DE19853778C1 - DNA-Sequenzen kodierend einen Glutamat/Malat-Translokator, Plasmide Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen aus Sorghum bicolor (Hirse), Flaveria bidentis und Spinacia oleracea (Spinat), die die Kodierregion eines Glutamat/Malat-Translokators enthalten, deren Einführung in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Kohlenstoffgrundgerüsten für die Fixierung von Stickstoff und die Weiterleitung des assimilierten Stickstoffs in transgenen Pflanzen verändert, Plasmide, Hefen und Bakterien, enthaltend diese DNA-Sequenzen, sowie transgene Pflanzen, bei denen durch Einführung der DNA-Sequenzen Veränderungen der Aktivität des Glutamat/Malat-Translokators und somit Änderungen im Stickstoff- und Kohlenstoffstoffwechsel hervorgerufen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, die durch die Veränderung der Aktivität des Glutamat/Malat-Translokators in ihrer Fähigkeit zur Photorespiration beeinflußt sind. Ebenso betrifft die Erfindung die Benutzung der beschriebenen Sequenzen des Glutamat/Malat-Translokators zur Identifizierung verwandter Translokatoren aus Pflanzen (Angiospermen, Gymnospermen und Algen) durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz oder durch PCR-Techniken, sowie die Nutzung der Glutamat/Malat-Translokatoren als Ziel ("Target") für Herbizide.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen aus Sorghum bicolor (Hirse), Flaveria bidentis und Spinacia oleracea (Spinat), die die Kodierregion eines Glutamat/Malat-Translokators enthalten, deren Einführung in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Kohlenstoffgrundgerüsten für die Fixierung von Stickstoff und die Weiterleitung des assimilierten Stickstoffs in transgenen Pflanzen verändert, Plasmide, Hefen und Bakterien enthaltend diese DNA-Sequenzen, sowie transgene Pflanzen, bei denen durch Einführung der DNA- Sequenzen Veränderungen der Aktivität des Glutamat/Malat-Translokators und somit Änderungen im Stickstoff- und Kohlenstoffstoffwechsel hervorgerufen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, die durch die Veränderung der Aktivität des Glutamat/Malat-Translokators in ihrer Fähigkeit zur Photorespiration beeinflußt sind. Ebenso betrifft die Erfindung die Benutzung der beschriebenen Sequenzen des Glutamat/Malat-Translokators zur Identifizierung verwandter Translokatoren aus Pflanzen (Angiospermen, Gymnospermen und Algen) durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz oder durch PCR-Techniken, sowie die Nutzung der Glutamat/Malat-Translokatoren als Ziel ("Target") für Herbizide.

Nur Pflanzen, Bakterien und Hefen sind zur Überführung von anorganischem Stickstoff (Nitratstickstoff) in organisch gebundenen Stickstoff in großem Maßstab (in der Regel in Form von Aminosäuren) durch reduktive Aminierung von organischen Kohlenstoffverbindungen befähigt. Der Rest der belebten Welt, insbesondere Nutztiere und Menschen, ist auf Pflanzen als primäre Lieferanten organischer Stickstoffverbindungen angewiesen. Die Assimilation von anorganischem Stickstoff in Pflanzen durch Bindung an organischen Kohlenstoff hängt von der Verfügbarkeit von Stickstoff, Kohlenstoff-Grundgerüsten und Energie ab.

Die Stickstoffversorgung der Pflanze ist durch Düngung zu beeinflussen. Die Energie für die Stickstoffassimilation stammt aus der Lichtreaktion der Photosynthese bzw. in Wurzeln und anderen nicht-grünen Geweben aus der Dissimilation und ist unter normalen Feldbedingungen kein begrenzender Faktor.

2-Oxoglutarat (α-Ketoglutarat) ist nach heutigem Kenntnisstand der primäre Akzeptor reduzierten Stickstoffs in der Glutaminsynthetase/Glutamin-2- Oxoglutarat-Aminotransferase (GOGAT)-Reaktion. In dieser Reaktionsfolge wird zunächst durch die Glutaminsynthetase reduzierter Stickstoff (Ammoniumstickstoff) unter Energieverbrauch auf die Aminosäure Glutamat übertragen. Es entsteht Glutamin. In einer Folgereaktion katalysiert nun die Glutamat-Oxoglutarat- Aminotransferase (GOGAT; Glutamatsynthase) unter Verbrauch von Reduktionsäquivalenten die Übertragung einer Aminogruppe von Glutamin auf 2- Oxoglutarat (Transaminierung). Es entstehen zwei Moleküle Glutamat. In der Summe werden aus einem Molekül Glutamat, einem Molekül 2-Oxoglutarat, einem Molekül Ammonium sowie ATP als Energieäquivalent und reduziertem Ferredoxin als Reduktionsäquivalent zwei Moleküle Glutamat, ADP und oxidiertes Ferredoxin gebildet. Es ist ersichtlich, daß ein Nettogewinn von einem Molekül organischer Stickstoffverbindung (Glutamat) bei jedem Durchlauf des Reaktionszyklus durch die reduktive Aminierung eines Moleküls 2-Oxoglutarat erzielt wird.

Die gesamte Reaktionsfolge der Glutaminsynthetase/GOGAT-Reaktion ist im Stroma der Plastiden der Pflanzen lokalisiert. Diese Organelle sind von zwei Lipiddoppelschichtmembranen umschlossen, deren äußere Molekularsiebcharakter hat und Verbindungen bis zu einer Größe von ca. 10 kDa frei passieren läßt (Flügge und Benz, 1984, FEBS Lett. 169: 85-89). Die innere Membran ist permeabel für einige kleinere Verbindungen wie Wasser, Kohlendioxid, Sauerstoff und Nitrit, nicht jedoch für größere geladene Moleküle wie zum Beispiel Glutamat oder Malat.

Diese Schlüsselverbindung der Glutaminsynthetase/GOGAT-Reaktion muß aus dem Cytosol der pflanzlichen Zelle durch einen spezifischen Translokator über die innere Plastidenhüllmembran in das Stroma des Plastiden bewegt werden. Der Transport von 2-Oxoglutarat in den Plastiden erfolgt im Gegentausch mit Malat aus dem Plastiden durch den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator. Das bei diesem Vorgang in das Cytosol exportierte Malat wird von einem zweiten Translokator, dem Glutamat/Malat-Translokator, im Gegentausch mit Glutamat zurücktransportiert. Es sei darauf hingewiesen, daß der 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, im Gegensatz zum Glutamat/Malat-Translokator, nicht den Transport von Glutamat (oder auch Aspartat) zu katalysieren vermag. Im Ergebnis wird, ohne einen Nettotransport von Malat, das über beide Translokatorsysteme zirkuliert ("Doppel-Translokator", Woo et al., 1987, Plant Physiol. 84: 624-632; Flügge et al., 1988, Planta 174: 534-541), 2- Oxoglutarat in den Chloroplasten importiert und das Endprodukt der Glutaminsynthetase/GOGAT-Reaktion, Glutamat, exportiert. Glutamat dient in der Pflanze als bevorzugter Aminogruppen-Donator in einer Reihe von Transaminierungsreaktionen, zum Beispiel bei der Biosynthese der Aminosäuren Alanin oder Phenylalanin etc. Die meisten stickstoffhaltigen Verbindungen in der Pflanze wie Aminosäuren, Nukleinsäuren oder Alkaloide benötigen in ihrem Biosyntheseweg zunächst Glutamat als primären Aminogruppendonator. Weiterhin ist Glutamat eine wichtige Transportform für organisch gebundenen Stickstoff innerhalb der Pflanze und wird als solche in das Leitgewebe der Pflanze (das Phloem) eingespeist. Die häufigsten Aminosäuren im Phloemsaft sind in der Regel Glutamat, Glutamin und Aspartat.

Transporter sind in die Allokation des Photoassimilates (d. h. primär Zucker und Aminosäuren) von den "Source"- zu den "Sink"-Organen an entscheidender Stelle eingebunden - wie der chloroplastidäre Triosephosphat/Phosphat-Translokator, der Saccharose-Translokator (über den die Siebröhren mit der Transportform des Photoassimilates Saccharose beladen werden) und der Glukose-6- phosphat/Phosphat-Translokator der Amyloplasten. Änderungen der Aktivität eines spezifischen Membran-Transporters können große Auswirkungen auf die Stoffwechselleistungen der Pflanzen haben. So konnte vor kurzem gezeigt werden, daß die Effektivität der photosynthetischen Kohlenstoffreduktion (Lichtreaktion und Calvin-Zyklus) ganz wesentlich durch die Aktivität des chloroplastidären Triosephosphat/Phosphat-Translokators beeinflußt werden kann, der den Austransport des fixierten Kohlenstoffs aus den Chloroplasten katalysiert. Die Hemmung dieses Transporters in planta über die Expression einer entsprechenden "antisense" mRNA führt zu einem verminderten Export des primären Photoassimilates (Triosephosphat, 3-Phosphoglycerat), das unter diesen Umständen innerhalb des Chloroplasten abgeleitet wird in die Biosynthese von Stärke, die sich massiv anstaut (Riesmeier et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6160-6164; Heineke et al., 1994, Planta 193: 174-180). Dieses Translokatorprotein stellt demzufolge eine Engstelle im Kohlenstoffstoffwechsel des "Source"-Gewebes dar. Auch die Reduktion der Saccharose-Transport-Aktivität über eine "antisense"- Inhibierung des für den Transport in die Siebröhren verantwortlichen Saccharose- Transporters (Riesmeier et al., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713) führt zu einem drastischem Phänotyp der Pflanzen: sie sind wesentlich kleiner, die Blätter sind geschädigt und die Pflanzen bilden, im Fall der Kartoffeln, kaum noch Knollen aus d. h. die Versorgung der "Sink"-Gewebe mit Photoassimilaten ist stark reduziert (Riesmeier et al., 1994, EMBO J. 13: 1-7).

Ebenso führt die Reduktion der Transportkapazität für 2-Oxoglutarat über die Plastiden-Hüllmembran durch antisense-Repression der 2-Oxoglutarat/Malat- Translokator mRNA in Tabak-Pflanzen zu einem drastischen Phänotyp. Die Pflanzen besitzen einen gestauchten, stark verlangsamten Wuchs mit verspäteter Blüte. Die Blätter zeigten ein Ausbleichen entlang der Leitbündel, die Interkostalfelder waren noch grün gefärbt. Die Pflanzen akkumulierten Ammonium und Chlorid, wiesen jedoch drastisch verringerte Nitratgehalte auf (eigene, unveröffentlichte Beobachtungen). Da der Glutamat/Malat-Translokator in denselben biochemischen Stoffwechselweg in zentraler Position eingebunden ist, kann von einer ähnlichen Auswirkung einer Repression dieses Transporters auf den Phänotyp von Pflanzen ausgegangen werden. Weiterer Beleg für diese Annahme ist eine Beobachtung von Somerville (1983, 1985), in der eine EMS-Mutante des Glutamat/Malat-Translokators in Arabidopsis beschrieben wird. Diese ist unter ambienten CO₂-Bedingungen nicht lebensfähig, da sie keinen vollständigen Photorespirationsweg ausführen kann (Somerville und Ogren, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1290-1294; Somerville und Somerville, 1985, Plant Science Letters 37: 217-220). Die beschriebene Mutante konnte bislang jedoch nicht zur Identifizierung und Klonierung eines Glutamat/Malat-Translokators genutzt werden.

Wie oben beschrieben, nimmt der Glutamat/Malat-Translokator der Plastidenhüllmembran eine Schlüsselrolle bei der intrazellulären Verteilung der an der Stickstoff-Fixierung beteiligten Aminogruppen-Akzeptoren und -Donatoren ein. Gelänge es, diesen Translokator zu klonieren und mit Hilfe der erhaltenen Sequenz die Aktivität des Translokators in Pflanzen zu modulieren, eröffnete dies den Weg zu Pflanzen mit einem veränderten Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis. Dies bedeutet, daß Pflanzen erzeugt werden könnten, die z. B. weniger Kohlenhydrate (Zucker, Stärke, Fette) und mehr organische Stickstoffverbindungen (Protein, Aminosäuren, Alkaloide) enthielten. An Pflanzen mit derart veränderten Inhaltsstoffen besteht dringender Bedarf, denn der überwiegende Teil der Menschen auf der Erde ist auf pflanzliche Ernährung angewiesen, mit der Konsequenz einer ständigen Unterversorgung an Eiweißen in diesen Bevölkerungsschichten. Ebenso wird in der Tierfütterung in den entwickelten Ländern zunehmend Tier- und Fischmehl dem Viehfutter beigemengt, um die Eiweißversorgung der Zuchttiere zu verbessern. Futterpflanzen mit höherem Proteingehalt wären hier sicher die bessere Alternative, insbesondere mit Blick auf die durch die Verfütterung von Tiermehlen entstehenden Probleme wie BSE etc. Ein Einfluß einer Überexpression des 2-Oxoglutarat/Malat- Translokators in Tabak auf das C/N-Verhältnis von Tabak-Pflanzen konnte bereits gezeigt werden (Weber, 1995, Dissertation, Universität Würzburg). Da der Glutamat/Malat-Translokator ein breiteres Substratspektrum aufweist als der 2- Oxoglutarat/Malat-Translokator, ist diese Einflußnahme auf das C/N-Verhältnis in transgenen Pflanzen mit veränderter Expression dieses Transporters anzunehmenderweise noch ausgeprägter.

Der drastische Phänotyp einer Mutation des Glutamat/Malat-Translokators (siehe oben) macht dieses Protein als Target für Herbizide interessant. Ein Hemmstoff dieses Transporters dürfte als Totalherbizid einsetzbar sein. Wie auch für eine weiteres Enzym des Photorespirationsweges gezeigt werden konnte (Glutaminsynthethase, GS) führt eine Hemmung dieses Enzyms durch ein Herbizid (Phosphinotricine, BASTA) zum Absterben der behandelten Pflanzen. Durch Einführung einer Enzymaktivität, die den möglichen Hemmstoff metabolisiert und damit wirkungslos macht könnte eine gezielte Resistenz gegen diesen Wirkstoff erzeugt werden. Ebenso wäre dies durch eine gezielte Veränderung der DNA- bzw. der hieraus resultierenden Aminosäure-Sequenz des Transporters möglich. Eine solche Veränderung würde die Bindungseigenschaften des Hennstoffs verändern und diesen damit wirkungslos machen ohne hierbei jedoch die Transportfunktion zu beeinträchtigen. Zur Auffindung eines solchen Hemmstoffes und zum Auffinden möglicher Sequenzänderungen des Transporter-Proteins kann das von uns beschriebene System der Rekonstitution rekombinanter Proteine in Proteoliposomen mit anschließender Funktionsmessung eingesetzt werden (siehe Ausführungsbeispiel 2).

Es ist uns vor kurzem gelungen, eine für den plastidären 2-Oxoglutarat/Malat- Translokator kodierende cDNA zu klonieren (Weber et al., 1995, Biochemistry 34: 2621-2627). Die Primärsequenz dieses Translokators unterscheidet sich grundsätzlich von den Sequenzen der bekannten 2-Oxoglutarat/Malat-Carrier aus den Mitochondrien von Rinderherzen und aus menschlichen Mitochondrien (Runswick et al., 1990, Biochemistry 29: 11033-11040; Iacobazzi et al., 1992, DNA Seq. 3(2): 79-88). Diese Transporter spielen eine wichtige Rolle im mitochondrialen Dikarbonsäure- Stoffwechsel (u. a. Malat/Aspartat-Shuttle, Oxoglutarat/Isocitrat-Shuttle) und sind der Familie mitochondrialer Metabolittransporter zugehörig, die untereinander nahe verwandt sind. Für die meisten mitochondrialen Carrier, wie auch für den 2- Oxoglutarat-Carrier konnte gezeigt werden, daß diese ohne eine sie zu den Organellen dirigierende Adressierungs-Sequenz ("Targeting"-Sequenz) in die Mitochondrienmembran eingebaut werden (Runswick et al., 1990, Biochemistry 29: 11033-11040). Es ist also anzunehmen, daß die "Targeting"-Information im reifen Carrierprotein enthalten ist.

Im Gegensatz hierzu benötigen plastidären Translokatoren für eine korrekte Adressierung zu der inneren Plastidenmembran eine entsprechende Präsequenz ("Targeting"-Sequenz), die das anhängende reife Protein korrekt zu den Plastiden dirigiert (Übersichtsartikel hierzu: Keegstra et al., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40: 471-501; Lubben et al., 1988, Photosynth. Res. 17: 173-194; Flügge, 1990, J. Cell Sci. 96: 351-354). Neben der für die "Plastiden-Adressierung" nötigen Präsequenz gibt es im reifen Teil (der Teil des Proteins, der nach der Abspaltung der Präsequenz durch eine spezifische Protease verbleibt) der Plastidenhüllmembran- Proteine noch weitere Informationen, die für die spezifische Insertion der Proteine in die Membran verantwortlich sind und einen Transport der Hüllmembranproteine über die Hüllmembran in das Plastidenstroma oder, im Fall der Chloroplasten, die Thylakoidmembran verhindern (Knight und Gray, 1995, Plant Cell 7: 1421-1432 bzw. eigene Untersuchungen: Brink et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 20808-20815). Eigene Arbeiten zeigten ferner am Beispiel eines mitochondrialen Carriers, des ADP/ATP- Transporters, daß dieses Protein nicht oder nur mit einer sehr geringen Effizienz zu Plastiden dirigiert und dort in die Hüllmembran eingebaut werden kann. Selbst ein Hybridprotein, bestehend aus einer plastidären Präsequenz (die Information für die Plastiden-Adressierung enthaltend) und diesem mitochondrialen Carrier, zeigte gegenüber dem authentischen Protein einen kaum erhöhten Einbau in die Plastidenhüllmembran (Silva-Filho et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 15264-15269; unveröffentlichte Beobachtungen). Da für eine korrekte Insertion die Protein/Lipid- Wechselwirkung von Bedeutung ist und sich die plastidäre Hüllmembran in ihrer Lipidzusammensetzung grundlegend von der anderer Zellorganellen und auch der Bakterien unterscheidet (Joyard et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199: 489-509), ist es sehr unwahrscheinlich, daß eine, wenn auch geringfügige, Insertion eines heterologen Proteins, dann auch funktionell ist, d. h., daß ein Transporter aus anderen Systemen überhaupt in einer seiner Funktion entsprechenden Konformation und Orientierung in die Plastidenhüllmembran eingebaut werden kann.

Somit ist es nach gegenwärtigem Stand der Technik nicht möglich, mit Hilfe bekannter Plastiden-"Targeting"-Sequenzen z. B. mitochondriale oder prokaryontische Dikarbonsäure-Transporter funktionell in die innere Plastidenhüllmembran zu integrieren. Beim gegenwärtigen Stand der Technik ist es erfolgversprechender, die für die Konstruktion der oben geschilderten Pflanzen notwendige DNA-Sequenz durch Klonierung des authentischen plastidären Glutamat/Malat-Translokators zu erhalten.

Obwohl dieses Transportsystem auch den Transport von Malat katalysiert, ist seine Primärstruktur anzunehmenderweise sehr unterschiedlich von der des kürzlich identifizierten 2-Oxoglutarat/Malat-Translokators. Versuche, den Translokator über eine niedrig stringente Durchmusterung einer pflanzlichen cDNA-Bibliothek mit einer von dem 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator abgeleiteten Sonde zu identifizieren, blieben erfolglos, ebenso wie die Identifizierung des Translokators über eine biochemischen Charakterisierung, Reinigung und Isolation des Glutamat/Malat-Translokators (eigene Beobachtungen).

Zur Identifizierung des Translokators wurde daher ein molekularbiologischer Ansatz gewählt, der auf der differentiellen Expression einer bestimmten mRNA- Spezies in verschiedenen cDNA-Populationen beruht (differentielles Screening; Ausführungsbeispiel 1). Im Gegensatz zu C₃-Planzen (z. B. Kartoffel, Tomate) besitzen C₄-Pflanzen, wie z. B. Mais, Hirse (Sorghum bicolor) oder Flaveria bidentis zwei verschiedene Blatt-Zelltypen, Mesophyll- und Bündelscheidenzellen, die in die Produktion des Photoassimilates eingebunden sind. In den Mesophyllzellen erfolgt die Primärfixierung des atmosphärischen Kohlendioxids unter Bildung eines C4- Körpers (z. B. Malat), der dann in die Bündelscheidenzellen transportiert wird. Dort läuft, nach Freisetzung des Kohlendioxids aus dem C4-Körper, die eigentliche Biosynthese des Photoassimilates ab. Es wurden cDNA Banken aus Mesophyllzellen und aus Bündelscheidenzellen von Sorghum bicolor hergestellt und geprüft, welche mRNAs spezifisch nur in den Bündelscheidenzellen exprimiert werden. Auf diese Weise gelang es, einen Partial-cDNA-Klon zu identifizieren, der eine geringe Homologie mit dem 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator aufwies (Wyrich et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37: 319-335). Das entsprechende cDNA-Insert wurde als Sonde für die anschließende Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek aus Sorghum bicolor genutzt und es konnte ein cDNA-Klon isoliert werden, der die vollständige cDNA (2088 Basenpaare) für das entsprechende Vorstufenprotein mit einer molekularen Masse von 59 kDa enthielt.

Ein Vergleich der aus der cDNA abgeleiteten Proteinsequenz mit Sequenzen der Datenbanken ergab eine nur geringe Ähnlichkeit mit dem bekannten 2- Oxoglutarat/Malat-Translokator (ca. 50%). Somit konnte vermutet werden, daß diese cDNA für einen Transporter kodiert, dessen Aktivität unterschiedlich zu der des 2-Oxoglutarat/Malat-Translokators ist. Ferner zeigte sich eine Homologie zu einer genomischen DNA-Sequenz aus Arabidopsis thaliana, die über die international verfolgten Sequenzierungsprojekte erhalten wurde. Diese Sequenz ist auf Chromosom 5 von Arabidopsis thaliana lokalisiert und zeigt ebenfalls eine geringe Homologie zur Sequenz des 2-Oxoglutarat/Malat-Translokators aus Spinat von ca. 50%. Im Rahmen des Genomsequenzierungsprojektes wurde hier nur auf die Homologie verwiesen, es erfolgte jedoch nicht die Bestimmung der Funktion.

Die Funktionsbestimmung des durch die cDNA kodierten Transportproteins erfolgte in einem heterologen Expressionssystem, der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe. Da aufgrund eigener Beobachtungen Transportproteine aus monokotylen Pflanzen nicht heterolog produziert werden können, wurden zunächst cDNA Sequenzen aus der C₄-Pflanze Flaveria bidentis und aus der C₃-Pflanze Spinat isoliert, die der Sequenz der Sorghum bicolor cDNA entsprachen. Dann wurde das cDNA-Insert aus Flaveria bidentis in einen eukaryotischen Hefe-Expressionsvektor eingebracht und mit diesem Konstrukt Zellen der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe transformiert. Transformanden, die das entsprechende Plasmid exprimierten, wurden isoliert. Transportexperimente, durchgeführt mit in künstlichen Membranen rekonstituierten Membranfraktionen der Hefetransformanden, ergaben, daß dieser Translokator den Transport von Malat im Gegentausch mit Glutamat (oder Aspartat) katalysiert. Im Gegensatz zu dem 2-Oxoglutarat/Malat-Tanslokator akzeptiert also dieser Translokator auch Aminosäuren (Glutamat und Aspartat) als Gegentauschsubstrate (Ausführungsbeispiele 2 und 3). Der Transporter erhielt den Namen Glutamat/Malat-Translokator.

Die vorliegende Erfindung stellt also DNA-Sequenzen zur Verfügung, die aus einem pflanzlichen Genom stammen und für einen plastidären Glutamat/Malat- Translokator kodieren, wobei die in der Nukleotidabfolge enthaltene Information bei Einführung und Expression in pflanzlichen Zellen zur Bildung einer Ribonuklein­ säure führt und über diese Ribonukleinsäure eine Glutamat/Malat-Translokator Aktivität in die Zellen eingeführt werden kann oder eine endogene Glutamat/Malat- Translokator Aktivität unterdrückt werden kann.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere die DNA-Sequenzen aus Sorghum bicolor (Hirse) mit der Nukleotidabfolge Seq-ID No.: 1, eine DNA-Sequenz aus Flaveria bidentis mit der Nukleotidabfolge Seq-ID No.: 2 und eine DNA-Sequenz aus Spinacia oleracea (Spinat) mit der Nukleotidabfolge Seq-ID No.: 3 (Fig. 1).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die mit der unter Seq.-ID No.: 1-3 genannten DNA-Sequenzen oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Dikarbonsäuretranslokators, insbesondere eines Glutamat/Malat-Translokators besitzt.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen. Um die Expression des Glutamat/Malat-Translokators in transformierten Zellen zu gewährleisten, kann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in Plasmide eingebracht werden und dabei mit Steuerelementen für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen kombiniert werden (siehe Ausführungsbeispiele 2 und 4). Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits Transkriptions-Terminatoren. Mit den Plasmiden können eukaryontische Zellen transformiert werden mit dem Ziel der Expression einer übersetzbaren Botenribonukleinsäure (RNA), die die Synthese eines plastidären Glutamat/Malat- Translokators in den transformierten Zellen erlaubt, oder mit dem Ziel der Expression einer nicht übersetzbaren, invers orientierten ("antisense"), Botenribonukleinsäure, die die Synthese der endogenen Glutamat/Malat- Translokatoren verhindert. Zu diesem Zweck könnten auch kürzere Fragmente der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen mit einem relativ hohen Grad an Homologie (mehr als ca. 65% Homologie) verwendet werden. Ebenso kann die Expression von endogenen Dikarbonsäuretranslokatoren durch die Expression eines für diesen Zweck konstruierten Ribozyms unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen inhibiert werden. Durch die Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen Sequenz eines pflanzlichen Glutamat/Malat-Translokators ist eine Veränderung des pflanzlichen Stickstoffmetabolismus möglich, deren wirtschaftliche Bedeutung darin liegt, daß eine Verbesserung der Weiterleitung von Glutamat aus dem Cytosol der Plastiden zu einer Veränderung des Verhältnisses von Kohlenhydraten (Zucker, Stärke, org. Säuren) und Fetten zugunsten der Stickstoffverbindungen (Aminosäuren, Proteine, evtl. Alkaloide) stattfindet. Es können somit Pflanzen erzeugt werden, die reicher an wertvollem Protein sind, jedoch einen geringeren Gehalt an Kohlenhydraten und Fetten aufweisen. Diese Modifikation steigert den ernährungsphysiologischen Wert von Pflanzen und damit auch deren wirtschaftlichen Wert. Weiterhin ermöglicht die heterologe Expression der beschriebenen Sequenz in Spalthefen (Ausführungsbeispiele 2 und 3; ferner: Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2155-2159) Struktur-Funktionsstudien des Glutamat/Malat- Translokators, die letztendlich zur Entwicklung eines spezifischen Hemmstoffs für dieses Protein führen könnte, insbesondere ist hier an die Herbizidentwicklung zu denken, da die Hemmung eines Proteins mit Schlüsselfunktion im Stoffwechselgeschehen zwangsweise letal für die Pflanze wäre. Ferner können diese Struktur-Funktionsstudien Grundlage für eine gerichtete Mutagenese der Substratbindungsstelle des Translokators sein, um die Substratspezifität des Transporters gezielt zu verändern.

Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244: 1293-1299; Potrykus, 1991, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol. 42: 205-225). Zur Expression von kodierenden Sequenzen in Pflanzen müssen diese mit transkriptionell regulatorischen Elementen verknüpft werden. Solche Elemente, Promotoren genannt, sind bekannt (u. a. Koster-Töpfer et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219: 390-396). Ferner müssen die Kodierregionen mit einem Transkriptionsterminations-Signal versehen werden, damit sie korrekt transkribiert werden können. Solche Elemente sind ebenfalls beschrieben (Gielen et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29). Der transkriptionelle Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Die DNA-Sequenz der Transkriptionsstart- und - terminationsregionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanze das Ti oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend beschrieben (Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B-V. Ablasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Critic. Rev. Plant Sci. 4: 1-46; An et al., 1985, EMBO J. 4: 277-287). Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen einen Resistenz gegenüber Bioziden oder Antibiotika wie Kanamycin, Bleomycin oder Hygromycin verleiht. Der individuell eingeführte Marker wird daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten Selektionsmedium ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mit gängigen molekularbiologischen Methoden auf die Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Teile dieser Sequenz oder Derivate dieser Sequenz) können auch in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für die Expression in Zellen von Spalthefen versehen werden (siehe Ausführungsbeispiel 2). Die Einführung des Glutamat/Malat-Translokators führt zu einer erheblichen Zunahme der durch Rekonstitution in künstliche Liposomen meßbaren Aktivität des Glutamat/Malat-Translokators in den rekombinanten Hefezellen. In rekombinaten Hefezellen ist eine vielfach höhere Malat- Transportaktivität nachweisbar. Es ist somit denkbar, mit Hilfe der beschriebenen DNA-Sequenz (oder Teilen oder Derivaten dieser Sequenz) Hefezellen so zu verändern, daß sie einen veränderten Proteingehalt aufweisen. Hierbei käme der Vorteil eines plastidären Translokators aus Pflanzen zum tragen, nicht den endogenen Regulations- und Kompartiment-Adressierungsmechanismen der Spalthefen zu unterliegen. Diese Stämme wären insbesondere für die Futtermittelindustrie von herausragender Bedeutung.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Derivate oder Teile dieser Sequenz) können auch in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erlauben. Dadurch kann die Spezifität des Glutamat/Malat-Translokators verändert werden z. B. in Richtung einer Affinität für andere Dikarbonsäuren.

Ebenso könnte eine Unempfindlichkeit des Glutamat/Malat-Translokators für spezifische Herbizide erreicht werden. Mit Hilfe von Standardverfahren (Sambrock et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche und/oder Basendeletionen vorgenommen und/oder synthetische oder natürliche Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können Adapter oder linker hinzugefügt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die nicht benötigte DNA entfernen, eingesetzt werden. Dort wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen oder Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden wie z. B. die Expression des modifizierten Proteins in Spalthefe und die Messung der modifizierten Transporteigenschaften in artifiziellen Liposomen (siehe Ausführungsbeispiele 2 und 3; ferner: Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2155-2159; sowie Fischer et al., 1997, Plant Cell, 9: 453-462; Kammerer et al. 1998, Plant Cell 10: 105-117) oder die Messung der modifizierten Transporteigenschaften am in transgenen Pflanzen exprimierten Protein mit Hilfe einer kürzlich von uns zu diesem Zweck entwickelten Methode (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194: 181-185) angewandt. Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz (oder Teile oder Derivate dieser Sequenz) kann dazu genutzt werden, nach Standardverfahren (insbesondere Hybridisierungs- Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken mit niedriger Stringenz unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder Teilen der DNA-Sequenz als Sonde oder die Erstellung von Sonden für stringente und niedrig stringente Durchmusterungs-Strategien durch Ableitung von degenerierten und/oder nicht degenerierten Primern aus der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz für PCR- Experimente mit DNA oder cDNA aus anderen Pflanzen aus dem Genom von Pflanzen ähnliche Sequenzen zu isolieren, die für Proteine kodieren. Die ebenfalls Dikarbonsäuren transportieren.

Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthält im übersetzten Proteinbereiche, die in der Lage sind, das im Cytoplasma an Ribosomen synthetisierte Protein spezifisch zu Plastiden zu dirigieren und das Auftreten des Proteins in anderen Membransystemen der Zelle zu verhindern. Dies steht im Gegensatz zu den bekannten mitochondrialen 2-Oxoglutarat Translokatoren, die eine solche Adressierungssequenz nicht enthalten. Der Proteinbereich, der das durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodierte Protein zu Plastiden dirigiert, liegt innerhalb der ersten hundert Aminosäuren des Proteins, ist für die Transportfunktion des Proteins nicht erforderlich und wird nach erfolgreicher Insertion des Proteins in die Plastidenhüllmembran entfernt. Durch Austausch dieser "Plastid-targeting"-Sequenz gegen eine der bekannten "Targeting"-Sequenzen z. B. für Mitochondrien ließe sich das Translokator-Protein in ein anderes Membransystem eukaryontischer Zellen dirigieren und könnte dort möglicherweise die Transporteigenschaften über die respektive Membran verändern. Ebenso könnten die "Plastid-targeting"-Sequenz des Glutamat/Malat-Translokators oder endogene Bereiche des reifen Proteins dazu genutzt werden, fremde Proteine (z. B. bakterielle Transportproteine oder Transporter aus Hefen) in die Plastiden bzw. in die Plastidenhüllmembran pflanzlicher Zellen zu dirigieren.

Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungs­ beispiele werden die wichtigsten eingesetzten Verfahren im folgenden erläutert.

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung der für den Glutamat/Malat-Translokator kodierenden cDNAs aus Sorghum bicolor und Flaveria bidentis wurde der Phage Lambda ZAPII sowie der Phagemid pBluescript II KS (pBSC) (Short et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 7583-7600) verwendet.

Für die Transformation von Hefen wurde der Vektor SAP-E (Truenit et al., 1996, Plant Cell 8: 2169-2182) verwendet.

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66: 221-230) kloniert.

2. Bakterien- und Hefestämme

Für das pBluescriptKS (pBSC) Phagemid sowie für SAP-E- und pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli Stamm DH5α (Hanahan et al., 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) verwendet.

Die Transformation der pBinAR-Konstrukte in Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1, pGV2260 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8720) durchgeführt.

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA in die Agrobakterien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen und Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birn­ boim und Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch auf Richtigkeit und Orientierung analysiert.

4. Pflanzentransformation

Pro Transformation wurden 15 kleine mit Schmirgelpapier und Skalpell verwundete Blätter einer Tabak-Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 100 µl einer unter strenger Selektion gewachsenen, transformierten Agro­ bacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 15 minütigem leichtem Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg Giberellinsäure, 500 mg/l Betabactyl®, 100 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3.000 Lux Beleuchtungsstärke wurde die Betabactylkonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.

Hinterlegungen

Am 12. 11. 1998 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Phagemide in Form von E. coli Stämmen, enthaltend diese Phagemide, hinterlegt:
Phagemid pSbGMT1 (GMT1-Sequenz aus Sorghum bicolor) (DSM 12480)
Phagemid pFbGMT1 (GMT1-Sequenz aus Flaveria bidentis) (DSM 12478)
Phagemid pSoGMT1 (GMT1-Sequenz aus Spinacia oleracea) (DSM 12479)

Ausführungsbeispiel 1 Isolierung und Klonierung der für den Glutamat/Malat-Translokator kodierenden cDNAs

Aus Blättern von Sorghum bicolor wurde poly(A⁺)-RNA isoliert, mit Hilfe eines Standard-cDNA-Synthesekits in doppelsträngige cDNA überführt und diese in den Vektor Lambda-ZAPII kloniert (Wyrich et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37: 319-335). Parallel dazu wurde durch partiellen Verdau mit Pektinasen und Cellulasen aus Blättern von Sorghum bicolor Mesophyll- und Bündelscheidenzellen präpariert und aus diesen wiederum poly(A⁺)-RNA. Aus der Mesophyll- bzw. Bündelscheiden- RNA wurde mit Hilfe der Reversen Transkriptase und radiaoaktiver Nukleotide eine Hybridisierungssonde hergestellt, mit der die cDNA-Bibliothek differentiell durchgemustert wurde. Die Sichtung führte u. a. zur Isolierung einer ca. 900 bp großen cDNA (HHU51), die Ähnlichkeiten zu einer cDNA aus Spinat erkennen ließ, die für den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator kodiert (Weber et al., 1995, Biochemistry 34: 2621-2627) und die bei Sorghum bicolor bündelscheidenspezifisch exprimiert wird (Wyrich et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37: 319-335). Um Vollängenklone für die in HHU51 kodierten Translokatorpartialsequenzen zu isolieren, wurde die cDNA-Bibliothek mit dem cDNA-Klon HHU51 als Hybridisierungssonde durchmustert. Positiv reagierende Lambda-Klone wurden nach Standardverfahren gereinigt. Das pBluescript-Phagemid mit dem cDNA-Insert kodierend für den Glutamat/Malat-Translokator wurde durch in vivo-Exzission (Short & Sorge, 1992, Meth. Enzymol. 216: 495-208) freigesetzt. Die Klone wurden durch Bestimmung der DNA-Sequenz analysiert (Dideoxymethode: Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) und aus dieser DNA-Sequenz die Primärstruktur des Glutamat/Malat-Translokators (Klon pSbGMT1) bestimmt. Die cDNA aus Sorghum bicolor (Hirse) wurde anschließend benutzt, um die entsprechenden cDNA-Klone aus Flaveria bidentis (Klon pFbMGT1) und Spinacia oleracea (Spinat) zu isolieren.

Ausführungsbeispiel 2 Expression des Glutamat/Malat Translokators aus Flaveria bidentis in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Das Phagemid pBluescript (pBSC), enthaltend die Insertion kodierend für den Glutamat/Malat-Translokator, wurde über die sich an den beiden Enden befindlichen EcoRI-Schnittstellen mit der Endonuclease EcoRI linearisiert und das so erhaltene Fragment in die singuläre EcoRI Klonierungsstelle des Hefe- Expressionsvektors SAP-E (Truenit et al., 1996, Plant Cell 8: 2169-2182) kloniert. Nach Amplifikation des Konstrukts (SAP-GMT1) in E. coli wurde das Plasmid in durch LiCl/PEG kompetent gemachte (Ito et al., 1983, J. Bact. 153: 163-168) Leucinsynthese­ defiziente S. pombe Zellen transformiert. Transformanden wurden durch Selektion auf Minimalmedium ohne Leucin selektiert, da das SAP-GMT1-Konstrukt den Hefezellen die Fähigkeit zum Wachstum auf leucinfreiem Medium verleiht.

Ausführungsbeispiel 3 Messung der Glutamat/Malat-Translokator Aktivität in rekombinanten Hefelinien

Mit dem SAP-GMT1 Plasmid transformierte Hefezellen wurden in Minimalmedium bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 1.0 angezogen und durch Zentrifu­ gation bei 3.000 × g für 5 min geerntet. Anschließend wurden die Zellen durch kräfti­ ges Schütteln mit 1/2 vol (bezogen auf die Zellen) Glasperlen aufgebrochen und Glasperlen und Zellbruchstücke durch Zentrifugation (600 g für 1 min) abgetrennt.

Der Überstand wurde auf eine Konzentration von 0.5% (Gewicht/Volumen) Triton X-100 eingestellt, mit dem gleichen Volumen Liposomen versetzt und die resultie­ renden Proteoliposomen sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Liposomen wurden zuvor durch Beschallen von Sojabohnen-Phospholipid (20 mg/ml) für 10 min bei 4°C in Gegenwart von 200 mM Tricine-NaOH (pH 7,6), 40 mM Malat und 60 mM Kaliumglukonat hergestellt. Nach dem Auftauen der Proteoliposomen und erneutem Beschallen der Suspension mit 10 Pulsen à 1 s wurden die Proteoliposomen vom umgebendem Medium durch Größenausschlußchromatographie auf Sephadex G-25, das zuvor mit 10 mM Tricine-NaOH (pH 7,6), 100 mM Natriumglukonat und 50 mM Kaliumglukonat äquilibriert worden war, abgetrennt. Die eluierten Proteoliposomen wurden für die Messung der Malat-Transportaktivität eingesetzt. Die Messung wurde nach der von Menzlaff und Flügge (1993, Biochim. Biophys. Acta 1147: 13-18) beschriebenen "Inhibitor-Stop" Methode durchgeführt. Die Malat-Transportaktivität in den SAP-GMT1 Transformanden wurde mit der Malat-Transportaktivität von Transformanden verglichen, die lediglich mit dem Vektor SAP ohne die GMT1-Insertion transformiert waren. Es zeigte sich, daß die Malat-Transportaktivität in den SAP-GMT1 Transformanden (gemessen in pmol transportiertes ¹⁴C-Malat/mg Protein pro Minute) um ein Vielfaches höher war als in SAP Kontroll-Transformanden. Es konnte ferner gezeigt werden, daß, im Gegensatz zu dem bereits bekannten 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, der Glutamat/Malat- Translokator den Transport von Aminosäuren (Glutamat/Aspartat) im Gegentausch mit Malat zu katalysieren vermag (siehe Tabelle 1).

Ausführungsbeispiel 4 Transformation von Pflanzen mit einer Konstruktion zur Überexpression der Kodierregion des Glutamat/Malat-Translokators

Aus dem Phagemid pBluescript-GMT1 (pBSC-SoGMT1), der als Insertion die cDNA für den Glutamat/Malat-Translokator aus Spinat enthielt (siehe Ausführungsbeispiel 1), wurde die Insertion durch Restriktionsverdau mit EcoRV und SmaI isoliert und in den Vektor pBinAR (Höfgen u. Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66: 221-230) der zuvor mit dem Enzym SmaI geschnitten worden war, kloniert. Nach Amplifikation des resultierenden Konstrukts pBinAR-GMT1 in E. coli wurden das Konstrukt in Agrobakterien transformiert und diese dann zur Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Kartoffel eingesetzt.

Die erhaltenen Transformanden wurden mit Hilfe von Southern-Blot Analysen auf die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären Gens untersucht. Mit Hilfe der "Gesamtblatt-Rekonstitutionsmethode" (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194: 181-185) wurde die Malattransportaktivität im Vergleich zu Kontrolltransformanden (transformiert mit Vektor pBinAR ohne Insertion) untersucht, ebenso das C/N-Ver­ hältnis, Photosyntheserate, Photorespiration und Wachstum.

Claims (19)

1. DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines Glutamat/Malat-Translokators enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA-Sequenzen die in Fig. 1 dargestellten Nukleotidabfolgen aufweisen (Seq-ID No.: 1-3).

2. DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Glutamat/Malat-Translokators besitzt.

3. Plasmide enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2.

4. Phagemid pSbGMT1 hinterlegt unter der DSM-Nummer DSM 12480 als E. coli Stamm DH5α pSbGMT1 enthaltend dieses Plasmid.

5. Phagemid pFbGMT1 hinterlegt unter der DSM-Nummer DSM 12478 als E. coli Stamm DH5α pFbGMT1 enthaltend dieses Plasmid.

6. Phagemid pSoGMT1 hinterlegt unter der DSM-Nummer DSM 12479 als E. coli Stamm DH5α pSoGMT1 enthaltend dieses Plasmid.

7. Bakterien, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 bzw. enthaltend Phagemide gemäß den Ansprüchen 3 bis 6.

8. Hefen, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 bzw. enthaltend Plasmide gemäß Anspruch 3.

9. Bakterien enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 bzw. enthaltend Plasmide/Phagemide gemäß den Ansprüchen 3 bis 6.

10. Pflanzenzellen enthaltend Plasmide gemäß den Ansprüchen 1 und 2.

11. Transformierte Pflanzenzellen und aus diesen regenerierte transgene Pflanzen enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei diese Sequenzen als Bestandteil eines rekombinaten DNA-Moleküls in die Pflanzenzellen eingeführt wurden.

12. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Einführung in pro- oder eukaryontische Zellen, wobei diese Sequenzen mit Steuerelementen, die die Transkription und Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft sind und zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Glutamat/Malat-Translokators bewirkt, führen.

13. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Isolierung von DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, das die biologische Aktivität eines Glutamat/Malat-Translokators besitzt.

14. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei diese Sequenz eine kodierende Region enthält, die für ein reifes Protein mit der biologischen Aktivität eines Glutamat/Malat-Translokators kodiert, zur Kombination mit "Targeting"-Sequenzen für andere Zellkompartimente oder zelluläre Membransysteme, wodurch das reife Protein in andere Kompartimente oder Membransysteme dirigiert wird.

15. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Identifizierung von Substanzen, die eine inhibierende Wirkung auf den Transport von Dikarbonsäuren über die innere Plastidenhüllmembran haben.

16. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Isolierung entsprechender genomischer Klone.

17. Verwendung von Promotorbereichen oder von Promotorteilbereichen gemäß Anspruch 16 zur gewebespezifischen Expression von Genen.

18. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von DNA-Sequenzen, die für einen pflanzlichen plastidären Dikarbonsäuretranslokator mit einer veränderten Spezifität kodieren.

19. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Identifizierung von Insertionsmutanten, zur homologen Rekombination oder zur Expression einer nicht translatierbaren RNA, die mittels eines "antisense"-Effektes, eine Kosupression oder einer Ribozymaktivität die Synthese eines oder mehrerer endogener plastidärer Glutamat/Malat-Translokatoren in den Zellen verhindert.