DE19845883A1 - Vorrichtung zur Durchführung von Biotests - Google Patents

Description

Biotests sind bekannt. So werden z. B. biologische Kurzzeittests zur Keimung und zum weite­ ren Wachstum von Pflanzen insbesondere der Wurzel und des Sprosses bis zum Keimblattsta­ dium durchgeführt.

Derartige Biotests werden je nach Fragestellung zur Bestimmung der Vitalität von Saatgut, besonders aber zum integralen Aufspüren von phyto/pflanzentoxischen Wirkungen von Rein­ stoffen, Stoffgemischen und Umweltproben (Wasser, Wasserkonzentrate, Boden, Sediment, Boden- und Sedimenteluate und -extrakte, Feststoffe) eingesetzt.

Sie ermöglichen die integrale Bewertung von in die Umwelt einzubringenden oder dort vor­ kommenden Stoffen hinsichtlich möglicher Gefährdungspotentiale z. B. durch Schadstoffein­ trag aus der Luft und dem Regen in Waldgebieten. Für potentielle Schadstoffgemische mit komplexer, chemisch-analytisch gar nicht umfassend analysierbarer Zusammensetzung - z. B. Abwasser-, Deponiesickerwasserströme, Bodenextrakte besonders aus Altlasten und deren biologische Sanierungsprodukte - Verbrennungsprodukte (Abgase) aus der Chemischen Indu­ strie, der Energieerzeuger und dem Straßenverkehr sind integrale Wirkungstests zur ökotoxi­ kologischen Bewertung unverzichtbar.

Biotests können besonders bei modernen Pflanzenschutzmitteln (hoher Wirksamkeit bei gerin­ ger Aufwandmenge) in Ergänzung und Konkurrenz zur oft schwierigen chemischen Analytik treten.

Das Wachstum von terrestrischen oder aquatischen Gefäßpflanzen ist die lebenswichtige Grundlage für jegliches tierische und menschliche Leben auf der Erde. Trotzdem wurde die Verwendung von Gefäßpflanzen zum Aufspüren von Schadstoffen bisher stark gegenüber dem Einsatz von einzelligen Algen vernachlässigt. Gefäßpflanzen sind jedoch z. B. gegenüber au­ xinanalogen Herbiziden viel empfindlicher als einzellige Algen, da letztere nicht über eine auxingesteuerte Wachstumsregulation verfügen. Die Bewertung von Luftschadstoffen ist erst durch die quantitative Erfassung von höheren Pflanzen möglich.

Der Grund für den selteneren Einsatz von Gefäßpflanzen ist unter anderem die höhere For­ menvielfalt und Komplexität von Gefäßpflanzen, welche bisher eine manuell optische und damit zeit- und kostenintensive und niemals völlig objektivierbare Auswertung erforderlich macht.

Der Pflanzen-Keimungs-Wurzellängentest z. B. nutzt die hohe Empfindlichkeit von Pflanzen gegenüber toxischen Stoffen während der Keimungsphase bis zur Ausbildung der Keimblätter aus.

Richtlinien für die Testdurchführung finden sich z. B. in:

• - DIN Entwurf 38412 "Bestimmung der Wirkung von Abwasser auf das Wurzellängen­ wachstum der Gartenkresse". Dieser sieht ein dreitägiges beleuchtetes Wachstum von Kressesamen auf Edelstahlnetzen in eine Verdünnungsreihe von Abwasser vor. Als Meß­ größen dient die manuell gemessene Wurzellänge. Außerdem sollen Erscheinungen wie die Ausbildung der Wurzelhaarzone und Entwicklungszustand von Hypokotyl und Blättern protokolliert werden.
• - Der Entwurf DIN 350 11 269 Teil 1 beschreibt die Prüfung des Wachstums vorgekeimter Gerstesamen in Bodenproben. Auch hier sollen nach 5 bis 7 Tagen und Entfernung der Er­ de die Länge der längsten Wurzel, gegebenenfalls auch die des Triebes gemessen werden.
• - Die EPA-Richtlinie 600-3-88-029 sieht ein fünftägiges "Protocols for short term toxicity screening of hazardous waste sites" Wachstum z. B. von Salatsamen im hell-/dunkel-Zyklus in Petrischalen in Gegenwart der Testlösung vor. Mögliche Meßgrößen sind Keimung, Wurzellänge und Trockengewicht.

Allen Richtlinien ist gemeinsam, daß neben der zerstörenden Trockenmassebestimmung nur die einfachste Meßgröße des Wachstums - die Länge der Wurzel- bestimmt wird, da nur diese Längenmessung dem menschlichen Auge problemlos möglich ist.

Weiter bekannt sind biologische Kurzzeittests zur Wachstumshemmung/-förderung von Was­ serlinsen (Lemnaceae):

Wurzelnde oder freischwimmende Gefäßpflanzen sind neben Algen ein wesentlicher Be­ standteil vieler aquatischer Ökosysteme. Wasserlinsen sind eine Nährungsquelle für Wasser­ vögel und viele Kleintiere. Sie dienen Fischen als Futter, Deckung und Schatten. Kleine wir­ bellose Tiere nutzen sie als Träger. Bei zu schnellem Wachstum können sie jedoch Licht- und Sauerstoffzufuhr soweit unterbinden, daß es zu Fischsterben kommt.

Ein Test ist z. B. in der ASTM Guideline E 1415-91 "Standard Guide for Conducting Static Toxicity Tests With Lemna gibba G3" dargestellt. Eine vergleichbare europäische Richtlinie gibt es noch nicht. Der Test nutzt die Tatsache aus, daß sich die Schwimmblätter von Wasser­ linsen bei ausreichender Temperierung, Beleuchtung und Nährstoffversorgung sehr schnell teilen. Unter toxischer Belastung kommt es jedoch zu einer Gelbfärbung vorhandener Schwimmblätter und zu einer Verringerung der Teilungsgeschwindigkeit.

Dazu müssen vor Testbeginn nach Augenmaß in alle Versuchsansätze "gleichwertige" Was­ serlinsenpflanzen aus der Vorzucht aussortiert und in Gefäße mit Nährlösung eingesetzt wer­ den. Dies ist grundlegend, da sich Startunterschiede im Verlauf des Tests weiter vergrößern und damit Schadstoffeffekte verdecken können. Gleichzeitig ist die optisch manuelle Auswahl von Pflanzen mit "gleichwertiger" Blattanzahl und Größe auch in Hinblick auf die Erforder­ nisse der Qualitätssicherung und Dokumentation mit einem hohen subjektiven Faktor belastet. Nach Ende der normalerweise siebentägigen Wachstumsphase im Phytotron, einer sehr gleichmäßig ausgeleuchteten Klimakammer, muß anhand einer geeigneten Meßgröße die För­ derung oder Hemmung des Wachstums behandelter Versuchsansätze gegenüber unbehandelten Kontrollansätzen ermittelt werden. Die häufigste und einfachste Methode ist die Zählung der einzelnen Schwimmblätter unabhängig von deren Größe. Weitere Meßgrößen sind die Anzahl der gebildeten Wurzeln, das Trockengewicht und die Gesamtlänge aller Wurzeln. Das Troc­ kengewicht ist der objektivste und reproduzierbarste Endpunkt, ist aber nur einmal unter Zer­ störung der Wasserlinsen möglich. Der Chlorophyllgehalt ist sehr aussagekräftig für die Vita­ lität der Pflanzen, aber ebenfalls nur unter Zerstörung direkt meßbar.

Nachteilig bei den genannten Testverfahren ist der hohe Arbeitsaufwand, die schlecht doku­ mentierbaren, da subjektiven Einflußfaktoren und/oder die objektzerstörenden Maßnahmen.

Es ist demzufolge Aufgabe der vorliegenden Erfindung, unter Vermeidung der aus dem Stand der Technik bekannten Merkmale eine einfach durchzuführende, objektivierbare und objekter­ haltende Möglichkeit zur Durchführung und Auswertung von Biotests zu schaffen.

Diese Aufgabe wird gelöst mit einer Vorrichtung zur Durchführung von Biotests, die Mittel zur automatischen bildanalytischen Auswertung von in Probenschalen angeordneten biologi­ schen Proben mit und ohne Einfluß potentiell phytotoxischer Substanzen in verschiedenen Matrices und eine optische Aufnahmeeinrichtung aufweist, die die Probenschale mit Auf- oder Durchlicht beleuchtet, die Proben gegebenenfalls mit einer Glasscheibe oder einer hoch pola­ ren Matrix planarisiert, mit einer digitalen (CCD) Kamera aufnimmt und die Daten zur Re­ duktion und Auswertung an ein Bildanalysesystem weitergibt.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

So ist es bevorzugt, wenn die Vorrichtung Mittel zur automatischen Diskriminierung von Pro­ benbestandteilen wie z. B. Samenhülle, Sproß, Wurzel, Wurzelhaare oder von Wurzelhaaren überdeckter Fläche, und zur darauffolgenden quantitativen Vermessung der Bestandteile auf z. B. Länge, Breite und Schattenfläche aufgrund der erhobenen Daten mittels Bildanalyse auf­ weist.

Weiter vorteilhaft sind Mittel zur Wiederauffindung individueller Proben, Probenbestandteile oder Probengruppen bei periodischen Vermessungen der gleichen Probe anhand von spezifi­ schen Formmerkmalen und Informationen über die räumlichen Veränderungsmöglichkeiten zwischen den Messungen.

Wenn an/in den Versuchseinheiten im Sichtfeld der Kamera Barcodes angeordnet sind, die zur sicheren Zuordnung der einzelnen Messungen jeweils bildanalytisch mit ausgewertet werden und neben Informationen zum Testansatz auch Angaben über die computergenerierte Plazie­ rung der Schale bei randomisierten Versuchen enthalten, liegt eine weitere bevorzugte Ausfüh­ rungsform vor.

Es ist weiter vorteilhaft, wenn eine Einrichtung zur automatischen Kalibrierung mit einem Einheitskörper bekannter Körpergeometrie und Farbe durch automatisches Vermessen von der Bildverarbeitung vorgesehen ist. Hierdurch können in einfacher Weise die Probendaten in ab­ solute Werte umgerechnet werden.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn der oder die Barcodes auf dem Einheitskörper zur Kalibrie­ rung angeordnet sind, da so der apparative Aufwand reduziert wird.

Wenn dies erforderlich sein sollte, die Bildanalyse auch ohne sichtbares Licht durchzuführen, kann eine Beleuchtungseinrichtung zum Auswerten in dunkler Testumgebung mit einem Wellenlängenbereich, der die Pflanzen in ihrem Verhalten nicht beeinflußt und bei der die CCD-Kamera arbeitet, vorgesehen werden.

Insbesondere kann dies eine Infrarotbeleuchtungseinrichtung sein.

Die in manchen Testreihen erforderliche, nach Farben getrennte Erfassung und Auswertung der Proben wird durch eine Farbkamera oder eine optische Filtereinrichtung realisiert.

Vorteilhaft ist weiter, wenn Mittel zum Vergleichen der gewonnenen Daten mit abgespeicher­ ten Vergleichsdaten vorgesehen sind. Hierdurch kann auf im Laufe der Zeit angesammeltes Referenzdatenmaterial zurückgegriffen werden.

Wenn die Aufnahmeeinrichtungen (CCD Kamera) und die Auswerteeinrichtungen (Bildanaly­ sesystem) räumlich getrennt sind, kann die Auswertung in vorteilhafter Weise zentral durchge­ führt wird. Hierdurch muß nicht an jedem Test-/Arbeitsplatz die volle Rechenleistung vorge­ halten werden.

Die CCD Kamera und die Probenschalen sollte relativ zueinander beweglich angeordnet sein, damit die CCD Kamera unterschiedliche Probenbereiche anfahren, fokussieren und aufnehmen kann.

Bevorzugt ist weiter, wenn die Auswerteeinrichtungen (Bildanalysesystem) anhand von Farb- und Strukturmustern der Testpflanzen Rückschlüsse auf die Xenobiotika (Umweltchemikali­ en) ziehen kann. Xenobiotika (Umweltchemikalien) verursachen bei den genannten Pflanzen verschiedene Strukturwandlungen. Die Pflanzen können sich z. B. in Farbe, Form, Größe, Teilungsrate, Infrarotmuster oder Chlorophyllgehalt verändern. Es kann vollständiger und partieller Pigmentverlust auftreten. Es kommt zu Kolonieenaufbruch, zur Buckelbildung, zum Verlust oder zur extremen Bildung von Wurzelhaaren. Wasserlinsen können Antozyane auf der Unterseite bilden, oder sie bilden Turione. All diese Merkmale können Rückschlüsse auf vorhandene Xenobiotika zu lassen. Die meisten Merkmale sind jedoch nach heutigem Stand der Technik nur durch Zerstörung des Organismus zu bestimmen. Dadurch können immer nur einzelne Merkmale untersucht werden, und die spezifische Aussagekraft der Mes­ sung ist nicht gegeben. Durch die Integrale Erfassung aller Merkmale, kann die Auswerte­ einrichtung Rückschlüsse auf die vorliegenden Xenobiotika machen. Dabei werden zwei ver­ schiedene Strategien verfolgt. Zum einen erkennt die Auswerteeinrichtung vorgegebene Merkmalsmuster, zum anderen werden durch eine Vielzahl von Tests neue Merkmalsver­ knüpfungen von der Auswerteeinrichtung selbständig gefunden.

Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal der Erfindung ist es, daß die Auswerteeinrichtungen (Bild­ analysesystem) die Keimlinge aufgrund von Bewegungsmustern, Farb- und Formenklassen auch nach deren Aufwachsen wiederfinden kann. In Keimungs- und Aufwuchstest werden eine Vielzahl gleicher Pflanzen in einem Versuchsgefäß beobachtet. Durch die enorme Ähn­ lichkeit ist es bisher nicht möglich, einzelne Organismen wieder aufzufinden und sie eindeu­ tig über längere Zeit zu identifizieren. Die Aufnahmeeinheit kann z. B. bis zu 100 Keimlinge gleichzeitig beobachten, und sie aufgrund der beschriebenen Merkmalsmuster einwandfrei zuordnen. Hinzu kommt die Möglichkeit der Wiedererkennung aufgrund von vorgegebenen Bewegungsmustern.

Objekte, die unter der Grenze der Auflösungsgröße der CCD-Kamera liegen (kleiner 1 mm), sollten bevorzugt originalgetreu wiedergegeben werden. Die normale Auflösungsgrenze von CCD Kameras mit einer Auflösung von 520.520 Pixeln liegt bei einem untersuchten Feld von 100×100 mm bei ca. 3 mm² (520 Pixel a 3 Farben entsprechen 174 Pixel pro Farbe. Um ein Objekt klar darzustellen braucht man jedoch mindestens 3.3 Pixel). Da die Objekte bekannt sind, kann die Auswerteeinheit gefundene Objekte an bekannte Muster anfitten, und so die Auflösung erhöhen. Die Objekte werden dann nicht mehr als Pixel Matrix dargestellt, sondern als mathematische Funktion. Dadurch ist es möglich, die eigentlich beschränkte Auflösung der Kamera zu steigern und auch Objekte, die kleiner als 3 mm² sind, maßstabs­ getreu darzustellen.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform liegt vor, wenn die Aufnahmeeinrichtung (CCD-Kamera) und die Auswerteeinrichtung durch Filtersysteme die Stoffwechselrate der Pflanze anhand von Infrarotmustern bestimmen kann. Ein wichtiges Merkmal für die Fitneß von Pflanzen ist deren Stoffwechselrate. Sowohl die Photosyntheseleistung, als auch die Oxidati­ on von Stärke und Fetten verändern das Infrarotmuster durch Reflexion und eigener Emissi­ on von Pflanzen. Diese Veränderungen können mittels IR-Filtern durch die CCD Kamera sichtbar gemacht werden. Die Auswerteeinheit paßt die Filtersysteme selbständig an, und kann somit zwischen Photosynthesestoffwechsel und Atmung unterscheiden. Diese Merk­ malsmuster konnten bisher nicht zerstörungsfrei und über längere Zeit erfaßt werden, da die IR-Spektren nicht von dem normalen Grundrauschen zu unterscheiden waren. Durch spezi­ elle Beleuchtung und Kühlung lassen sich nun auch feinste Unterschiede feststellen.

Schließlich ist es vorteilhaft, wenn spezifische optische Filter für Beleuchtung und Kamera zur Messung und Quantifizierung der Fluoreszenz von Pflanzen vorgesehen sind. Bisher werden derartige Fluoreszenzsignale integral über die gesamte Bildfläche ausgewertet. Neu­ artig ist, daß derartige Fluoreszenzsignale mit morphologischen Filtern bearbeitet werden. Weiterhin werden die Bilddaten mit den Daten und Formen der Bildobjekte im sichtbaren und IR-Bereich überlagert und gemeinsam ausgewertet. Diese Anwendung eignet sich be­ sonders für Kurzzeittests im Stundenbereich.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung (vgl. Fig. 1) zeichnet sich bei vollständiger Kompatibili­ tät mit den vorhandenen Testrichtlinien durch eine Vermeidung der oben genannten Probleme bei gleichzeitiger Schaffung neuer, empfindlicherer Meßgrößen aus. Durch die automatische Bildanalyse werden subjektive Faktoren ausgeschlossen, der notwendige Personalaufwand drastisch reduziert. Damit werden Mehrfachmessungen problemlos möglich und eine valide, kontinuierliche Dokumentierbarkeit geschaffen.

Die eigentliche Auswertung wird nur durch die verwendete Software eingeschränkt. So ist es z. B. möglich, mit den gewonnenen Daten folgende Untersuchungen durchzuführen:

• - Erkennung von Nekrosen, Chlorosen und Blattmißbildungen;
• - Unterscheidung von toten und lebenden Blättern;
• - Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit und Keimungsrate und andere kontinuierli­ che oder engmaschige Bestimmungen von Parametern (z. B. Teilungsrate, Flächenzunah­ me, Chlorophyllentwicklung, Wachstumsdynamik, Absterbedynamik), die von Hand we­ gen des hohen Zeitaufwands kaum (wirtschaftlich) möglich sind;
• - Bestimmung der Blattanzahl;
• - Bestimmung der Frondzahl;
• - Bestimmung von Gesamt- und Einzelfrondfläche;
• - Bestimmung von Gesamt- und Einzelgrünheit;
• - Bestimmung des Chlorophyllgehaltes über die Grünheit der Blätter
• - Bestimmung des Trockengewichts über Volumenanalyse und Flächenanalyse;
• - Bestimmung von Effektkonzentrationen (EC_x);
• - Bestimmung von Blattgrößen, Blattgrößenverteilungen und Blattformen;
• - Gesamterfassung einer höheren Pflanze;
• - automatischer Vergleich zu unbelasteten sogenannten Nullkontrollen, sowohl aus paralle­ len Versuchsansätzen als auch aus gespeicherten Datensätzen;
• - Erfassung von IR-Mustern und Überlagerung mit sichtbaren morphologischen Strukturen;
• - Archivierung der bildanalytischen Daten z. B. für eventuelle spätere Zweitgutachten.

Dabei ist es insbesondere möglich, die gewonnenen Daten mittels Datenfernübertragung an eine zentrale Analyseeinrichtung zu übermitteln, dort z. B. durch Vergleich mit großen Bestän­ den an Standarddaten auswerten zu lassen und die Auswertung zurückzuübermitteln.

Die in den beiden Fig. 1 und 2 dargestellten Vorrichtungen sind lediglich Ausführungsbei­ spiele der Erfindung.

In Fig. 1 ist eine Ausführungsform dargestellt, bei der die in einer Probenschale od. dgl. be­ findliche Probe auf einem Objekttisch angeordnet wird. Je nach Fragestellung erfolgt entweder keine Beleuchtung oder eine Beleuchtung von den neben der Kamera angeordneten Beleuch­ tungseinrichtungen als Auflicht oder von der unterhalb des Objekttisches angeordneten Be­ leuchtungseinrichtung als Durchlicht. Die Kamera, z. B. eine CCD Kamera nimmt die Bilder auf, die dann mittels einer Auswerteeinheit, vorzugsweise in Form eines PCs bildanalytisch verarbeitet werden. Die Daten werden auf einem Monitor dargestellt.

In Fig. 2 ist eine alternative Ausführungsform gezeigt, bei der die Kamera oberhalb einer Klimakammer mit mehreren Proben verfahrbar angeordnet ist. Die Kamera kann so in vorge­ gebenen zeitlichen Abständen die einzelnen Proben anfahren und entsprechende Aufnahmen wie vorbeschrieben machen.

Nachstehend werden noch zwei Anwendungsbeispiele für die erfindungsgemäße Vorrichtung erläutert.

Anwendungsbeispiel Wurzellängentest

Die erfindungsgemäße computergestützte Bildanalyse erfaßt jeden Keimling einzeln. Mit bildanalytischen Methoden werden dann Samenhülle, Sproß und Wurzel, gegebenenfalls auch Wurzelhaare separiert und dann getrennt quantifiziert. Mögliche Meßgrößen sind z. B. Samenquellung, Keimung (Wurzel nach bestimmter Inkubationszeit länger als 1-4 mm), Wurzellänge, Wurzelschattenfläche, mittlerer Wurzeldurchmesser, Verhältnis der Wurzel­ länge zum Durchmesser, von den Wurzelhaaren bedeckte Fläche, Sproßlänge, Sproßfläche und Blattfläche.

Dies erlaubt es, ohne zusätzlichen Arbeitsaufwand auch bisher nur schlecht feststellbare Ef­ fekte wie eine Veränderung der Wurzeldicke oder Blattfläche unter Schadstoffeinfluß zu erkennen.

Die erst durch die Automatisierung praktikable periodische Vermessung aller Proben bei Petrischalentests während der Keim- und Wachstumsphase ermöglicht die Bestimmung zeitlicher Wachstumsparameter wie Keimungszeitpunkt und individuelle Wachstumskur­ ven. Dies ermöglicht auch eine automatische Separierung von ungekeimten Samen und sol­ chen, die in der Keimungs- oder ersten Wachstumsphase abgestorben sind. Zur individuel­ len Wiederauffindung der sich auf dem Untergrund bewegenden Keimlinge werden bei je­ der Messung die räumliche Lage spezifischer Keimlingsmerkmale der einzelnen Keimlinge bildanalytisch ermittelt und mit abgespeichert. Diese Merkmale ermöglichen bei der näch­ sten Messung die individuelle Zuordnung von Keimlingen.

Die Auswertung des Versuchs erfolgt beim Test in Petrischalen entweder durch Heraus­ nehmen der Schalen aus dem Inkubationsraum (gegebenenfalls Phytotron) in die Meßvor­ richtung oder durch Einbau der Kamera in einen horizontal beweglichen Schlitten im Inku­ bationsraum. Dies gestattet vollautomatische Mehrfachmessungen und die Messung und Versuchsauswertung an arbeitsfreien Tagen.

Bei anderen Testvorschriften werden die Pflanzen von der Aufwuchsmatrix manuell befreit und anschließend bildanalytisch vermessen.

Zur Planarisierung kann eine Glasscheibe auf die Keimlinge/Pflanzen gelegt werden.

Alle Rohdaten können direkt statistisch ausgewertet werden.

Um Verwechslungen auszuschließen, kann an/in jedem Gefäß/Versuchsansatz im Sichtfeld der Kamera ein Barcode angebracht werden, der bei der Bildanalyse jeweils mit eingelesen wird. Er enthält neben Informationen zum Testansatz auch Angaben über die computerge­ nerierte Plazierung der Schale bei randomisierten Versuchen.

Die Beleuchtung wird in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Pflanze als Durchlicht oder Auflicht ausgeführt. Ein spezieller Fall stellt die Infrarotbeleuchtung dar. Mit Infrarot­ beleuchtung können die Keimlinge kontrolliert werden, ohne ihr Wachstum zu beeinflus­ sen, da Infrarotlicht keine Auswirkungen auf die Photosynthese der Pflanzen hat. Ander­ seits ist die CCD Kamera dagegen empfindlich für Infrarotlicht.

Für eine automatische Kalibrierung der Meßgröße kann ein definierter Körper in die Schale eingebracht werden. Die Pixelwerte und deren Farbwerte, die von der Bildverarbeitung auf­ genommen werden, können so in absolute Meßgrößen umgewandelt werden. Dies ermög­ licht einen Vergleich mit manuellen Auswertungen.

Anwendungsbeispiel Wasserlinsentest

Die computergestützte Bildanalyse erfaßt jedes Blatt der Wasserlinsen im Testgefäß ein­ zeln, stellt die Fläche fest und ermöglicht damit über die Anzahl hinaus Größenverteilungen und Gesamtfläche darzustellen. Dies erlaubt auch bisher nur schlecht feststellbare Effekte, wie eine Verkleinerung der Schwimmblätter unter Schadstoffeinfluß, zu erkennen.

Die Auswertung des Versuchs erfolgt entweder durch Herausnehmen der Schalen aus dem Phytotron und Plazierung in die Meßvorrichtung oder auch durch Einbau der Kamera auf einem beweglichen Schlitten im Phytotron selbst bzw. der Probe. Dies gestattet vollauto­ matische Mehrfachmessungen und die Messung und die Versuchsauswertung an arbeits­ freien Tagen.

Die Beleuchtung für die Messung erfolgt von oben mit einer zusätzlichen Beleuchtung rund um die Kamera, wobei ggf. das Licht des Phytotrons abgeschirmt wird. Zur besseren Unter­ scheidung von grünen, gelben und "weißen" Blättchen wird eine Farbkamera oder eine Graustufen-Kamera mit beweglichen Filtern verwendet und gegebenenfalls auch mit Durchlicht gearbeitet. Die Bestimmung der Summe aller Schwimmblätter erfolgt nach Ab­ schaltung der Zusatzbeleuchtung ohne Filter. Bei direkten Messungen im Phytotron wird die Zusatzbeleuchtung abgeschaltet, so daß eine quasi indirekte Beleuchtung/Durchlicht vorliegt.

Zur Dokumentation der jeweiligen Startbedingungen in jedem Versuchsgefäß werden vor Versuchsbeginn alle einzusetzenden Wasserlinsengruppen mit der Bildanalyse vermessen und Gruppen, die enge Qualitätsanforderungen an die Homogenität nicht einhalten, aussor­ tiert. Dies verringert mögliche Standardabweichungen erheblich und schafft eine Testho­ mogenität, die mit dem menschlichen Auge alleine nicht erreichbar wäre.

Während des laufenden Versuches können gegebenenfalls in definierten Abständen ohne großen Aufwand Messungen durchgeführt und zeitliche Verschiebungen in der Wachs­ tumsdynamik dokumentiert werden.

Für die Endauswertung, die statistischer Auswertung der Rohdaten und die Kennzeichnung mittels Barcodes gelten die vorstehenden Ausführungen analog.

Claims (17)

1. Vorrichtung zur Durchführung von Biotests, gekennzeichnet durch Mittel zur automatischen bildanalytischen Auswertung von in Probenschalen angeordneten biologischen Proben mit und ohne Einfluß potentiell phytotoxischer Substanzen in ver­ schiedenen Matrices, mit einer optische Aufnahmeeinrichtung, die die Probenschale mit Auf- oder Durchlicht beleuchtet, die Proben gegebenenfalls mit einer Glasscheibe oder ei­ ner hoch polaren Matrix planarisiert, mit einer digitalen (CCD) Kamera aufnimmt und die Daten zur Reduktion und Auswertung an ein Bildanalysesystem weitergibt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Mittel zur automatischen Diskrimi­ nierung von Probenbestandteilen wie z. B. Samenhülle, Sproß, Wurzel, Wurzelhaare oder von Wurzelhaaren überdeckter Fläche, und zur darauffolgenden quantitativen Vermessung der Bestandteile auf z. B. Länge, Breite und Schattenfläche aufgrund der erhobenen Daten mittels Bildanalyse.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch Mittel zur Wiederauffindung individueller Proben, Probenbestandteile oder Probengruppen bei periodischen Vermes­ sungen der gleichen Probe anhand von spezifischen Formmerkmalen und Informationen über die räumlichen Veränderungsmöglichkeiten zwischen den Messungen.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch an/in den Versuchs­ einheiten im Sichtfeld der Kamera angeordneten Barcodes, die zur sicheren Zuordnung der einzelnen Messungen jeweils bildanalytisch mit ausgewertet werden und neben Informa­ tionen zum Testansatz auch Angaben über die computergenerierte Plazierung der Schale bei randomisierten Versuchen enthalten.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur automatischen Kalibrierung mit einem Einheitskörper bekannter Körpergeometrie und Farbe durch automatisches Vermessen von der Bildverarbeitung, so daß die Probendaten in absolute Werte umgerechnet werden können.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der oder die Barcodes auf dem Einheitskörper zur Kalibrierung angeordnet sind.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch eine Beleuchtungs­ einrichtung zum Auswerten in dunkler Testumgebung mit einem Wellenlängenbereich, der die Pflanzen in ihrem Verhalten nicht beeinflußt und bei der die CCD-Kamera arbeitet, so daß die Bildanalyse auch ohne sichtbares Licht durchgeführt werden kann.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinrichtung als Infrarotbeleuchtungseinrichtung ausgebildet ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch eine Farbkamera oder eine optische Filtereinrichtung zur nach Farben getrennten Erfassung und Auswer­ tung der Proben.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch Mittel zum Verglei­ chen der gewonnenen Daten mit abgespeicherten Vergleichsdaten.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Auf­ nahmeeinrichtungen (CCD Kamera) und die Auswerteeinrichtungen (Bildanalysesystem) räumlich getrennt sind, so daß die Auswertung zentral durchgeführt wird.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die CCD Kamera und die Probenschalen relativ zueinander beweglich angeordnet sind, so daß die CCD Kamera unterschiedliche Probenbereiche anfahren, fokussieren und aufnehmen kann.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Aus­ werteeinrichtungen (Bildanalysesystem) anhand von Farb- und Strukturmustern der Test­ pflanzen Rückschlüsse auf die Xenobiotika (Umweltchemikalien) ziehen kann.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Aus­ werteeinrichtungen (Bildanalysesystem) die Keimlinge aufgrund von Bewegungsmustern, Farb- und Formenklassen auch nach deren Aufwachsen wiederfinden kann.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß Objekte, die unter der Grenze der Auflösungsgröße der CCD-Kamera liegen (kleiner 1 mm), origi­ nalgetreu wiedergegeben werden.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Auf­ nahmeeinrichtung (CCD-Kamera) und die Auswerteeinrichtung durch Filtersysteme die Stoffwechselrate der Pflanze anhand von Infrarotmustern bestimmen kann.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß spezifische optische Filter für Beleuchtung und Kamera zur Messung und Quantifizierung der Fluo­ reszenz von Pflanzen vorgesehen sind.