C), wobei jedoch die Oli gonukleotid-Kombination BS-MfeI (5' ata ata caa ttg att aaa gag gag aaa tta act atg 3'), welches die ribosomale Bindungsstelle vervollständigt und unmittelbar vor der ribosomalen Bindungsstelle eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease MfeI in das DNA- Fragment einfiührt, und EC-DHFR-2 verwendet wurde.C) A second PCR was carried out analogously to Example 1C), but with the oli gonucleotide combination BS-MfeI (5 'ata ata caa ttg att aaa gag gag aaa tta act atg 3'), which completes the ribosomal binding site and immediately before the ribosomal Binding site a recognition sequence for the restriction endonuclease MfeI in the DNA Introduces fragment, and EC-DHFR-2 was used.

D) Der PCR-Ansatz wurde wie unter Beispiel 1B) beschrieben gereinigt, wobei ein Fragment mit einer Länge von 531 bp erhalten wurde.D) The PCR mixture was purified as described in Example 1B), with one fragment with a length of 531 bp was obtained.

E) Das isolierte DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen MfeI verdaut.
30,0 µl Fragment aus der 2. PCR
5,0 µl MfeI [50 U]
10,0 µl Puffer 4 (10 ×; 50 mM K-Acetat, 20 mM Tris-Acctat, 10 mM Mg-Acctat, 1 mM Dithiothreitol, pH 7,9)
55,0 µl H₂O_bidest
Das Restriktionsenzym wurde von der Firma New England Biolabs (Schwalbach) be zogen. Der Ansatz wurde 150 min bei 37°C inkubiert und wie unter Beispiel 1B) be schrieben gereinigt und zum Verdau mit der Restriktionsendonuklease NotI einge setzt.E) The isolated DNA fragment was digested with the restriction endonucleases MfeI.
30.0 µl fragment from the 2nd PCR
5.0 µl MfeI [50 U]
10.0 µl buffer 4 (10 ×; 50 mM K-acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM Mg-acetate, 1 mM dithiothreitol, pH 7.9)
55.0 µl H ₂ O _bidist
The restriction enzyme was obtained from New England Biolabs (Schwalbach). The mixture was incubated at 37 ° C. for 150 min and purified as described under Example 1B) and used for digestion with the restriction endonuclease NotI.

F) Das gereinigte DNA-Fragment aus E) wurde mit der Restriktionsendonuklease NotI ver daut.
30,0 µl Fragment aus E)
5,0 µl NotI [50 U]
10,0 µl Puffer 3 (10 ×; 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol, pH 7,9)
55,0 µl H₂O_bidest
Das Restriktionsenzym wurde von der Firma New England Biolabs (Schwalbach) be zogen. Der Ansatz wurde 150 min bei 37°C inkubiert und wie unter Beispiel 1B) be schrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt. F) The purified DNA fragment from E) was digested with the restriction endonuclease NotI.
30.0 µl fragment from E)
5.0 µl NotI [50 U]
10.0 µl buffer 3 (10 ×; 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM dithiothreitol, pH 7.9)
55.0 µl H ₂ O _bidist
The restriction enzyme was obtained from New England Biolabs (Schwalbach). The mixture was incubated at 37 ° C. for 150 min and purified as described under Example 1B) and used for ligation.

G) 5 µg des Expressionsvektors pNCO-N-BS-LuSy in einem Volumen von 30 µl wurden zu nächst mit der Restriktionsendonuklease NotI analog F) verdaut und gemäß Beispiel 1B) gereinigt.G) 5 µg of the expression vector pNCO-N-BS-LuSy in a volume of 30 µl were added next digested with the restriction endonuclease NotI analogous to F) and according to Example 1B) cleaned.

H) Das Vektorfragment aus G) wurde anschließend mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut.
30,0 µl Vektor-Fragment aus G
2,5 µl EcoRI [62,5 U]
20,0 µl OPAU (10 ×; 500 mM K-Acetat, 100 mM Mg-Acetat, 100 mM Tris-Acetat pH 7,5) 47,5 µl H₂O_bidest
Der Ansatz wurde ebenfalls 150 min bei 37°C inkubiert und das entstanden DNA- Fragment mit einer Länge von 3863 bp wie unter Beispiel 1B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.H) The vector fragment from G) was then digested with the restriction endonuclease EcoRI.
30.0 µl vector fragment from G
2.5 µl EcoRI [62.5 U]
20.0 µl OPAU (10 ×; 500 mM K acetate, 100 mM Mg acetate, 100 mM Tris acetate pH 7.5) 47.5 µl H ₂ O _bidist
The mixture was also incubated at 37 ° C. for 150 min and the resulting DNA fragment with a length of 3863 bp was purified as described in Example 1B) and used for ligation.

I) Das weitere Vorgehen erfolgte gemäß Beispiel 1G) bis L).I) The further procedure was carried out according to Example 1G) to L).

J) Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde gemäß Beispiel 1M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-EC-DHFR-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 34,5 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichs stamm ohne pNCO-EC-DHFR = BS-LuSy-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die be obachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 40-50% bezogen auf alle löslichen Pro teine (geschätzt).J) The SDS polyacrylamide gel electrophoresis was carried out according to Example 1M). in the Crude extract of the strain XL1-pNCO-EC-DHFR-BS-LuSy was able to use a protein band A molecular weight of approximately 34.5 kDa can be observed in a comparison strain without pNCO-EC-DHFR = BS-LuSy expression plasmid could not be seen. The be observed band corresponded to a share of approx. 40-50% based on all soluble pro teine (estimated).

K) Die Überprüfung der Funktionalität der 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase erfolgte ge mäß Beispiel 1N) in Verbindung mit O). Im Rohextrakt konnte kein signifikanter Unter schied zu einer nicht-derivatisierten Wildtyp-Lumazinsynthase beobachtet werden.K) The functionality of the 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase was checked according to example 1N) in connection with O). No significant sub could be found in the crude extract to a non-derivatized wild-type lumazine synthase can be observed.

L) Die Reinigung erfolgte gemäß Beispiel 2S) an einer Sepharose-6B-Gelfiltrationssäule, wo bei die Konzentrierung der Proteinfraktionen bei 28000 Umin^-1 durchgeführt wurde. Nega tivkontrastierung gemäß Beispiel 1P) zeigten hohle, sphärische Partikel mit einem Außen durchmesser von ca. 20 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.L) The purification was carried out according to Example 2S) on a Sepharose 6B gel filtration column, where the concentration of the protein fractions was carried out at 28000 rpm ^-1 . Negative contrasting according to Example 1P) showed hollow, spherical particles with an outer diameter of approximately 20 nm and an inner diameter of approximately 5 nm.

M) Die Überprüfung der Quartarstruktur erfolgte gemäß Beispiel 1S). Im Vergleich zur Wild typ-Lumazinsynthase konnte ein deutlicher Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit (EC-DHFR-BS-LuSy wanderte deutlich langsamer, bildete aber auch eine diskrete Bande) beobachtet werden.M) The quaternary structure was checked in accordance with Example 1S). Compared to game Type lumazine synthase could make a significant difference in the rate of migration (EC-DHFR-BS-LuSy migrated much more slowly, but also formed a discrete band) to be watched.

Beispiel 9Example 9 Fusion des "Maltose-bindenden-Proteins" aus Escherichia coli an den N-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilisFusion of the "Maltose-binding protein" from Escherichia coli to the N-terminus of the Bacillus subtilis lumazine synthase

A) Das Gen für das "Maltose-bindene-Protein" (MBP) wurde mittels PCR aus dem Plasmid pMAL-C2 (New England Biolabs, Schwalbach) unter Verwendung der Oligonukleotide MALE-1 (5' gag gag aaa tta act atg aaa atc gaa gaa ggt aaa c 3'), welches am 3'-Ende zum 5'-Ende des MBP-Gens komplementär ist und am 5'-Ende für einen Teil einer optimierten ribosomalen Bindungsstelle kodiert, und MALE-2 (5' gca ggt cga ctc tag cgg ccg cga att ctg 3'), welches am 3'-Ende zum Gen des MBP komplementär ist und unmittelbar hinter dem letzten codierenden Basentriplett eine Erkennungssequenz für die Endonuklease NotI einführt, amplifiziert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1A), wobei ca. 10 ng Plasmid-DNA eingesetzt wurde.A) The gene for the "maltose-binding protein" (MBP) was removed from the plasmid by means of PCR pMAL-C2 (New England Biolabs, Schwalbach) using the oligonucleotides MALE-1 (5 'gag gag aaa tta act atg aaa atc gaa gaa ggt aaa c 3'), which at the 3 'end for 5'-end of the MBP gene is complementary and at the 5'-end optimized for part of one ribosomal binding site, and MALE-2 (5 'gca ggt cga ctc tag cgg ccg cga att ctg 3 '), which is complementary to the gene of the MBP at the 3' end and immediately behind the last coding base triplet a recognition sequence for the endonuclease NotI introduces, amplifies. The PCR was carried out analogously to Example 1A), with approx. 10 ng of plasmid DNA was used.

B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 1210 bp erhalten wurde.B) The PCR mixture was purified according to Example 1B), with a DNA fragment with a length of 1210 bp was obtained.

C) Die Durchführung einer zweiten PCR erfolgte analog Beispiel 1C), wobei jedoch die Oli gonukleotid-Kombination BS-MfeI (5' ata ata caa ttg att aaa gag gag aaa tta act atg 3'), welches die ribosomale Bindungsstelle vervollständigt und unmittelbar vor der ribosomalen Bindungsstelle eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease MfeI in das DNA- Fragment einführt, und MALE-2 verwendet wurde. C) A second PCR was carried out analogously to Example 1C), but with the oli gonucleotide combination BS-MfeI (5 'ata ata caa ttg att aaa gag gag aaa tta act atg 3'), which completes the ribosomal binding site and immediately before the ribosomal Binding site a recognition sequence for the restriction endonuclease MfeI in the DNA Introduces fragment, and MALE-2 was used.

D) Der PCR-Ansatz wurde wie unter Beispiel 1B) beschrieben gereinigt, wobei ein Fragment mit einer Länge von 1227 bp erhalten wurde.D) The PCR mixture was purified as described in Example 1B), with one fragment with a length of 1227 bp was obtained.

E) Das weitere Vorgehen erfolgte gemäß Beispiel 8 E) bis I).E) The further procedure was carried out according to Example 8 E) to I).

F) Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde gemäß Beispiel 1M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-EC-MBP-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 59,5 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichs stamm ohne pNCO-EC-MBP-BS-LuSy-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die be obachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 50% bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).F) The SDS polyacrylamide gel electrophoresis was carried out according to Example 1M). in the Crude extract of the strain XL1-pNCO-EC-MBP-BS-LuSy was able to use a protein band A molecular weight of approximately 59.5 kDa can be observed in a comparison strain was not seen without pNCO-EC-MBP-BS-LuSy expression plasmid. The be observed band corresponded to a share of approx. 50% based on all soluble proteins (estimated).

G) Die Überprüfung der Funktionalität der 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase erfolgte ge mäß Beispiel 1N) in Verbindung mit O). Im Rohextrakt konnte kein signifikanter Unter schied zu einer nicht-derivatisierten Wildtyp-Lumazinsynthase beobachtet werden.G) The functionality of the 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase was checked according to example 1N) in connection with O). No significant sub could be found in the crude extract to a non-derivatized wild-type lumazine synthase can be observed.

H) Die Reinigung erfolgte gemäß Beispiel 2S) an einer Sepharose-6B-Gelfiltrationssäule, wo bei die Konzentrierung der Proteinfraktionen bei 28000 Umin^-1 durchgeführt wurde. Nega tivkontrastierung gemäß Beispiel 1P) zeigten hohle, sphärische Partikel mit einem Außen durchmesser von ca. 25 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.H) The purification was carried out according to Example 2S) on a Sepharose 6B gel filtration column, where the protein fractions were concentrated at 28,000 rpm ^-1 . Negative contrasting according to Example 1P) showed hollow, spherical particles with an outer diameter of approximately 25 nm and an inner diameter of approximately 5 nm.

I) Die Überprüfung der Quartärstruktur erfolgte gemäß Beispiel 1S). Im Vergleich zur BS- LuSy und EC-DHFR-BS-LuSy konnte ein deutlicher Unterschied in der Wanderungs geschwindigkeit (EC-MBP-BS-LuSy wanderte deutlich langsamer als BS-LuSy und EC- DHFR-BS-LuSy, bildete aber auch eine diskrete Bande) beobachtet werden.I) The quaternary structure was checked in accordance with Example 1S). Compared to the BS LuSy and EC-DHFR-BS-LuSy could make a significant difference in the migration speed (EC-MBP-BS-LuSy moved significantly slower than BS-LuSy and EC- DHFR-BS-LuSy, but also formed a discrete band).

Beispiel 10Example 10 Fusion der Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli an den C-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilisFusion of the dihydrofolate reductase from Escherichia coli to the C-terminus of the Bacillus subtilis lumazine synthase

A) Das Gen für die Dihydrofolatreduktase (DHFR) wurde mittels PCR aus isolierter chromo somaler-DNA (Escherichia coli RR28) unter Verwendung der Oligonukleotide Oligo nukleotide EC-FolA-1 (5' ata gtg gcg aca atg cgg ccg ctg gtg gag gcg gaa tga tca gtc tga ttg cgg cg 3'), welches am 3'-Ende zum 5'-Ende des DHFR-Gens komplementär ist und am 5'-Ende unmittelbar vor dem Startcodon des DHFR-Gens eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Notl einführt und EC-FolA-2 (5' ttc tat gga tcc tta ccg ccg ctc cag aat c 3'), welches am 3'-Ende zum Gen der DHFR komplementär ist und unmittelbar hinter dem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Endonuklease BamHI einführt, amplifiziert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1A), wobei ca. 50 ng chromosomale DNA eingesetzt wurde.A) The gene for dihydrofolate reductase (DHFR) was isolated by PCR from isolated chromo somaler DNA (Escherichia coli RR28) using the oligonucleotides oligo nucleotides EC-FolA-1 (5 'ata gtg gcg aca atg cgg ccg ctg gtg gag gcg gaa tga tca gtc tga ttg cgg cg 3 '), which is complementary at the 3' end to the 5 'end of the DHFR gene and at 5 'end immediately before the start codon of the DHFR gene a recognition sequence for the Restriction endonuclease Notl introduced and EC-FolA-2 (5 'ttc tat gga tcc tta ccg ccg ctc cag aat c 3 '), which is complementary at the 3' end to the gene of DHFR and immediate introduces a recognition sequence for the endonuclease BamHI behind the stop codon, amplified. The PCR was carried out analogously to Example 1A), with about 50 ng chromosomal DNA was used.

B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 524 bp erhalten wurde.B) The PCR mixture was purified according to Example 1B), with a DNA fragment with a length of 524 bp was obtained.

C) Das isolierte DNA-Fragment wurde mit der Restriktionsendonukleasen BamHI verdaut.
30,0 µl Fragment aus der 2. PCR
3,0 µl BamHI[60 U]
20,0 µl OPAU (10×)
47,0 µl H₂O_bidest
Das Restriktionsenzym wurde von der Pharmacia Biotech (Freiburg) bezogen. Der Ansatz wurde 150 min bei 37°C inkubiert und wie unter Beispiel 1B) beschrieben ge reinigt und zum Verdau mit der Restriktionsendonuklease NotI eingesetzt.C) The isolated DNA fragment was digested with the restriction endonucleases BamHI.
30.0 µl fragment from the 2nd PCR
3.0 µl BamHI [60 U]
20.0 µl OPAU (10 ×)
47.0 µl H ₂ O _bidist
The restriction enzyme was obtained from Pharmacia Biotech (Freiburg). The mixture was incubated for 150 min at 37 ° C. and cleaned as described under Example 1B) and used for digestion with the restriction endonuclease NotI.

D) Das gereinigte DNA-Fragment aus C) wurde mit der Restriktionsendonuklease NotI gemäß Beispiel 8F) verdaut und wie unter Beispiel 1B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.D) The purified DNA fragment from C) was with the restriction endonuclease NotI according to Example 8F) digested and purified as described in Example 1B) and for ligation used.

E) 5 µg des Expressionsvektors pNCO-C-BS-LuSy in einem Volumen von 30 µl wurden zu nächst gemäß C) und D) verdaut, wobei ein Fragment mit einer Länge von 3880 bp ent standen ist, gemäß Beispiel 1B) gereinigt, und zur Ligation eingesetzt. E) 5 µg of the expression vector pNCO-C-BS-LuSy in a volume of 30 µl were added next digested according to C) and D), a fragment with a length of 3880 bp ent stood, cleaned according to Example 1B), and used for ligation.

J) Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde gemäß Beispiel 1M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 34,8 kDa beobachtet werden, die in einem Ver gleichsstamm ohne pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 25% bezogen auf alle löslichen Pro teine (geschätzt).J) The SDS polyacrylamide gel electrophoresis was carried out according to Example 1M). in the Crude extract of the strain XL1-pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR was able to use a protein band a molecular weight of about 34.8 kDa can be observed, which in a ver the same strain was not seen without pNCO-BS-LuSy-EC-DHFR expression plasmid. The observed band corresponded to a share of approx. 25% based on all soluble pro teine (estimated).

L) Die Überprüfung der Quartärstruktur erfolgte gemäß Beispiel 1S). Im Vergleich zur Wild typ-Lumazinsynthase konnte ein deutlicher Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit (EC-DHFR-BS-LuSy wanderte deutlich langsamer, bildete aber auch eine diskrete Bande) beobachtet werden.L) The quaternary structure was checked in accordance with Example 1S). Compared to game Type lumazine synthase could make a significant difference in the rate of migration (EC-DHFR-BS-LuSy migrated much more slowly, but also formed a discrete band) to be watched.

Kopplung eines 17 Aminosäuren langen Epitops des VP2 Oberflächenproteins eines Säugetiervirus an den N-Terminus, an den C-Terminus und an beide Termini der Lu mazinsynthase aus Bacillus subtilisCoupling of a 17 amino acid epitope of the VP2 surface protein of a Mammalian virus at the N-terminus, at the C-terminus and at both termini of the Lu magazine synthase from Bacillus subtilis

Die folgenden Beispiele beschreiben die Fusion von kurzen Peptiden an beide Termini der iko saedrischen Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis unter Erhalt der sphärischen Struktur. Durch die gleichzeitige Belegung beider Termini wird eine 120-fache Belegung der Oberfläche des Ikosaeders ermöglicht. Das 17 Aminosäuren lange Peptid zählt zu den hochkonservierten Bereichen des VP2 Ober flächenproteins von verschiedenen tierischen Virusarten, wie z. B. des "Mink enteritis Virus", des "Feline panleukopeniavirus" oder des "Canine Parvovirus".The following examples describe the fusion of short peptides to both iko terms acidic lumazine synthase from Bacillus subtilis while maintaining the spherical structure. The simultaneous assignment of both terms means that the surface is occupied 120 times of the icosahedron. The 17 amino acid long peptide is one of the highly conserved areas of the VP2 Ober surface protein of various animal virus types, such as. B. the "Mink enteritis virus", the "Feline panleukopeniavirus" or the "Canine Parvovirus".

Beispiel 11Example 11 Fusion der VP2-Domäne an den N-Terminus der LumazinsynthaseFusion of the VP2 domain to the N-terminus of lumazine synthase

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde zunächst mit den Oligo nukleotiden N-VP2-1 (5' ggt cag ccg gct gtt cgt aac gaa cgt atg aat atc ata caa gga aat tta gtt ggt ac 3'), welches an seinem 3'-Ende komplemetär zum 5'-Ende des Lumazinsynthase gens und am 3'-Ende für einen Teil der VP2-Domäne kodiert und RibH-3 (siehe Beispiel 3 A)) aus dem Plasmid pRF2 (siehe Beispiel 1A)) amplifiziert. Die Durchführung der PCR erfolgte gemäß Beispiel 1A).A) The gene for lumazine synthase from Bacillus subtilis was initially linked to the oligo nucleotides N-VP2-1 (5 'ggt cag ccg gct gtt cgt aac gaa cgt atg aat atc ata caa gga aat tta gtt ggt ac 3 '), which at its 3' end is complementary to the 5 'end of the lumazine synthase gene and at the 3 'end for a part of the VP2 domain and RibH-3 (see Example 3 A)) amplified from the plasmid pRF2 (see Example 1A)). Carrying out the PCR was carried out according to Example 1A).

B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 504 bp erhalten wurde, gereinigt und als DNA-Matrize für eine 2. PCR eingesetzt.B) The PCR approach was carried out according to Example 1B), a DNA fragment with a length of 504 bp was obtained, purified and used as a DNA template for a second PCR.

C) Die Durchführung der 2. PCR erfolgte analog Beispiel 1C), wobei jedoch die Oligonukleo tid-Kombination N-VP2-2 (5' gag gag aaa tta act atg ggg gac ggt gct gtt cag ccg gac ggt ggt cag ccg gct gtt cgt aac gaa cg 3'), welches an seinem 3'-Ende komplementär zu dem schon eingeführten Teil der VP2-Domäne ist, die VP2-Domäne vervollständigt, ein ATG- Startcodon und einen Teil einer optimierten ribosomalen Bindungsstelle unmittelbar vor der VP2-Sequenz einführt, und RibH-3 verwendet wurden.C) The 2nd PCR was carried out analogously to Example 1C), but with the oligonucleo tid combination N-VP2-2 (5 'gag gag aaa tta act atg ggg gac ggt gct gtt cag ccg gac ggt ggt cag ccg gct gtt cgt aac gaa cg 3 '), which is complementary to that at its 3' end already introduced part of the VP2 domain, the VP2 domain completes, an ATG Start codon and part of an optimized ribosomal binding site immediately before the VP2 sequence and RibH-3 were used.

D) Der PCR-Ansatz aus C) wurde analog Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 549 bp erhalten wurde, gereinigt und als DNA-Matrize für eine 3. PCR einge setzt.D) The PCR approach from C) was analogous to Example 1B), with a DNA fragment with a Length of 549 bp was obtained, purified and used as a DNA template for a 3rd PCR puts.

E) Die Durchführung der 3. PCR erfolgte analog Beispiel 1C), jedoch mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2A)) und RibH-3.E) The 3rd PCR was carried out analogously to Example 1C), but with the Oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see Example 2A)) and RibH-3.

F) Der PCR-Ansatz aus E) wurde analog Beispiel 1B) gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 567 bp erhalten. F) The PCR mixture from E) was purified analogously to Example 1B) and a DNA fragment was also included obtained a length of 567 bp.

G) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1E) bis L), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XL1-pNCO-N-VP2-BS-LuSy erhalten wurde.G) The further processing was carried out analogously to Example 1E) to L), the Escherichia coli Expression strain XL1-pNCO-N-VP2-BS-LuSy was obtained.

H) Die Überprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges wurde analog Beispiel 1M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-N- VP2-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 18,2 kDa be obachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-N-VP2-BS-LuSy-Expres sionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 10 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).H) Checking the expression rate or the size of the monomeric protein strand was carried out analogously to Example 1M). In the crude extract of strain XL1-pNCO-N- VP2-BS-LuSy could be a protein band with a molecular weight of about 18.2 kDa be observed in a comparison strain without pNCO-N-VP2-BS-LuSy-Express sionsplasmid was not seen. The observed band corresponded to approximately 10 % based on all soluble proteins (estimated).

I) Nach Überprüfung der Funktionalität gemäß Beispiel 1N) bis Q) konnte kein signifikanter Unterschied zum Wildtyp-Enzym beobachtet werden.I) After checking the functionality according to Example 1N) to Q), none was significant Difference to the wild-type enzyme can be observed.

Beispiel 12Example 12 Fusion der VP2-Domäne an den C-Terminus der LumazinsynthaseFusion of the VP2 domain to the C-terminus of lumazine synthase

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde zunächst mit den Oligo nukleotiden RibH-1 (siehe Beispiel 1A)) und C-VP2-1 (5' cca ccg tcc ggc tga aca gca ccg tca cct tcg aaa gaa cgg ttt aag ttt gcc 3'), welches an seinem 3'-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase ist und unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basen triplett der Lumazinsynthase einen Teil der VP2-Domäne einführt, aus dem Plasmid pRF2 (siehe Beispiel 1A)) amplifiziert.A) The gene for lumazine synthase from Bacillus subtilis was initially linked to the oligo nucleotides RibH-1 (see Example 1A)) and C-VP2-1 (5 'cca ccg tcc ggc tga aca gca ccg tca cct tcg aaa gaa cgg ttt aag ttt gcc 3 '), which at its 3' end is complementary to Gene for lumazine synthase is and immediately behind the last coding base triplet of lumazine synthase introduces part of the VP2 domain from the plasmid pRF2 (see Example 1A)) amplified.

B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 506 bp erhalten wurde, gereinigt und als DNA-Matrize für eine 2. PCR eingesetzt.B) The PCR approach was carried out according to Example 1B), a DNA fragment with a length of 506 bp was obtained, purified and used as a DNA template for a second PCR.

C) Die Durchführung der 2. PCR erfolgte analog Beispiel 1C), wobei jedoch die Oligonukleo tid-Kombination EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2A)) und C-VP2-2 (5' ata tat gga tcc taa cgt tcg tta cga aca gcc ggc tga cca ccg tcc ggc tga aca gca ccg tc 3'), welches die VP2- Domäne in 3'-Richtung vervollständigt, hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der VP2-Domäne ein Stopcodon in die Sequenz einführt und unmittelbar hinter diesem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI beinhaltet, verwendet wurde.C) The 2nd PCR was carried out analogously to Example 1C), but with the oligonucleo tid combination EcoRI-RBS-2 (see Example 2A)) and C-VP2-2 (5 'ata tat gga tcc taa cgt tcg tta cga aca gcc ggc tga cca ccg tcc ggc tga aca gca ccg tc 3 '), which the VP2- Domain completed in the 3 'direction, behind the last coding base triplet of the VP2 domain introduces a stop codon into the sequence and immediately after it Stop codon contains a recognition sequence for the restriction endonuclease BamHI, was used.

D) Der PCR-Ansatz aus C) wurde analog Beispiel 1B) gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 564 bp erhalten.D) The PCR mixture from C) was purified analogously to Example 1B) and a DNA fragment was also included obtained a length of 564 bp.

E) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1E) bis L), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XL1-pNCO-C-VP2-BS-LuSy erhalten wurde.E) The further processing was carried out analogously to Example 1E) to L), the Escherichia coli Expression strain XL1-pNCO-C-VP2-BS-LuSy was obtained.

F) Die Überprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges wurde analog Beispiel 1M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-C- VP2-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 18,1 kDa be obachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-C-VP2-BS-LuSy- Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 10% bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).F) Checking the expression rate or the size of the monomeric protein strand was carried out analogously to Example 1M). In the crude extract of strain XL1-pNCO-C- VP2-BS-LuSy could be a protein band with a molecular weight of about 18.1 kDa which are in a comparison strain without pNCO-C-VP2-BS-LuSy- Expression plasmid was not seen. The observed band corresponded to a share of approx. 10% based on all soluble proteins (estimated).

G) Nach Überprüfung der Funktionalität gemäß Beispiel 1N) bis Q) konnte kein signifikanter Unterschied zum Wildtyp-Enzym beobachtet werden.G) After checking the functionality according to Example 1N) to Q), no significant Difference to the wild-type enzyme can be observed.

Beispiel 13Example 13 Fusion der VP2-Domäne an den N- und an den C-Terminus der LumazinsynthaseFusion of the VP2 domain at the N- and at the C-terminus of the lumazine synthase

A) Ausgehend von dem in Beispiel 11 erhaltenen Expressionsplasmid pNCO-N-VP2-BS-LuSy, welches die VP2-Domäne an das 5'-Ende des Lumazinsynthasegen fusioniert enthält, wurde analog Beispiel 12 die VP2 Domäne an das 3'-Ende des Lumazinsynthasegens fusioniert.A) Starting from the expression plasmid pNCO-N-VP2-BS-LuSy obtained in Example 11, which contains the VP2 domain fused to the 5 'end of the lumazine synthase gene analogously to Example 12, the VP2 domain fused to the 3 'end of the lumazine synthase gene.

B) Die Überprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges wurde analog Beispiel 1M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-N/C- VP2-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 20 kDa be obachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-N/C-VP2-BS-LuSy-Expres sionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 10 % bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).B) Checking the expression rate or the size of the monomeric protein strand was carried out analogously to Example 1M). In the crude extract of the strain XL1-pNCO-N / C- VP2-BS-LuSy could be a protein band with a molecular weight of about 20 kDa are observed in a comparison strain without pNCO-N / C-VP2-BS-LuSy-Express sionsplasmid was not seen. The observed band corresponded to approximately 10 % based on all soluble proteins (estimated).

C) Nach Überprüfung der Funktionalität gemäß Beispiel 1N) bis Q) konnte kein signifikanter Unterschied zum Wildtyp-Enzym beobachtet werden.C) After checking the functionality according to Example 1N) to Q), no significant Difference to the wild-type enzyme can be observed.

Beispiel 14Example 14 Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, an den C-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilisCoupling of an artificial 13 amino acid long, in vivo biotinylatable peptide, to the C-terminus of lumazine synthase from Bacillus subtilis

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde unter Verwendung der Poly merasekettenreaktion und der synthetischen Oligonukleotide EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2 A)) und C-Biotag-1 (5' cat agc ttc gaa gat gcc gcc gag tgc ggc cgc ttc gaa aga acg gtt taa gtt tgc cat ttc 3'), welches an seinem 3'-Ende komplementär zum Gen für die Lumazin synthase ist und unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazin synthase, DNA für einen Linker, bestehend aus 3 Alaninresten und einen Teil der DNA kodierend für das biotinylierfähige Peptid einführt, aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (siehe Beispiel 1) amplifiziert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1A).A) The gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was determined using the poly merase chain reaction and the synthetic oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see Example 2 A)) and C-Biotag-1 (5 'cat agc ttc gaa gat gcc gcc gag tgc ggc cgc ttc gaa aga acg gtt taa gtt tgc cat ttc 3 '), which at its 3' end is complementary to the gene for the lumazine synthase is and immediately behind the last coding base triplet the lumazine synthase, DNA for a linker, consisting of 3 alanine residues and part of the DNA coding for the biotinylatable peptide from the plasmid pNCO-BS-LuSy (see Example 1) amplified. The PCR was carried out analogously to Example 1A).

B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 528 bp erhalten wurde, gereinigt und als DNA-Matrize für eine 2. PCR eingesetzt.B) The PCR approach was carried out according to Example 1B), a DNA fragment with a length of 528 bp was obtained, purified and used as a DNA template for a second PCR.

C) Die Durchführung der 2. PCR erfolgte analog Beispiel 1C), wobei jedoch die Oligonukleo tid-Kombination EcoRI-RBS-2 und C-Biotag-2 (5' tat tat gga tcc tta gcg cca ctc cat ctt cat agc ttc gaa gat gcc gcc gag tgc ggc 3'), welches die biotinylierfähige Domäne in 3'-. Richtung vervollständigt, unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett dieser Domäne ein Stopcodon in die Sequenz einführt und unmittelbar hinter diesem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI beinhaltet, verwendet wurde.C) The 2nd PCR was carried out analogously to Example 1C), but with the oligonucleo tid combination EcoRI-RBS-2 and C-Biotag-2 (5 'tat tat gga tcc tta gcg cca ctc cat ctt cat agc ttc gaa gat gcc gcc gag tgc ggc 3 '), which is the biotinylatable domain in 3'-. Direction completed, immediately behind the last coding base triplet Domain introduces a stop codon into the sequence and immediately after this stop codon contains a recognition sequence for the restriction endonuclease BamHI has been.

D) Der PCR-Ansatz aus C) wurde analog Beispiel 1B) gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 558 bp erhalten.D) The PCR mixture from C) was purified analogously to Example 1B) and a DNA fragment was also included obtained a length of 558 bp.

E) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1E) bis L), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XL1-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy erhalten wurde.E) The further processing was carried out analogously to Example 1E) to L), the Escherichia coli Expression strain XL1-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy was obtained.

F) Bei der Überprüfung der Funktionalität der Lumazinsynthase gemäß Beispiel 1N) konnte nur eine enzymatische Aktivität, die der Aktivität des Escherichia coli Stammes XL1 ent sprach, ermittelt werden.F) When checking the functionality of the lumazine synthase according to Example 1N) could only an enzymatic activity that corresponds to the activity of the Escherichia coli strain XL1 spoke, be determined.

G) Die Überprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe der löslichen Proteine wurde analog Beispiel 1M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy konnte keine signifikante Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 18,5 kDa be obachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-C-Biotag-BS-LuSy-Expres sionsplasmid nicht zu sehen war.G) The check of the expression rate or the size of the soluble proteins was analogous Example 1M). In the crude extract of the XL1-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy strain could not be a significant protein band with a molecular weight of about 18.5 kDa are observed in a comparison strain without pNCO-C-Biotag-BS-LuSy-Express sionsplasmid was not seen.

H) Zur Herstellung eines Gesamtproteinextraktes wurden die Zellen analog Beispiel 1K) kul tiviert. 1/12 der gewonnenen Zellmasse wurde mit 300 µl Proteinauftragspuffer (siehe Bei spiel 1M)) suspendiert und 15 min auf siedendem Wasserbad gekocht. Nach dem Abkühlen wurden die verbliebenen unlöslichen Bestandteile der Proben in einer Eppendorfzentrifuge pelletiert (15000 Umin^-1, 5 min. 4°C) und 8 µl des klaren Überstandes auf das Sammelgel aufgetragen. Das weitere Vorgehen erfolgte analog Beispiel 1M). Es zeigte sich in Verbin dung mit G), daß der Stamm XL1-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy rekombinantes Protein in Form von unlöslichen Einschlußkörpern in einer Menge von ca. 15% bezogen auf alle zellulären Proteine (lösliche und unlösliche Proteine, abgeschätzt vom SDS-PAGE) liefert.H) To produce a total protein extract, the cells were cultivated as in Example 1K). 1/12 of the cell mass obtained was suspended with 300 μl protein application buffer (see example 1M)) and boiled in a boiling water bath for 15 min. After cooling the remaining insolubles of the samples were in an Eppendorf centrifuge pelleted (15000 rpm ^-1, 5 min. 4 ° C) and 8 ul of the clear supernatant to the stacking gel applied. The further procedure was carried out analogously to Example 1M). It was shown in connection with G) that the strain XL1-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy recombinant protein in the form of insoluble inclusion bodies in an amount of approx. 15% based on all cellular proteins (soluble and insoluble proteins, estimated by SDS-PAGE).

I) Zum Nachweis des Lumazinsynthaseanteils im artefiziellen Lumazinsynthase-Fusionsprotein wurde eine Western-Blot Analyse analog Beispiel 1Q), wobei jedoch zusätzlich zur lösli chen Proteinfraktion auch die Gesamtproteinfraktion analysiert wurde, durchgeführt. Nach Entwicklung der Membran konnte rekombinantes Lumazinsynthase-Fusionsprotein nur in der Gesamtproteinfraktion, jedoch nur zu einem vernachlässigbaren Anteil in der löslichen Proteinfraktion nachgewiesen werden.I) For the detection of the lumazine synthase content in the artificial lumazine synthase fusion protein was a Western blot analysis analogous to Example 1Q), but in addition to the sol Chen protein fraction, the total protein fraction was also carried out. To Development of the membrane was only possible in recombinant lumazine synthase fusion protein of the total protein fraction, but only to a negligible extent in the soluble one Protein fraction can be detected.

J) Zum Nachweis der Biotinylierung wurden sowohl die lösliche Proteinfraktion, als auch die Gesamtproteinfraktion auf eine Membran übertragen. Ausgehend von einem denaturieren den SDS-Polyacrylamidgel (16%) erfolgte die Übertragung der denaturierten Proteine über einen Zeitraum von 2 Stunden bei einer konstanten Stromstärke von 40 mA. Nach erfolgter Transformation der Proteine auf die Membrane, wurde diese kurz in Antikörper-Wasch puffer-A (siehe Beispiel 1Q)) gewaschen und anschließend in Antikörper-Waschpuffer-B 1 Stunde inkubiert. Danach wurde die Membran übernacht mit 20 µl Streptavidin gekoppelt an "alkalische Phosphatase" (Promega, Madison, Wisconsin, USA) in einem Gesamtvolumen von 15 ml Antikörper-Waschpuffer-C geschwenkt. Nach der Inkubation wurde die Mem bran 3 × mit je 5 ml Antikörper-Waschpuffer-A gewaschen. Nach erfolgtem Waschen erfolgte die Detektion des Biotin-gebundenen Streptavidins via Zugabe der Substrate für die Alkalische Phosphatase. 50 µl BCIP-Stammlösung (25 mg 5-Brom-4-Chlor-indol-3-yl phosphat in 500 µl Dimethylformamid lösen und lichtgeschützt bei 4°C aufbewahren) und 100 µl NBT-Stammlösung (50 mg Nitroblautetrazoliumchlorid in 700 µl Dimethylformamid und 300 µl Wasser lösen und lichtgeschützt bei 4°C aufbewahren) werden in 15 ml Färbepuffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, pH 9,5) verdünnt. Nach Entwicklung der Membran in dieser Lösung konnte im Gesamtproteinextrakt rekombinantes, biotinyliertes Protein bei einem Molekulargewicht von ca. 18,5 kDa in Form einer blauen Bande, detektiert werden. Gesamtprotein aus dem Escherichia coli Stamm XL1 ohne das Plasmid pNCO-C-Biotag-BS-LuSy wies keine diesbezügliche Färbung auf. Nach erfolgter Anfärbung wurde die Membran in Wasser gewaschen und 5 min in einem Stop-Puffer (20 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA-Na₂, pH 8,0) inkubiert.J) To detect the biotinylation, both the soluble protein fraction and the total protein fraction were transferred to a membrane. Starting from a denatured SDS polyacrylamide gel (16%), the denatured proteins were transferred over a period of 2 hours at a constant current of 40 mA. After the proteins had been transformed onto the membrane, the membrane was briefly washed in antibody wash buffer A (see example 1Q) and then incubated in antibody wash buffer B for 1 hour. The membrane was then swiveled overnight with 20 μl streptavidin coupled to “alkaline phosphatase” (Promega, Madison, Wisconsin, USA) in a total volume of 15 ml of antibody wash buffer-C. After the incubation, the membrane was washed 3 × with 5 ml of antibody wash buffer A each. After washing, the biotin-bound streptavidin was detected by adding the substrates for the alkaline phosphatase. 50 µl BCIP stock solution (25 mg 5-bromo-4-chloroindol-3-yl phosphate in 500 µl dimethylformamide and store protected from light at 4 ° C) and 100 µl NBT stock solution (50 mg nitro blue tetrazolium chloride in 700 µl dimethylformamide and Dissolve 300 µl water and store protected from light at 4 ° C) in 15 ml staining buffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl ₂ , pH 9.5). After development of the membrane in this solution, recombinant, biotinylated protein with a molecular weight of approx. 18.5 kDa in the form of a blue band could be detected in the total protein extract. Total protein from the Escherichia coli strain XL1 without the plasmid pNCO-C-Biotag-BS-LuSy was not stained in this regard. After staining, the membrane was washed in water and incubated for 5 min in a stop buffer (20 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA-Na ₂ , pH 8.0).

K) Zur Renaturierung des unlöslichen biotinylierten Lumazinsynthase-Fusionsproteins wurden zunächst die löslichen Proteinfraktionen gemäß Beispiel 1L) abgetrennt.K) For the renaturation of the insoluble biotinylated lumazine synthase fusion protein the soluble protein fractions according to Example 1L) are first separated off.

L) Der unlösliche Rückstand aus K) wurde in 100 mM K-Phosphatpuffer, pH 7,0, der 6 M Harnstoff, 6 mM 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)2,4-(1H,3H)-pyrimidindion und 100 mM Di thiothreitol (DTE) enthielt, während 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur solubi lisiert. Die entstandene Proteinlösung wurde anschließend zweimal gegen das 10-fache Vo lumen 100 mM K-Phosphatpuffer, pH 7,0, der 1 mM 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)2,4- (1H,3H)-pyrimidindion und 1 mM DTE enthielt, jeweils 12 Stunden bei 4°C dialysiert. Nach Zentrifugation (Sorvall SS34-Rotor; 15000 Umin^-1; 20 min. 4°C) wurde das im Über stand enthaltene Protein unter Verwendung einer Ultrazentrifuge konzentriert (Beckman TFT 70-Rotor; 32000 Umin^-1; 16 h; 4°C). Die Analytik des renaturierten Proteins erfolgte gemäß den Ausführungen J), Beispiel 1S) und Beispiel 1P). Mit der oben beschriebenen Maßnahme konnte renaturiertes, ikosaedrisches, aus 60 Untereinheiten bestehendes Fu sionsprotein erhalten werden.L) The insoluble residue from K) was dissolved in 100 mM K-phosphate buffer, pH 7.0, the 6 M urea, 6 mM 5-nitro-6- (D-ribitylamino) 2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione and contained 100 mM di thiothreitol (DTE), solubilized for 24 hours with stirring at room temperature. The resulting protein solution was then twice against 10 times the volume of 100 mM K-phosphate buffer, pH 7.0, the 1 mM 5-nitro-6- (D-ribitylamino) 2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione and Contained 1 mM DTE, dialyzed at 4 ° C for 12 hours each. After centrifugation (Sorvall SS34 rotor; 15,000 rpm ^-1 ; 20 min. 4 ° C), the protein contained in the supernatant was concentrated using an ultracentrifuge (Beckman TFT 70 rotor; 32,000 rpm ^-1 ; 16 h; 4 ° C) ). The renatured protein was analyzed in accordance with statements J), Example 1S) and Example 1P). With the measure described above, renatured icosahedral fusion protein consisting of 60 subunits could be obtained.

M) Der Nachweis der Zugänglichkeit der Biotinmoleküle im nativen Protein erfolgte unter Verwendung von Mikrotiterplatten und eines Mehrkanalphotometers (ELISA-reader). 100 µl einer Avidin-Stammlösung (Sigma, München) mit der Konzentration 1 mg/ml wurden zunächst in 20 ml Beschichtungspuffer (20 mM Na-Carbonat, pH 9,6) verdünnt (Standardlösung). Jeweils 100 µl der Standardlösung wurden in die Probentaschen der Mi krotiterplatte pipettiert, die Probentaschen anschließend mit einer Klebefolie verschlossen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde anschließend abgegossen und jeder Napf 3 mal mit je 200 µl PBS (20 mM Na-Phosphat, 130 mM NaCl, pH 7,2) gewaschen. Die nicht mit Avidin bedeckte Kunststoffoberfläche der Probentasche wurde mit je 350 µl Abdecklösung (3% Milchpulver in PBS) für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Abdecklösung wurde anschließend abgegossen und die Mikrotiterplatte kurz ausgeklopft. In die 1. von 8 Probentaschen wurde anschließend 100 µl der renaturierten Probenlösung aus L) (ca. 1 mg/ml) gegeben. In die Probentaschen 2-8 wurden jeweils 50 µl Verdünnungslösung (1% Milchpulver in PBS) gegeben. Die 8. Probentasche wurde freigelassen. 50 µl aus Proben tasche 1 wurden mit den 50 µl Verdünnungslösung in Probentasche 2 verdünnt (10 × auf und ab pipettieren). 50 µl aus Probentasche 2 wurden anschließend mit 50 µl Verdünnungs lösung aus Probentasche 3 verdünnt, etc.. Zum Schluß wurden 50 µl aus Probentasche 7 verworfen, so daß nun alle Probentaschen 50 µl Probenlösung in verschiedenen Konzentra tionen (log 2 Verdünnung) enthielten. Die Proben wurden mit Klebefolie abgedeckt und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Probenlösungen wurden anschließend abgegossen, die Mi krotiterplatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 × mit jeweils 350 µl Waschlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurden 15 µl Streptavidin-Alkalische Phosphatase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) in 20 ml Verdünnungslösung verdünnt (Detektionslösung). Jeweils 100 µl Detektionslösung wurden in die Probentaschen 1-8 pipettiert und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Detektionslösungen wurden anschließend abgegossen, die Mikrotiterplatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 × mit jeweils 350 µl Waschlösung (PBS) gewaschen. Die Entwicklung der Mikrotiterplatte erfolgte unter Zugabe von 150 µl Substratlösung (10 mg p-Nitrophenylphosphat in 10 ml Färbepuffer (siehe J)) für die Alkalische Phosphatase und Messung der Extinktion bei 405 nm. Da es sich bei der Lumazinsynthase um ein sphärisches Molekül handelt, liegen die Biotinmoleküle statistisch auf der Oberfläche verteilt vor. Befinden sich zuviele biotinylierte Lumazinsynthasemoleküle auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte (über Avidin an die Mikrotiterplatte gebunden), so sind die seitlichen Biotinmoleküle für eine Bindung an Streptavidin nicht mehr zugänglich. Erst nach Verringerung der Konzentration der biotinylierten Lumazinsynthasemoleküle werden die seitlichen Biotinmolekule für eine Bindung an Streptavidin zugänglich, d. h. die Signalstärke steigt an.M) The accessibility of the biotin molecules in the native protein was verified under Use of microtiter plates and a multi-channel photometer (ELISA reader). 100 µl of an avidin stock solution (Sigma, Munich) with a concentration of 1 mg / ml first diluted in 20 ml of coating buffer (20 mM Na carbonate, pH 9.6) (Standard solution). 100 µl of the standard solution were placed in the sample bags of the Mi Pipette the titer plate, then seal the sample bags with an adhesive film and incubated overnight at 37 ° C. The solution was then poured off and everyone Well 3 times with 200 ul PBS (20 mM Na phosphate, 130 mM NaCl, pH 7.2) washed. The plastic surface of the sample bag not covered with avidin was washed with 350 µl each Cover solution (3% milk powder in PBS) incubated for 60 min at 37 ° C. The covering solution was then poured off and the microtiter plate was tapped briefly. In the 1st of 8 100 μl of the renatured sample solution from L) (approx. 1 mg / ml). 50 µl dilution solution (1% Milk powder in PBS). The 8th sample bag was released. 50 µl from samples bag 1 was diluted with the 50 µl dilution solution in sample bag 2 (10 × and pipette from). 50 µl from sample bag 2 were then diluted with 50 µl diluted solution from sample bag 3, etc. Finally, 50 µl from sample bag 7 discarded so that all sample bags now contain 50 µl sample solution in different concentrations ions (log 2 dilution). The samples were covered with adhesive film and 2 Incubated at 37 ° C for hours. The sample solutions were then poured off, the Mi Tap the titer plate briefly and the sample bags 3 × with 350 µl washing solution each (PBS) washed. Then 15 µl streptavidin-alkaline phosphatase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) diluted in 20 ml diluent (Detection solution). 100 µl detection solution was placed in the sample pockets 1-8 pipetted and incubated for 1 hour at 37 ° C. The detection solutions were then poured off, the microtiter plate tapped briefly and the sample bags 3 × with each 350 µl wash solution (PBS) washed. The microtiter plate was developed under Add 150 µl substrate solution (10 mg p-nitrophenyl phosphate in 10 ml staining buffer (see J)) for the alkaline phosphatase and measurement of the absorbance at 405 nm. Since it if the lumazine synthase is a spherical molecule, the biotin molecules are located statistically distributed on the surface. There are too many biotinylated Lumazine synthase molecules on the surface of the microtiter plate (via avidin to the Bound microtiter plate), so the side biotin molecules for binding Streptavidin no longer accessible. Only after reducing the concentration of the biotinylated lumazine synthase molecules become the side biotin molecules for one Binding to streptavidin accessible, d. H. the signal strength increases.

Markierung des C-terminalen Endes der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis mit einer reaktiven AminosäureLabeling of the C-terminal end of the lumazine synthase from Bacillus subtilis with a reactive amino acid

Die folgenden Beispiele beschreiben die Einführung von reaktiven Aminosäuren (Lysin und Cystein) am C-Terminus der Lumazinsynthase. Auf der Oberfläche der Lumazinsynthase sind zwar basische Aminosäuren, die sich eventuell für eine kovalente Kopplung von chemischen Molekülen eignen vorhanden, ihre Zugänglichkeit ist jedoch durch benachbarte Aminosäuren reste eingeschränkt. Auf der Oberfläche der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis befinden sich keine freien Cysteinreste die sich, aufgrund ihrer Thiolgruppe für eine kovalente Kopplung von chemischen Molekülen eignen könnten.The following examples describe the introduction of reactive amino acids (lysine and Cysteine) at the C-terminus of lumazine synthase. Are on the surface of the lumazine synthase basic amino acids, which may be used for covalent coupling of chemical Molecules are suitable, but their accessibility is due to neighboring amino acids Rests restricted. Located on the surface of the lumazine synthase from Bacillus subtilis there are no free cysteine residues due to their thiol group for covalent coupling of chemical molecules.

Zur Verbesserung der Zugänglichkeit, bzw. zur Minimierung der sterischen Hinderung wurde ein Linker (Tentakel-Linker) zwischen dem C-Terminus der Lumazinsynthase und der betref fenden Aminosäure eingeführt, so daß die reaktiven Aminosäuren für nahezu jede chemische Kopplung mit Fremdmolekülen zugänglich werden. To improve accessibility or to minimize steric hindrance a linker (tentacle linker) between the C-terminus of lumazine synthase and the subject fenden amino acid introduced, so that the reactive amino acids for almost any chemical Coupling with foreign molecules become accessible.

Beispiel 15Example 15 Verlängerung des C-Terminus und Einführung einer terminalen basischen Aminosäure (Lysin) als Grundlage zur chemischen Kopplung von ZielmolekülenExtension of the C-terminus and introduction of a terminal basic amino acid (Lysine) as the basis for the chemical coupling of target molecules

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2A)) und. C-Lys165 (5' tat tat gga tcc tta ttt acc aga gcc acc acc aga acc acc gcc acc ttc gaa aga acg gtt taa gtt tgc cat ttc 3'), welches an seinem 3'-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase ist und unmittelbar hinter dem letzten ko dierenden Basentriplett der Lumazinsynthase ein Gen, kodierend für das Peptid (Gly)₄Ser- (Gly)₃Ser-Gly-Lys, einführt, aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy amplifiziert. Unmittelbar hinter dem Codon für Lysin (aaa) an der Aminosäurenposition 165 wird mit dem Oligonukleotid C-Lys165 ein Stopcodon und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI in die DNA-Sequenz eingeführt. Die PCR wurde analog Beispiel 1A) durchgeführt.A) The gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was with the oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see Example 2A)) and. C-Lys165 (5 'tat tat gga tcc tta ttt acc aga gcc acc acc aga acc acc gcc acc ttc gaa aga acg gtt taa gtt tgc cat ttc 3'), which at its 3 'end is complementary to the gene for lumazine synthase and immediately after the last coding base triplet of the lumazine synthase, a gene coding for the peptide (Gly) ₄ Ser- (Gly) ₃ Ser-Gly-Lys, is inserted from the plasmid pNCO-BS-LuSy. Immediately behind the codon for lysine (aaa) at amino acid position 165, the oligonucleotide C-Lys165 is used to introduce a stop codon and a recognition sequence for the restriction endonuclease BamHI into the DNA sequence. The PCR was carried out analogously to Example 1A).

B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 543 bp erhalten wurde.B) The PCR mixture was purified according to Example 1B), with a DNA fragment with a length of 543 bp was obtained.

C) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1B), E) bis L). Es wird das Plasmid pNCO-Lys165-BS LuSy erhalten.C) The further procedure was carried out analogously to Example 1B), E) to L). It becomes the plasmid pNCO-Lys165-BS LuSy obtained.

D) Die Überprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges er folgte analog Beispiel 1M). Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-Lys165-BS-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 17 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-Lys165-BS-LuSy-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 10% bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).D) Checking the expression rate or the size of the monomeric protein strand followed analogously to Example 1M). In the crude extract of the strain XL1-pNCO-Lys165-BS-LuSy a protein band with a molecular weight of approx. 17 kDa could be observed, that in a control strain without pNCO-Lys165-BS-LuSy expression plasmid did not increase was see. The observed band corresponded to approximately 10% of all soluble proteins (estimated).

E) Die weitere Analytik wurde gemäß Beispiel 1N) bis Q) durchgeführt, wobei keine signifi kanten Unterschiede zum Wildtyp-Enzym (BS-LuSy) zu beobachten waren.E) The further analysis was carried out according to Example 1N) to Q), with no signifi edge differences to the wild-type enzyme (BS-LuSy) were observed.

Beispiel 16Example 16 Verlängerung und Einführung eines terminalen Cysteinrestes an den C-Terminus der Lumazinsynthase als Grundlage zur chemischen Kopplung von ZielmolekülenExtension and introduction of a terminal cysteine residue at the C-terminus of the Lumazine synthase as the basis for the chemical coupling of target molecules

A) Die Konstruktion erfolgte analog Beispiel 15A) bis C), jedoch wurde anstelle des Oligo nukleotids C-Lys165 das Oligonukleotid C-Cys167 (5' tat tat gga tcc tta gca gcc acc acc aga gcc acc acc aga acc acc gcc acc ttc gaa aga acg gtt taa gtt tgc cat ttc 3'), welches an seinem 3'-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase ist und unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase ein Gen, kodierend für das Peptid (Gly)₄Ser-(Gly)₃Ser-(Gly)3-Cys, einführt, verwendet. Unmittelbar hinter dem Codon für Cystein 167 (tgc) wird mit dem Oligonukleotid C-Cys 167 ein Stopcodon und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI in die DNA-Sequenz eingeführt. Es wurde ein DNA-Fragment mit einer Länge von 549 bp erhalten. Es wurde der Escherichia coli Stamm XL1-pNCO-Cys167-BS-LuSy erhalten.A) The construction was carried out analogously to Example 15A) to C), but instead of the oligonucleotide C-Lys165, the oligonucleotide C-Cys167 (5 'tat tat gga tcc tta gca gcc acc acc aga gcc acc acc aga acc acc gcc acc ttc gaa aga acg gtt taa gtt tgc cat ttc 3 '), which at its 3' end is complementary to the gene for lumazine synthase and immediately after the last coding base triplet of lumazine synthase is a gene coding for the peptide (Gly) ₄ Ser- (Gly ) ₃ Ser- (Gly) 3-Cys, introduced. Immediately after the codon for cysteine 167 (tgc), the oligonucleotide C-Cys 167 introduces a stop codon and a recognition sequence for the restriction endonuclease BamHI into the DNA sequence. A DNA fragment with a length of 549 bp was obtained. The Escherichia coli strain XL1-pNCO-Cys167-BS-LuSy was obtained.

B) Bei der Überprüfung der Molekülmasse des monomeren Proteinstranges (Cys167-BS- LuSy) analog Beispiel 15D) konnte eine Bande bei ca. 17,1 kDa beobachtet werden. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 5% bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).B) When checking the molecular mass of the monomeric protein strand (Cys167-BS- LuSy) analogous to Example 15D) a band was observed at approximately 17.1 kDa. The observed band corresponded to a share of approx. 5% based on all soluble proteins (estimated).

C) Die weitere Analytik wurde gemäß Beispiel 1N) bis Q) durchgeführt, wobei keine signifi kanten Unterschiede zum Wildtyp-Enzym (BS-LuSy) zu beobachten waren. C) The further analysis was carried out according to Example 1N) to Q), with no signifi edge differences to the wild-type enzyme (BS-LuSy) were observed.

Beispiel 17Example 17 Kopplung eines 12 Aminosäuren langen Peptids mit der Erkennungssequenz für einen monoklonalen Antikörper (Anti-FLAG-M2/IgG1/Maus) an den N-Terminus der Luma zinsynthase aus Bacillus subtilisCoupling of a 12 amino acid long peptide with the recognition sequence for one monoclonal antibody (anti-FLAG-M2 / IgG1 / mouse) to the N-terminus of the luma interest synthase from Bacillus subtilis

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde mit den Oligonukleotiden FLAG-BS-LuSy-1 (5' ata ata ata aag ctt atg aat atc ata caa gga aat tta g 3'), welches an seinem 3'-Ende komplemetär zum 5'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis und am 5'-Ende eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease HindIII einführt und Flag-BS-LuSy-2 (5' tat tat gaa ttc tta ttc gaa aga acg gtt taa g 3'), welches an seinem 3'-Ende komplemetär zum 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis und am 5'-Ende eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease EcoRI einführt, aus dem Plasmid pRF2 (vgl. Beispiel 1A)) amplifiziert.A) The gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis was with the oligonucleotides FLAG-BS-LuSy-1 (5 'ata ata ata aag ctt atg aat atc ata caa gga aat tta g 3'), which on its 3 'end is complementary to the 5' end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis and introduces a restriction endonuclease HindIII recognition sequence at the 5 'end and Flag-BS-LuSy-2 (5 'did tat gaa ttc tta ttc gaa aga acg gtt taa g 3'), which on its 3 'end complementary to the 3' end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis and am 5'-end introduces a recognition sequence for the restriction endonuclease EcoRI from which Plasmid pRF2 (see Example 1A)) amplified.

B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 492 bp erhalten wurde, gereinigt.B) The PCR approach was carried out according to Example 1B), a DNA fragment with a length of 492 bp was purified.

C) Das isolierte DNA-Fragment und der Vektor pFLAG-MAC (Eastman Kodak Company, New Haven) wurden zunächst mit der Restriktionsendonuklease HindIII verdaut.
30,0 µl pFLAG-MAC [5 µg] bzw. 30 µl isoliertes DNA-Fragment
3,0 µl HindIII [60 U]
10,0 µl OPAU (10 ×)
57,0 µl H₂O_bidest
Der Ansatz wurde ebenfalls 180 min bei 37°C inkubiert und das entstanden DNA- Fragment wie unter Beispiel 1B) beschrieben gereinigt und zum Verdau mit der Re striktionsendonuklease EcoRI eingesetzt.C) The isolated DNA fragment and the vector pFLAG-MAC (Eastman Kodak Company, New Haven) were first digested with the restriction endonuclease HindIII.
30.0 µl pFLAG-MAC [5 µg] or 30 µl isolated DNA fragment
3.0 µl HindIII [60 U]
10.0 µl OPAU (10 ×)
57.0 µl H ₂ O _bidist
The mixture was also incubated at 37 ° C. for 180 min and the resulting DNA fragment was purified as described in Example 1B) and used for digestion with the restriction endonuclease EcoRI.

D) Das isolierte DNA-Fragment und der Vektor pFLAG-MAC aus C) wurden anschließend mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut.
30,0 µl DNA-Fragmente aus C)
3,0 µl EcoRI [60 U]
24,0 µl OPAU (10 ×)
63,0 µl H₂O_bidest
Der Ansatz wurde 180 min bei 37°C inkubiert und wie unter B) beschrieben gereinigt und zur Ligation eingesetzt.D) The isolated DNA fragment and the vector pFLAG-MAC from C) were then digested with the restriction endonuclease EcoRI.
30.0 µl DNA fragments from C)
3.0 µl EcoRI [60 U]
24.0 µl OPAU (10 ×)
63.0 µl H ₂ O _bidist
The mixture was incubated at 37 ° C. for 180 min and purified as described under B) and used for ligation.

E) Die weitere Vorgehensweise erfolgte gemäß Beispiel 1G) bis L).E) The further procedure was carried out according to Example 1G) to L).

F) Nach Durchführung einer denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß Beispiel 1 M) konnte im Rohextrakt eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 17,7 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pFLAG-MAC-BS-LuSy- Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 10% bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).F) After performing a denaturing polyacrylamide gel electrophoresis according to the example 1 M) a protein band with a molecular weight of approx. 17.7 could be found in the crude extract kDa observed in a control strain without pFLAG-MAC-BS-LuSy- Expression plasmid was not seen. The observed band corresponded to a share of approx. 10% based on all soluble proteins (estimated).

G) Die Überprüfung der Funktionalität erfolgte analog Beispiel 1N) bis P), wobei kein signifi kanter Unterschied zum Wildtypenzym beobachtet werden konnte.G) The functionality was checked analogously to Example 1N) to P), with no signifi edge difference to the wild type enzyme could be observed.

H) Zur immunologischen Überprüfung der Funktionalität des FLAG-Peptides wurde eine Wes tern-Blot-Analyse gemäß Beispiel 1Q), jedoch unter Verwendung des monoklonalen Anti körpers "Anti-FLAG®MZ" (Eastman Kodak Company, New Haven) als 1. Antikörper (10 µl Anti-FLAG®M2 in 5 ml TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) und Anti-Maus-IgG- HRP-Konjugat als 2. Antikörper (10 µl Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat in 5 ml TBS; vgl. Beispiel 18 H)). Nach Entwicklung der Membran konnte das Fusionsprotein bei ca. 17,7 kDa detektiert werden.H) For the immunological check of the functionality of the FLAG peptide, a Wes tern blot analysis according to Example 1Q), but using the monoclonal anti body "Anti-FLAG®MZ" (Eastman Kodak Company, New Haven) as 1st antibody (10 µl Anti-FLAG®M2 in 5 ml TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4) and anti-mouse IgG HRP conjugate as 2nd antibody (10 µl anti-mouse IgG-HRP conjugate in 5 ml TBS; cf. Example 18 H)). After development of the membrane, the fusion protein was approximately 17.7 kDa can be detected.

I) Die Reinigung erfolgte analog Beispiel 2S), es wurde jedoch kein Lysozym zum Auf schlußpuffer zugesetzt. I) The cleaning was carried out analogously to Example 2S), but no lysozyme was used final buffer added.

J) Negativ-Kontrastierung am Elektronenmikroskop gemäß Beispiel 1P) zeigten hohle, sphä rische Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.J) Negative contrasting on the electron microscope according to Example 1P) showed hollow, spherical particles with an outer diameter of approx. 15 nm and an inner diameter of approx. 5 nm.

K) Die Überprüfung der Quartärstruktur wurde analog Beispiel 1S) durchgeführt. Das ge reinigte Lumazinsynthase-Fusionsprotein war als diskrete Bande auf dem nativen Gel zu se hen. Es konnte eine verringerte Mobilität im Vergleich zu einer Wildtyp-Lumazinsynthase, die auf den vergößerten Durchmesser zurückzuführen ist, beobachtet werden.K) The quaternary structure was checked as in Example 1S). The ge purified lumazine synthase fusion protein was seen as a discrete band on the native gel hen. There was reduced mobility compared to a wild-type lumazine synthase, which is due to the enlarged diameter can be observed.

Beispiel 18Example 18 Kopplung eines 6 Aminosäuren langen Peptids (6 × Histidin) zur Bindung an Ni-Chelat- Affinitätsmatrix, zur Bindung eines monoklonalen Antikörpers (Penta-His) bzw. zur Bindung von Ni-NTA-HRP-Konjugat an den C-Terminus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilisCoupling of a 6 amino acid long peptide (6 × histidine) for binding to Ni chelate Affinity matrix, for binding a monoclonal antibody (Penta-His) or for Binding of Ni-NTA-HRP conjugate to the C-terminus of lumazine synthase Bacillus subtilis

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus snbtilis wurde zunächst mit den ligo nukleotiden RibH-1 (vgl. Beispiel 1A)) und RibH-His6-C-1 (5' gtg gtg atg gtg atg ttc gaa aga acg gtt taa g 3'), welches an seinem 3'-Ende komplemetär zum 3'-Ende des Lumazin synthasegens aus Bacillus subtilis und am 5'-Ende für einen Teil des Affinitätspeptids ko diert, aus dem Plasmid pRF2 (vgl. Beispiel 1A)) amplifiziert.A) The gene for the lumazine synthase from Bacillus snbtilis was first identified with the ligo nucleotides RibH-1 (see Example 1A)) and RibH-His6-C-1 (5 'gtg gtg atg gtg atg ttc gaa aga acg gtt taa g 3 '), which at its 3'-end is complementary to the 3'-end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis and at the 5 'end for part of the affinity peptide ko diert, amplified from the plasmid pRF2 (see. Example 1A)).

B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 492 bp erhalten wurde, gereinigt und als Matrize für eine 2. PCR gemäß Beispiel 1C), jedoch mit der Oligonukleotidkombination EcoRI-RBS-2 (vgl. Beispiel 2A)) und RibH- His6-C-2 (5' tat tat gga tcc tta atg gtg gtg atg gtg atg 3'), welches die His6-Domäne in 3'- Richtung vervollständigt, unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett dieser Domäne ein Stopcodon in die Sequenz einführt und unmittelbar hinter diesem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI beinhaltet, verwendet wurde.B) The PCR approach was carried out according to Example 1B), a DNA fragment with a length of 492 bp was obtained, purified and as a template for a 2nd PCR according to Example 1C), however with the oligonucleotide combination EcoRI-RBS-2 (see Example 2A)) and RibH- His6-C-2 (5 'tat tat gga tcc tta atg gtg gtg atg gtg atg 3'), which the His6 domain in 3'- Direction completed, immediately behind the last coding base triplet Domain introduces a stop codon into the sequence and immediately after this stop codon contains a recognition sequence for the restriction endonuclease BamHI has been.

C) Der PCR-Ansatz aus B) wurde analog Beispiel 1B) gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 528 bp erhalten.C) The PCR mixture from B) was purified analogously to Example 1B) and a DNA fragment was also included obtained a length of 528 bp.

D) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1E) bis L), wobei der hscherichia culi Expressionsstamm XL1-pNCO-C-His6-BS-LuSy erhalten wurde.D) The further processing was carried out analogously to Example 1E) to L), the hscherichia culi Expression strain XL1-pNCO-C-His6-BS-LuSy was obtained.

E) Nach Durchführung einer denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß Beispiel 1M) konnte im Rohextrakt eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 17,1 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-C-His6-BS-LuSy-Ex pressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 30% bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).E) After performing a denaturing polyacrylamide gel electrophoresis according to the example 1M) a protein band with a molecular weight of approx. 17.1 could be found in the crude extract kDa observed in a control strain without pNCO-C-His6-BS-LuSy-Ex pressure plasmid was not seen. The observed band corresponded to a share of approx. 30% based on all soluble proteins (estimated).

F) Die Überprüfung der Funktionalität erfolgte analog Beispiel 1N) bis P), wobei kein signifi kanter Unterschied zum Wildtypenzym beobachtet werden konnte.F) The functionality was checked analogously to Example 1N) to P), with no signifi edge difference to the wild type enzyme could be observed.

G) Zur immunologischen Überprüfung der Funktionalität des His6-Peptides wurde eine Wes tern-Blot-Analyse gemäß Beispiel 1Q), jedoch unter Verwendung des monoklonalen Anti körpers "Penta-His™-Antibody" (Quiagen, Hilden) als 1. Antikörper (10 µl Penta-His™-Anti body" in 5 ml TBS (siehe Beispiel 17H)) und Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat als 2. Anti körper (10 µl Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat in 5 ml TBS). Nach Entwicklung der Mem bran konnte das Fusionsprotein bei ca. 17,1 kDa detektiert werden.G) For the immunological check of the functionality of the His6 peptide, a Wes tern blot analysis according to Example 1Q), but using the monoclonal anti body "Penta-His ™ -antibody" (Quiagen, Hilden) as 1st antibody (10 µl Penta-His ™ -anti body "in 5 ml TBS (see Example 17H)) and anti-mouse-IgG-HRP conjugate as 2nd anti body (10 µl anti-mouse IgG-HRP conjugate in 5 ml TBS). After development of the mem The fusion protein was detected at around 17.1 kDa.

H) Der Nachweis der Zugänglichkeit der His6-Peptide im nativen Protein erfolgte unter Ver wendung von Mikrotiterplatten und eines Mehrkanalphotometers (ELISA-reader). In die 1. von 8 Probentaschen wurde je 100 µl der Rohextraktlösung aus D) (ca. 5-8 mg/ml Gesamt protein) gegeben. In die Probentaschen 2-8 wurden jeweils 50 µl Verdünnungslösung (1% Milchpulver in PBS) gegeben. Die 8. Probentasche wurde freigelassen. 50 µl aus Proben tasche 1 wurden mit den 50 µl Verdünnungslösung in Probentasche 2 verdünnt (10 × auf und ab pipettieren). 50 µl aus Probentasche 2 wurden anschließend mit 50 µl Verdünnungs lösung aus Probentasche 3 verdünnt, etc.. Zum Schluß wurden 50 µl aus Probentasche 7 verworfen, so daß nun alle Probentaschen 50 µl Probenlösung in verschiedenen Konzentra tionen (10 g 2 Verdünnung) enthielten. Die Proben wurden mit Klebefolie abgedeckt und übernacht bei 37°C inkubiert. Die nicht mit Fusionsprotein bedeckte Kunststoffoberfläche der Probentasche wurde mit je 350 µl Abdecklösung (3% Milchpulver in PBS) für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Abdecklösung wurde anschließend abgegossen, die Mikrotiterplatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 × mit jeweils 350 µl Waschlösung (PBS) ge waschen. Anschließend wurden 10 µl Penta-His™-Antibody (Quiagen, Hilden) in 5 ml Ver dünnungslösung verdünnt (1. Antikörper). Jeweils 50 µl 1. Antikörper wurden in die Pro bentaschen 1-8 pipettiert und 2 Stunde bei 37°C inkubiert. Der 1. Antikörper wurde an schließend abgegossen, die Mikrotiterplatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 × mit jeweils 350 µl Waschlösung (PBS) gewaschen. Anschließend erfolgte die Zugabe von 150 µl des 2. Antikörpers (10 µl Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat in 5 ml Verdünnungslösung, Sigma, München) mit einer Inkubationszeit von 2 h bei 37°C. Der 2. Antikörper wurde an schließend abgegossen, die Mikrotiterplatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 × mit jeweils 350 µl Waschlösung (PBS) gewaschen. Die Entwicklung der Mikrotiterplatte erfolgte unter Zugabe von 150 µl Substratlösung (100 mg o-Phenylendiamin in 25 ml Substratpuffer, 50 mM Citronensäure, pH 5) für die Peroxidase und Messung der Extink tion bei 492 nm. Das Fusionsprotein konnte von den hochspezifischen Penta-His-Anti körpern erkannt werden. Es konnte eine konzentrationsabhängige (log2 Verdünnung von gebundenem Fusionsprotein) Signalverringerung beobachtet werden.H) The accessibility of the His6 peptides in the native protein was verified using Ver Use of microtiter plates and a multi-channel photometer (ELISA reader). In the 1st 100 µl of the crude extract solution from D) (approx. 5-8 mg / ml total protein). 50 µl dilution solution (1% Milk powder in PBS). The 8th sample bag was released. 50 µl from samples bag 1 was diluted with the 50 µl dilution solution in sample bag 2 (10 × and pipette from). 50 µl from sample bag 2 were then diluted with 50 µl diluted solution from sample bag 3, etc. Finally, 50 µl from sample bag 7 discarded so that all sample bags now contain 50 µl sample solution in different concentrations ions (10 g 2 dilution). The samples were covered with adhesive film and incubated overnight at 37 ° C. The plastic surface not covered with fusion protein the sample bag was covered with 350 µl covering solution (3% milk powder in PBS) for 60 min incubated at 37 ° C. The cover solution was then poured off, the microtiter plate tapped briefly and the sample bags 3 × with 350 µl washing solution (PBS) each to wash. Then 10 .mu.l Penta-His ™ Antibody (Quiagen, Hilden) in 5 ml Ver diluted dilution solution (1st antibody). 50 µl of each antibody was added to the Pro pipetted 1-8 and incubated for 2 hours at 37 ° C. The 1st antibody was turned on then poured off, the microtiter plate was tapped briefly and the sample bags were thrown 3 times each washed 350 ul wash solution (PBS). Then 150 was added µl of the 2nd antibody (10 µl anti-mouse-IgG-HRP conjugate in 5 ml dilution solution, Sigma, Munich) with an incubation time of 2 h at 37 ° C. The 2nd antibody was on then poured off, the microtiter plate was tapped briefly and the sample bags were thrown 3 times each washed 350 ul wash solution (PBS). The development of the microtiter plate was carried out with the addition of 150 ul substrate solution (100 mg o-phenylenediamine in 25 ml Substrate buffer, 50 mM citric acid, pH 5) for the peroxidase and measurement of the absorbance tion at 492 nm. The fusion protein could from the highly specific Penta-His-Anti bodies are recognized. A concentration dependent (log2 dilution of bound fusion protein) signal reduction can be observed.

I) Negativ-Kontrastierung am Elektronenmikroskop gemäß Beispiel 1P) zeigten hohle, sphä nsche Partikel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.I) Negative contrasting on the electron microscope according to Example 1P) showed hollow, spherical nsche particles with an outer diameter of approx. 15 nm and an inner diameter of approx. 5 nm.

J) Die Überprüfung der Quartärstruktur wurde analog Beispiel 1S) durchgeführt. Das ge reinigte Lumazinsynthase-Fusionsprotein war als diskrete Bande auf dem nativen Gel zu se hen. Es konnte eine verringerte Mobilität im Vergleich zu einer Wildtyp-Lumazinsynthase, die auf den vergrößerten Durchmesser zurückzuführen ist, beobachtet werden.J) The quaternary structure was checked as in Example 1S). The ge purified lumazine synthase fusion protein was seen as a discrete band on the native gel hen. There was reduced mobility compared to a wild-type lumazine synthase, due to the enlarged diameter can be observed.

Beispiel 19Example 19 Herstellung von Mischungen aus C-Biotag-BS-LuSy und C-His6-BS-LuSy auf dem Wege der gesteuerten in vitro Rückfaltung der unlöslichen ProteineProduction of mixtures of C-Biotag-BS-LuSy and C-His6-BS-LuSy on the Ways of controlled in vitro refolding of the insoluble proteins

A) Die Kultivierung des Escherichia coli Stammes XL1-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy (Beispiel 14) erfolgte gemäß Beispiel 1K), jedoch in einem Volumen von 500 ml.A) The cultivation of the Escherichia coli strain XL1-pNCO-C-Biotag-BS-LuSy (example 14) was carried out according to Example 1K), but in a volume of 500 ml.

B) Die Kultivierung des Escherichia coli Stammes XL1-pNCO-C-His6-BS-LuSy (Beispiel 18) erfolgte ebenfalls gemäß Beispiel 1K), jedoch in einem Volumen von 500 ml.B) Cultivation of the Escherichia coli strain XL1-pNCO-C-His6-BS-LuSy (Example 18) was also carried out according to Example 1K), but in a volume of 500 ml.

C) Der Aufschluß der Zellen aus A) erfolgte unter Verwendung einer Ultraschall-erzeugenden Apparatur (Branson-Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dunbury, Con necticut). Zum Aufschluß wurde das gewaschene Zellpellet in 40 ml Abtrennpuffer (50 mM Tris pH 9,5) suspendiert und 10 min auf Eis gekühlt. Die Zellsuspension wurde dann 15 mal mit der Nadelsonde des Ultraschallgerätes bei Stufe 5 behandelt. Anschließend wurde die Suspension 5 min auf Eis gekühlt. Der Vorgang wurde insgesamt 4 mal wiederholt. Die Zellsuspension wurde anschließend zentrifugiert (Sorvall-Zentrifuge mit SS34-Rotor; 5000 Umin^-1, 4°C, 10 min), der Überstand (Rohextrakt A-1) abgetrennt und das Zellpellet (Rückstand A-1) weiterverarbeitet.C) The cells from A) were disrupted using an ultrasound-generating apparatus (Branson-Sonifier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dunbury, Connecticut). The washed cell pellet was suspended in 40 ml of separation buffer (50 mM Tris pH 9.5) and cooled on ice for 10 min. The cell suspension was then treated 15 times with the needle probe of the ultrasound device at level 5. The suspension was then cooled on ice for 5 minutes. The process was repeated 4 times in total. The cell suspension was then centrifuged (Sorvall centrifuge with SS34 rotor; 5,000 rpm ^-1, 4 ° C, 10 min), the supernatant is separated (crude extract A-1) and further processed, the cell pellet (residue A-1).

D) Der Aufschlußvorgang wurde ein zweites Mal durchgeführt, wobei der Rückstand A-1 aus C) wiederum in 40 ml Abtrennpuffer suspendiert wurde. Die weitere Durchführung erfolgte analog C). Es wurde Rohextrakt A-2 und unlöslicher Rückstand A-2 erhalten. D) The digestion process was carried out a second time, leaving the residue A-1 C) was again suspended in 40 ml separation buffer. The further implementation took place analogous to C). Crude extract A-2 and insoluble residue A-2 were obtained.

E) Der Aufschluß der Zellen aus B) erfolgte ebenfalls unter Verwendung einer Ultraschaller zeugenden Apparatur (Branson-Sonilier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dun bury, Connecticut). Zum Aufschluß wurde das gewaschene Zellpellet in 40 ml Abtrenn puffer (50 mM Tris pH 9,5) suspendiert und 10 min auf Eis gekühlt. Die Zellsuspension wurde dann 15 mal mit der Nadelsonde des Ultraschallgerätes bei Stufe 5 behandelt. An schließend wurde die Suspension 5 min auf Eis gekühlt. Der Vorgang wurde insgesamt 4 mal wiederholt. Die Zellsuspension wurde anschließend zentrifugiert (Sorvall-Zentrifuge mit SS34-Rotor; 15000 Umin^-1, 4°C, 30 min), der Überstand-B abgetrennt und weiterverarbei tet.E) The cells from B) were also disrupted using an ultrasound generating apparatus (Branson-Sonilier B-12A, Branson SONIC Power Company, Dunbury, Connecticut). For the digestion, the washed cell pellet was suspended in 40 ml of separation buffer (50 mM Tris pH 9.5) and cooled on ice for 10 min. The cell suspension was then treated 15 times with the needle probe of the ultrasound device at level 5. The suspension was then cooled on ice for 5 min. The process was repeated 4 times in total. The cell suspension was then centrifuged (Sorvall centrifuge with SS34 rotor, 15000 rpm ^-1, 4 ° C, 30 min), the supernatant-B separated and weiterverarbei tet.

F) Der unlösliche Rückstand A-2 (C-Biotag-BS-LuSy) aus D) wurde in 40 ml Solubilisierungs puffer (50 mM Tris, pH 9,5, 6 M Guanidiniumthiocyanat (G-SCN), 100 mM Dithiothreitol (DTE)), während 24 h unter Rühren bei Raumtemperatur solubilisiert.F) The insoluble residue A-2 (C-Biotag-BS-LuSy) from D) was solubilized in 40 ml buffer (50mM Tris, pH 9.5, 6M guanidinium thiocyanate (G-SCN), 100mM dithiothreitol (DTE)), solubilized for 24 h with stirring at room temperature.

G) Zum löslichen Überstand-B (40 ml) wurden 6 M G-SCN und 100 mM DTE gegeben und 24 h unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert.G) 6 M G-SCN and 100 mM DTE were added to the soluble supernatant-B (40 ml) and Incubated for 24 h with stirring at room temperature.

H) Die Solubilisierungslösung aus F) wurde einer Zentrifugation (Sorvall SS34-Rotor; 15000 Umin^-1; 20 min. 25°C) unterworfen und Rückstand-A-3 und Überstand-A-3 erhalten.H) The solubilization of F) was subjected to centrifugation (Sorvall SS34 rotor, subjected to 20 min 25 ° C) and residue-A-3, and obtained supernatant-A-3; 15000 rpm ^-1..

I) Anschließend wurden Portionen von Überstand-A-3 und Rückstand-A-3 unter Verwendung einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert.I) Then portions of supernatant-A-3 and residue-A-3 were used SDS polyacrylamide gel electrophoresis.

J) Die Überprüfung der Überstände wurde analog Beispiel 1M) durchgeführt.J) The supernatants were checked as in Example 1M).

K) Zur Überprüfung von Rückstand-A-3 wurde eine Spatelspitze des Rückstandes mit 200 µl Proteinauftragspuffer (siehe Beispiel 1M)) suspendiert und 15 min auf siedendem Wasser bad gekocht. Nach dem Abkühlen wurden die verbliebenen unlöslichen Bestandteile der Probe in einer Eppendorfzentrifuge pelletiert (15000 Umin^-1, 5 min. 4°C) und 6 µl des kla ren Überstandes auf das Sammelgel aufgetragen. Das weitere Vorgehen erfolgte analog Beispiel 1M).K) To check residue A-3, a spatula tip of the residue was suspended with 200 ul protein application buffer (see example 1M)) and boiled in boiling water for 15 minutes. After cooling the remaining insolubles of the sample were pelleted in an Eppendorf centrifuge (15000 rpm ^-1, 5 min. 4 ° C) and 6 .mu.l of the supernatant kla ren to the stacking gel applied. The further procedure was carried out analogously to Example 1M).

L) Aus J) und K) zeigte sich, daß sich das unlösliche Protein C-Biotag-BS-LuSy zu ca. 80% unter den angegebenen Bedingungen solubilisieren läßt.L) From J) and K) it was found that the insoluble protein C-Biotag-BS-LuSy was approximately 80% can be solubilized under the specified conditions.

M) Der erhaltene Rückstand-A-3 aus H) wurde nochmals den Schritten F) und H) bis K) un terworfen. Die Solubilisierungsrate konnte nicht verbessert werden.M) The residue A-3 obtained from H) was again steps F) and H) to K) un thrown. The solubilization rate could not be improved.

N) Die Fusionsproteinmengen der beiden Überstände A-3 und B waren vergleichbar.N) The fusion protein amounts of the two supernatants A-3 and B were comparable.

O) 2 ml Überstand-C-Bio-BS-LuSy (Überstand-A-3) und 2 ml Überstand-C-His6-BS-LuSy (Überstand-B) wurden gemischt (Mischung A).O) 2 ml of supernatant-C-Bio-LuSy (supernatant-A-3) and 2 ml of supernatant-C-His6-BS-LuSy (Supernatant-B) were mixed (Mixture A).

P) 3,5 ml Überstand-C-Bio-BS-LuSy und 0,5 ml Überstand-C-His6-BS-LuSy wurden ge mischt (Mischung B).P) 3.5 ml of supernatant-C-Bio-LuSy and 0.5 ml of supernatant-C-His6-BS-LuSy were ge mixes (Mix B).

Q) Mischung A und Mischung B wurden 48 h bei Raumtemperatur gerührt.Q) Mixture A and mixture B were stirred at room temperature for 48 hours.

R) Mischung A und Mischung B aus Q) wurden anschließend gegen 400 ml Abtrennpuffer, der 8 M Harnstoff und 1 mM DTE enthielt während 18 h bei Raumtemperatur dialysiert.R) Mix A and Mix B from Q) were then against 400 ml separation buffer, the 8 M urea and 1 mM DTE contained dialyzed for 18 h at room temperature.

S) Zu beiden Mischungen wurde anschließend 6,6 MM 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)2,4- (1H,3H)-pyrimidindion gegeben und 8 h bei Raumtemperatur gerührt und Mischung A-Ni tro bzw. Mischung B-Nitro erhalten.S) 6.6 MM 5-nitro-6- (D-ribitylamino) 2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione added and stirred for 8 h at room temperature and mixture A-Ni get tro or mixture B-nitro.

T) Mischung A-Nitro und Mischung B-Nitro wurden in einen Dialyseschlauch überführt und gegen 32 ml (5-faches Volumen) Rückfaltungspuffer A (100 mM K-Phosphatpuffer, pH 7,0, 1 mM 5-Nitro-6-(D-ribitylamino)2,4-(1H,3H)-pyrimidindion, 1 mM DTE, 0,02% Na- Azid) 12 Stunden bei 4°C dialysiert und Mischung A-1/5 und Mischung B-1/5 erhalten.T) Mixture A-nitro and mixture B-nitro were transferred into a dialysis tube and against 32 ml (5-fold volume) refolding buffer A (100 mM K-phosphate buffer, pH 7.0, 1 mM 5-nitro-6- (D-ribitylamino) 2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione, 1 mM DTE, 0.02% Na- Azide) dialyzed for 12 hours at 4 ° C. and mixture A-1/5 and mixture B-1/5 were obtained.

U) Anschließend wurde der Dialysepuffer aus T) mit 40 ml Rückfaltungspuffer B (100 mM K- Phosphatpuffer, pH 7,0, 1 mM DTE, 0,02% Na-Azid) verdünnt und weitere 24 h bei 4°C dialysiert (Mischung A-1/10 und Mischung B-1/10).U) The dialysis buffer from T) was then treated with 40 ml refolding buffer B (100 mM K- Phosphate buffer, pH 7.0, 1 mM DTE, 0.02% Na azide) diluted and a further 24 h at 4 ° C dialyzed (Mix A-1/10 and Mix B-1/10).

V) Anschließend wurde der Dialysepuffer aus U) mit 80 ml Rückfaltungspuffer B verdünnt und weitere 24 h bei 4°C dialysiert und die Dialysate Mischung A-1/20 und Mischung B-1/20 erhalten. V) Then the dialysis buffer from U) was diluted with 80 ml refolding buffer B and dialyzed for a further 24 h at 4 ° C. and the dialysates mixture A-1/20 and mixture B-1/20 receive.

W) Mischung A-1/20 und Mischung B-1/20 wurden anschließend gegen 72 ml (10-faches Vo lumen) Rückfaltungspuffer C (100 mM K-Phosphatpuffer, pH 7,0, 1 mM DTE, 0,25 mM 5- Nitro-6-(D-ribitylamino)2,4-(1H,3H)-pyrimidindion, 0,02% Na-Azid) 24 h bei 4°C dialy siert und Mischung A-1/200 und Mischung B-1/200 erhalten.W) Mixture A-1/20 and mixture B-1/20 were then against 72 ml (10 times Vo lumen) refolding buffer C (100 mM K-phosphate buffer, pH 7.0, 1 mM DTE, 0.25 mM 5- Nitro-6- (D-ribitylamino) 2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione, 0.02% Na azide) 24 h at 4 ° C dialy siert and mixture A-1/200 and mixture B-1/200 obtained.

X) Nach Zentrifugation (Sorvall SS34-Rotor; 15000 Umin^-1; 20 min. 4°C) wurden Portionen von Überstand-Mischung A-1/200 bzw. Mischung B-1/200 und Rückstand-Mischung A- 1/200 bzw. Mischung B-1/200 unter Verwendung einer SDS-Polyacrylamidgelelektropho rese analysiert.X) After centrifugation (Sorvall SS34 rotor; 20 min 4 ° C) were portions of supernatant mixture A-1/200 or mix B-1/200 and 1/200 A residue mixture; 15000 rpm ^-1. or mixture B-1/200 analyzed using an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.

Y) Die Überprüfung der Überstände wurde analog Beispiel 1M) durchgeführt.Y) The supernatants were checked as in Example 1M).

Z) Die Überprüfung der Rückstände erfolgte analog K).Z) The residues were checked analogously to K).

AA) Aus Y) und Z) zeigte sich, daß sich ca. 50-80% gemischtes Lumazinsynthase-Konjugat unter den angegebenen Bedingungen erzeugen läßt. Die Fusionsproteinmengen der einge setzten Proteinmengen entsprachen sich im rückgefalteten Zustand (abgeschätzt vom SDS- PAGE), so daß kein Unterschied im Rückfaltungsverhalten der beiden Fusionsproteine fest gestellt werden konnte.AA) From Y) and Z) it was found that there was approximately 50-80% mixed lumazine synthase conjugate can generate under the specified conditions. The fusion protein amounts of the set amounts of protein corresponded in the refolded state (estimated by the SDS- PAGE), so that no difference in the refolding behavior of the two fusion proteins was found could be put.

BB) Die Überprüfung der Quartärstruktur erfolgte analog Beispiel 1S), wobei jedoch 40 µl Proteinlösung (Überstand-Mischung A-1/200, Überstand-Mischung B-1/200) eingesetzt wurde. Die renaturierten Fusionsprotein-Mischungen waren als diskrete Banden auf dem nativen Polyacrylamidgl zu sehen. Die Mobilität war vergleichbar mit den Mobilitäten der renaturierten Proteine C-Bio-BS-LuSy und C-His6-BS-LuSy, was höchstwahrscheinlich auf den ähnlichen hydrodynamischen Durchmesser der Proteine zurückzuführen ist. Mit der oben beschriebenen Maßnahme konnte demnach renaturiertes, ikosaedrisches, aus 60 Un tereinheiten bestehendes Fusionsprotein erhalten werden.BB) The quaternary structure was checked analogously to Example 1S), but 40 μl Protein solution (supernatant mixture A-1/200, supernatant mixture B-1/200) was used has been. The renatured fusion protein mixtures were on the as discrete bands to see native polyacrylamide gl. The mobility was comparable to the mobility of the renatured proteins C-Bio-BS-LuSy and C-His6-BS-LuSy, most likely based on is due to the similar hydrodynamic diameter of the proteins. With the The measure described above could therefore be renatured, icosahedral, from 60 Un existing fusion protein can be obtained.

CC) Der Nachweis der beiden Untereinheiten im renaturierten ikosaedrischen Protein erfolgte unter Verwendung von Mikrotiterplatten und eines Mehrkanalphotometers (ELISA-reader). Die Beschichtung der Näpfe mit Avidin erfolgte analog Beispiel 14M). In die 1. von 8 Pro bentaschen wurde je 100 µl der renaturierten Probenlösung aus W) (ca. 0,5-1 mg/ml) gege ben. In die Probentaschen 2-8 wurden jeweils 50 µl Verdünnungslösung (1% Milchpulver in PBS) gegeben. Die 8. Probentasche wurde freigelassen. 50 µl aus Probentasche 1 wurden mit den 50 µl Verdünnungslösung in Probentasche 2 verdünnt (10 × auf und ab pipettieren). 50 µl aus Probentasche 2 wurden anschließend mit 50 µl Verdünnungslösung aus Proben tasche 3 verdünnt, etc.. Zum Schluß wurden 50 µl aus Probentasche 7 verworfen, so daß nun alle Probentaschen 50 µl Probenlösung in verschiedenen Konzentrationen (10 g 2 Ver dünnung) enthielten. Die Proben wurden mit Klebefolie abgedeckt und übernacht bei 37°C inkubiert und danach wurde 3 × mit jeweils 350 µl Waschlösung (PBS) gewaschen. An schließend wurden 10 µl Penta-His™ Antibody (Quiagen, Hilden) in 5 ml Verdünnungs lösung verdünnt (1. Antikörper). Jeweils 50 µl 1. Antikörper wurden in die Probentaschen 1- 8 pipettiert und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Der 1. Antikörper wurde anschließend abge gossen, die Mikrotiterplatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 × mit jeweils 350 µl Waschlösung (PBS) gewaschen. Anschließend erfolgte die Zugabe von 150 µl des 2. Anti körpers (10 µl Anti-Maus-IgG-HRP-HRP-Konjugat in 5 ml Verdünnungslösung, Sigma, München) mit einer Inkubationszeit von 2 h bei 37°C. Der 2. Antikörper wurde anschlie ßend abgegossen, die Mikrotiterplatte kurz ausgeklopft und die Probentaschen 3 × mit je weils 350 µl Waschlösung (PBS) gewaschen. Die Entwicklung der Mikrotiterplatte erfolgte unter Zugabe von 150 µl Substratlösung (100 mg o-Phenylendiamin in 25 ml Substrat puffer, 50 mM Citronensäure, pH 5) für die Peroxidase und Messung der Extinktion bei 492 nm. Überstand-Mischung A-1/200 und Überstand-Mischung B-1/200 konnten von den hochspezifischen Penta-His-Antikörpern erkannt werden. Es konnte eine konzentrations abhängige (log2 Verdünnung von gebundenem Fusionsprotein) Signalverringerung be obachtet werden. Bei Überstand-Mischung A-1/200 konnte ein stärkeres Signal als bei Überstand-Mischung B-1/200 beobachtet werden. Zur Bindung an die Avidin-beschichtete Mikrotiterplatte genügt theoretisch ein Biotinmolekül, während die Signalstärke mit der Anzahl von His6-Epitopen pro Molekül korelliert. In Überstand-Mischung A-1/200 sind pro Ikosaeder mehr His6-Epitope enthalten als im Vergleichskonstrukt Überstand-Mischung B- 1/200, so daß bei Überstand-Mischung A-1/200, wie der praktische Versuch bestätigt, ein stärkeres Signal zu erwarten ist. Aus diesem Ergebnis folgt, daß mit den oben beschriebenen Rückfaltungsmaßnahmen Ikosaeder erhalten wurden, die aus verschiedenen Untereinheiten bestehen.CC) The two subunits were detected in the renatured icosahedral protein using microtiter plates and a multi-channel photometer (ELISA reader). The wells were coated with avidin as in Example 14M). In the 1st of 8 Pro 100 µl of the renatured sample solution from W) (approx. 0.5-1 mg / ml) was washed ben. 50 µl of dilution solution (1% milk powder in PBS). The 8th sample bag was released. 50 µl from sample bag 1 were diluted with the 50 µl dilution solution in sample bag 2 (pipet up and down 10 times). 50 µl from sample bag 2 were then mixed with 50 µl dilution solution from samples bag 3 diluted, etc. Finally 50 µl from sample bag 7 were discarded, so that now all sample bags 50 µl sample solution in different concentrations (10 g 2 ver thinning) included. The samples were covered with adhesive film and overnight at 37 ° C incubated and then washed 3 × with 350 ul washing solution (PBS). On finally 10 µl Penta-His ™ Antibody (Quiagen, Hilden) in 5 ml dilution diluted solution (1st antibody). 50 µl each of 1. Antibodies were placed in the sample pockets 1- 8 pipetted and incubated at 37 ° C for 2 hours. The first antibody was then abge pour, the microtiter plate is tapped briefly and the sample bags 3 × with 350 µl each Wash solution (PBS) washed. Then 150 µl of the 2nd Anti was added body (10 µl anti-mouse IgG-HRP-HRP conjugate in 5 ml dilution solution, Sigma, Munich) with an incubation period of 2 h at 37 ° C. The second antibody was then poured off, tapped the microtiter plate briefly and the sample bags 3 × with each because 350 ul washing solution (PBS) washed. The microtiter plate was developed with the addition of 150 µl substrate solution (100 mg o-phenylenediamine in 25 ml substrate buffer, 50 mM citric acid, pH 5) for the peroxidase and measurement of the absorbance at 492 nm. Supernatant mixture A-1/200 and supernatant mixture B-1/200 could of the highly specific Penta-His antibodies are recognized. It could be a concentration dependent (log2 dilution of bound fusion protein) signal reduction be taken care of. With supernatant mixture A-1/200 a stronger signal than with Supernatant mixture B-1/200 can be observed. For binding to the avidin-coated Theoretically, a microtiter plate is sufficient for one biotin molecule, while the signal strength with the Number of His6 epitopes correlated per molecule. In supernatant mix A-1/200 are pro Icosahedra contain more His6 epitopes than in the comparative construct supernatant mixture B- 1/200, so that with supernatant mixture A-1/200, as the practical experiment confirms stronger signal is expected. From this result it follows that with those described above Refolding icosahedra were obtained from different subunits consist.

Beispiel 20Example 20 Herstellung der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus unter Verwen dung von 11, an die Escherichia coli Codonsverwendung angepasster synthetischer Oli gonukleotide und einer 6-stufigen Polymerase-Kettenreaktion (Deckert et al., 1998)Production of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus using of 11, synthetic oli adapted to the Escherichia coli codon use gonucleotides and a 6-stage polymerase chain reaction (Deckert et al., 1998)

A) Das erste Teilstück des Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde mit den Oligonukleotiden AQUI-1 (5'gct gcg ggt gaa ctg gcg cgt aaa gag gac att gat gct gtt atc gca att ggc gtt ctc atc 3'; Strangprimer) und AQUI-2 (5'cta atg aaa ggt tcg cga ggc ctt ttg aaa ctt cag agg cga tat aat cga aat gtg gcg ttg 3'; Gegenstrangprimer) unter Verwendung des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis als Matrize (Vektor pNCO-BS-LuSy, vgl. Beispiel 1G)) amplifiziert. Beide Oligonukleotide wurden an die optimale Codon verwendung (für stark exprimierte Gene; Grosjean und Fiers, 1982; Ikemura, 1981; Wada et al. 1992) von Escherichia coli angepasst. AQUI-1 enthält die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease MfeI (C*AATTG) und AQUI-2 für StuI (AGG*CCT).
10 µl PCR-Puffer (75 mM Tris/HCl, pH 9.0; 20 mM (NH₄)₂SO₄; 0.01% (w/v) Tween 20)
6 µl Mg²⁺ [1,5 mM]
8 µl dNTP's [je 200 µM]
1 µl AQUI-1 [0,5 µM]
1 µl AQUI-2 [0,5 µM)
1 µl pNCO-BS-LuSy (vgl. Beispiel 1) [10 ng]
1 µl Goldstar-Taq-Polymerase [0,5 U] (Eurogentec, Seraing, Belgien)
72 µl H₂O_bidest
Der Ansatz wurde im Thermocycler (GeneAmp® PCR System 2400; Perkin Eimer) bei folgenden Bedingungen durchgeführt:
1. 5,0 min 95°C
2. 0,5 min 94°C
3. 0,5 min 50°C
4. 0,5 min 72°C
5. 5,0 min 72°C
6. abkühlen auf 4°C
Die Schritte 2.-4. wurden 20 × wiederholt.A) The first part of the gene for the lumazine synthase from Aquifex aeolicus was treated with the oligonucleotides AQUI-1 (5'gct gcg ggt gaa ctg gcg cgt aaa gag gac att gat gct gtt atc gca att ggc gtt ctc atc 3 '; strand primer) and AQUI-2 (5'cta atg aaa ggt tcg cga ggc ctt ttg aaa ctt cag agg cga tat aat cga aat gtg gcg ttg 3 '; counter strand primer) using the gene for the lumazine synthase from Bacillus subtilis as a template (vector pNCO-BS- LuSy, see Example 1G)) amplified. Both oligonucleotides were adapted to the optimal codon usage (for highly expressed genes; Grosjean and Fiers, 1982; Ikemura, 1981; Wada et al. 1992) from Escherichia coli. AQUI-1 contains the recognition sequence for the restriction endonuclease MfeI (C * AATTG) and AQUI-2 for StuI (AGG * CCT).
10 µl PCR buffer (75 mM Tris / HCl, pH 9.0; 20 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ; 0.01% (w / v) Tween 20)
6 µl Mg ²⁺ [1.5 mM]
8 µl dNTP's [200 µM each]
1 µl AQUI-1 [0.5 µM]
1 µl AQUI-2 [0.5 µM)
1 µl pNCO-BS-LuSy (see Example 1) [10 ng]
1 µl Goldstar Taq polymerase [0.5 U] (Eurogentec, Seraing, Belgium)
72 µl H ₂ O _bidist
The approach was carried out in a thermal cycler (GeneAmp® PCR System 2400; Perkin Elmer) under the following conditions:
1. 5.0 min 95 ° C
2. 0.5 min 94 ° C
3. 0.5 min 50 ° C
4. 0.5 min 72 ° C
5. 5.0 min 72 ° C
6. cool to 4 ° C
Steps 2.-4. were repeated 20 times.

B) Der PCR-Ansatz wurde mittels Agarosegelelektrophorese (3% Agarose) aufgetrennt, die DNA durch Färbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht und das Fragment mit einer Länge von 132 bp mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten. Die weitere Aufreinigung erfolgte gemäß Beispiel 1B).B) The PCR mixture was separated by means of agarose gel electrophoresis (3% agarose), which DNA made visible by staining with ethidium bromide under UV light and that 132 bp fragment cut out of the gel with a scalpel. The further purification was carried out according to Example 1B).

C) 10 ng der isolierten DNA aus B) dienten anschließend als Matrize für eine 2. PCR mit den Oligonukleotiden AQUI-3 (5' act ctg gtt cgt gtt cca ggc tca tgg gaa ata ccg gtt gct gcg ggt gaa ctg gcg cgt aaa g 3'; Strangprimer) und AQUI-4 (5' cca agg tgt cag ctg taa taa cac cga agg tga tag gtt tac gta gtt cta atg aaa ggt tcg cga ggc c 3'; Gegenstrangprimer). Beide Oli gonukleotide wurden an die optimale Codonverwendung für stark exprimierte Gene (Grosjean und Fiers, 1982; Ikemura, 1981; Wada et al. 1992) von Escherichia coli angepasst. AQUI-3 enthält die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease AgeI (A*CCGGT) und AQUI-4 für SnaBI (TAC*GTA) und PvuII (CAG*CTG). Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgte wie unter A) beschrieben.C) 10 ng of the isolated DNA from B) then served as a template for a 2nd PCR with the Oligonucleotides AQUI-3 (5 'act ctg gtt cgt gtt cca ggc tca tgg gaa ata ccg gtt gct gcg ggt gaa ctg gcg cgt aaa g 3 '; Strand primer) and AQUI-4 (5 'cca agg tgt cag ctg taa taa cac cga agg tga tag gtt tac gta gtt cta atg aaa ggt tcg cga ggc c 3 '; Counter strand primer). Both oli gonucleotides were designed to optimize codon usage for highly expressed genes (Grosjean and Fiers, 1982; Ikemura, 1981; Wada et al. 1992) from Escherichia coli customized. AQUI-3 contains the recognition sequence for the restriction endonuclease AgeI (A * CCGGT) and AQUI-4 for SnaBI (TAC * GTA) and PvuII (CAG * CTG). The Polymerase chain reaction was carried out as described under A).

D) Das Produkt aus C) wurde wie unter B) beschrieben gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 219 bp erhalten.D) The product from C) was purified as described under B) and a DNA fragment with obtained a length of 219 bp.

E) 10 ng der isolierten DNA aus D) dienten anschließend als Matrize für eine 3. PCR mit den Oligonukleotiden AQUI-5 (5' gga ggg tgc aat tga ttg cat agt ccg tca tgg cgg ccg tga aga aga cat tac tct ggt tcg tgt tcc agg c 3'; Strangprimer) und AQUI-6 (5' gtt gcc gtg ttt tgt gcc ggc gcg ctc gat agc ctg ttc caa ggt gtc agc tgt aat aac 3'; Gegenstrangprimer). Beide Oligo nukleotide wurden an die optimale Codonverwendung (für stark exprimierte Gene) von Escherichia coli angepasst. AQUI-5 enthält die Erkennungssequenz für die Restriktions endonuklease EagI (C*GGCCG) und AQUI-6 für BssHII (G*CGCGC) und PvuII (CAG*CTG). Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgte wie unter A) beschrieben.E) 10 ng of the isolated DNA from D) then served as a template for a 3rd PCR with the Oligonucleotides AQUI-5 (5 'gga ggg tgc aat tga ttg cat agt ccg tca tgg cgg ccg tga aga aga cat tac tct ggt tcg tgt tcc agg c 3 '; Strand primer) and AQUI-6 (5 'gtt gcc gtg ttt tgt gcc ggc gcg ctc gat agc ctg ttc caa ggt gtc agc tgt aat aac 3 '; Counter strand primer). Both oligo nucleotides were designed to optimize codon usage (for highly expressed genes) Escherichia coli adapted. AQUI-5 contains the recognition sequence for the restriction endonuclease EagI (C * GGCCG) and AQUI-6 for BssHII (G * CGCGC) and PvuII (CAG * CTG). The polymerase chain reaction was carried out as described under A).

F) Das Produkt aus E) wurde wie unter B) beschrieben gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 309 bp erhalten.F) The product from E) was purified as described under B) and a DNA fragment with obtained a length of 309 bp.

G) 10 ng der isolierten DNA aus F) dienten anschließend als Matrize für eine 4. PCR mit den Oligonukleotiden AQUI-7 (5' cgg tat cgt agc atc acg ttt taa tca tgc tct tgt cga ccg tct ggt gga ggg tgc aat tga ttg cat ag 3'; Strangprimer) und AQUI-8 (5' gaa taa gtt tgc cat ttc aat ggc aga aag cgc tgc ttc cca acc ttt gtt gcc gtg ttt tgt gcc ggc 3'; Gegenstrangprimer). Beide Oligonukleotide wurden an die optimale Codonverwendung (für stark exp 31842 00070 552 001000280000000200012000285913173100040 0002019910102 00004 31723rimierte Gene) von Escherichia coli angepasst. AQUI-7 enthält die Erkennungssequenz für die Restrik tionsendonuklease SaII (G*TCGAC) und AQUI-8 für Eco47III (AGC*GCT). Die Polyme rase-Kettenreaktion erfolgte wie unter A) beschrieben.G) 10 ng of the isolated DNA from F) subsequently served as a template for a 4th PCR with the Oligonucleotides AQUI-7 (5 'cgg tat cgt agc atc acg ttt taa tca tgc tct tgt cga ccg tct ggt gga ggg tgc aat tga ttg cat ag 3 '; Strand primer) and AQUI-8 (5 'gaa taa gtt tgc cat ttc aat ggc aga aag cgc tgc ttc cca acc ttt gtt gcc gtg ttt tgt gcc ggc 3 '; Counter strand primer). Both Oligonucleotides were engineered to optimize codon usage (for strongly exp 31842 00070 552 001000280000000200012000285913173100040 0002019910102 00004 31723) adapted from Escherichia coli. AQUI-7 contains the recognition sequence for the restriction tion endonuclease SaII (G * TCGAC) and AQUI-8 for Eco47III (AGC * GCT). The polyme rase chain reaction was carried out as described under A).

H) Das Produkt aus G) wurde wie unter B) beschrieben gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 405 bp erhalten.H) The product from G) was purified as described under B) and a DNA fragment with obtained a length of 405 bp.

I) 10 ng der isolierten DNA aus H) dienten anschließend als Matrize für eine 5. PCR mit den Oligonukleotiden AQUI-9 (5' atg caa atc tac gaa ggt aaa cta act gct gaa ggc ctt cgt ttc ggt atc gta gca tca cgt ttt aat c 3'; Strangprimer) und AQUI-10 (5' tat tat gga tcc tta tcg gag aga ctt gaa taa gtt tgc cat ttc aat gg 3'; Gegenstrangprimer). Beide Oligonukleotide wurden an die optimale Codonverwendung (für stark exprimierte Gene) von Escherichia coli ange passt. AQUI-9 vervollständigt das Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus und enthält die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease StuI (AGG*CCT). Das Oligonukleotid AQUI-10, welches am 3'-Ende zum Gen der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus komplementär ist, führt unmittelbar hinter dem Stopcodon eine Erkennungssequenz für die Endonuklease BamHI (G*GATCC) ein. Die Polymerase- Kettenreaktion erfolgte wie unter A) beschrieben.I) 10 ng of the isolated DNA from H) then served as a template for a 5th PCR with the Oligonucleotides AQUI-9 (5 'atg caa atc tac gaa ggt aaa cta act gct gaa ggc ctt cgt ttc ggt atc gta gca tca cgt ttt aat c 3 '; Strand primer) and AQUI-10 (5 'tat tat gga tcc tta tcg gag aga ctt gaa taa gtt tgc cat ttc aat gg 3 '; Counter strand primer). Both oligonucleotides were to the optimal codon usage (for highly expressed genes) of Escherichia coli fits. AQUI-9 completes the gene for the lumazine synthase from Aquifex aeolicus and contains the recognition sequence for the restriction endonuclease StuI (AGG * CCT). The Oligonucleotide AQUI-10, which at the 3 'end to the gene of lumazine synthase from Aquifex aeolic is complementary, leads immediately after the stop codon Recognition sequence for the endonuclease BamHI (G * GATCC). The polymerase Chain reaction took place as described under A).

J) Das Produkt aus I) wurde wie unter B) beschrieben gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 476 bp erhalten.J) The product from I) was purified as described under B) and a DNA fragment with obtained a length of 476 bp.

K) 10 ng der isolierten DNA aus J) dienten anschließend als Matrize für eine 6. PCR mit den Oligonukleotiden AQUI-11 (5' ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg caa atc tac gaa ggt aaa cta ac 3'; Strangprimer) und AQUI-10 (Gegenstrangprimer). Das Oligonukleotid AQUI-11 ist am 3'-Ende zum 5'-Ende des synthetischen Gens für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus komplementär. Am 5'-Ende führt es eine ribosomale Bindungsstelle und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease EcoRI vor dem Startcodon ein. Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgte wie unter A) beschrieben.K) 10 ng of the isolated DNA from J) then served as a template for a 6th PCR with the Oligonucleotides AQUI-11 (5 'ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg caa atc tac gaa ggt aaa cta ac 3 '; Strand primer) and AQUI-10 (counter strand primer). The oligonucleotide AQUI-11 is from the 3 'end to the 5' end of the synthetic gene for lumazine synthase Aquifex aeolicus complementary. It has a ribosomal binding site at the 5 'end a recognition sequence for the restriction endonuclease EcoRI before the start codon. The polymerase chain reaction was carried out as described under A).

L) Das Produkt aus K) wurde wie unter B) beschrieben gereinigt und ein DNA-Fragment mit einer Länge von 510 bp erhalten.L) The product from K) was purified as described under B) and a DNA fragment with obtained with a length of 510 bp.

M) Die weitere Verarbeitung des DNA-Fragmentes aus L) erfolgte wie unter Beispiel 1E)-G) wobei das Plasmid pNCO-AA-LuSy erhalten wurde. M) The further processing of the DNA fragment from L) was carried out as in Example 1E) -G) whereby the plasmid pNCO-AA-LuSy was obtained.

N) Anschließend wurden die Schritte H)-M) gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-AA-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von 16,7 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne das betreffende Plasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 20% bezogen auf alle löslichen Proteine.N) Steps H) -M) were then carried out in accordance with Example 1. In the crude extract of the XL1-pNCO-AA-LuSy strain was able to produce a protein band with a molecular weight of 16.7 kDa can be observed in a comparison strain without the relevant Plasmid was not seen. The observed band corresponded to a share of approx. 20% based on all soluble proteins.

O) Die Überprüfung der Funktionalität erfolgte gemäß Beispiel 1N). Das Protein zeigte eine optimale Aktivität im Bereich von 80-90°C.O) The functionality was checked according to Example 1N). The protein showed one optimal activity in the range of 80-90 ° C.

P) Die Negativkontrastierung erfolgte gemäß Beispiel 1P) und zeigte hohle, sphärische Parti kel mit einem Außendurchmesser von ca. 15 nm und einem Innendurchmesser von ca. 5 nm.P) The negative contrast was carried out according to Example 1P) and showed hollow, spherical parts with an outer diameter of approx. 15 nm and an inner diameter of approx. 5 nm.

Q) Die Reinigung des Proteins erfolgte in zwei Schritten: Die Kultivierung des Escherichia coli Stammes XL1-pNCO-AA-LuSy erfolgte gemäß Beispiel 1K), jedoch in einem Volu men von 1 l. Der Aufschluß erfolgte gemäß Beispiel 1R). Der klare Überstand wurde an schließend im Wasserbad 20 min bei 90°C inkubiert. Die Suspension wurde anschließend zentrifugiert (Sorvall SS34-Rotor; 15000 Umin^-1; 4°C; 30 min). Mit diesem Schritt konnte eine Anreicherung des Zielproteins um Faktor 4 erreicht werden (abgeschätzt von SDS- PAGE). Die weitere Reinigung erfolgte gemäß Beispiel 2S) unter Verwendung des Über standes nach der Zentrifugation und einer Gelfiltrationssäule.Q) The protein was purified in two steps: The cultivation of the Escherichia coli strain XL1-pNCO-AA-LuSy was carried out according to Example 1K), but in a volume of 1 l. The digestion was carried out according to Example 1R). The clear supernatant was then incubated in a water bath at 90 ° C. for 20 min. The suspension was then centrifuged (Sorvall SS34 rotor; 15000 Umin ^-1 ; 4 ° C; 30 min). With this step, the target protein could be enriched by a factor of 4 (estimated by SDS-PAGE). The further purification was carried out according to Example 2S) using the supernatant after centrifugation and a gel filtration column.

R) Die Überprüfung der Quartärstruktur erfolgte gemäß Beispiel 1S) und ergab ein mit der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis vergleichbares Ergebnis.R) The quaternary structure was checked according to Example 1S) and resulted in a Lumazine synthase from Bacillus subtilis comparable result.

Beispiel 21Example 21 Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, an den C-Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicusCoupling of an artificial 13 amino acid long, in vivo biotinylatable peptide, to the C-terminus of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus

A) Das Gen für die synthetische Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde unter Verwen dung der Polymerasekettenreaktion und der synthetischen Oligonukleotide EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2A)) und AQUI-C-NotI (5' tat tat tat agc ggc cgc tcg gag aga ctt gaa taa g 3') aus dem Plasmid pNCO-AA-LuSy (siehe Beispiel 20) amplifiziert. Das Oligonukleotid AQUI-C-NotI ist an seinem 3'-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase und führt unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease NotI (GC*GGCCGC) ein. Diese Er kennungssequenz wird in drei Alaninmoleküle translatiert. Die Durchführung der PCR er folgte analog Beispiel 1A).A) The gene for the synthetic lumazine synthase from Aquifex aeolicus was used of the polymerase chain reaction and the synthetic oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see example 2A)) and AQUI-C-NotI (5 'tat tat tat agc ggc cgc tcg gag aga ctt gaa taa g 3 ') from the plasmid pNCO-AA-LuSy (see Example 20). The oligonucleotide AQUI-C-NotI is at its 3 'end complementary to the gene for lumazine synthase and introduces immediately behind the last coding base triplet of lumazine synthase Recognition sequence for the restriction endonuclease NotI (GC * GGCCGC). This he identifier sequence is translated into three alanine molecules. Carrying out the PCR he followed analogously to Example 1A).

B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 513 bp erhalten wurde, gereinigt.B) The PCR approach was carried out according to Example 1B), a DNA fragment with a length of 513 bp was purified.

C) Das gereinigte DNA-Fragment aus B) wurde mit der Restriktionsendonuklease NotI analog Beispiel 8F) verdaut und anschließend gemäß Beispiel 1B) gereinigt.C) The purified DNA fragment from B) was analogous with the restriction endonuclease NotI Example 8F) digested and then purified according to Example 1B).

D) Das gereinigte DNA-Fragment aus C) wurde analog Beispiel 8H) mit der Restriktions endonuklease EcoRI behandelt und ein Fragment mit der Länge von 498 bp erhalten.D) The purified DNA fragment from C) was analogous to Example 8H) with the restriction Endonuclease EcoRI treated and a fragment with the length of 498 bp obtained.

E) 5 µg des Expressionsplasmids pNCO-C-Biotag-BS-LuSy (Beispiel 14) in einem Volumen von 30 µl wurden analog Beispiel 8G) und H) behandelt. Das DNA-Fragment mit einer Länge von 3437 bp wurde isoliert und gereinigt.E) 5 µg of the expression plasmid pNCO-C-Biotag-BS-LuSy (Example 14) in one volume of 30 ul were treated analogously to Example 8G) and H). The DNA fragment with a 3437 bp length was isolated and purified.

F) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1E) bis L), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XL1-pNCO-C-Biotag-AA-LuSy erhalten wurde.F) The further processing was carried out analogously to Example 1E) to L), the Escherichia coli Expression strain XL1-pNCO-C-Biotag-AA-LuSy was obtained.

G) Bei der Überprüfung der Funktionalität der Lumazinsynthase gemäß Beispiel 1N) konnte nur eine enzymatische Aktivität, die der Aktivität des Escherichia coli Stammes XL1 ent sprach, ermittelt werden.G) When checking the functionality of the lumazine synthase according to Example 1N) only an enzymatic activity that corresponds to the activity of the Escherichia coli strain XL1 spoke, be determined.

H) Die Überprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe der löslichen Proteine wurde analog Beispiel 1M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-C-Biotag-AA-LuSy konnte keine signifikante Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 18,5 kDa be obachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-C-Biotag-AA-LuSy-Expres sionsplasmid nicht zu sehen war.H) The check of the expression rate or the size of the soluble proteins was analogous Example 1M). In the crude extract of strain XL1-pNCO-C-Biotag-AA-LuSy could not be a significant protein band with a molecular weight of about 18.5 kDa are observed in a comparison strain without pNCO-C-Biotag-AA-LuSy-Express sionsplasmid was not seen.

I) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 14H) bis M). Es konnte ein vergleich bares Ergebnis erzielt werden.I) The further processing was carried out analogously to Example 14H) to M). It could be a comparison real result can be achieved.

Beispiel 22Example 22 Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, über einen Linker bestehend aus der Aminosäurenfolge H-H-H-H-H-H-A-A-A an den C-Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicusCoupling of an artificial 13 amino acid long, in vivo biotinylatable peptide, via a linker consisting of the amino acid sequence H-H-H-H-H-H-A-A-A to the C-terminus of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus

A) Das Gen für die synthetische Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde analog Beispiel 21 unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und der synthetischen Oligonukleotide EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2A)) und AQUI-C-HIS₆-NotI (5' tat tat tat agc ggc cgc atg gtg gtg atg gtg atg tcg gag aga ctt gaa taa gtt tgc 3') aus dem Plasmid pNCO-AA-LuSy (siehe Beispiel 20) amplifiziert. Das Oligonukleotid AQUI-C-HIS₆-NotI ist an seinem 3'- Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase und führt unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase eine Sequenz, kodierend für 6 Histidinmoleküle und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease NotI (GC*GGCCGC) ein. Diese Erkennungssequenz wird in drei Alaninmoleküle translatiert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1A).A) The gene for the synthetic lumazine synthase from Aquifex aeolicus was analogously to Example 21 using the polymerase chain reaction and the synthetic oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see Example 2A)) and AQUI-C-HIS ₆ -NotI (5 'tat tat tat agc ggc cgc atg gtg gtg atg gtg atg tcg gag aga ctt gaa taa gtt tgc 3 ') from the plasmid pNCO-AA-LuSy (see Example 20). The oligonucleotide AQUI-C-HIS ₆ -NotI is at its 3 'end complementary to the gene for the lumazine synthase and has a sequence immediately after the last coding base triplet of the lumazine synthase, coding for 6 histidine molecules and a recognition sequence for the restriction endonuclease NotI (GC * GGCCGC). This recognition sequence is translated into three alanine molecules. The PCR was carried out analogously to Example 1A).

B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 531 bp erhalten wurde, gereinigt.B) The PCR approach was carried out according to Example 1B), a DNA fragment with a length of 531 bp was purified.

D) Das gereinigte DNA-Fragment aus C) wurde analog Beispiel 8H) mit der Restriktions endonuklease EcoRI behandelt und ein Fragment mit der Länge von 516 bp erhalten.D) The purified DNA fragment from C) was analogous to Example 8H) with the restriction treated endonuclease EcoRI and obtained a fragment with the length of 516 bp.

E) Der Expressionsvektor wurde gemäß Beispiel 21E) vorbereitet.E) The expression vector was prepared according to Example 21E).

F) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1E) bis J), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XL1-pNCO-HIS6-C-Biotag-AA-LuSy erhalten wurde.F) The further processing was carried out analogously to Example 1E) to J), the Escherichia coli Expression strain XL1-pNCO-HIS6-C-Biotag-AA-LuSy was obtained.

G) Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Beispiel 1R). Nach der Zentrifugation wurde der klare Überstand verworfen und mit dem verbliebenen Rückstand weitergearbeitet.G) The cells were cultivated according to Example 1R). After centrifugation, the discarded clear supernatant and continued to work with the remaining residue.

H) Der unlösliche Rückstand aus G) wurde in 50 ml NTA-Puffer A (50 mM Na-Phosphat-Puf fer pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,02% Na-Azid, 6 M Guanidiniumhydrochlorid) während 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation (Sorvall SS34-Rotor, 15000 Umin^-1, 20°C, 20 min). Der Überstand wurde dekantiert und mit 6 ml Ni-NTA-Agarose (Quiagen, Hilden) versetzt und über Nacht unter umschwenken inkubiert (20°C). Anschließend wurde die Suspension einer Zentrifugation unterworfen (800 g, 20 °C, 10 min). Der Überstand wurde dekantiert. Der Rückstand wurde in 10 ml NTA-Puffer- A aufgenommen und 15 min unter umschwenken bei 20°C inkubiert. Nach Zentrifugation (s.o.) und Abnahme des Überstandes wurde der Rückstand in 10 ml NTA-Puffer-B (8 M Harnstoff, 100 mM Na-Phosphat-Puffer, 10 mM Tris pH 6,3) für 15 min bei 20°C inkubiert und weiterverarbeitet (s.o.). Der Vorgang wurde ein zweites Mal wiederholt. Anschließend wurde der Rückstand zweimal mit je 10 ml NTA-Puffer-C (8 M Harnstoff, 100 mM Na- Phosphat-Puffer, 10 mM Tris pH 5,9) behandelt. Zum Schluß wurde der Rückstand zwei mal mit je 10 ml NTA-Puffer-D (8 M Harnstoff, 100 mM Na-Phosphat-Puffer, 10 mM Tris pH 4,5) gewaschen. Die Verunreinigungen konnten mit NTA-Puffer-B entfernt werden, das Zielprotein wurde mit NTA-Puffer-C bzw. D eluiert. Auf einem denaturierenden Poly acrylamidgel (nach Neutralisation) gemäß Beispiel 1M) konnte nur noch eine singuläre Bande bei 19,3 kDa beobachtet werden. H) The insoluble residue from G) was immersed in 50 ml of NTA buffer A (50 mM Na phosphate buffer pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.02% Na azide, 6 M guanidinium hydrochloride) for 24 hours Stir incubated at room temperature. This was followed by centrifugation (Sorvall SS34 rotor, 15000 Umin ^-1 , 20 ° C, 20 min). The supernatant was decanted and mixed with 6 ml of Ni-NTA agarose (Quiagen, Hilden) and incubated overnight with inverting (20 ° C.). The suspension was then subjected to centrifugation (800 g, 20 ° C., 10 min). The supernatant was decanted. The residue was taken up in 10 ml of NTA buffer A and incubated at 20 ° C. for 15 min while swirling. After centrifugation (see above) and removal of the supernatant, the residue was incubated in 10 ml of NTA buffer B (8 M urea, 100 mM Na phosphate buffer, 10 mM Tris pH 6.3) at 20 ° C. and processed (see above). The process was repeated a second time. The residue was then treated twice with 10 ml of NTA buffer C (8 M urea, 100 mM Na phosphate buffer, 10 mM Tris pH 5.9). Finally, the residue was washed twice with 10 ml of NTA buffer D (8 M urea, 100 mM Na phosphate buffer, 10 mM Tris pH 4.5). The contaminants could be removed with NTA buffer B, the target protein was eluted with NTA buffer C or D. On a denaturing poly acrylamide gel (after neutralization) according to Example 1M), only a single band at 19.3 kDa could be observed.

Beispiel 23Example 23 Kopplung eines artefiziellen 13 Aminosäuren langen, in vivo biotinylierfähigen Peptids, über einen Linker bestehend aus den Aminosäuren H-H-H-H-H-H-GGS-GA-A-A an den C-Terminus der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicusCoupling of an artificial 13 amino acid long, in vivo biotinylatable peptide, via a linker consisting of the amino acids H-H-H-H-H-H-GGS-GA-A-A the C-terminus of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus

A) Das Gen für die synthetische Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde analog Beispiel 21 unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und der synthetischen Oligonukleotide EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2A)) und AQUI-C-HIS₆-GLY₂-SER-GLY-NotI (5' tat tat tat agc ggc cgc gcc aga acc gcc atg gtg gtg atg gtg atg tcg gag aga ctt gaa taa gtt tgc 3') aus dem Plasmid pNCO-AA-LuSy (siehe Beispiel 20) amplifiziert. Das Oligonukleotid AQUI- C-HIS₆-GLY₂-SER-GLY-NotI ist an seinem 3'-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase, führt unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett der Lumazinsynthase eine Sequenz, kodierend für für das Peptid H-H-H-H-H-H-G-G-S-G, und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease NotI (GC*GGCCGC) ein. Diese Erkennungssequenz wird in drei Alaninmoleküle translatiert. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1A).A) The gene for the synthetic lumazine synthase from Aquifex aeolicus was analogous to Example 21 using the polymerase chain reaction and the synthetic oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see Example 2A)) and AQUI-C-HIS ₆ -GLY ₂ -SER-GLY-NotI (5 'tat tat tat agc ggc cgc gcc aga acc gcc atg gtg gtg atg gtg atg tcg gag aga ctt gaa taa gtt tgc 3') amplified from the plasmid pNCO-AA-LuSy (see Example 20). The oligonucleotide AQUI-C-HIS ₆ -GLY ₂ -SER-GLY-NotI is complementary at its 3 'end to the gene for the lumazine synthase, has a sequence immediately behind the last coding base triplet of the lumazine synthase, coding for the peptide HHHHHHGGSG, and a recognition sequence for the restriction endonuclease NotI (GC * GGCCGC). This recognition sequence is translated into three alanine molecules. The PCR was carried out analogously to Example 1A).

B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 543 bp erhalten wurde, gereinigt.B) The PCR approach was carried out according to Example 1B), a DNA fragment with a length of 543 bp was purified.

D) Das gereinigte DNA-Fragment aus C) wurde analog Beispiel 8H) mit der Restriktions endonuklease EcoRI behandelt und ein Fragment mit der Länge von 528 bp erhalten.D) The purified DNA fragment from C) was analogous to Example 8H) with the restriction Endonuclease EcoRI treated and a fragment with the length of 528 bp obtained.

F) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1E) bis L), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XL1-pNCO-HIS6-GLY2-SER-GLY-C-Biotag-AA-LuSy erhalten wurde.F) The further processing was carried out analogously to Example 1E) to L), the Escherichia coli Expression strain XL1-pNCO-HIS6-GLY2-SER-GLY-C-Biotag-AA-LuSy was obtained.

G) Die weitere Verarbeitung erfolgte gemäß Beispiel 22 G) bis H) wobei ein vergleichbares Ergebnis erzielt wurde.G) The further processing was carried out according to Example 22 G) to H), with a comparable one Result was achieved.

Beispiel 24Example 24 Herstellung eines chimären Proteins bestehend aus einem Teil der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis und einem Teil der thermostabilen Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicusProduction of a chimeric protein consisting of part of the lumazine synthase Bacillus subtilis and part of the thermostable lumazine synthase from Aquifex aeolicus

A) Ein Teil des Gens für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und der synthetischen Oligonukleotide EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2A)) und BS-LuSy-AgeI (5' tat tat tat aac cgg tat ttc aaa tgc gcc 3') aus dem Plasmid pNCO-BS-LuSy (siehe Beispiel 1) amplifiziert. Das Oligonukleotid BS-LuSy-AgeI ist an seinem 3'-Ende komplementär zum Gen für die Lumazinsynthase und führt eine Er kennungssequenz fiür die Restriktionsendonuklease AgeI (A*CCGGT) in die DNA-Sequenz ein. Die Durchführung der PCR erfolgte analog Beispiel 1A). A) Part of the gene for Bacillus subtilis lumazine synthase was used the polymerase chain reaction and the synthetic oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see Example 2A)) and BS-LuSy-AgeI (5 'tat tat tat aac cgg tat ttc aaa tgc gcc 3') from the Plasmid pNCO-BS-LuSy (see Example 1) amplified. The oligonucleotide BS-LuSy-AgeI is at its 3 'end complementary to the gene for lumazine synthase and carries an Er identifier sequence for the restriction endonuclease AgeI (A * CCGGT) in the DNA sequence on. The PCR was carried out analogously to Example 1A).

B) Der PCR-Ansatz wurde gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 225 bp erhalten wurde, gereinigt. Das gereinigte DNA-Fragment aus B) wurde mit der Restriktionsendonuklease AgeI verdaut.
30,0 µl DNA-Fragmente aus C)
4,0 µl AgeI [8 U]
10,0 µl Puffer 1 (10 ×) [10 mM Bis-Tris-Propane-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, pH 7,0]
56,0 µl H₂O_bidest
Der Ansatz wurde 180 min bei 25°C inkubiert und wie unter B) beschrieben gereinigt und zum Verdau mit der Restriktionsendonuklease EcoRI eingesetzt.B) The PCR mixture was purified according to Example 1B), a DNA fragment with a length of 225 bp being obtained. The purified DNA fragment from B) was digested with the restriction endonuclease AgeI.
30.0 µl DNA fragments from C)
4.0 µl AgeI [8 U]
10.0 µl buffer 1 (10 ×) [10 mM bis-tris-propane-HCl, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, pH 7.0]
56.0 µl H ₂ O _bidist
The mixture was incubated at 25 ° C. for 180 min and purified as described under B) and used for digestion with the restriction endonuclease EcoRI.

C) Verdau des gereinigten Fragmentes aus B) mit der Restriktionsendonuklease EcoRI.
30,0 µl DNA-Fragment aus B)
3,0 µl EcoRI [60 U]
20,0 µl OPAU (10 ×)
47,0 µl H₂O_bidest
Der Ansatz wurde 180 min bei 37°C inkubiert und das entstanden DNA-Fragment wie unter Beispiel 1B) beschrieben gereinigt.C) Digestion of the purified fragment from B) with the restriction endonuclease EcoRI.
30.0 µl DNA fragment from B)
3.0 µl EcoRI [60 U]
20.0 µl OPAU (10 ×)
47.0 µl H ₂ O _bidist
The mixture was incubated at 37 ° C. for 180 min and the resulting DNA fragment was purified as described in Example 1B).

D) Das Plasmid PNCO-AA-LuSy (30 µl, 5 µgl wurde analog B) und C) behandelt und an schließend gemäß Beispiel 1B) gereinigt, wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 3676 bp erhalten wurde.D) The plasmid PNCO-AA-LuSy (30 .mu.l, 5 .mu.g was analogous to B) and C) treated and on finally purified according to Example 1B), a DNA fragment with a length of 3676 bp was obtained.

E) Die weitere Verarbeitung erfolgte analog Beispiel 1E) bis L), wobei der Escherichia coli Expressionsstamm XL1-pNCO-BS-LuSy-AgeI-AA-LuSy erhalten wurde.E) The further processing was carried out analogously to Example 1E) to L), the Escherichia coli Expression strain XL1-pNCO-BS-LuSy-AgeI-AA-LuSy was obtained.

F) Bei der Überprüfung der Funktionalität der Lumazinsynthase gemäß Beispiel 1N) konnte eine enzymatische Aktivität ermittelt werden.F) When checking the functionality of the lumazine synthase according to Example 1N) could an enzymatic activity can be determined.

G) Die Überprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe der löslichen Proteine wurde analog Beispiel 1M) durchgeführt. Im Rohextrakt des Stammes XL1- pNCO-BS-LuSy-AgeI-AA- LuSy konnte eine signifikante Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 16,4 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-BS-LuSy-AgeI-AA-LuSy Expressionsplasmid nicht zu sehen war.G) The check of the expression rate or the size of the soluble proteins was analogous Example 1M). In the crude extract of the strain XL1- pNCO-BS-LuSy-AgeI-AA- LuSy was able to detect a significant protein band with a molecular weight of approx. 16.4 kDa can be observed in a comparison strain without pNCO-BS-LuSy-AgeI-AA-LuSy Expression plasmid was not seen.

Beispiel 25Example 25 Herstellung eines Vektors zur rekombinanten N-terminalen Fusion von Fremdpeptiden an die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus (Fremdpeptide können auch ohne Linker direkt an das Trägerprotein fusioniert werden; hierfür wird die singuläre Restriktionsschnittstelle BgIII verwendet, die sich in der Sequenz des Trägerproteins befindet)Production of a vector for the recombinant N-terminal fusion of foreign peptides to the lumazine synthase from Aquifex aeolicus (foreign peptides can also be used without a linker be fused directly to the carrier protein; for this the singular Restriction site BglII used, which is in the sequence of the carrier protein located)

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde mit den Oligonukleotiden AOUI-11-BglII ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg cag atc tac gaa gg 3'), welches am 3'-Ende teilweise komplementär zum 5'-Ende der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus ist, wobei durch eine stille Mutation eine singuläre Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BglII (A*GATCT) eingeführt wird und am 5'-Ende eine ribosomale Bindungsstelle und eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease EcoRI einführt, und AQUI-10 (siehe Beispiel 20I)) aus dem Plasmid pNCO-AA-LuSy amplifiziert. Die PCR wurde analog Beispiel 1A) durchgeführt.A) The gene for the lumazine synthase from Aquifex aeolicus was with the oligonucleotides AOUI-11-BglII ata ata gaa ttc att aaa gag gag aaa tta act atg cag atc tac gaa gg 3 '), which at the 3 'end is partially complementary to the 5' end of the lumazine synthase from Aquifex is aeolic, whereby a silent mutation is a singular recognition sequence for the Restriction endonuclease BglII (A * GATCT) is introduced and one at the 5 'end ribosomal binding site and a recognition sequence for the restriction endonuclease Introduces EcoRI, and AQUI-10 (see Example 20I) from the plasmid pNCO-AA-LuSy amplified. The PCR was carried out analogously to Example 1A).

B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 510 bp erhalten wurde.B) The PCR mixture was purified according to Example 1B), with a DNA fragment with a length of 510 bp was obtained.

C) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1B), E) bis L). Es wird das Plasmid pNCO AA-BglII-LuSy erhalten.C) The further procedure was carried out analogously to Example 1B), E) to L). It becomes the plasmid pNCO AA-BglII-LuSy obtained.

D) Die Uberprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges er folgte analog Beispiel 1M). Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-AA-BglII-LuSy konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 16,7 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-AA-BglII-LuSy-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 20% bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).D) Checking the expression rate or the size of the monomeric protein strand followed analogously to Example 1M). In the crude extract of the strain XL1-pNCO-AA-BglII-LuSy a protein band with a molecular weight of approx. 16.7 kDa was observed be in a control strain without pNCO-AA-BglII-LuSy expression plasmid was not to be seen. The observed band corresponded to a share of approx. 20% on all soluble proteins (estimated).

E) Die weitere Analytik wurde gemäß Beispiel 20O) bis R) durchgeführt, wobei keine signifi kanten Unterschiede zum Wildtyp-Enzym (AA-LuSy) zu beobachten waren.E) The further analysis was carried out according to Example 20O) to R), with no signifi edge differences to the wild-type enzyme (AA-LuSy) were observed.

Beispiel 26Example 26 Herstellung eines Vektors zur C-terminalen Fusion von Fremdpeptiden an die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicusPreparation of a vector for the C-terminal fusion of foreign peptides to the Lumazine synthase from Aquifex aeolicus

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus wurde mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2A)) und AOUI-10-(BamHI) (5' tat tat gga tcc tcg gag aga ctt gaa taa gtt tgc 3'), welches am 3'-Ende komplementär zum 3'-Ende der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus ist und unmittelbar hinter dem letzten kodierenden Basentriplett eine singuläre Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI (G*GATCC) einführt (das, in der ursprünglichen Sequenz enthaltene Stopcodon wird aufgelöst; als neues Stopcodon dient ein, in der Vektorsequenz vorhandenes Stopcodon), aus dem Plasmid pNCO-AA-LuSy amplifiziert. Die PCR wurde analog Beispiel 1A) durchgeführt.A) The gene for the lumazine synthase from Aquifex aeolicus was with the oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see Example 2A)) and AOUI-10- (BamHI) (5 'tat tat gga tcc tcg gag aga ctt gaa taa gtt tgc 3 '), which at the 3'-end is complementary to the 3'-end of the Lumazine synthase from Aquifex aeolicus is coding just after the last one Base triplet a unique recognition sequence for the restriction endonuclease BamHI (G * GATCC) (which becomes the stop codon contained in the original sequence dissolved; a stop codon present in the vector sequence serves as the new stop codon), amplified from the plasmid pNCO-AA-LuSy. The PCR was carried out analogously to Example 1A) carried out.

B) Die Reinigung des PCR-Ansatzes erfolgte gemäß Beispiel 1B), wobei ein DNA-Fragment mit einer Länge von 507 bp erhalten wurde.B) The PCR mixture was purified according to Example 1B), with a DNA fragment with a length of 507 bp was obtained.

C) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1B), E) bis L). Es wird das Plasmid pNCO AA-LuSy-(BamHI) erhalten.C) The further procedure was carried out analogously to Example 1B), E) to L). It becomes the plasmid pNCO AA-LuSy- (BamHI) obtained.

D) Die Überprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges er folgte analog Beispiel 1M). Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-AA-LuSy-(BamHI) konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 17,8 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-AA-LuSy-(BamHI)-Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 20% bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).D) Checking the expression rate or the size of the monomeric protein strand followed analogously to Example 1M). In the crude extract of the strain XL1-pNCO-AA-LuSy- (BamHI) a protein band with a molecular weight of approx. 17.8 kDa was observed be in a control strain without pNCO-AA-LuSy (BamHI) expression plasmid was not to be seen. The observed band corresponded to a share of approx. 20% on all soluble proteins (estimated).

Beispiel 27Example 27 Herstellung eines Vektors zur gleichzeitigen N- und C-terminalen Fusion von Fremdpeptiden an die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicusPreparation of a vector for the simultaneous N- and C-terminal fusion of Foreign peptides to the lumazine synthase from Aquifex aeolicus

A) Das Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifer acolicus wurde mit den Oligonukleotiden EcoRI-RBS-2 (siehe Beispiel 2A)) und AQUI-10-(BamHI) (siehe Beispiel 26), aus dem Plasmid pNCO-AA-BglII-LuSy amplifziert. Die PCR wurde analog Beispiel 1A) durchgeführt.A) The gene for lumazine synthase from Aquifer acolicus was linked to the oligonucleotides EcoRI-RBS-2 (see Example 2A)) and AQUI-10- (BamHI) (see Example 26), from which Plasmid pNCO-AA-BglII-LuSy amplified. The PCR was carried out analogously to Example 1A) carried out.

C) Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog Beispiel 1B), E) bis L). Es wird das Plasmid pNCO-AA-BglII-LuSy-(BamHI) erhalten.C) The further procedure was carried out analogously to Example 1B), E) to L). It becomes the plasmid pNCO-AA-BglII-LuSy- (BamHI) obtained.

D) Die Überprüfung der Expressionsrate bzw. der Größe des monomeren Proteinstranges er folgte analog Beispiel 1M). Im Rohextrakt des Stammes XL1-pNCO-AA-BglII-LuSy- (BamHI) konnte eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 17,8 kDa beobachtet werden, die in einem Vergleichsstamm ohne pNCO-AA-BglII-LuSy-(BamHI)- Expressionsplasmid nicht zu sehen war. Die beobachtete Bande entsprach einem Anteil von ca. 20% bezogen auf alle löslichen Proteine (geschätzt).D) Checking the expression rate or the size of the monomeric protein strand followed analogously to Example 1M). In the crude extract of the strain XL1-pNCO-AA-BglII-LuSy- (BamHI) a protein band with a molecular weight of approx. 17.8 kDa observed in a control strain without pNCO-AA-BglII-LuSy- (BamHI) - Expression plasmid was not seen. The observed band corresponded to a share of approx. 20% based on all soluble proteins (estimated).

E) Die weitere Analytik wurde gemäß Beispiel 20O) bis R) durchgeführt, wobei keine signifi kanten Unterschiede zum Wildtyp-Enzym (AA-LuSy) zu beobachten waren. E) The further analysis was carried out according to Example 20O) to R), with no signifi edge differences to the wild-type enzyme (AA-LuSy) were observed.

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Sequenzprotokolle Sequence listings

Claims

1. Protein-Konjugat bestehend aus mindestens einem Funktionsbereich an einer beliebigen Position der Sequenz eines Trägerproteinbereichs zur Ausbildung einer Kapsid- Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ, so daß deren Außenperipherie mit einer Vielzahl dieser Funktionsbereiche kovalent verknüpft ist.1. Protein conjugate consisting of at least one functional area on any one Position of the sequence of a carrier protein region to form a capsid Spatial structure of the lumazine synthase type, so that its outer periphery with a variety these functional areas are covalently linked.

2. Rekombinant herstellbares Protein-Konjugat bestehend aus mindestens einem Funktionsproteinbereich am N-Terminus und/oder C-Terminus und/oder inseriert in eine Schleifenregion der Sequenz eines Trägerproteinbereichs zur Ausbildung einer Kapsid- Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ, so daß deren Außenperipherie mit einer Vielzahl der Funktionsproteinbereiche kovalent verknüpft ist.2. Recombinantly producible protein conjugate consisting of at least one Functional protein area at the N-terminus and / or C-terminus and / or inserted into one Loop region of the sequence of a carrier protein region to form a capsid Spatial structure of the lumazine synthase type, so that its outer periphery with a variety the functional protein areas are covalently linked.

3. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich eine Aminosäuresequenz - ausgewählt aus einer Sequenzmenge - aufweist, die sich dadurch ergibt, daß man für jede Aminosäureposition in der Sequenz einer vorbestimmten nativen Lumazinsynthase eine Aminosäure oder eine Deletion aus der entsprechenden Position eines Alignments der vorbestimmten Lumazinsynthase-Sequenz mit mindestens einer nativen Lumazinsynthase-Sequenz eines anderen Organismus auswählt.3. Protein conjugate according to claim 1 and 2, characterized in that the Carrier protein region an amino acid sequence - selected from a sequence set - which results from the fact that one for each amino acid position in the sequence predetermined native lumazine synthase an amino acid or a deletion from the corresponding position of an alignment of the predetermined lumazine synthase sequence selects at least one native lumazine synthase sequence from another organism.

4. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich die Sequenz einer nativen Lumazinsynthase aufweist.4. Protein conjugate according to claim 1 and 2, characterized in that the Carrier protein region has the sequence of a native lumazine synthase.

5. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich die Sequenz einer thermostabilen nativen Lumazinsynthase aufweist.5. Protein conjugate according to claim 1 and 2, characterized in that the Carrier protein region has the sequence of a thermostable native lumazine synthase.

6. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß die thermostabile native Lumazinsynthase die Proteinsequenz der Lumazinsynthase aus einem hyperthermophilen Mikroorganismus, insbesonders aus Aquifex aeolicus aufweist.6. Protein conjugate according to claim 1 and 2, characterized in that the thermostable native lumazine synthase the protein sequence of lumazine synthase from a Hyperthermophilic microorganism, especially from Aquifex aeolicus.

7. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich aus einer Mischsequenz bestehend aus den Aminosäurenpositionen 1- 60 der nativen Lumazinsynthase aus einem mesophilen Organismus bezogen auf Bacillus subtilis, und den Aminosäurenpositionen 61-154 der nativen Lumazinsynthase aus einem hyperthermophilen Mikroorganismus, bezogen auf Aquifex aeolicus, aufgebaut ist.7. Protein conjugate according to claim 1 and 2, characterized in that the Carrier protein region from a mixed sequence consisting of amino acid positions 1- 60 of the native lumazine synthase from a mesophilic organism based on Bacillus subtilis, and amino acid positions 61-154 of native lumazine synthase from one hyperthermophilic microorganism, based on Aquifex aeolicus.

8. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich aus einer beliebigen Sequenz besteht, wobei die Hauptkette dieser Sequenz in α-Helix und β-Faltblatt-Motiven faltet, wobei 4 β-Segmente ein paralleles, zentrales 4-strängiges β-Faltblatt bilden und wobei das zentrale 4-strängige β-Faltblatt auf beiden Seiten von jeweils 2 α-Helices flankiert wird, so daß sich 5 Einheiten dieser α-β- Motive zu einer pentameren Struktur zusammenlagern, wobei der N-Terminus einer jeden Einheit in der benachbarten Einheit das fünfte β-Segment zum zentralen 4-strängigen β- Faltblatt bilden kann, wobei 12 dieser pentameren Unterstrukturen sich zusammenlagern und die ikosaedrische Struktur einer Lumazinsynthase bilden und die N- und C-Termini der beliebigen Sequenz mit den oben beschriebenen Strukturmerkmalen sich an der Oberfläche des gebildeten lkosaeders befinden und wobei die beliebige, Sequenz vorzugsweise aus dem Vergleich einer Sequenzmenge verschiedener, d. h. aus verschiedenen Organismen stammenden Lumazinsynthasesequenzen, insbesondere unter Verwendung von Suchalgorithmen nach Altschul et al. (1997), gewonnen werden.8. Protein conjugate according to claim 1 and 2, characterized in that the Carrier protein region consists of any sequence, the main chain of which Sequence folds into α-helix and β-sheet motifs, with 4 β segments forming a parallel, form the central 4-stranded β-sheet and the central 4-stranded β-sheet is flanked on both sides by 2 α-helices, so that 5 units of these α-β- Assemble motifs into a pentameric structure, with the N-terminus of each Unit in the neighboring unit the fifth β segment to the central 4-strand β- Leaflet can form, with 12 of these pentameric substructures assemble and form the icosahedral structure of a lumazine synthase and the N and C termini of any sequence with the structural features described above can be found on the surface of the icosahedron formed and the arbitrary sequence is preferably from the Comparison of a sequence set of different, i.e. H. from different organisms originating lumazine synthase sequences, in particular using Search algorithms according to Altschul et al. (1997).

9. Protein-Konjugat nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich eine Sequenz einer nativen Lumazinsynthase aufweist, bei der mindestens eine Cysteineinheit durch eine andere Aminosäure ausgetauscht oder deletiert ist oder chemisch modifiziert ist.9. Protein conjugate according to claim 1 and 2, characterized in that the Carrier protein region has a sequence of a native lumazine synthase, in which at least one cysteine unit has been replaced or deleted by another amino acid or is chemically modified.

10. Protein-Konjugat nach Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet, daß eine Cysteineinheit an einer der Position 93 und/oder der Position 139 der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis entsprechenden Position deletiert ist oder gegen eine andere Aminosäure, vorzugsweise Serin, ausgetauscht ist.10. Protein conjugate according to claim 9, characterized in that a cysteine unit one of position 93 and / or position 139 of the lumazine synthase from Bacillus subtilis corresponding position is deleted or against another amino acid, preferably Serine, is exchanged.

11. Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich und der Funktionsproteinbereich über ein Linkerpeptid miteinander verknüpft sind.11. Protein conjugate according to one of claims 1 to 10, characterized in that the Carrier protein region and the functional protein region with one another via a linker peptide are linked.

12. Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 2 bis 11 dadurch gekennzeichnet, daß der Funktionsproteinbereich die Sequenz einer Dihydrofolatreduktase, eines Maltose-bindenden Proteins, eines in vivo biotinylierbaren Peptids, eines Antigen-wirksamen Peptids, insbesondere aus einem Oberflächenprotein eines Virus, eines durch einen monoklonalen Antikörper erkennbaren Peptids, eines zufällig generierten Peptids, oder eine chemisch derivatisierbare Aminosäure, beispielsweise Cystein oder Lysin ist.12. Protein conjugate according to one of claims 2 to 11, characterized in that the Functional protein area the sequence of a dihydrofolate reductase, a maltose-binding Protein, an in vivo biotinylatable peptide, an antigen-active peptide, in particular from a surface protein of a virus, one by a monoclonal Antibody recognizable peptide, a randomly generated peptide, or a chemical one derivatizable amino acid, for example cysteine or lysine.

13. Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 2 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerproteinbereich chemisch modifiziert ist.13. Protein conjugate according to one of claims 2 to 12, characterized in that the Carrier protein area is chemically modified.

14. Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 2 bis 13 dadurch gekennzeichnet, daß der Funktionsproteinbereich chemisch modifiziert, vorzugsweise biotinyliert ist.14. Protein conjugate according to one of claims 2 to 13, characterized in that the Functional protein area is chemically modified, preferably biotinylated.

15. Heterooligomeres Protein-Konjugat bestehend aus Mischungen von mindestens zwei unter schiedlichen Protein-Konjugaten nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder von mindestens einem Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und mindestens einem Trägerproteinbereich ohne Funktionsproteinbereich mit einer Sequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die einzelnen Proteine gegebenfalls durch chemische Behandlung miteinander kovalent verknüpft sind.15. Heterooligomeric protein conjugate consisting of mixtures of at least two under different protein conjugates according to any one of claims 1 to 14 or of at least a protein conjugate according to any one of claims 1 to 14 and at least one Carrier protein region without a functional protein region with a sequence according to one of the Claims 3 to 8, wherein the individual proteins optionally by chemical treatment are covalently linked together.

16. Verfahren zur Herstellung eines Protein-Konjugats nach Anspruch 1 gekennzeichnet durch die folgenden Schitte,

a) Isolierung einer Lumazinsynthase aus einem Wild-Typ oder einem rekombinanten Organismus (Trägerprotein);
b) Chemische Kopplung von Funktionsmolekülen an das Trägerprotein.
c) Reinigung des Protein-Konjugats.

16. A method for producing a protein conjugate according to claim 1, characterized by the following steps,

a) isolation of a lumazine synthase from a wild type or a recombinant organism (carrier protein);
b) Chemical coupling of functional molecules to the carrier protein.
c) Purification of the protein conjugate.

17. Verfahren zur Herstellung eines Protein-Konjugats oder eines heterooligomeren Proteins nach einem der Ansprüche 2 bis 14 gekennzeichnet durch die folgenden Schitte,

a) Herstellung einer ersten DNA, die für den Trägerproteinbereich kodiert;
b) Das Fusionieren von mindestens einer zweiten DNA, die für den Funktionsbereich und gegebenenfalls für das Linkerprotein kodiert mit dem 5'-Ende und/oder dem 3'- Ende der ersten DNA und/oder Inserieren der zweiten DNA in einem für eine Schleifenregion des Trägerproteinbereichs kodierenden Region der ersten DNA unter Bildung einer artefiziellen DNA.
c) Umwandlung der artefiziellen DNA der Stufe b) in ein Expressionsplasmid.
d) Transformation von Wirtszellen mit einem oder mehreren der in Stufe c) erhaltenen Expressionsplasmiden.
e) Expression der artefiziellen DNA in den transformierten Wirtszellen unter Bildung eines Proteinkonjugats gegebenenfalls unter der Einführung einer vorbestimmten posttranslationalen Modifikation des Protein-Konjugats in vivo, vorzugsweise durch Phosphorylierung, Glycosylierung oder Biotinylierung.
f) Reinigung des Protein-Konjugats.
g) gegebenenfalls Modifizierung des Protein-Konjugats durch chemische Kopplung von Aminosäurenresten auf der Proteinoberfläche einer aus dem Protein-Konjugat gebildeten Kapsid-Raumstruktur mit frei bestimmbaren Kopplungspartnern.

17. A method for producing a protein conjugate or a heterooligomeric protein according to one of claims 2 to 14, characterized by the following steps,

a) preparation of a first DNA which codes for the carrier protein region;
b) The fusion of at least one second DNA which codes for the functional region and optionally for the linker protein with the 5 'end and / or the 3' end of the first DNA and / or inserting the second DNA in a for a loop region of the Region of the first DNA encoding the carrier protein region to form an artificial DNA.
c) conversion of the artificial DNA of stage b) into an expression plasmid.
d) transformation of host cells with one or more of the expression plasmids obtained in step c).
e) Expression of the artificial DNA in the transformed host cells to form a protein conjugate, optionally with the introduction of a predetermined post-translational modification of the protein conjugate in vivo, preferably by phosphorylation, glycosylation or biotinylation.
f) Purification of the protein conjugate.
g) optionally modification of the protein conjugate by chemical coupling of amino acid residues on the protein surface of a capsid spatial structure formed from the protein conjugate with freely definable coupling partners.

18. Verfahren nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, daß man ein heterooligomeres Protein herstellt durch

a) Mischen verschiedener, gemäß Anspruch 16, Stufe c) und/oder Anspruch 17, Stufe f) gewonnener, Protein-Konjugate.
b) Denaturierung der erhaltenen Mischung und
c) Renaturierung der Mischung; oder durch
- 1. Denaturierung verschiedener, gemäß Anspruch 16, Stufe c) und/oder Anspruch 17, Stufe f) gewonnener, Protein-Konjugate,
- 2. Mischung der denaturierten Protein-Konjugate
- 3. Renaturierung der Mischung.

18. The method according to claim 15, characterized in that one produces a heterooligomeric protein by

a) Mixing different protein conjugates obtained according to claim 16, stage c) and / or claim 17, stage f).
b) denaturing the mixture obtained and
c) renaturation of the mixture; or by
- 1. denaturation of various protein conjugates obtained according to claim 16, stage c) and / or claim 17, stage f),
- 2. Mixture of denatured protein conjugates
- 3. Renaturation of the mixture.

19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Protein-Konjugate ein setzt, die unter Verwendung eines faltungsunterstützenden Liganden hergestellt wurden.19. The method according to claim 15, characterized in that one protein conjugates sets that were produced using a folding-supporting ligand.

20. Vektoren zur Herstellung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 2 bis 14.20. Vectors for the production of the protein conjugates according to one of claims 2 to 14.

21. DNA, die für ein Protein gemäß Anspruch 20 kodiert.21. DNA coding for a protein according to claim 20.

22. Protein bestehend aus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis gekennzeichnet dadurch, daß die Aminosäure Cystein an Position 93 gegen die Aminosäure Serin ausgetauscht ist.22. Protein consisting of the lumazine synthase from Bacillus subtilis, characterized in that that the amino acid cysteine at position 93 is replaced by the amino acid serine.

23. Protein bestehend aus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis gekennzeichnet dadurch, daß die Aminosäure Cystein an Position 139 gegen die Aminosäure Serin ausgetauscht ist.23. Protein consisting of the lumazine synthase from Bacillus subtilis, characterized in that that the amino acid cysteine at position 139 is replaced by the amino acid serine.

24. Protein bestehend aus der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis gekennzeichnet dadurch, daß die Aminosäure Cystein an den Positionen 93 und 139 gegen die Aminosäuren Serin ausgetauscht sind.24. Protein consisting of the lumazine synthase from Bacillus subtilis, characterized in that that the amino acid cysteine at positions 93 and 139 against the amino acids serine are exchanged.

25. An die Kodon-Verwendung von Escherichia coli angepasste DNA zur Herstellung der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus in einem rekombinanten Escherichia coli Stamm.25. DNA adapted to the codon use of Escherichia coli for the production of Lumazine synthase from Aquifex aeolicus in a recombinant Escherichia coli strain.

26. Protein bestehend aus der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus zur Verwendung als Trägerprotein gemäß Anspruch 1.26. Protein consisting of the lumazine synthase from Aquifex aeolicus for use as Carrier protein according to claim 1.

27. Chimäres Protein bestehend aus den Aminosäuren 1-60 der Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis und den Aminosäuren 61-154 der Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus zur Verwendung als Trägerprotein gemäß Anspruch 1.27. Chimeric protein consisting of amino acids 1-60 of lumazine synthase from Bacillus subtilis and amino acids 61-154 of lumazine synthase from Aquifex aeolicus Use as a carrier protein according to claim 1.

28. Vektor zur Herstellung von Protein-Konjugaten nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 5'-Ende des Trägerproteingens vom Lumazinsynthase-Typs befindet, wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich, einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ und optional ein Linkerpeptid enthält und wobei der Funktionsproteinbereich und das Linkerpeptid sich am N-Terminus des Trägerproteinbereichs befinden und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) ein DNA-Fragment kodierend für einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ
b) ein DNA-Fragment kodierend für einen beliebigen Funktionsproteinbereich.
c) optional: ein DNA-Fragment kodierend für ein Linkerpeptid.

28. Vector for the production of protein conjugates according to claim 12, characterized in that the functional DNA portion is located at the 5 'end of the carrier protein gene of the lumazine synthase type, the fused gene coding for an artificial protein which comprises a functional protein region, contains a carrier protein region for the formation of a capsid spatial structure of the lumazine synthase type and optionally a linker peptide and the functional protein region and the linker peptide are located at the N-terminus of the carrier protein region and the vector contains the following components:

a) a DNA fragment coding for a carrier protein region to form a capsid spatial structure of the lumazine synthase type
b) a DNA fragment coding for any functional protein region.
c) optional: a DNA fragment coding for a linker peptide.

29. Ein Vektor nach Anspruch 28 gekennzeichnet dadurch, daß er das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis kodierend für den Trägerproteinbereich, das Gen für die Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli kodierend für den Funktionsproteinbereich und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment kodierend für ein Tripeptid bestehend aus der Aminosäure Alanin enthält. 29. A vector according to claim 28, characterized in that it contains the gene for the Bacillus subtilis lumazine synthase encoding the carrier protein region, the gene for the dihydrofolate reductase from Escherichia coli coding for the functional protein area and as a linker peptide a DNA fragment coding for a tripeptide consisting of the Contains amino acid alanine.

30. Ein Vektor nach Anspruch 28 gekennzeichnet dadurch, daß er das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis kodierend für den Trägerproteinbereich, das Gen für das "Maltose bindende Protein" aus Escherichia coli kodierend für den Funktionsproteinbereich und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment kodierend für die Aminosäurensequenz SNNNNNNNNNNLGIEGRISEFAAA enthält.30. A vector according to claim 28, characterized in that it contains the gene for the Bacillus subtilis lumazine synthase encoding the carrier protein region, the gene for the "Maltose binding protein" from Escherichia coli coding for the Functional protein area and as a linker peptide encoding a DNA fragment for the Contains amino acid sequence SNNNNNNNNNLLGIEGRISEFAAA.

31. Vektor zur Herstellung von Protein-Konjugaten nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 3'-Ende des Trägerproteingens vom Lumazinsynthase-Typs befindet und wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich, einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ und optional ein Linkerpeptid enthält und wobei der Funktionsproteinbereich und das Linkerpeptid sich am C-Terminus des Trägerproteinbereichs befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) ein DNA-Fragment kodierend für einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ (jeweils ohne Stop-Codon).
b) ein DNA-Fragment kodierend für einen beliebigen Funktionsproteinbereich.
c) optional: ein DNA-Fragment kodierend für ein Linkerpeptid.

31. Vector for the production of protein conjugates according to claim 12, characterized in that the functional DNA portion is at the 3 'end of the carrier protein gene of the lumazine synthase type and the fused gene codes for an artificial protein which comprises a functional protein region, contains a carrier protein region for the formation of a capsid spatial structure of the lumazine synthase type and optionally a linker peptide and wherein the functional protein region and the linker peptide are located at the C-terminus of the carrier protein region and the vector contains the following components:

a) a DNA fragment coding for a carrier protein region to form a capsid spatial structure of the lumazine synthase type (in each case without a stop codon).
b) a DNA fragment coding for any functional protein region.
c) optional: a DNA fragment coding for a linker peptide.

32. Vektor nach Anspruch 31 gekennzeichnet dadurch, daß er das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis kodierend für den Trägerproteinbereich, das Gen für die Dihydrofolatreduktase aus Escherichia coli kodierend für den Funktionsproteinbereich und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment kodierend für die Aminosäuresequenz LAAAGGGG enthält.32. Vector according to claim 31, characterized in that it contains the gene for the Bacillus subtilis lumazine synthase encoding the carrier protein region, the gene for the dihydrofolate reductase from Escherichia coli coding for the functional protein area and as a linker peptide a DNA fragment coding for the amino acid sequence LAAAGGGG contains.

33. Vektor nach Anspruch 31 gekennzeichnet dadurch, daß er das Gen für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus (gemäß Anspruch 25) kodierend für den Trägerproteinbereich und ein Genfragment kodierend für den Funktionsproteinbereich mit der Aminosäuresequenz GSVDLQPSLIS enthält. Der Vektor verfügt über eine singuläre Erkennungssequenz am 5'-Ende der Gensequenz des Trägerproteins für die Restriktionsendonuklease BglII, wobei diese Schnittstelle für eine Fusion von Fremdgenen an das 5'-Ende der Lumazinsynthase genutzt werden kann.33. Vector according to claim 31, characterized in that it is the gene for the Lumazine synthase from Aquifex aeolicus (according to claim 25) coding for the Carrier protein area and a gene fragment coding for the functional protein area with contains the amino acid sequence GSVDLQPSLIS. The vector has a singular Recognition sequence at the 5 'end of the gene sequence of the carrier protein for the Restriction endonuclease BglII, this interface for a fusion of foreign genes can be used at the 5 'end of the lumazine synthase.

34. Vektor zur Herstellung von Protein-Konjugaten nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 3'-Ende des Trägerproteingens vom Lumazinsynthase-Typs befindet, wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich, einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ und optional ein Linkerpeptid enthält und wobei der Funktionsproteinbereich und das Linkerpeptid sich am C-Terminus des Trägerproteinbereichs befindet und wobei der Funktionsproteinbereich in vivo biotinyliert wird und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) ein DNA-Fragment kodierend für einen Trägerproteinbereich zur Ausbildung einer Kapsid-Raumstruktur vom Lumazinsynthase-Typ (jeweils ohne Stop-Codon).
b) ein DNA-Fragment kodierend für ein biotinylierbares Peptid mit der Sequenz LGGIFEAMKMEWR, wobei die Aminosäure Lysin in vivo biotinyliert wird.
c) optional: ein DNA-Fragment kodierend für ein Linkerpeptid.

34. Vector for the production of protein conjugates according to claim 12, characterized in that the functional DNA portion is at the 3 'end of the carrier protein gene of the lumazine synthase type, the fused gene coding for an artificial protein which comprises a functional protein region, contains a carrier protein region for the formation of a capsid spatial structure of the lumazine synthase type and optionally a linker peptide and the functional protein region and the linker peptide are located at the C-terminus of the carrier protein region and the functional protein region is biotinylated in vivo and the vector contains the following components:

a) a DNA fragment coding for a carrier protein region to form a capsid spatial structure of the lumazine synthase type (in each case without a stop codon).
b) a DNA fragment coding for a biotinylatable peptide with the sequence LGGIFEAMKMEWR, the amino acid lysine being biotinylated in vivo.
c) optional: a DNA fragment coding for a linker peptide.

35. Ein Vektor nach Anspruch 34 gekennzeichnet dadurch, daß er das Gen für die Lumazinsynthase aus Bacillus subtilis kodierend für den Trägerproteinbereich, und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment kodierend für ein Tripeptid bestehend aus der Aminosäure Alanin enthält.35. A vector according to claim 34, characterized in that it contains the gene for the Bacillus subtilis lumazine synthase encoding the carrier protein region, and as Linker peptide a DNA fragment coding for a tripeptide consisting of the amino acid Contains alanine.

36. Ein Vektor nach Anspruch 34 gekennzeichnet dadurch, daß er das an die Kodon- Verwendung von Escherichia coli angepasste Gen kodierend für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus nach Anspruch 25 als Trägerproteinbereich, und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment kodierend für ein Tripeptid bestehend aus der Aminosäure Alanin enthält.36. A vector according to claim 34, characterized in that it connects to the codon Use of Escherichia coli-adapted gene coding for lumazine synthase Aquifex aeolicus according to claim 25 as a carrier protein region, and as a linker peptide DNA fragment coding for a tripeptide consisting of the amino acid contains alanine.

37. Ein Vektor nach Anspruch 34 gekennzeichnet dadurch, daß er das an die Kodon- Verwendung von Escherichia coli angepasste Gen kodierend für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus nach Anspruch 25 als Trägerproteinbereich, und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment kodierend für Peptid bestehend aus der Aminosäurensequeitz enthält.37. A vector according to claim 34, characterized in that it attaches the codon Use of Escherichia coli-adapted gene coding for lumazine synthase Aquifex aeolicus according to claim 25 as a carrier protein region, and as a linker peptide DNA fragment coding for peptide consisting of the amino acid sequence contains.

38. Ein Vektor nach Anspruch 34 gekennzeichnet dadurch, daß er das an die Kodon- Verwendung von Escherichia coli angepasste Gen kodierend für die Lumazinsynthase aus Aquifex aeolicus nach Anspruch 25 als Trägerproteinbereich, und als Linkerpeptid ein DNA-Fragment kodierend für Peptid bestehend aus der Aminosäurensequenz HHHHHHGGSGAAA enthält.38. A vector according to claim 34, characterized in that it attaches to the codon Use of Escherichia coli-adapted gene coding for lumazine synthase Aquifex aeolicus according to claim 25 as a carrier protein region, and as a linker peptide DNA fragment coding for peptide consisting of the amino acid sequence HHHHHHGGSGAAA contains.

39. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 5'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet, wobei der Funktions-DNA-Anteil für ein antigen wirksames Peptid aus dem VP2-Oberflächenprotein des "Mink enteritis Virus" kodiert und das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinanteil und einen Trägerproteinanteil enthält und wobei der Funktionsproteinanteil sich am N- Terminus der Lumazinsynthase befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis.
b) Peptidkodierende DNA am 5'-Ende des Lumazinsynthasegens. Das Fremdpeptid besitzt die Sequenz MGDGAVQPDGGQPAVRNER.

39. Vector for the production of a protein conjugate according to claim 12, characterized in that the functional DNA portion is at the 5 'end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis, the functional DNA portion for an antigenic peptide from VP2 Surface protein of the "mink enteritis virus" and the fused gene codes for an artificial protein which contains a functional protein component and a carrier protein component and the functional protein component is located at the N-terminus of the lumazine synthase and the vector contains the following components:

a) Lumazine synthase gene from Bacillus subtilis.
b) DNA encoding peptides at the 5 'end of the lumazine synthase gene. The foreign peptide has the sequence MGDGAVQPDGGQPAVRNER.

40. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet, wobei der Funktions-DNA-Anteil für ein antigen wirksames Peptid aus dem VP2-Oberflächenprotein des "Mink enteritis Virus" kodiert und wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinanteil und einen Trägerproteinanteil enthält, wobei der Funktionsproteinanteil sich am C-Terminus der Lumazinsynthase befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis (ohne Stop-Codon).
b) Peptidkodierende DNA am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens. Das Fremdpeptid besitzt die Sequenz GDGAVQPDGGQPAVRNER.

40. Vector for the production of a protein conjugate according to claim 12, characterized in that the functional DNA portion is at the 3 'end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis, the functional DNA portion for an antigenic peptide from VP2 Surface protein of the "mink enteritis virus" and the fused gene codes for an artificial protein which contains a functional protein component and a carrier protein component, the functional protein component being located at the C-terminus of the lumazine synthase and the vector containing the following components:

a) Bacillus subtilis lumazine synthase gene (without stop codon).
b) DNA encoding peptides at the 3 'end of the lumazine synthase gene. The foreign peptide has the sequence GDGAVQPDGGQPAVRNER.

41. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Anteil am 5'-Ende und am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet und der Funktions-DNA-Anteil für ein antigen wirksames Peptid aus dem VP2-Oberflächenprotein des "Mink enteritis Virus" kodiert und das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinanteil und einen Trägerproteinanteil enthält und wobei der Funktionsproteinanteil sich sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus der Lumazinsynthase befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis (ohne Stop-Codon).
b) Zwei peptidkodierende Sequenzen am 5'- und am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens.
Das Peptid am N-Terminus besitzt die Sequenz MGDGAVQPDGGQPAVRNER, das Peptid am C-Terminus die Sequenz GDGAVQPDGGQPAVRNER.

41. Vector for the production of a protein conjugate according to claim 12, characterized in that the functional DNA portion is at the 5 'end and at the 3' end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis and the functional DNA portion for an antigen an active peptide from the VP2 surface protein of the "mink enteritis virus" and the fused gene codes for an artificial protein which contains a functional protein component and a carrier protein component and the functional protein component is located both at the N-terminus and at the C-terminus of the lumazine synthase and the vector contains the following components:

a) Bacillus subtilis lumazine synthase gene (without stop codon).
b) Two peptide coding sequences at the 5 'and 3' end of the lumazine synthase gene.
The peptide at the N-terminus has the sequence MGDGAVQPDGGQPAVRNER, the peptide at the C-terminus has the sequence GDGAVQPDGGQPAVRNER.

42. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Bereich am 5'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet und der Funktions-DNA-Anteil für ein Oktapeptid (FLAG-Peptid) kodiert, welches durch einen monoklonalen Antikörper (vorzugsweise Anti-FLAG-M2; IBI E.coli FLAG® Expression System, Integra Biosciences; Fernwald) erkannt wird, wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich und einen Trägerproteinbereich enthält und wobei sich der Funktionsproteinbereich am N- Terminus der Lumazinsynthase befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis.
b) Peptidkodierende DNA am 5'-Ende des Lumazinsynthasegens. Das Fremdpeptid besitzt die Sequenz MDYKDDDDK.
c) DNA kodierend für ein Linkerpeptid mit der Sequenz VKL.

42. Vector for the production of a protein conjugate according to claim 12, characterized in that the functional DNA region is located at the 5 'end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis and the functional DNA portion codes for an octapeptide (FLAG peptide) , which is recognized by a monoclonal antibody (preferably anti-FLAG-M2; IBI E.coli FLAG® Expression System, Integra Biosciences; Fernwald), the fused gene coding for an artificial protein which contains a functional protein region and a carrier protein region, and wherein the functional protein region is located at the N-terminus of lumazine synthase and the vector contains the following components:

a) Lumazine synthase gene from Bacillus subtilis.
b) DNA encoding peptides at the 5 'end of the lumazine synthase gene. The foreign peptide has the sequence MDYKDDDDK.
c) DNA coding for a linker peptide with the sequence VKL.

43. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Bereich am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet, wobei der Funktions-DNA-Anteil für ein Hexapeptid (His-6- Peptid) kodiert, welches durch einen monoklonalen Antikörper (vorzugsweise Penta-His™ Antibody; Quiagen, Hilden) erkannt wird und wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich und einen Trägerproteinbereich enthält und wobei der Funktionsproteinbereich sich am C-Terminus der Lumazinsynthase befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis ohne Stopkodon.
b) Peptidkodierende DNA am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens. Das Fremdpeptid besitzt die Sequenz HHHHHH.

43. Vector for the production of a protein conjugate according to claim 12, characterized in that the functional DNA region is located at the 3 'end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis, the functional DNA component being for a hexapeptide (His-6- Encoded peptide), which is recognized by a monoclonal antibody (preferably Penta-His ™ Antibody; Quiagen, Hilden) and wherein the fused gene codes for an artificial protein which contains a functional protein region and a carrier protein region and wherein the functional protein region is at the C-terminus the lumazine synthase and the vector contains the following components:

a) Bacillus subtilis lumazine synthase gene without stop codon.
b) DNA encoding peptides at the 3 'end of the lumazine synthase gene. The foreign peptide has the sequence HHHHHH.

44. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Bereich am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet, wobei der Funktions-DNA-Bereich für eine artefizielle Peptidsequenz kodiert, die mit der Aminosäure Lysin endet, wobei die Aminosäure Lysin zur chemischen Kopplung von Funktionsmolekülen an den Trägerproteinbereich verwendet werden (vgl. Anspruch 16b) kann und wobei der Funktionsproteinbereich als Linker (Tentakel-Linker) dient und wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, weiches einen Funktionsproteinbereich und einen Trägerproteinbereich enthält, wobei der Funktionsproteinbereich sich am C-Terminus des Trägerproteinbereichs befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis.
b) Kodon für Lysin (aaa) am 3'-Ende der artefiziellen DNA.
c) DNA kodierend für ein Linkerpeptid mit der Sequenz GGGGSGGGSG.

44. Vector for the production of a protein conjugate according to claim 12, characterized in that the functional DNA region is located at the 3 'end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis, the functional DNA region coding for an artificial peptide sequence which the amino acid lysine ends, where the amino acid lysine can be used for the chemical coupling of functional molecules to the carrier protein region (cf. claim 16b) and where the functional protein region serves as a linker (tentacle linker) and the fused gene codes for an artificial protein, soft contains a functional protein region and a carrier protein region, the functional protein region being located at the C-terminus of the carrier protein region and the vector containing the following components:

a) Lumazine synthase gene from Bacillus subtilis.
b) Codon for lysine (aaa) at the 3 'end of the artificial DNA.
c) DNA coding for a linker peptide with the sequence GGGGSGGGSG.

45. Vektor zur Produktion eines Protein-Konjugates nach Anspruch 12 gekennzeichnet dadurch, daß sich der Funktions-DNA-Bereich am 3'-Ende des Lumazinsynthasegens aus Bacillus subtilis befindet, wobei der Funktions-DNA-Bereich für eine artefizielle Peptidsequenz kodiert, die mit der Aminosäure Cystein endet, wobei die Aminosäure Cystein zur chemischen Kopplung von Funktionsmolekülen an den Trägerproteinbereich verwendet werden (vgl. Anspruch 16b) kann, wobei der Funktionsproteinbereich als Linker (Tentakel-Linker) dient und wobei das fusionierte Gen für ein artefizielles Protein kodiert, welches einen Funktionsproteinbereich und einen Trägerproteinbereich enthält und wobei der Funktionsproteinbereich sich am C-Terminus des Trägerproteinbereichs befindet und wobei der Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) Lumazinsynthasegen aus Bacillus subtilis (ohne Stop-Codon).
b) Kodon für Cystein (tgc) am 3'-Ende der artefiziellen DNA.
c) DNA kodierend für ein Linkerpeptid mit der Sequenz GGGGSGGGSGGG

45. Vector for the production of a protein conjugate according to claim 12, characterized in that the functional DNA region is located at the 3 'end of the lumazine synthase gene from Bacillus subtilis, the functional DNA region coding for an artificial peptide sequence which codes with the amino acid cysteine ends, the amino acid cysteine being able to be used for the chemical coupling of functional molecules to the carrier protein region (cf. claim 16b), the functional protein region serving as a linker (tentacle linker) and the fused gene coding for an artificial protein which contains a functional protein region and a carrier protein region and the functional protein region is located at the C-terminus of the carrier protein region and the vector contains the following components:

a) Bacillus subtilis lumazine synthase gene (without stop codon).
b) Codon for cysteine (tgc) at the 3 'end of the artificial DNA.
c) DNA coding for a linker peptide with the sequence GGGGSGGGSGGG

46. Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Anwendung als Arzneistoff oder Impfstoff.46. Protein conjugates according to one of claims 1 to 15 for use as a pharmaceutical or Vaccine.

47. Verwendung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels oder eines Impfstoffs.47. Use of the protein conjugates according to one of claims 1 to 15 for the preparation a drug or a vaccine.

48. Verwendung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung von diagnostisch oder therapeutisch verwendbaren Antikörpern.48. Use of the protein conjugates according to one of claims 1 to 15 for the preparation of diagnostically or therapeutically usable antibodies.

49. Verwendung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur selektiven Detektion von Antikörpern oder zur Reinigung von Antiköpergemischen oder zur Cha rakterisierung von Antikörpern.49. Use of the protein conjugates according to one of claims 1 to 15 for selective Detection of antibodies or for the purification of antibody mixtures or for cha characterization of antibodies.

50. Verwendung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung von Proteinbibliotheken.50. Use of the protein conjugates according to one of claims 1 to 15 for the preparation of protein libraries.

51. Arzneimittel enthaltend eine pharmakologisch wirksame Menge eines Protein-Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 15.51. Medicament containing a pharmacologically effective amount of a protein conjugate according to one of claims 1 to 15.

52. Impfstoff, enthaltend eine immunologisch wirksame Menge eines Protein-Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 15.52. Vaccine containing an immunologically effective amount of a protein conjugate one of claims 1 to 15.

53. Verwendung der Protein-Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als Biosensor.53. Use of the protein conjugates according to one of claims 1 to 15 as a biosensor.