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Die Erfindung betrifft ein Mikroskop
mit einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, mit einer
spektral selektiven Einrichtung zum Einkoppeln des Anregungslichts
in das Mikroskop und zum Ausblenden des am Objekt gestreuten und/oder
reflektierten Anregungslichts aus dem Detektionsstrahlengang.
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Sowohl bei der konventionellen wie
auch bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie werden in den
Strahlengang einer für
Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle Farbstrahlteiler mit
einer ganz besonderen Transmissions- und Reflexionscharakteristik
verwendet. Dabei handelt es sich ganz überwiegend um dichroitische
Strahlteiler. Mit einem solchen Element wird die Fluoreszenzanregungswellenlänge λill1 (bzw. λill2 , λill3 ..., λilln bei
der Verwendung von mehreren Lasern) in den Beleuchtungsstrahlengang reflektiert,
um die Fluoreszenzverteilung im Objekt anzuregen und dann zusammen
mit dem am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslicht den Strahlengang
bis hin zum Farbstrahlteiler zu durchlaufen. Das Anregungslicht
mit den Wellenlängen λill1 , λill2 , λill3 ,...., λilln wird
am Farbstrahlteiler zurück
in den Laser reflektiert, nämlich
aus dem Detektionsstrahlengang heraus. Das Fluoreszenzlicht mit den
Wellenlängen λfluo1 , λfluo2 , λfluo3 ,..., λfluon passiert
den Farbstrahlteiler und wird – gegebenenfalls
nach weiterer spektraler Aufteilung – detektiert.
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Farbstrahlteiler sind üblicherweise
durch ein Interferenzfilter realisiert und werden je nach den verwendeten
Wellenlängen
für die
Anregung bzw. für
die Detektion gezielt bedampft. An dieser Stelle sei angemerkt,
dass gemäß voranstehender
Beschreibung des Standes der Technik unter einem Dichroit ein Wellenlängen-separierbares
Element verstanden wird, welches das Licht unterschiedlicher Wellenlänge aufgrund
der Wellenlänge
und nicht aufgrund der Polarisation trennt.
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In der Praxis ist die Verwendung
von Farbstrahlteilern zunächst
einmal insoweit nachteilig, als es sich hierbei um in der Herstellung
aufwendige und daher teure optische Bausteine handelt. Des Weiteren
ist nachteilig, dass Farbstrahlteiler eine feste Wellenlängencharakteristik
aufweisen und daher nicht mit beliebiger Flexibilität hinsichtlich
der Wellenlänge
des Anregungslichts verwendet werden können. Bei einem Wechsel der
Wellenlänge
des Anregungslichts müssen
auch die Farbstrahlteiler ausgewechselt werden, so beispielsweise
bei einer Anordnung mehrerer Farbstrahlteiler in einem Filterrad. Dies
ist abermals aufwendig und daher teuer und erfordert im Übrigen eine
ganz besondere Justage der einzelnen Farbstrahlteiler.
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Die Verwendung eines Farbstrahlteilers bringt
den weiteren Nachteil mit sich, dass durch Reflexion bedingte Lichtverluste
auftreten, insbesondere Lichtverluste von Fluoreszenzlicht, welches
gerade detektiert werden soll. Der spektrale Transmissions-/Reflexionsbereich
ist bei Farbstrahlteilern recht breit (λill ± 20 nm) und keineswegs ideal „steil". Folglich lässt sich
das Fluoreszenzlicht aus diesem spektralen Bereich nicht ideal detektieren.
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Bei Verwendung von Farbstrahlteilern
ist die Anzahl der gleichzeitig einkoppelbaren Laser begrenzt, nämlich beispielsweise
auf die Anzahl der in einem Filterrad angeordneten und kombinierbaren Farbstrahlteiler. Üblicherweise
werden maximal drei Laser in den Strahlengang eingekoppelt. Wie
bereits zuvor ausgeführt,
müssen
sämtliche
Farbstrahlteiler, also auch die in einem Filterrad angeordneten
Farbstrahlteiler, exakt justiert werden, was einen ganz erheblichen
Aufwand in der Handhabung mit sich bringt. Alternativ können geeignete
Neutralstrahlteiler eingesetzt werden, die das Fluoreszenzlicht
gemeinsam mit dem am Objekt gestreuten/reflektierten Anregungslicht
effizient zum Detektor leiten. Die Verluste bei der Lasereinkopplung
sind dabei jedoch erheblich.
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Zur Dokumentation des Standes der
Technik wird lediglich beispielhaft auf die
DE 196 27 568 A1 verwiesen,
die eine optische Anordnung zur konfokalen Mikroskopie zeigt. Dabei
handelt es sich im Konkreten um eine Anordnung zur zeitgleichen
konfokalen Beleuchtung einer Objektebene mit einer Vielzahl geeignet
divergierender Leuchtpunkte sowie zugehörigen Abbildungsgliedern und
einer Vielzahl von Pinholes zur konfokalen kontrastreichen Abbildung
in einem Beobachtungsgerät,
wobei es sich dabei um ein Mikroskop handeln kann. Die Einkopplung
mehrerer Lichtquellen erfolgt dort über ein diffraktives Element. Mehrere
optische Teilerelemente bzw. Farbstrahlteiler sind im Detektionsstrahlengang
angeordnet, wodurch sich ein ganz erheblicher apparativer Aufwand ergibt.
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Hinsichtlich der Verwendung aktiver
optischer Elemente im Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskops
wird ergänzend
auf die
US 4,827,125 und
die
US 5,410,371 verwiesen,
wobei diese Druckschriften die grundsätzliche Verwendung eines AOD
(Acousto-Optical-Deflector) und eines AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) zeigen, und zwar
stets mit dem Zweck, einen Strahl abzulenken oder abzuschwächen.
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Aus der
DE 195 10 102 C1 ist ein
gattungsbildendes Mikroskop bekannt, bei dem im Beleuchtungsstrahlengang
zwei identische Prismenspektrometer, zwei Streifenblenden sowie
eine Selektionsblende angeordnet sind. Hierbei ist der monochromatischen
Lichtquelle ein erste Streifenblende und ein erstes Prismenspektrometer
nachgeordnet, wobei das erste Prismenspektrometer das aus der ersten Streifenblende
austretende Anregungslicht spektral auffächert und in eine Zwischenbildebene
fokussiert, in der die Selektionsblende angeordnet ist. Die Selektionsblende
ist in der Zwischenbildebene beweglich angeordnet und kann einzelne
Lichtkomponenten des spektral aufgefächerten Lichts passieren lassen
oder reflektieren. Das zur Objektbeleucht dienende Licht kann sodann
das zweiten Prismenspektro– meter
passieren, das aufgefächerte
Anregungslicht spektral zusammenführt und auf die zweite Streifenblende
fokussiert. Die zweite Streifenblende wirkt sowohl als Anregungslicht-
als auch als Detektionsstreifenblende für das konfokale Fluoreszenzmikroskop.
Das Anregungslicht, das die zweite Streifenblende passieren kann,
wird über
einen Scanspiegel zum Objekt geleitet, das hierdurch zur Fluoreszenz angeregt
werden kann.
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Das zu detektierende Fluoreszenzlicht durchläuft den
optischen Strahlengang in umgekehrter Richtung, bis es die zweite
Streifenblende erreicht. Lediglich Licht aus der Fokalebene des
Mikroskopobjektivs kann die zweite Streifenblende passieren. Das
zweite Prismenspektrometer fächert
das Fluoreszenzlicht spektral auf und fokussiert das aufgefächerte Fluoreszenzlicht
auf die in der Zwischenbildebene angeordnete Selektionsblende. Das
am Objekt gestreute bzw. reflektierte Licht wird in gleicher Weise
wie das Anregungslicht von dem zweiten Prismenspektrometer spektral
aufgefächert
und ebenfalls auf die Selektionsblende fokussiert. Aufgrund der
Umkehrbarkeit des Lichtwegs wird das am Objekt reflektierte bzw.
gestreute Anregungslicht von der Selektionsblende in Richtung der
Lichtquelle geleitet. Das Fluoreszenzlicht hingegen wird in Richtung
des Detektors geleitet. Das spektral aufgefächerte Fluoreszenzlicht wird
von einem dritten, der Selektionsblende nachgeordneten Prismenspektrometer
zusammengeführt
und auf den Detektor fokussiert.
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Durch die Verschiebung der Selektionsblende
kann Fluoreszenzlicht einer gewünschten
Fluoreszenzwellenlänge
dem Detektor zugeleitet werden, wodurch in vorteilhafter Weise mit
ein und denselben Komponenten dieses optischen Strahlengangs Licht unterschiedlicher
Wellenlängenbereiche
detektiert werden kann. Zur Fluoreszenzanregung des Objekts können auch
mehrere monochromatische Lichtquellen dienen, so dass das aus dieser
Entgegenhaltung bekannte konfokale Fluoreszenzmikroskop. mit Anregungslicht
mehrerer Anregungswellenlängen
betrieben werden kann.
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Das aus der
DE 195 10 102 C1 bekannte konfokale
Fluoreszenzmikroskop ist jedoch in der Praxis problematisch. So
müssen
die beiden Streifenblenden sowie die Selektionsblende exakt aufeinander
justiert sein. Auch die drei Prismenspektrometer nebst dazugehöriger Anpassungsoptik
müssen exakt
zueinander positioniert und kalibriert sein. Schließlich erfordert
ein stabiler Langzeitbetrieb aufgrund der Vielzahl der rotwendigen
optischen Komponenten einen ganz erheblichen apperativen Aufwand.
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Der vorliegenden Erfindung liegt
nun die Aufgabe zugrunde, ein gattungsbildendes Mikroskop derart
auszugestalten und weiterzubilden, dass die bislang auftretenden
Justierprobleme vermindert sind.
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Das erfindungsgemäße Mikroskop löst die voranstehende
Aufgabe sowohl durch die Merkmale des Patentanspruchs 1 als auch
durch die Merkmale des Patentanspruchs 2. Danach ist das gattungsbildende
Mikroskop gemäß Patentanspruch
1 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der spektral selektiven
Einrichtung um ein einzelnes, passives Bauteil handelt, dass das
Anregungslicht unterschiedliche Wellenlängen umfasst, die aus unterschiedlichen Richtungen
auf das Bauteil einfallen und von diesem koaxial zu einem Anregungslichtstrahl
vereinigbar sind, und dass das Anregungslicht durch das Bauteil aus
dem Detektionsstrahlengang ausblendbar ist.
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Gemäß Patentanspruch 2 ist das
erfindungsgemäße Mikroskop
dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der spektral selektiven
Einrichtung um ein einzelnes, aktives Bauteil handelt, welches auf
die aus dem Detektionsstrahlengang auszublen dende Anregungswellenlänge einstellbar
ist.
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Das Wesen der Erfindung liegt in
der Ausbildung der spektral selektiven Einrichtung als einzelnes
Bauteil, das in seiner Ausbildung als passives Bauteil Anregungslicht
unterschiedlicher Wellenlängen
koaxial vereinigt und das Anregungslicht aus dem Detektionsstrahlengang
das in seiner Ausbildung als aktives Bauteil zwecks aus dem Detektionsstrahlengang
auszublendenen (monochromatischen) Anregungslichts auf die Anregungswellenlänge einstellbar
ist.
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Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass man
im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle,
insbesondere im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops,
den dort bislang verwendeten Farbstrahlteiler durch ein ganz besonderes
spektral selektives Element ersetzen kann, nämlich durch ein spektral selektives
Element, welches geeignet ist, Anregungslicht unterschiedlicher
Wellenlängen
auszublenden oder einzublenden bzw. einzukoppeln. Dieses spektral
selektive Element dient einerseits zum Einkoppeln des Anregungslichts
mindestens einer Lichtquelle in das Mikroskop und andererseits zum
Ausblenden des am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslichts
bzw. der entsprechenden Anregungswellenlänge aus dem über den
Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Licht. Insoweit kommt
dem spektral selektiven Element eine Doppelfunktion zu, wobei beide
Funktionen quasi zwangsgekoppelt sind.
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Alternativ zu der Fähigkeit
des spektral selektiven Elements, Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen ausblenden
zu können,
ist das spektral selektive Element auf die jeweils einzublendende oder
auszublendende Anregungswellenlänge
einstellbar ist. Auch insoweit ist aufgrund der voranstehend geschilderten
Doppelfunktion eine Zwangskopplung auf einfache Weise gewährleistet,
nämlich dadurch,
dass mit Hilfe des spektral selektiven Elements das Anregungslicht
in den Beleuchtungsstrahlengang einkoppelbar und dass exakt die
Wellenlänge
des Anregungslichts, nämlich
die Anregungswellenlänge,
aufgrund der hier vorgesehenen Einstellbarkeit aus dem über den
Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Licht ausblendbar ist,
so dass zur Detektion das vom Objekt kommende Detektionslicht (=Fluoreszenzlicht)
verbleibt.
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So kann es sich bei dem spektral
selektiven Element – zur
Begünstigung
der vo ranstehend erörterten
Doppelfunktion – um
ein passives Element bzw. Bauteil handeln. Dazu könnte das
spektral selektive Element als transparentes optisches Gitter oder
als holographisches Element ausgeführt sein. Ebenso ist es denkbar,
das spektral selektive Element als passiven AOD (Acousto-Optical-Deflector) oder
als passiven AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) auszuführen.
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Insbesondere zur Realisierung der
Einstellbarkeit des spektral selektiven Elements auf die auszublendende
Anregungswellenlänge
kann es sich bei dem spektral selektiven Element um ein aktives
Bauteil handeln, so bspw. um ein akustooptisch und/oder elektrooptisch
arbeitendes Element. Im Konkreten kommt hier als spektral selektives
Element ein AOD (Acousto-Optical-Deflector) oder ein AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter)
in Frage.
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Anstelle des im Stand der Technik üblichen Farbstrahlteilers
wird hier ein aktives spektral selektives Element verwendet, so
beispielsweise ein AOD oder ein AOTF. Die Aufgabe dieser aktiven
Bauteile besteht darin, das Anregungslicht der Lichtquelle bzw.
des Lasers oder der Laser λill1
, λill2
, λill3
,...., λilln
in den Beleuchtsstrahlengang und somit in das Mikroskop einzukoppeln,
um danach per Beam-Scanning die Fluoreszenzverteilung im Objekt anzuregen.
Bei der Detektion kann das vom Objekt kommende Fluoreszenzlicht
nahezu ungestört
das aktive spektral selektive Element passieren. Dabei wird das
vom Objekt gestreute oder reflektierte Licht mit den Anregungswellenlängen der
Lichtquelle bzw. des Lasers oder der Laser aus dem Detektionsstrahlengang
weitgehend herausreflektiert.
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Zur Einkopplung einer Lichtquelle
bzw. eines Lasers oder mehrerer Laser mit verschiedenen Wellenlängen λill1 , λill2 ,..., λilln kann
ein AOD mit entsprechenden Frequenzen ν1 , ν2 ,..., νn vorzugsweise simultan beschaltet
werden, so dass die verschiedenen Laserstrahlen nach dem Durchgang
durch den AOD koaxial mit der optischen Achse verlaufen. Hinsichtlich
der Verwendung des AOD ist wesentlich, dass dort eine Frequenz νn eine Wellenlänge λilln, selektiert,
die aus dem eigentlichen Strahlengang abgelenkt wird. Der Ablenkungswinkel ϕ ist
dabei durch die Formel ϕ = λilln νn/2f definiert,
wobei f die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Schallwelle im AOD ist.
Das zu detektierende Fluoreszenzlicht mit einer spektralen Verteilung
um die Wellenlängen λfluo1 , λfluo2 ,..., λfluon zusammen mit
dem am Objekt gestreuten bzw. reflektierten Anregungslicht mit den
Wellenlängen λill1 , λill2 ,..., λilln durchläuft nun
den AOD in umgekehrter Richtung. Jedoch wird gemäß der Umkehrbarkeit des Lichtwegs
das Anregungslicht mit den Wellenlängen λill1 , λill2 ,..., λilln wegen der spezifischen
Einstellung des AOD aus dem Detektionsstrahlengang in Richtung des
Lasers abgelenkt (1. Ordnung). Somit kann das „spektral verbleibende" Fluoreszenzlicht
um die Wellenlängen λfluo1 , λfluo2 ,..., λfluon – verglichen
mit einem herkömmlichen
Farbstrahlteiler – auf
verbesserte Weise detektiert werden (0. Ordnung). Dadurch lässt sich
jedenfalls die Justage der Einkopplung unterschiedlicher Laser einfacher
als im Stand der Technik (dort unter Anwendung herkömmlicher
Farbstrahlteiler in einem Filterrad) vornehmen.
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In weiter vorteilhafter Weise könnte ein Nachschalten
weiterer AOTF die einzelnen Wellenlängen in ihrer Leistung nach
der Strahlzusammenführung
selektiv regeln.
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Zur Einkopplung einer Laserlichtquelle
mit verschiedenen Wellenlängen λfill1 , λfill2 ,..., λfilln kann
ein AOTF mit entsprechenden Frequenzen ν1 , ν2 ,..., νn simultan geschaltet sein,
so dass die verschiedenen Wellenlängen in ihrer Anregungsleistung variieren
und auf die Anwendung hin optimierbar sind. Die Zuführung des
Laserlichts kann mittels Lichtleitfaser erfolgen.
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Jedenfalls wird die Lichtquelle bzw.
der Laser koaxial aus der Richtung der 1. Ordnung des Kristalls eingekoppelt.
Das zu detektierende Fluoreszenzlicht mit einer spektralen Verteilung
um die Wellenlängen λfluo1 , λfluo2 ,..., λfluon gemeinsam
mit dem am Objekt gestreuten bzw. reflektierten Anregungslicht mit den
Wellenlängen λfill1 , λfill2 ,..., λfilln durchlaufen nun
den AOTF in umgekehrte Richtung. Gemäß der Umkehrbarkeit des Lichtwegs
wird das Anregungslicht mit den Wellenlängen λfill1 , λfill2 ,..., λfilln wegen der spezifischen
Einstellung des AOTF aus dem Detektionsstrahlengang in Richtung
der Lichtquelle bzw. des Lasers abgelenkt. Somit kann auch hierbei das „spektral
verbleibende" Fluoreszenzlicht
um die Wellenlängen λfluo1 , λfluo2 ,..., λfluon in
einer – verglichen
zum herkömmlichen
Farbstrahlteiler – verbesserten
Weise detektiert werden (0. Ordnung).
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Sowohl unter Verwendung eines AOD
oder AOTF als auch unter Verwendung eines transparenten Gitters
wird sich das Fluoreszenzlicht nach dem Duchgang durch das jeweilige
aktive Element aufgrund der auftretenden Dispersion spektral auffächern. Insoweit
ist es von Vorteil, ein oder mehrere entsprechende „inverse" Elemente nachzuschalten, so
dass die ungewünschte
spektrale Auffächerung wieder
rückgängig gemacht
wird. Auch ist es denkbar, weitere optische Elemente zur Fokussierung oder
zum Ausblenden unerwünschter
Strahlanteile dem jeweiligen Element (AOD, AOTF oder transparentes
Gitter) vor- bzw. nachzuschalten. Der dadurch wiedervereinigte Detektionsstrahl
kann dann in herkömmlicher
Weise durch nachgeschaltete Farbstrahlteiler spektral zerlegt und
auf die verschiedenen Detektoren abgebildet werden.
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Grundsätzlich ist eine Anordnung im
Sinne eines „Multibanddetektor" denkbar. Hierzu
wird auf die Patentanmeldung
DE 43 30 347.1 A1 verwiesen, deren Inhalt
hier ausdrücklich
hinzugezogen und insoweit als bekannt vorausgesetzt wird. Zwischen
der Scan-Einheit und dem AOD bzw. dem transparenten Gitter (bei
mehreren Lichtquellen bzw. Lasern mehrerer Wellenlängen) bzw.
dem AOTF (bei einer Lichtquelle bzw. einem Laser mit verschiedenen
Wellenlängen)
ist das Anregungs-Pinhole angeordnet, wobei dieses identisch mit
dem Detektions-Pinhole ist. In vorteilhafter Weise wird dabei die
Eigenschaft des Kristalls, den Lichtstrahl der 0. Ordnung durch
den Prismeneffekt spektral aufzufächern, zur Detektion genutzt.
Das dispersive Element des Multibanddetektors ist dabei mit dem
Farbstrahlteiler zu einem Bauteil vereinigt, wodurch alle weiteren,
dem herkömmlichen
Detektionsstrahlengang nachgeordneten und mit weiteren Verlusten
in der Fluoreszenzintensität
behafteten Farbstrahlteiler entfallen.
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In ganz besonders vorteilhafter Weise
kann die voranstehend erörterte
Technik in Kombination mit einer in der Wellenlänge variabel durchstimmbaren
Laserlichtquelle – z.B.
Farbstofflaser, OPO (optisch parametrisierter Oszillator), Elektronenstrahlkollisionslichtquelle – äußerst flexible
Fluoreszenzmikroskopie-Anwendungen ermöglichen. Die Einstellung bzw.
Kontrolle der Anregungswellenlänge
kann direkt mit der Ansteuereinheit eines der zuvor beschriebenen
spektral selektiven Elemente gekoppelt sein, so dass nur diese Anregungswellenlänge koaxial
in den Anregungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt und wiederum
nur diese Wellenlänge aus
dem Detektionsstrahlengang. ausgeblendet wird. Die Kopplung bzw.
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Zwangskopplung der Lichtquelle mit
dem strahlteilenden Element kann entweder manuell oder automatisch
oder gar nach einer vorgebbaren Vorschrift erfolgen, wobei diese
Möglichkeit
dem jeweiligen Anforderungsprofil anzupassen ist. Beispielsweise
kann nach jeder gescannten Bildebene die Anregungswellenlänge sowie
der Strahlteiler in geeigneter Weise verändert werden. Somit lassen
sich Mehrfarbenfluoreszenzobjekte detektieren. Eine zeilenweise
Umschaltung ist ebenso denkbar.
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Zusammenfassend lassen sich die Vorteile der
erfindungsgemäßen Lehre
nebst vorteilhafter Ausgestaltung wie folgt zusammenfassen:
Die
spektral selektiven Elemente sind für alle Wellenlängen außer für die selektierten
Anregungswellenlängen λill1 , λill2 ,... λilln „transparent". Der „spektrale Verlust" ist minimal, da
vom spektral selektiven Element nur der selektierte spektrale Bereich
von typischerweise λilln ± 2 nm
abgelenkt wird. Dadurch wird der spektrale Bereich für die Detektion
vergrößert. Somit
können
nahezu beliebig viele unterschiedliche Wellenlängenbereiche simultan eingekoppelt
und genutzt werden. Die spektral „verlorene Fluoreszenzintensität", die durch die spektral
selektiven Elemente bedingt ist, ist geringer als bei herkömmlichen
Farbstrahlteilern. Mit anderen Worten liegen hier reduzierte Intensitätsverluste
im interessierenden Bereich vor. Die aktiven spektral selektiven
Elemente sind flexibel einstellbar, so dass prinzipiell beliebig
viele Lichtquellen bzw. Laser mit unterschiedlichen Wellenlängen auch
simultan in das Mikroskop einkoppelbar sind. Dies ermöglicht die
verbesserte Anwendung bei Multi-Color FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung).
Folglich ist dann nur noch eine Limitierung der spektralen Aufspaltung
des Fluoreszenzlichts, bspw. durch „Cross-Talk", gegeben. Herkömmliche
Sperrfilter können
komplett entfallen, so dass weitere Verluste von Fluoreszenzlicht
in der Detektion vermieden sind.
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Schließlich ist es auch denkbar,
dass ein anderes aktives holographisches Element dem spektral selektiven
Element nachgeschaltet ist und dabei die Aufgabe des Strahlscanners
ausübt.
Beide Elemente können
zu einem einzigen Bauteil zusammengefasst sein.
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Grundsätzlich lassen sich unterschiedliche Lichtquellen
verwenden, solange sie zur Fluoreszenzanregung geeignet sind. So
kommt bspw. eine Weißlichtquelle,
eine Lichtquelle zur Verwendung eines optisch parametrisierten Oszillators,
eine Elektro nenstrahlkollisionslichtquelle oder eine Laserlichtquelle
in Frage, wobei die Laserlichtquelle in der Wellenlänge variabel
durchstimmbar sein kann. Laserlichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen oder eine
mehrere Laser umfassende Lichtquelle ist bzw. sind verwendbar.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzwbilden. Dazu ist einerseits auf die den Patentansprüchen 1 und
2 nachgeordneten Patentansprüche,
andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele
der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit
der Erläuterung
der bevorzugten Ausführungsbeispiele
der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte
Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In
der Zeichnung zeigen
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1 in
einer schematischen Darstellung eine gattungsbildende optische Anorndung
im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops zur Dokumentation
des der Erfindung zugrunde liegenden Standes der Technik,
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2 in
einer schematischen Darstellung ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen optischen
Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops,
wobei dort ein Laser mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen einkoppelbar
ist,
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3 in
einer schematischen Darstellung ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen optischen
Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops,
wobei dort drei Laser mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen einkoppelbar
sind,
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4 in
einer schematischen Darstellung ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen optischen
Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops,
wobei dort die Einkopplung von drei Laserlichtquellen über ein transpa rentes
Gitter erfolgt,
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5 in
schematischer Darstellung, vergrößert und
teilweise, den Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang,
wobei dem aktiven spektral selektiven Element zur Strahlzusammenführung dienende
Mittel nachgeschaltet sind,
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6 in
schematischer Darstellung, vergrößert und
teilweise, den Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang,
wobei dort eine Dispersionskorrektur erfolgt,
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7 in
einer schematischen Darstellung die prinzipielle Funktionsweise
eines AOD oder AOTF,
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8 in
einer schematischen Darstellung ein weiteres Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäßen optischen
Anordnung, wobei dort eine zusätzliche
spektrale Auffächerung
vor einem Multibanddetektor stattfindet und
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9 in
einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel aus 8, wobei dort im Detektionsstrahlengang
vor dem Multibanddetektor ein variables Spaltfilter angeordnet ist.
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1 dokumentiert
den Stand der Technik und zeigt dabei eine herkömmliche optische Anordnung
im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle,
wobei es sich hier um eine optische Anordnung im Strahlengang eines
konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops handelt. Der Laserscanner 1 ist
dabei lediglich symbolisch dargestellt. Bei der den Stand der Technik
betreffenden Darstellung sind als Lichtquellen insgesamt drei Laser 2 vorgesehen,
die mit ihrem Anregungslicht 3 über spektral selektive Elemente 4 in
den Beleuchtungsstrahlengang 5 des Mikroskops einkoppeln.
Bei den spektral selektiven Elementen 4 handelt es sich im
Konkreten um einen Spiegel 6 sowie um Farbstrahlteiler 7.
Jedenfalls wird das Anregungslicht 3 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 eingekoppelt
und gelangt über
einen weiteren Spiegel 8 als Anregungslicht 9 zum
Laserscanner 1.
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Das von dem ebenfalls lediglich symbolisch dargestellten
Objekt 10 zurückkommende
Licht – hier handelt
es sich um das am Objekt gestreute und reflektierte Anregungslicht 9 einerseits
und um das vom Objekt 10 ausgesandte Fluoreszenzlicht 11 – gelangt über den
Spiegel 8 zu dem spektral selektiven Element 4,
wobei es sich hier um den Farbstrahlteiler 7 handelt. Von
dort aus wird das Anregungslicht 9 bzw. die Anregungswellenlänge aus
dem über
den Detektionsstrahlengang 12 vom Objekt 10 kommenden Licht 13 ausgeblendet
und gelangt als zurückkommendes
Anregungslicht 9 zurück
zu den Lasern 2. Das durch den Farbstrahlteiler 7 nicht
abgelenkte Detektionslicht 14 gelangt unmittelbar zu dem
Detektor 15.
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Erfindungsgemäß ist durch das spektral selektive
Element 4 zurückkommendes
Anregungslicht 3 unterschiedlicher Wellenlängen ausblendbar.
Dies ist insbesondere in 4 dargestellt.
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Alternativ – in ebenfalls erfindungsgemäßer Weise – ist das
spektral selektive Element 4 auf die auszublendende Anregungswellenlänge einstellbar. Dies
lässt sich
den Ausführungsbeispielen
aus den 2, 3 und 8, 9 besonders
gut entnehmen.
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Bei dem in 2 gezeigten Ausführungsbeispiel ist lediglich
ein Laser 2 vorgesehen, dessen Anregungslicht 3 unterschiedliche
Wellenlängen
aufweisen kann. Jedenfalls gelangt das Anregungslicht 3 über einen
Spiegel 6 und über
ein zusätzliches
optisches Element, nämlich über eine
Linse 16 zu einem AOTF 17, der als spektral selektives
Element arbeitet. Von dort aus gelangt das Anregungslicht 3 wiederum über ein
zusätzliches
optisches Element – im
hier gewählten
Ausführungsbeispiel
eine Linse 18 – und über einen
Spiegel 8 zum Laserscanner 1. Vom Objekt 10 reflektiert,
gelangt das zurückkommende Licht – reflektiertes
Anregungslicht 9 und Detektionslicht 11 – über den
Spiegel 8 und die Linse 18 zurück in den AOTF 17 und
wird dort entsprechend der Beschattung des AOTF 17 teilweise
ausgeblendet. Im Konkreten wird nämlich das Detektionslicht bzw.
Fluoreszenzlicht 11 über
den Detektionsstrahlengang 12 zum Detektor 15 geführt (0.
Ordnung). Das zurückkommende
Anregungslicht 9 wird dagegen über die Linse 16 und
den Spiegel 6 zurück
zum Laser 2 geführt
und ist somit aus dem Detektionsstrahlengang 12 ausgeblendet. Ähnlich verhält es sich
bei dem in 3 gezeigten
Ausführungsbeispiel,
wobei dort gleichzeitig drei Laser 2 über zusätzliche optische Elemente,
hier Linsen 16, ihr Anregungslicht 3 über ein
AOD 19, eine weitere nachgeschaltete Linse 18 und
einen Spiegel 8 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 einkoppeln.
Von dort aus gelangt das Anregungslicht 3 zum Laserscanner 1 und
zum Objekt 10.
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Das vom Objekt kommende Licht 13 umfasst bei
dem voranstehend genannten Ausführungsbeispiel
Fluoreszenzlicht 11 und zurückkommendes Anregungslicht 9,
wobei dort der AOD 19 das zurückkommende Fluoreszenzlicht
als Detektionslicht 14 zu dem Detektor 15 führt. Das
zurückkommende
Anregungslicht 9 wird ausgeblendet und gelangt über Linsen 16 zu
den jeweiligen Lasern 2.
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Das in 4 gezeigte
Ausführungsbeispiel umfasst
als spektral selektives Element 4 ein transparentes Gitter 20,
wobei über
das transparente Gitter 20 gleichzeitig drei Laser 2 ihr
Anregungslicht 3 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 des
Mikroskops einkoppeln. Wesentlich ist hier jedenfalls, dass das transparente
Gitter 20 das vom Objekt 10 zurückkommende
Anregungslicht 9 aus dem Detektionsstrahlengang ausblendet,
so dass dieses Licht zurück
zu den Lasern 2 gelangt. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht 11 gelangt über den
Detektionsstrahlengang 12 zum Detektor 15.
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5 zeigt
die Möglichkeit
einer Dispersionskorrektur, wobei das vom Objekt zurückkomende Licht 13 in
den AOTF 17 oder AOD 19 gelangt. Dort wird das
zurückkommende
Detektionslicht 14 – zwangsweise – spektral
aufgefächert
und über
nachgeschaltete Elemente – AOD/AOTF – parallelisiert und
schließlich
konvergiert. Das spektral vereinigte Detektionslicht 14 gelangt
von dort zu dem in 5 nicht
gezeigten Detektor 15.
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Bei der in 6 gezeigten Dispersionskorrektur wird
das vom Objekt kommende Licht 13 mittels AOD 17/AOTF 19 aufgefächert, wobei
das aufgefächerte
Detektionslicht 14 über
ein weiteres passives spektral selektives Element 4 – AOTF 17 oder AOD 19 – über eine
Linse 21 mit Feldkorrektur konvertiert und durch ein Detektionspinhole 22 oder durch
einen Detektionsspalt zum Detektor 15 gelangt.
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Gemäß der Darstellung in 7 handelt es sich bei dem
spektral selektiven Element 4 um ein AOTF 17 oder
ein AOD 19, wobei diese Elemente einen speziellen Kristall
mit dispersionsfreier 0. Ordnung umfassen. Dieser Kristall bzw.
dieses spektral selektive Element wird über ein Piezoelement 23 angeregt
bzw. beaufschlagt. 7 zeigt
besonders deutlich, dass das vom Objekt kommende Licht 13 in dem
AOTF 17 bzw. AOD 19 aufgespalten wird, wobei das
Detektionslicht 14 als dispersionsfreies Licht 0. Ordnung
ungehindert durch den Kristall läuft.
Das vom Objekt zurückkommende
Anregungslicht 9 wird dagegen als Licht 1. Ordnung
abgelenkt und zurück zu
den hier nicht gezeigten Lasern geführt.
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8 zeigt
eine spezielle Detektion unter Ausnutzung der spektralen Auffächerung
des spektral selektiven Elements 4, wobei hier im Konkreten ein
AOTF 17 verwendet ist. Das vom Objekt 10 kommende
Licht 13 wird im AOTF 17 spektral aufgespalten,
wobei das Detektionslicht 14 über eine Linse 16 und
einen Spiegel 6 zu einem Multibanddetektor 24 bzw.
Spektrometer gelangt. Der Spiegel 6 führt zu einer Verlängerung
der Strecke, so dass eine Auffächerung
des zurückkomenden
Detektionslichts 14 bis hin zum Multibanddetektor 24 begünstigt wird.
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Das im AOTF 17 ausgeblendete
Anregungslicht 9 gelangt über die Linse 16 und
den Spiegel 8 zurück
zum Laser 2.
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Schließlich zeigt 9 in einer schematischen Darstellung
das Ausführungsbeispiel
aus 8, wobei dort – in Ergänzung – im Detektionsstrahlengang
vor dem Multibanddetektor 24 ein variables Spaltfilter 25 angeordnet
ist. Dieses Spaltfilter 25 ist im Detektionsstrahlengang 12 unmittelbar
vor dem Detektor 15 angeordnet und im Detektionsstrahlengang
positionierbar. Des Weiteren ist der Spalt 26 des Spaltfilters 25 variabel,
so dass auch insoweit eine spektrale Selektion des Detektionslichts 14 möglich ist.
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Hinsichtlich weiterer Ausgestaltungen
der erfindungsgemäßen Lehre,
die den Figuren nicht zu entnehmen sind, wird zur Vermeidung von
Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung und die
dort geschilderte Funktionsweise der Lehre und der vorteilhaften
Ausgestaltungen verwiesen.