DE19901030A1 - Vorrichtung zur Proteinreinigung - Google Patents

Abstract

Eine Vorrichtung zur Proteinreinigung, insbesondere zur Elution von mit einem chromatographischen Sorbens in Wechselwirkung getretenen Proteinen, weist eine Vielzahl von mit dem Sorbens befüllbaren Probenbehältern, wie Chromatographiesäulen, sowie eine entsprechende Anzahl von unterhalb einer Auslaßöffnung jedes Probenbehälters angeordneter Auffangbehälter, wie Vials, auf. Sämtliche Probenbehälter sind mittels Schläuchen mit einem gemeinsamen Reservoir zur Aufnahme einer Chromatographielösung gasdicht verbindbar, aus dem den Probenbehältern die Chromatographielösung unter einem für alle Probenbehälter gleichen, variablen Druck zuführbar ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Protein­ reinigung, insbesondere zur Elution von mit einem chroma­ tographischen Sorbens in Wechselwirkung getretenen Prote­ inen, mit einer Vielzahl von mit dem Sorbens befüllbaren Probenbehältern, wie Chromatographiesäulen, sowie einer entsprechenden Anzahl von unterhalb einer Auslaßöffnung jedes Probenbehälters angeordneter Auffangbehälter.

Zur Isolierung oder Anreicherung bestimmter Proteine aus komplexen biologischen Materialien werden in der Regel chromatographische Verfahren, wie die Affinitäts-, Ionen­ austausch- oder Gelchromatographie verwendet.

Die Affinitätschromatographie beruht auf der Fähigkeit bestimmter zusammengehöriger Partner, wie Antigen-Anti­ körper, Enzym-Substrat, Receptor-Hormon, Kohlehydrat- Lectin oder Nucleinsäure-komplementäre Nucleinsäure, sich gegenseitig zu erkennen und miteinander in Wechselwirkung zu treten. Hierbei wird die biospezifische Affinität eines Partners genützt, der - als reaktiver Ligand oder Effektor an ein chromatographisches Sorbens als Träger­ matrix fixiert - aus einem aufgebrachten Gemisch die spezifisch passende Komponente bindet, während die übri­ gen Komponenten nicht mit dem Sorbens in Wechselwirkung treten und beispielsweise eine mit dem Sorbens befüllte Chromatographiesäule unverändert passieren.

Die Elution der mit dem chromatographischen Sorbens in Wechselwirkung getretenen Proteine bzw. der spezifisch gebundenen Komponenten erfolgt mit einem Elutionsmittel, beispielsweise durch Änderung des pH-Werts, der Ionen­ stärke oder biospezifisch mit einem kompetitiven lösli­ chen Inhibitor oder Liganden-Analogen. Mit der Affini­ tätschromatographie können sowohl einzelne Proteine als auch ganze Proteinfamilien isoliert werden.

Bei der Ionenaustauschchromatographie, die sowohl in der analytischen Chemie als auch in der Biochemie zur präpa­ rativen Trennung und Reinigung von homogenen Gemischen Verwendung findet, beruht die Wechselwirkung zwischen den einzelnen Komponenten und dem chromatographischen Sorbens auf der unterschiedlichen Affinität ionogener Komponenten zum jeweiligen Sorbens, beispielsweise auf Kieselgelba­ sis. Die Elution erfolgt mit solchen Chromatographielö­ sungen, die mit dem chromatographischen Sorbens stärkere ionische Wechselwirkungen eingehen und die adsorbierten ionogenen Komponenten dadurch verdrängen.

Bei der Gelchromätographie besteht das Sorbens aus Perlen mit einem heteroporösen gequollenen Netzwerk, dessen Porengrößenverteilung über mehrere Größenordnungen vari­ iert, so daß eine Fraktionierung nach Molekülgröße er­ folgt. Wird beispielsweise eine flüssige Phase mit ge­ lösten Proteinen unterschiedlicher Kettenlänge auf das Gel aufgegeben, diffundieren die Moleküle in alle Teile des Netzwerks, die ihnen aufgrund ihrer Größe versperrt sind. Folglich dringen die kleineren Moleküle tiefer ein und werden länger vom Gel zurückgehalten als die größeren Moleküle. Moleküle, die größer sind als die größten Poren des gequollenen Gels, können die Gelkörner nicht durch­ dringen und wandern an diesen vorbei; sie verlassen die Säule folglich zuerst. Die Moleküle erscheinen daher im Eluat in der Reihenfolge abnehmender Molekülgröße.

Zur Proteinreinigung werden in der Regel kommerziell erhältliche Chromatographiesäulen aus Glas oder Kunst­ stoff verwendet, die entweder schon herstellerseitig mit einem chromatographischen Sorbens befüllt sind oder - als Mehrwegprodukte - mit geeigneten Sorbentien befüllbar sind, wobei das Sorbens meist zwischen zwei Fritten angeordnet ist, um einen Austrag aus der Säule beider Anreicherung bzw. bei der Elution zu verhindern. Zur Elution derartiger, mit einem Sorbens befüllter Chromato­ graphiesäulen sind verschiedene Vorrichtungen bekannt, die insbesondere den Nachteil aufweisen, daß bei der Elution einer großen Anzahl von Säulen, z. B. bei der Aufreinigung einer großen Anzahl von Proteinproben, eine geeignete Chromatographielösung manuell auf die einzelnen Säulen aufgegeben, z. B. pipettiert, werden muß. Dies stellt insbesondere bei Optimierungsexperimenten, bei denen z. B. zur rekombinanten Herstellung von Proteinen mittels Genexpression zahlreiche Proteine unter variablen Bedingungen hergestellt, gereinigt und hinsichtlich ihrer Funktion zur Optimierung getestet werden, einen erhebli­ chen Zeitaufwand dar.

Im Bereich der Wasseranalytik sind weiterhin Vorrich­ tungen bekannt, mit denen bis zu sechs Wasserproben gleichzeitig an bis zu sechs mit einem chromatographi­ schen Sorbens befüllbaren Chromatographiesäulen angerei­ chert, die Sorbentien getrocknet und mit bis zu fünf verschiedenen Elutionsmitteln eluiert werden können. Derartige Vorrichtungen sind einerseits teuer, anderer­ seits nicht zur simultanen Aufreinigung einer großen Anzahl von Proteinproben geeignet, da nur sechs Proben gleichzeitig behandelt werden können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine kosten­ günstige Vorrichtung der eingangs genannten Art zur simultanen Proteinreinigung einer großen Anzahl von Proben vorzuschlagen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer Vorrichtung der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß sämtliche Probenbehälter mittels Schläuchen mit einem gemeinsamen Reservoir zur Aufnahme einer Chromatographielösung gas­ dicht verbindbar sind, aus dem den Probenbehältern die Chromatographielösung unter für alle Probenbehälter gleichem Druck zuführbar ist.

Das den Probenbehältern, insbesondere Chromatographiesäu­ len, gemeinsame Reservoir ermöglicht die simultane Auf­ reinigung einer großen Anzahl von Proteinproben, ohne daß eine geeignete Chromatographielösung einzeln aufgegeben, beispielsweise pipettiert werden muß. Erfindungsgemäß wird lediglich das Reservoir mit der Chromatographielö­ sung befüllt und mittels der erfindungsgemäßen Vorrich­ tung von diesem über die einzelnen Chromatographiesäulen geleitet. Die gasdichte Schlauchverbindung der Probenbe­ hälter mit dem Reservoir gewährleistet für alle Protein­ proben identische Elutionsbedingungen bezüglich der Durchflußgeschwindigkeit der Chromatographielösung, falls für jede Charge gleiche Säulen mit gleicher Sorbensbefül­ lung und somit gleichem Druckverlust verwendet werden. Als Chromatographielösung können z. B. in Abfolge jeweils unterschiedliche Pufferlösungen, wie Lade-, Wasch- oder Glutionspufferlösungen, eingesetzt werden, die für den jeweiligen Prozeßabschnitt geeignet sind.

Insbesondere ist vorgesehen, daß die Schläuche auf glei­ chem Höhenniveau im unteren Bereich des Reservoirs an dieses anschließbar sind. Diese Anordnung gewährleistet für jeden über jeweils einen Schlauch mit dem Reservoir verbundenen Probenbehälter den gleichen hydrostatischen Druck der im Reservoir bevorrateten Chromatographielö­ sung.

Das Reservoir kann von beliebiger Form, beispielsweise zylindrisch sein, wobei die Anschlüsse für die Schläuche am Umfang des Reservoirs im wesentlichen radial ange­ ordnet sind, um den Boden freizuhalten und das Reservoir beliebig aufstellen zu können.

Eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, daß das Reservoir gegenüber den Probenbehäl­ tern höhenverstellbar angeordnet ist, so daß der hydro­ statische Druck der Chromatographielösung in den Proben­ behältern durch die Höhenlage des Reservoirs steuerbar ist. Derart kann die Durchflußmenge der Chromatographie­ lösung auf einfache Weise dadurch vergrößert werden, daß das Reservoir höher angeordnet und somit der hydrostati­ sche Druck der Chromatographielösung erhöht wird. Umge­ kehrt kann durch Absenken des Reservoirs die Durchfluß­ menge reduziert werden.

Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vor­ richtung sieht vor, daß das Reservoir geschlossen und mittels einer insbesondere regelbaren Pumpe, wie einer Ballpumpe, Membranpumpe oder dgl., zur Steuerung des Drucks der Chromatographielösung in den Probenbehältern mit Überdruck beaufschlagbar ist. Die Pumpe kann hierbei beispielsweise mit einem unter Umgebungsdruck stehenden Vorratsbehälter verbunden sein, aus dem sie die Chromato­ graphielösung entnimmt und dem Reservoir unter einem vorgegebenen, variablen Druck zuführt.

Das Reservoir besteht vorzugsweise aus einem im wesent­ lichen inerten Material, wie Polymethacrylat, Glas oder dgl. Die Schläuche bestehen ebenfalls vorzugsweise aus einem im wesentlichen inerten Material, wie Polytetra­ fluorethen (PTFE), Silikon oder dgl., welches insbeson­ dere auch elastisch ist, um eine flexible Verbindung des Reservoirs mit den Probenbehältern zu gewährleisten.

Die Verbindung der Schläuche mit dem Reservoir kann auf bekannte Weise beispielsweise dadurch verwirklicht sein, daß die Auslaßöffnungen des Reservoirs mit einem An­ schlußstück versehen sind, an das der Schlauch mit einer entsprechenden Armatur anschließbar ist. Die Verbindung zwischen Schlauch und Chromatographiesäule ist vorzugs­ weise lösbar, so daß der Schlauch jederzeit von der Chromatographiesäule entfernt werden kann, um beispiels­ weise eine eluierte Chromatographiesäule durch eine Chromatographiesäule, deren Sorbens frisch mit Proteinen beaufschlagt wurde, zu ersetzen. Hierfür eignen sich z. B. sogenannte "Luer-Verschlüsse", die insbesondere aus dem Bereich der Biomedizin bekannt sind.

Eine bevorzugte Ausführung der Erfindung sieht vor, daß jeder Schlauch mittels einer Schließeinrichtung, z. B. einem Hahn, einer Klemme oder dgl., separat verschließbar ist. Somit können einzelne Chromatographiesäulen ge­ schlossen bzw. vom Reservoir entkoppelt werden, wenn weniger als die maximal mögliche Anzahl an Proben bear­ beitet werden soll. Desweiteren können die Schließein­ richtungen verschlossen werden, um den Chromatographie­ vorgang z. B. während eines Wechsels der Chromatographie­ lösung im Reservoir zu unterbrechen.

In weiterhin bevorzugter Ausführung ist eine automati­ sierte Niveauerkennung vorgesehen, die bei einer vorgege­ benen Chromatographielösungsmenge im Auffangbehälter die mit einem Stellantrieb versehene Schließeinrichtung in dem zum entsprechenden Probenbehälter führenden Schlauch zusteuert. Die automatische Niveauerkennung kann bei­ spielsweise optisch, insbesondere mittels Lichtschranken, über die Füllhöhe des Eluates im Auffangbehälter, gravi­ metrisch über das Füllgewicht des Auffangbehälters, oder kapazitiv, beispielsweise über die Änderung der Dielek­ trizitätskonstanten von den Auffangbehältern zugeordneten Kondensatoren, erfolgen.

Eine weiterhin bevorzugte Ausführung sieht eine Meßein­ richtung, wie ein UV-Spektrometer oder dgl., zur Analyse der Proteinlösung vor, die eine automatisierte Absorp­ tionsmessung eines Eluates ermöglicht, um Informationen über das Elutionsprofil eines gereinigten Proteins zu erhalten. Die Meßeinrichtung kann z. B. auf bekannte Weise mit einem Schreiber und/oder einem Rechner verbunden sein.

Nachstehend ist die Erfindung anhand von Ausführungsbei­ spielen im einzelnen erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Ansicht eines Ausfüh­ rungsbeispiels mit einstellbarem hydrosta­ tischen Druck der Chromatographielösung;

Fig. 2 eine schematische Ansicht eines Ausfüh­ rungsbeispiels mit steuerbarem Druck der Chromatographielösung;

Fig. 3 eine Detailansicht eines Reservoirs gemäß Fig. 2 und,

Fig. 4 eine Detailansicht eines Ausführungsbei­ spiels mit einer Meßeinrichtung.

Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung 1 weist eine Halteeinrichtung 2 zur Aufnahme mehrerer Probenbehälter in Form von mit einem chromatographischen Sorbens befüll­ ten Chromatographiesäulen 3 sowie unterhalb der Auslaß­ öffnung 4 jeder Chromatographiesäule 3, angeordnete Auf­ fangbehälter 5 in Form von Vials auf. Sie weist weiterhin ein den Chromatographiesäulen 3 gemeinsames Reservoir 6 zur Aufnahme einer Chromatographielösung 7, z. B. einer Pufferlösung, auf, welches beispielsweise auf einer Standplatte 8 aufgestellt ist, die an einer Stativstange 9 höhenverstellbar geführt und mittels einer Klemmein­ richtung 10 festsetzbar ist. Das Reservoir 6 kann natür­ lich auf einem beliebigen höhenverstellbaren Mittel oberhalb der Chromatographiesäulen 3 angeordnet sein.

Die Chromatographiesäulen 3 sind über vorzugsweise aus PTFE, Silikon oder dgl. bestehende Schläuche 12 gasdicht mit dem Reservoir 6 verbunden. Bei dem dargestellten zylindrischen Reservoir 6 sind im unteren Bereich am Umfang und auf gleicher Höhe Anschlußstücke 14 für die Schläuche 12 vorgesehen. Für den gasdichten Anschluß können beliebige herkömmliche Mittel eingesetzt werden. Aufgrund dieser Anordnung und der gasdichten Schlauchver­ bindung der Chromatographiesäulen 3 mit dem Reservoir 6 ist der von der Höhe zwischen der Oberfläche des Elu­ tionsmittels 7 im Reservoir 6 und einem chromatographi­ schen Sorbens in den Chromatographiesäulen 3 abhängige hydrostatische Druck und somit die Durchflußmenge der Chromatographielösung 7 durch die Säulen 3 variierbar, wobei die Verwendung von Säulen 3 gleicher Länge, glei­ chen Querschnitts, gleicher Sorbensbefüllung und somit gleichen Durckverlusts eine konstante Durchflußrate der Chromatographielösung 7 durch sämtliche Säulen 3 garan­ tiert.

Die gasdichte Verbindung zwischen Schläuchen 12 und. Chromatographiesäulen 3 kann auf jede bekannte Weise erfolgen. Sie ist lösbar, um einzelne Säulen 3 der Vor­ richtung 1 entnehmen zu können.

Die Ausführungsform nach Fig. 2 unterscheidet sich von der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform dadurch,, daß das Reservoir 6 dicht geschlossen und mittels einer steuer- oder regelbaren Pumpe 15 mit Überdruck beaufschlagbar ist. Mit der Pumpe 15 kann ein zum hydrostatischen Druck der Chromatographielösung 7 additiver Druck erzeugt werden, um z. B. bei einer hohen Befüllung der Chromato­ graphiesäulen 3 mit chromatographischen Sorbentien bzw. mit einer Befüllung von Sorbentien mit geringer Porosität und folglich hohem Druckverlust für eine höhere Durch­ flußmenge der Chromatographielösung 7 durch die Säulen 3 zu sorgen. Alternativ kann das Reservoir 6 in diesem Fall auch auf gleicher Höhe oder unterhalb der Säulen 3 ange­ ordnet sein. Die Pumpe 15 ist z. B. über ein Anschlußstück 16 und einen druckfesten Schlauch 17 mit dem Reservoir 6 verbunden. In der gezeigten Ausführungsform entnimmt die Pumpe 15 dar Chromatographielösung 7 aus einem z. B. unter Umgebungsdruck stehenden Vorratsbehälter 18 und fördert sie in das Reservoir 6.

Wie aus Fig. 3 ersichtlich, weist jeder Schlauch 12 eine manuell oder mechanisch betätigbare, gegebenenfalls ferngesteuerte Schließeinrichtung 20, z. B. einen Hahn, eine Klemme oder dgl. auf, mittels der die Schläuche 12 separat verschlossen werden können, um den mit Pfeil 13 angedeuteten Fluß zu unterbinden. Alternativ können die Schließeinrichtungen 20 auch in die Anschlußstücke 14 des Reservoirs 6 integriert sein. Die Halteeinrichtung 2 nimmt eine der Anzahl von Chromatographiesäulen 3 ent­ sprechende Anzahl von Auffangbehältern 5 auf. Diese dienen z. B. während der Beladung der Säulen 3 mit Pro­ teinen und während der Proteinreinigung der Aufnahme des Durchflusses. Vor der Elution können die Auffangbehälter 5 durch frische Auffangbehälter ersetzt werden, um die gereinigte Proteinlösung zu empfangen. Um verschiedene Fraktionen der gereinigten Proteinlösung zu sammeln, können die Auffangbehälter 5 auch zu verschiedenen Zeit­ punkten während der Elution ausgetauscht werden.

Die in Fig. 4 dargestellte Ausführungsform weist eine Meßeinrichtung 21, wie ein UV-Spektrometer, zur Analyse der Proteinlösung auf. Die Meßeinrichtung 21 ist im gezeigten Ausführungsbeispiel zwischen Chromatographie­ säulen 3 und Auffangbehältern 5 angeordnet und mit einem Schreiber 22 verbunden. Hierdurch können Informationen über die Elutionsprofile der gereinigten Proteine gewon­ nen werden. Alternativ oder zusätzlich können weitere Meßeinrichtungen, wie IR-Spektrometer, Durchfluß- oder Leitfähigkeitsmeßgeräte etc. vorgesehen sein.

Alternativ kann eine Halteeinrichtung 2 für die Auffang­ behälter 5 vorgesehen sein, die z. B. nach Art eines Autosamplers ausgebildet ist, der die Auffangbehälter 5 einer einzigen Meßeinrichtung entweder direkt zuführt oder aus den Auffangbehältern 5, z. B. mittels einer Spritze, jeweils eine Probe entnimmt, diese beispielswei­ se in eine Meßküvette überführt und der Meßeinrichtung übergibt.

Claims (13)

1. Vorrichtung (1) zur Proteinreinigung, insbesondere zur Elution von mit einem chromatographischen Sorbens in Wechselwirkung getretenen Proteinen, mit einer Vielzahl von mit dem Sorbens befüllbaren Probenbehäl­ tern, wie Chromatographiesäulen (3), sowie einer entsprechenden Anzahl von unterhalb einer Auslaßöff­ nung (4) jedes Probenbehälters (3) angeordneter Auffangbehälter (5), dadurch gekennzeichnet, daß sämtliche Probenbehälter (3) mittels Schläuchen (12) mit einem gemeinsamen Reservoir (6) zur Aufnahme einer Chromatographielösung (7) gasdicht verbindbar sind, aus dem den Probebehältern (3) die Chromatogra­ phielösung (7) unter für alle Probenbehälter (3) gleichem Druck zuführbar ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schläuche (12) auf gleichem Höhenniveau im unteren Bereich des Reservoirs (6) an dieses an­ schließbar sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Schläuche (12) am Umfang des im wesentlichen zylindrischen Reservoirs (6) im wesentlichen radial anschließbar sind.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reservoir (6) gegenüber den Probenbehältern (3) höhenverstellbar angeordnet ist, so daß der hydrostatische Druck der Chromatographie­ lösung (7) in den Probenbehältern (3) durch die Höhenlage des Reservoirs (6) steuerbar ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Reservoir (6) geschlossen und mittels einer insbesondere regelbaren Pumpe (15) zur Steuerung des Drucks der Chromatographielösung (7) in den Probenbehältern (3) mit Überdruck beaufschlagbar ist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Reservoir (6) aus einem im wesentlichen inerten Material, wie Polymethacrylat, Glas oder dgl. besteht.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Schläuche (12) aus einem elastischen, im wesentlichen inerten Material, wie Polytetrafluorethen (PTFE), Silikon oder dgl., be­ stehen.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Schlauch (12) mittels einer Schließeinrichtung (20), z. B. einem Hahn, einer Klemme oder dgl., separat verschließbar ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine automatisierte Niveauerkennung vorgesehen ist, die bei einer vorgegebenen Elutionsmittelmenge im Auffangbehälter (5) die mit einem Stellantrieb versehene Schließeinrichtung (20) in dem zum ent­ sprechenden Probenbehälter (3) führenden Schlauch zusteuert.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Niveauerkennung optisch, insbesondere mittels Lichtschranken, erfolgt.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Niveauerkennung gravimetrisch erfolgt.

12. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Niveauerkennung kapazitiv erfolgt.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, da­ durch gekennzeichnet, daß eine Meßeinrichtung (21), wie ein UV-Spektrometer oder dgl., zur Analyse der Proteinlösung vorgesehen ist.