DE19851415A1 - Mutanter Transaktivator - Google Patents
Mutanter TransaktivatorInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen mutanten Transaktivator mit einem Tet-Repressor TetR, der mindestens einen Amminosäureaustausch an einer Position verschieden von den Amminosäurepositionen 71, 95, 101 oder 102 aufweist.
Description
Nach dem Stand der Technik sind aus Gossen, M., Freudenlieb,
S., Bänder, G., Müller, G., Hillen, W. & Bujard, H. (1995):
Transcriptional activation of tetracyclines in mammalian
cells, Science 268, 1766-1769 mutante Transaktivatoren be
kannt. Dabei handelt es sich um reverse Transaktivatoren
rtTA, die Austausche an den Aminosäurepositionen 71, 95, 101
und 102 des Tet-Repressors TetR aufweisen. Die Austausche be
finden sich am Anfang und am Ende von Helix 6 des TetR-
Moleküls. Es wird angenommen, dass diese Austausche eine Kon
formationsänderung nach der Induktion bewirken. Wie diese
Austausche zum reversen Phänotyp führen, ist noch nicht ge
klärt.
Aus Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., & Her
rero, E. (1998): An activator/repressor dual system allows
tight tetracycline-regulated gene expression in budding
yeast, Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, No. 4 942-947
sowie Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M. & Herrero, E.
(1997): Yeast, Vol. 13; 837-848 ist die Expression von Trans
aktivatoren tTA und rtTA in Saccharomyces cerevisiae bekannt.
Dabei konnte allerdings rtTA nicht alleine als Transaktivator
benutzt werden, weil aufgrund einer hohen Basisexpression
keine regulierbäre Genexpression mehr möglich war. Zur Behe
bung dieses Nachteils ist ein regulierbarer Repressor in das
System eingefügt worden. - Das System zeigt hohe Induktions
raten. Gleichwohl ist es kompliziert und schwer beherrschbar.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand
der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere mutante
Transaktivatoren angegeben werden, mit denen in Hefe auf mög
lichst einfache und unkomplizierte Weise hohe Induktionsraten
erzielt werden können.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.
Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen
der Ansprüche 2 bis 12.
Zur Lösung der Aufgabe ist ein mutanter Transaktivator vorge
sehen, mit einem Tet-Repressor TetR, der mindestens einen
Aminosäureaustausch an einer Position verschieden von den
Aminosäurepositionen 71, 95, 101 oder 102 aufweist.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass mit solchen mu
tanten Transaktivatoren hohe Induktionsraten erzielbar sind.
Sie zeigen ein niedriges Basalniveau. Auf die Einführung ei
nes Repressors kann in diesem System verzichtet werden. Das
System ist einfach und lässt sich gut beherrschen.
Die muntanten Transriptionsaktivatoren sind induktorspezi
fisch, d. h. die Expression kann durch die Art des Induktor
variiert werden.
Die mutierten Transaktivatoren eigenen sich darüber hinaus
zur Anwendung in einem breiten Spektrum von Organismen, ins
besondere in Pflanzen oder niederen Pilzen.
Von Vorteil ist es, dass mindestens ein Aminosäureaustausch
im DNA-bindenden Bereich, vorzugsweise an der Aminsäureposi
tion 19, sich befindet. Des weiteren kann sich ein Aminosäu
reaustausch im Bereich der Helix 4, vorzugsweise an der Ami
nosäureposition 56, befinden. Bereits die vorgenannten Aus
tausche sind überraschenderweise ausreichend, um den reversen
Phänotyp zu erzeugen. Es sind also andere Bereiche betroffen
als in der bekannten rtTA. Das legt es nahe, dass hier mögli
cherweise ein neuer Induktionsmechanismus zugrunde liegt.
Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal liegen weitere Ami
nosäureaustausche an der Aminosäureposition 148 und/oder 179
vor. Es kann sein, dass mindestens ein Aminosäureaustausch in
den Aminosäurepositionen 71, 95, 101 und 102 vorliegt.
Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal enthält der Trans
aktivator das Virusprotein 16 VP16. Ein solcher Transaktiva
tor ist einfach herzustellen.
Der Transaktivator kann in niederen Pilzen, insbesondere in
Saccharomyces cerevisiae, in mammalischen Zellen, insbesonde
re in HeLa, und in pflanzlichen Zellen die Expression in Ab
hängigkeit niedermolekularer Induktoren aktivieren.
Zweckmäßigerweise ist der mutante Transaktivator aus der fol
genden Gruppe ausgewählt: rtTA-E19G/A56P, rtTA-22R, rtTR-34R,
rtTA-44R, rtTR-52R, rtTR-68R, rtTR-92R. Die genannten mutan
ten Transaktivatoren zeigen eine besonders hohe Induktionsra
te insbesondere in Anwesenheit von Doxizyklin.
Nach einer weiteren Ausgestaltung ist ein erfindungsgemäßer
mutanter Transaktivator Bestandteil eines Arzneimittels oder
eines transgenen Organismus oder eines Expresionssystems oder
eines Genregulationssystems.
Nachfolgend werden die Herstellung und die Eigenschaften er
findungsgemäßer mutanter Transaktivatoren beispielhaft erläu
tert. Dabei zeigen:
Fig. 1 eine Karte des Plasmids pCM190-GFP+,
Fig. 2 die Fluoreszenzintensität der Reporter-Expression
hervorgerufen durch verschiedene mutante Transakti
vatoren in Abhängigkeit unterschiedlicher Regulato
ren,
Fig. 3 die Fluoreszenzintensität der Reporter-Expression
hervorgerufen durch verschiedene mutante Transakti
vatoren in Abhängigkeit der Temperatur,
Fig. 4 die Luciferase-Aktivität der Reporter-Expression
hervorgerufen durch verschiedene mutante Transakti
vatoren in HeLa-Zellen und
Fig. 5 den Anteil der einzelnen Aminosäureaustausche von
rtTA-34R am reversen Phänotyp.
Fig. 1 zeigt einen zur Herstellung der erfindungsgemäßen mu
tanten Transaktivatoren geeigneten Vektor, nämlich den Vektor
pCM190-GFP+. Der Vektor enthält eine konstitutiv exprimierte
TetR-VP16-Fusion als Transaktivator tTA. Stromabwärts
schliesst sich daran ein durch Tc regulierbarer Promotor,
z. B. ein CMV Promotor an. Der hier gewählte Promotor umfasst
7 tet-Operatoren tetO7, die stromaufwärts der CYC TATA-Region
der Bäckerhefe angeordnet sind. In der Nähe der CYC TATA-
Region ist das für das grün fluoreszierende Protein GFP aus
Aequorea victoria codierende Gen in die singuläre BamHI-
Schnittstelle von pCM190 ligiert. Der Vektor enthält ferner
ein URA3-Gen sowie eine 2µ-Sequenz.
Die Funktion der vorgenannten Bestandteile des Vektors ist
folgende:
Aus dem tTA bzw. rtTA kann über geeignete Restriktions schnittstellen der tetR-Anteil entfernt und durch eine korre spondierende mutagenisierte tetR-Sequenz ersetzt werden.
Aus dem tTA bzw. rtTA kann über geeignete Restriktions schnittstellen der tetR-Anteil entfernt und durch eine korre spondierende mutagenisierte tetR-Sequenz ersetzt werden.
Die Herstellung mutagenisierter TetR kann vorteilhafterweise
mittels PCR erfolgen. Dazu wird TetR mittels der Taq-DNA-
Polymerase amplifiziert. Ein Zusatz von z. B. Manganchlorid
sowie die Einstellung eines Ungleichgewichts der Nukleotide
bewirkt eine hohe Fehlerrate dieser Polymerase: Etwa 90% der
gebildeten PCR-Produkte weisen einzelne oder mehrere Punktmu
tationen auf.
Das GFP-Gen dient als Indikator- bzw. Reportergen. Es eignet
sich insbesondere als Reporter in der Bäckerhefe. Das URA3-
Gen dient als Selektionsmarker in der Bäckerhefe. Die 2µ-
Sequenz gewährleistet eine besonders hohe Kopienzahl des Vek
tors in den Bäckerhefe-Zellen.
Zur Durchführung eines zum Auffinden der erfindungsgemäßen
Transaktivatoren geeigneten Auswahl- bzw. Screeningverfahrens
wird ein zufällig generiertes tetR-Mutanten enthaltendes
pCM190-GFP+ Gemisch mittels Transformation in Saccaromyces
cerevisiae eingebracht. Anschließend wird mittels Uracil-
Prototropie der Transformanden auf die Anwesenheit des Vek
tors selektioniert.
Auf geeigneten Agarplatten kann nun die Induktion von TetR-
Mutanten unter verschiedenen Bedingungen geprüft werden. Es
kann z. B. der die Induktion von TetR-Mutanten bewirkende Ef
fektor variiert werden. Als Effektoren kommen z. B. Tc-
Derivate oder andere chemische Verbindungen in Frage.
Die Fig. 2 und Fig. 3 zeigen die Eigenschaften von unter Ver
wendung des Verfahrens aufgefundenen Mutanten. Dabei wurde
wie folgt vorgegangen:
Der TetR-Anteil von tTA wurde mit dem Vektor pCM190 als Ma trize und zwei entsprechenden Oligonukleotiden (5'- GACCGATCCAGCCTCCGCGG und 5'-CGTGTGTCCCGCGGGGAGAA) nach der Methode von Leung et al. (Leung, D. W., Chen, E., & Goeddel, D. V. 1989: A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction, Technique 1, 11-15) amplifiziert. Die enthaltenen, mutagenisierten PCR-Fragmente (= mutagenisierte TetR-Gene) und PCM190-GFP+ wurden mit Xbal und BsiWI verdaut und aufgereinigt. Anschlie ßend wurden die PCR-Fragmente in den geschnittenen Vektor li giert und in E. coli DH5α transformiert. Jeweils mehrere 1000 E. coli-Klone wurde zusammen kultiviert und deren Plasmid-DNA präpariert. Diese Plasmidpools wurden sodann mittels der LiAc-Methode in Saccaromyces cerevisiae transformiert (Ito et al., H., Fukada, Y., Murata, K, & Kimura 1983: Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bact. 153, 163-168).
Der TetR-Anteil von tTA wurde mit dem Vektor pCM190 als Ma trize und zwei entsprechenden Oligonukleotiden (5'- GACCGATCCAGCCTCCGCGG und 5'-CGTGTGTCCCGCGGGGAGAA) nach der Methode von Leung et al. (Leung, D. W., Chen, E., & Goeddel, D. V. 1989: A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction, Technique 1, 11-15) amplifiziert. Die enthaltenen, mutagenisierten PCR-Fragmente (= mutagenisierte TetR-Gene) und PCM190-GFP+ wurden mit Xbal und BsiWI verdaut und aufgereinigt. Anschlie ßend wurden die PCR-Fragmente in den geschnittenen Vektor li giert und in E. coli DH5α transformiert. Jeweils mehrere 1000 E. coli-Klone wurde zusammen kultiviert und deren Plasmid-DNA präpariert. Diese Plasmidpools wurden sodann mittels der LiAc-Methode in Saccaromyces cerevisiae transformiert (Ito et al., H., Fukada, Y., Murata, K, & Kimura 1983: Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bact. 153, 163-168).
Die erhaltenen Uracil-prototrophen Hefeklone wurden auf Mini
malmedium-Platten ohne Uracil, aber mit jeweils 10 µg/ml
Tetrazyklin bzw. Doxizyklin oder ohne Tc-Derivat replikaplat
tiert und nach zwei bis drei Tagen Wachstum bei 30°C unter
langweiligem UV-Licht kontrolliert. Dabei konnten Mutanten
identifiziert werden, die einen reversen Phänotyp aufweisen,
d. h. sie induzieren im Gegensatz zu tTA in Anwesenheit von
Tetrazyklin-Derivaten.
Die mutanten Transaktivatoren wurden zusammen mit einem GFP
freien Kontrollstamm, dem tTA- und dem rtTA- enthaltenden
Stamm über Nacht in Minimalmedium kultiviert. Die Zellen wur
den geerntet und je eine OD600 wurde mit PBS gewaschen und in
2 ml PBS resuspendiert. Die Lichtemission der Zellen bei 512 mm
wurde in einem Fluorimeter bei einer Anregungswellenlänge
von 490 nm vermessen. Dabei erwies sich die Basalaktivität
der Mutante rtTA-34R rtTA-22R, rtTA-52R, rtTA-68R und rtTA-92R
in Hefe als deutlich erniedrigt im Vergleich zu dem bis
her bekannten rtTA (Belli et al. 1998: An activator/repressor
dual system allows tight tetracycline-regulated gene expres
sion in budding yeast, Nucleic Acids Res. 26, 942-947). Wie
aus Fig. 2 ersichtlich ist, liegt die Aktivierung etwa im Be
reich des rtTA bzw. des rTA. Es werden hierbei Induktionsfak
toren von 100-300 gemessen. Also sind die vorgenannten Mutan
ten für den Einsatz zur regulierbaren Genexpression in Hefe
wesentlich besser geeignet als rtTA, dessen Induktionsraten
maximal 40-fach sind.
In Fig. 3 ist die relative Fluoreszenzintensität über erfin
dungsgemäßen mutanten Transaktivatoren im Vergleich zu tTA
und rtTA bei einer Temperatur von 28°C sowie von 37°C aufge
tragen. Insbesondere die mutante rtTA-52R zeigt eine ausge
prägte Abhängigkeit der Induktionsrate von der Temperatur.
Nach Isolation der entsprechenden Vektoren aus der Bäckerhefe
wurden die mutagenisierten tTA-Bereiche sequenziert, um die
für den reversen Phänotyp verantwortlichen Aminosäureaustau
sche zu bestimmen. Anschließend wurden sowohl rtTA-34R als
auch -44R in den Vektor pUHD15-1 (Gossen & Bujard, 1992:
Tight control of gene expression in mammalian cells by
tetracycline-responsive promoters, Proc., Natl., Acad. Sci.
USA 89, 5547-5551) umkloniert, wobei die mutagenisierten
Transaktivatoren tTA ersetzten. Durch transiente Transfektio
nen zusammen mit dem Luciferase-kodierenden Vektor pUHC13-3
wurden die Aktivitäten der Konstrukte in HeLa-Zellen über
prüft.
Aus Fig. 4 ist ersichtlich, dass insbesondere rtTA-34R auch
in Humanzellen eine mehrfach höhere Induktion des Reporter
gens bewirkt als bisher verwendete rtTA. Dieser Effekt kommt
zum einen wie in Saccaromyces cerevisiae durch erniedrigtes
Basalniveau zustande. Zum anderen dadurch, dass die Aktivie
rung der Transkription deutlich erhöht ist.
Eine transiente Transfektion von humanen Epithelzellen zeigt,
dass rtTA-34R den bisher verwendeten rtTA in Humanzellen
überlegen ist. Dazu wurde der Tetrazyklin-regulierbare Repor
ter Luciferase in Abhängigkeit von unterschiedlichen Transak
tivatoren quantifiziert. Die dabei erzielten Ergebnisse sind
aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich.
Die Tabelle zeigt, dass durch rtTA-34R etwa 3-fach höhere In
duktionsraten erzielt werden als durch rtTA. rtTA-34R stellt
daher einen deutlich verbesserten Transaktivator dar.
Zur Prüfung der Frage, ob in Hefe erzielte Ergebnisse auf Hu
manzellen übertragbar sind, wurden nach Klonierung der rtTA-
Mutanten in den Vektor pUHD15-1 fünf der Klone, die in Hefe
einen sehr ausgeprägten Phänotyp zeigten, mittels transienter
Transfektionen in humanen Epithelzellen getestet.
U. a. rtTA-34R stellt eine deutliche Verbesserung des rever
sen, Tc-induzierbaren Systems dar, denn sowohl in Humanzellen
als auch in Bäckerhefe sind die Induktionsraten in Anwesen
heit von Doxizyklin im Vergleich zum bisher verwendeten rtTA
mehrfach gesteigert. Während der rtTA-Phänotyp auf die Ami
nosäureaustausche D95N L101S G102D zurückzuführen ist, wurden
in dem neu konstruierten rtTA-34R die Austausche E19G A56P
(H139H) A148E H179R identifiziert. Die Aminosäuren 71, 95,
101 und 102 sind in rtTA-34R nicht betroffen.
Um den Einfluss der einzelnen Positionen genauer zu untersu
chen, wurden die Mutationen 19/56 und (139)/148/179 getrennt.
Die entstandenen Proteine rtTA-1956R und rtTA-148179R wurden
durch transiente Transfektionsstudien in HeLa-Zellen auf ihr
Aktivierungspotential untersucht.
Aus Fig. 5 ist ersichtlich, dass die Austausche E19G und A56P
ausreichend sind, um einen reversen Phänotyp zu erhalten. Die
Mutationen an Position 148 und 179 tragen nur wenig zur Aus
prägung bei. Dagegen führen die Mutationen D148E und H179R
nicht zur Reversion des Induktionsmechanismus.
Der bisher verwendete rtTA hat im Vergleich zu tTA Austausche
an den Aminosäurepositionen 71, 95, 101 und 102 des TetR-
Moleküls. Diese Aminosäuren liegen in eine eng begrenzten Be
reich des Proteins am Anfang und Ende von Helix 6.
rtTA-34R dagegen zeigt die Austausche an den Positionen 19,
56, 148 und 179, wobei die Austausche 19 und 56 ausreichend
sind, um den reversen Phänotyp hervorzurufen (siehe Mutante
rtTA-E19G/A56P). Position 19 liegt im DNA-bindenden Bereich
und Position 56 in Helix 4.
Claims (12)
1. Mutanter Transaktivator mit einem Tet-Repressor TetR,
der mindestens einen Aminosäureaustausch an einer Posi
tion verschieden von den Aminosäurepositionen 71, 95,
101 oder 102 aufweist.
2. Mutanter Transaktivator nach Anspruch 1, wobei minde
stens ein Aminosäureaustausch im DNA-bindenden Bereich,
vorzugsweise an der Aminosäureposition 19, sich befin
det.
3. Mutanter Transaktivator nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei ein Aminosäureaustausch im Bereich der
Helix 4, vorzugsweise an der Aminosäureposition 56,
sich befindet.
4. Mutanter Transaktivator nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei weitere Aminosäureaustausche an der
Aminosäureposition 148 und/oder 179 vorliegen.
5. Mutanter Transaktivator nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei mindestens ein Aminosäureaustausch in
den Aminosäurepositionen 71, 95, 101 oder 102 vorliegt.
6. Mutanter Transaktivator nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei der Transaktivator das Virus Protein
16 enthält.
7. Mutanter Transaktivator nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei der Transaktivator in niederen Pilzen,
insbesondere in Saccharomyces cerevisiae, in mammali
schen Zellen, insbesondere in HeLa, und in pflanzlichen
Zellen die Expression in Abhängigkeit niedermolekularer
Induktoren aktiviert.
8. Mutanter Transaktivator nach einem der vorhergehenden
Ansprüche mit einer Stuktur aus der folgenden Gruppe:
rtTA-E19G/A56P, rtTA-22R, rtTR-34R, rtTA-44R, rtTR-52R,
rtTR-68R, rtTR-92R.
9. Mutanter Transaktivator nach einem der vorhergehenden
Ansprüche als Bestandteil eines Arzneimittels.
10. Mutanter Transaktivator nach einem der Ansprüche 1 bis
8 als Bestandteil eines transgenen Organismus.
11. Mutanter Transaktivator nach einem der vorhergehenden
Ansprüche 1 bis 8 als Bestandteil eines Expressionssy
stems.
12. Mutanter Transaktivator nach einem der Ansprüche 1 bis
8 als Bestandteil eines Genregulationssystems.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998151415 DE19851415B4 (de) | 1998-11-07 | 1998-11-07 | Mutanter Transaktivator |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998151415 DE19851415B4 (de) | 1998-11-07 | 1998-11-07 | Mutanter Transaktivator |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19851415A1 true DE19851415A1 (de) | 2000-05-11 |
| DE19851415B4 DE19851415B4 (de) | 2010-11-04 |
Family
ID=7887043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1998151415 Expired - Lifetime DE19851415B4 (de) | 1998-11-07 | 1998-11-07 | Mutanter Transaktivator |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19851415B4 (de) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002020811A2 (en) * | 2000-09-09 | 2002-03-14 | Basf Plant Science Gmbh | Modified tet-inducible system for regulation of gene expression in plants |
| WO2003056021A2 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-10 | Wolfgang Hillen | Modified tetracycline repressor protein compositions and methods of use |
| US7541446B2 (en) | 1999-06-07 | 2009-06-02 | Tet Systems Holding Gmbh & Co. Kg | Tet repressor-based transcriptional regulatory proteins |
| US8541002B2 (en) | 2003-09-12 | 2013-09-24 | Agenus Inc. | Vaccine for treatment and prevention of herpes simplex virus infection |
| CN113164625A (zh) * | 2018-09-28 | 2021-07-23 | 哈佛大学的校长及成员们 | 用于基因表达的突变体反向四环素反式激活因子 |
| CN114134160A (zh) * | 2021-12-04 | 2022-03-04 | 安徽大学 | 一种四环素调控蛋白突变体基因及其在调控基因表达和环境检测中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996040892A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Basf Ag | Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered dna binding specificities |
-
1998
- 1998-11-07 DE DE1998151415 patent/DE19851415B4/de not_active Expired - Lifetime
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| CN114134160A (zh) * | 2021-12-04 | 2022-03-04 | 安徽大学 | 一种四环素调控蛋白突变体基因及其在调控基因表达和环境检测中的应用 |
| CN114134160B (zh) * | 2021-12-04 | 2024-01-09 | 安徽大学 | 一种四环素调控蛋白突变体基因及其在调控基因表达和环境检测中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19851415B4 (de) | 2010-11-04 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: TET SYSTEMS GMBH & CO. KG, 69120 HEIDELBERG, DE |
|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8381 | Inventor (new situation) |
Inventor name: HILLEN, WOLFGANG, 91080 UTTENREUTH, DE |
|
| R020 | Patent grant now final |
Effective date: 20110204 |
|
| R081 | Change of applicant/patentee |
Owner name: TET SYSTEMS GMBH & CO. KG, DE Free format text: FORMER OWNER: HILLEN, WOLFGANG, 91080 UTTENREUTH, DE Effective date: 20110228 |
|
| R082 | Change of representative | ||
| R071 | Expiry of right |