DE19831609A1 - Increasing microbial production of specific amino acids by increasing activity or expression of pyruvate carboxylase - Google Patents

Increasing microbial production of specific amino acids by increasing activity or expression of pyruvate carboxylase

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Abstract

Microbial production of amino acids (A) of the asparate and/or glutamate families comprises increasing pyruvate carboxylase (PC) activity by genetic alteration of the enzyme and/or increasing expression of the PC gene in appropriate microorganisms. Independent claims are also included for the following: (1) a PC gene (I) encoding a 1104 amino acid enzyme (II) and/or its allelic variants; (2) gene construct containing (I); (3) vector containing (I) or the construct; and (4) transformed cells containing, in a replicable form, (I) or the construct.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie gemäß den Ansprüchen 1 bis 17, Pyruvat- Carboxylase-Gene nach Anspruch 18 bis 23, Genstrukturen nach Anspruch 24, Vektoren nach Anspruch 25, transformierte Zellen nach Anspruch 26 bis 31 sowie Verwendungen nach Anspruch 32 bis 37.The invention relates to a method for the microbial production of amino acids the aspartate and / or glutamate family according to claims 1 to 17, pyruvate Carboxylase genes according to Claims 18 to 23, gene structures according to Claim 24, Vectors according to claim 25, transformed cells according to claims 26 to 31 and Uses according to claims 32 to 37.

Aminosäuren sind von großem wirtschaftlichen Interesse, wobei die Verwendung von Aminosäuren vielfältig ist: So wird z. B. L-Lysin wie auch L-Threonin, L-Methionin und L-Tryptophan als Futtermittelzusatz benötigt, L-Glutamat als Gewürzzusatz, L- Isoleucin und L-Tyrosin in der pharmazeutischen Industrie, L-Arginin und L-Isoleucin als Medikament oder L-Glutamat, L-Aspartat und L-Phenylalanin als Ausgangssubstanz zur Synthese von Feinchemikalien.Amino acids are of great economic interest, the use of Amino acids is diverse: B. L-lysine as well as L-threonine, L-methionine and L-tryptophan as feed additive, L-glutamate as spice additive, L- Isoleucine and L-tyrosine in the pharmaceutical industry, L-arginine and L-isoleucine as a drug or L-glutamate, L-aspartate and L-phenylalanine as Starting substance for the synthesis of fine chemicals.

Eine bevorzugte Methode zur Herstellung dieser verschiedensten Aminosäuren ist die biotechnologische Herstellung mittels Mikroorganismen; denn auf diese Weise wird direkt die biologisch wirksame und optisch aktive Form der jeweiligen Aminosäure erhalten, und es können einfache und preisgünstige Rohstoffe eingesetzt werden. Als Mikroorganismen werden z. B. Corynebacterium glutamicum und seine Verwandten ssp. flavum und ssp. lactofermentum (Liebl et al., Int J System Bacteriol 1991, 41: 255 bis 260) wie auch Escherichia coli und verwandte Bakterien eingesetzt. A preferred method for producing these various amino acids is biotechnological production using microorganisms; because in this way directly the biologically active and optically active form of the respective amino acid obtained, and simple and inexpensive raw materials can be used. As Microorganisms are e.g. B. Corynebacterium glutamicum and its relatives ssp. flavum and ssp. lactofermentum (Liebl et al., Int J System Bacteriol 1991, 41: 255 to 260) as well as Escherichia coli and related bacteria.  

Diese Bakterien produzieren die Aminosäuren normalerweise aber nur in der zum Wachstum benötigten Menge, so daß also keine überschüssigen Aminosäuren gebildet und ausgeschieden werden. Dies ist darin begründet, daß in der Zelle die Biosynthese der Aminosäuren in vielfacher Weise kontrolliert wird. Folglich sind bereits verschiedenste Verfahren bekannt, um die Produktbildung durch Ausschalten der Kontrollmechanismen zu steigern. Bei diesen Prozessen werden z. B. Aminosäureanaloga eingesetzt, um die effektive Regulation der Biosynthese auszuschalten. So ist beispielsweise ein Verfahren beschrieben, bei dem Corynebacterium-Stämme benutzt werden, die gegen L-Tyrosin- und L- Phenylalaninanaloga resistent sind (JP 19037/1976 und 39517/1978). Ebenso sind Verfahren beschrieben, bei denen gegenüber L-Lysin- oder auch L-Theoninanaloga resistente Bakterien eingesetzt werden, um die Kontrollmechanismen zu überwinden (EP 0 205 849, GB 2 152 509).These bacteria normally only produce the amino acids in the for Growth required amount, so that no excess amino acids are formed and be eliminated. This is because biosynthesis occurs in the cell of amino acids is controlled in many ways. Hence are already Various processes known to switch off the product formation Increase control mechanisms. In these processes, e.g. B. Amino acid analogues used to effectively regulate biosynthesis turn off. For example, a method is described in which Corynebacterium strains are used which are against L-tyrosine and L- Phenylalanine analogues are resistant (JP 19037/1976 and 39517/1978). Likewise are Methods described in which compared to L-lysine or L-theonine analogs resistant bacteria are used to overcome the control mechanisms (EP 0 205 849, GB 2 152 509).

Weiterhin sind auch durch rekombinante DNA-Techniken konstruierte Mikroorgansimen bekannt, bei denen ebenfalls die Regulation der Biosynthese aufgehoben ist, indem die Gene, die für die nicht mehr feedback-inhibierbaren Schlüsselenzyme kodieren, kloniert und exprimiert werden. So ist z. B. ein rekombinantes, L-Lysin produzierendes Bakterium mit plasmid-kodierter, feedback­ resistenter Aspartatkinase bekannt (EP 0 381 527). Ebenso ist ein rekombinantes, L- Phenylalanin produzierendes Bakterium mit feedback-resistenter Prephenatdehydrogenase beschrieben (JP 123475/1986, EP 0 488 424).Furthermore, are also constructed by recombinant DNA techniques Microorganisms known to also regulate biosynthesis is abolished by the genes that are no longer feedback-inhibitable Encode, clone and express key enzymes. So z. B. a recombinant, L-lysine producing bacterium with plasmid-encoded, feedback resistant aspartate kinase known (EP 0 381 527). A recombinant, L- Phenylalanine-producing bacterium with feedback-resistant Prephenate dehydrogenase described (JP 123475/1986, EP 0 488 424).

Darüber hinaus wurden auch durch Überexpression von Genen, die nicht für feedback-sensitive Enzyme der Aminosäuresynthese kodieren, erhöhte Aminosäureausbeuten erreicht. So wird z. B. die Lysinbildung durch erhöhte Synthese der Dihydrodipicolinatsynthase verbessert (EP 0 197 335). Ebenso wird durch erhöhte Synthese der Threonindehydratase eine verbesserte Isoleucinbildung erreicht (EP 0 436 886).In addition, overexpression of genes that are not responsible for Encode feedback-sensitive enzymes of amino acid synthesis Amino acid yields reached. So z. B. lysine formation by increased synthesis  the dihydrodipicolinate synthase improved (EP 0 197 335). Likewise, by increased Synthesis of threonine dehydratase achieved an improved isoleucine formation (EP 0 436 886).

Weitere Versuche zur Erhöhung der Aminosäureproduktion zielen auf eine verbesserte Bereitstellung der zellulären Primärmetabolite des Zentralstoffwechsels. So ist bekannt, daß die durch rekombinante Techniken erreichte Überexpression der Transketolase eine verbesserte Produktbildung von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L- Phenylalanin ermöglicht (EP 0 600 463). Weiterhin führt die Reduktion der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität in Corynebacterium zu verbesserter Bildung aromatischer Aminosäuren (EP 03 331 145), wohingegen die Erhöhung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität in Corynebacterium zu erhöhter Ausscheidung von Aminosäuren der Aspartatfamilie führte (EP 0 358 940).Further attempts to increase amino acid production are aimed at one improved provision of primary cellular metabolites of central metabolism. It is known, for example, that the overexpression of the Transketolase an improved product formation of L-tryptophan, L-tyrosine or L- Phenylalanine enables (EP 0 600 463). Furthermore, the reduction of Phosphoenolpyruvate carboxylase activity improved in Corynebacterium Formation of aromatic amino acids (EP 03 331 145), whereas the increase in Phosphoenolpyruvate carboxylase activity increased in Corynebacterium Excretion of amino acids of the aspartate family led (EP 0 358 940).

Während des Wachstums und speziell unter Aminosäureproduktionsbedingungen muß der Tricarbonsäure-Cyclus kontinuierlich und effektiv mit C4-Verbindungen, z. B. Oxalacetat, aufgefüllt werden, um die für die Aminosäurebiosynthese abgezogenen Zwischenprodukte zu ersetzen. Bis vor kurzem hat man angenommen, daß für diese sogenannten anaplerotischen Funktionen in Corynebacterium die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase verantwortlich ist (Kinoshita, Biology of industrial micro-organisms 1985: 115 bis 142, Benjamin/Cummings Publishing Company, London; Liebl, The prokaryotes II, 1991: 1157 bis 1171, Springer Verlag N.Y.; Vallino und Stephanopoulos, Biotechnol Bioeng 1993, 41: 633 bis 646). Es wurde jedoch gefunden, daß Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-negative Mutanten im Vergleich zu den jeweiligen Ausgangsstämmen auf allen getesteten Medien gleich wuchsen (Peters-Wendisch et al., FEMS Microbiology Letters 1993, 112: 269 bis 274; Gubler et al., Appl Microbiol Biotechnol 1994, 40: 857 bis 863). Dieses Ergebnis zeigte, daß die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase nicht essentiell für das Wachstum ist und für die anaplerotischen Reaktionen keine oder nur eine untergeordnete Rolle spielt. Des weiteren wies das oben genannte Ergebnis darauf hin, daß es in Corynebacterium mindestens ein anderes Enzym geben muß, das für die Synthese von Oxalacetat, das für das Wachstum benötigt wird, verantwortlich ist. Kürzlich wurde auch tatsächlich eine Pyruvat-Carboxylase-Aktivität in permeabilisierten Zellen von Corynebacterium glutamicum gefunden (Peters- Wendisch et al., Microbiology 1997, 143: 1095 bis 1103). Dieses Enzym wird effektiv durch AMP, ADP und Acetyl-Coenzym A inhibiert und in Gegenwart von Laktat als Kohlenstoffquelle in erhöhter Menge gebildet. Da davon ausgegangen werden mußte, daß dieses Enzym in erster Linie für die Auffüllung des Tricarbonsäure-Cyclus' beim Wachstum verantwortlich ist, war zu erwarten, daß eine Erhöhung der Genexpression bzw. der Enzymaktivität entweder zu keiner oder allenfalls zu einer geringfügigen Erhöhung der zur Aspartatfamilie gehörenden Aminosäuren führt. Des weiteren wurde erwartet, daß eine Erhöhung der Genexpression bzw. der Enzymaktivität der Pyruvat- Carboxylase ebenso keinen Einfluß auf die Produktion von Aminosäuren anderer Familien haben würde.During growth and especially under amino acid production conditions the tricarboxylic acid cycle continuously and effectively with C4 compounds, e.g. B. Oxaloacetate, to be replenished to be deducted for amino acid biosynthesis To replace intermediates. Until recently, it was believed that for this so-called anaplerotic functions in Corynebacterium Phosphoenolpyruvate carboxylase is responsible (Kinoshita, Biology of industrial micro-organisms 1985: 115 to 142, Benjamin / Cummings Publishing Company, London; Liebl, The prokaryotes II, 1991: 1157 to 1171, Springer Verlag N.Y .; Vallino and Stephanopoulos, Biotechnol Bioeng 1993, 41: 633 to 646). It was however found that phosphoenolpyruvate carboxylase negative mutants in Comparison to the respective parent strains on all tested media the same (Peters-Wendisch et al., FEMS Microbiology Letters 1993, 112: 269 bis 274; Gubler et al., Appl Microbiol Biotechnol 1994, 40: 857 to 863). This  The result showed that the phosphoenolpyruvate carboxylase was not essential for the There is no or only one growth for the anaplerotic reactions plays a subordinate role. Furthermore, the above result indicated that there must be at least one other enzyme in Corynebacterium that Synthesis of oxaloacetate, which is needed for growth. Recently, pyruvate carboxylase activity has actually been found in permeabilized cells of Corynebacterium glutamicum found (Peters- Wendisch et al., Microbiology 1997, 143: 1095 to 1103). This enzyme becomes effective inhibited by AMP, ADP and acetyl coenzyme A and in the presence of lactate as Carbon source formed in an increased amount. Since it had to be assumed that this enzyme is primarily used to replenish the tricarboxylic acid cycle at Growth responsible was expected to increase gene expression or the enzyme activity either to none or at most to a minor one Increases in the amino acids belonging to the aspartate family. Furthermore was expects an increase in the gene expression or the enzyme activity of the pyruvate Carboxylase also has no effect on the production of other amino acids Families would have.

Es wurde nunmehr überraschenderweise gefunden, daß nach Erhöhung der Pyruvat- Carboxylase-Aktivität durch genetische Veränderung des Enzyms und/oder nach Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase-Genexpression die mikrobielle Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder der Glutamatfamilie erhöht wird. Es zeigte sich, daß insbesondere Stämme mit erhöhter Kopienzahl des Pyruvat-Carboxylase-Gens etwa 50% mehr Lysin, 40% mehr Threonin und 150% mehr Homoserin ins Kulturmedium ausscheiden.It has now surprisingly been found that after increasing the pyruvate Carboxylase activity by genetic modification of the enzyme and / or after Increasing Pyruvate Carboxylase Gene Expression Microbial Production of Amino acids of the aspartate and / or the glutamate family is increased. It was found, that in particular strains with an increased copy number of the pyruvate carboxylase gene about 50% more lysine, 40% more threonine and 150% more homoserine ins Eliminate culture medium.

Die genetische Veränderung der Pyruvat-Carboxylase zur Erhöhung der Enzymaktivität erfolgt vorzugsweise durch Mutation des endogenen Gens. Derartige Mutationen können entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch Uv-Bestrahlung oder durch mutationsauslösenden Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotidaustausch(e).The genetic modification of pyruvate carboxylase to increase the Enzyme activity is preferably carried out by mutating the endogenous gene. Such  Mutations can either be created undirected using classic methods, such as by UV radiation or by mutation-triggering Chemicals, or specifically by means of genetic engineering methods such as deletion (s), Insertion (s) and / or nucleotide exchange (s).

Die Pyruvat-Carboxylase-Genexpression wird durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Expression des Gens positiv beeinflussen, erhöht. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem insbesondere die Transkriptionssignale erhöht werden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß durch Veränderung der dem Strukturgen vorgeschalteten Promotorsequenz der Promotor in seiner Wirksamkeit erhöht wird oder indem der Promotor komplett durch wirksamere Promotoren ausgetauscht wird. Auch kann eine Verstärkung der Transkription durch entsprechende Beeinflussung eines dem Pyruvat-Carboxylase- Gens zugeordneten Regulatorgens erfolgen. Des weitern kann ggf. durch Mutation einer regulatorischen Gensequenz die Effektivität der Bindung eines Regulatorporteins an die DNA des zu regulierenden Pyruvat-Carboxylase-Gens so beeinflußt sein, daß dadurch die Transkription verstärkt und somit die Genexpression erhöht ist. Des weiteren können dem Pyruvat-Carboxylase-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sog. "enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Pyruvat-Carboxylase-Genexpression bewirken. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA verbessert wird.Pyruvate carboxylase gene expression is achieved by increasing the gene copy number and / or by enhancing regulatory factors that affect the expression of the gene influence positively, increased. This can strengthen regulatory elements preferably at the transcription level, in particular by Transcription signals are increased. This can be done, for example, in that by changing the promoter sequence upstream of the structural gene Promoter is increased in its effectiveness or by the promoter completely more effective promoters is exchanged. A reinforcement of the Transcription by influencing a pyruvate carboxylase Regens gene associated with the gene. Furthermore, mutation may be necessary a regulatory gene sequence the effectiveness of binding a Regulatorsports to the DNA of the pyruvate carboxylase gene to be regulated so be influenced that this enhances transcription and thus gene expression is increased. Furthermore, the pyruvate carboxylase gene can be used as a regulatory Sequences but also so-called "enhancers" can be assigned, which have an improved Interaction between RNA polymerase and DNA also increased Pyruvate carboxylase gene expression. But there is also one Enhancement of translation possible, for example, by the stability of the m-RNA is improved.

Zur Erhöhung der Genkopienzahl wird das Pyruvat-Carboxylase-Gen in ein Genkonstrukt bzw. Vektor eingebaut. Das Genkonstrukt enthält insbesondere dem Pyruvat-Carboxylase-Gen zugeordnete regulatorische Sequenzen, vorzugsweise solche, die die Genexpression verstärken. Für den Einbau des Pyruvat-Carboxylase- Gens in ein Genkonstrukt wird das Gen vorzugsweise aus einem Mikroorganismen- Stamm der Gattung Corynebacterium isoliert und in einen Aminosäure­ produzierenden Mikroorganismen-Stamm, insbesondere Corynebacterium oder in Escherichia coli oder Serratia marcescens, transformiert. Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich insbesondere Gene aus C. glutamicum oder C. glutamicum ssp. flavum oder C. glutamicum ssp. lactofermentum. Nach Isolierung des Gens und der in vitro-Rekombination mit bekannten Vektoren (vgl. z. B. Simon et al., Bio/Technology 1983, 1: 784 bis 791; Eikmanns et al., Gene 1991, 102: 93 bis 98) erfolgt die Transformation in die Aminosäure-produzierenden Stämme durch Elektroporation (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 1991, 65: 299 bis 304) oder Konjugation (Schäfer et al., J Bacteriol 1990, 172: 1663 bis 1666). Als Wirtsstämme werden vorzugsweise solche Aminosäureproduzenten eingesetzt, die in der Synthese der entsprechenden Aminosäure dereguliert sind und/oder die eine erhöhte Exportcarrier- Aktivität für die entsprechende Aminosäure aufweisen. Weiterhin werden solche Stämme bevorzugt, die einen erhöhten Anteil an solchen Zentralstoffwechselmetaboliten enthalten, die an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligt sind und/oder Stämme, die einen erniedrigten Anteil an den nicht an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Zentralstoffwechselmetaboliten enthalten, insbesondere an Metaboliten, die für Konkurrenzreaktionen zuständig sind; d. h. es werden solche Stämme bevorzugt, bei denen ein zu dem entsprechenden Aminosäurebiosyntheseweg konkurrierender Biosyntheseweg mit verminderter Aktivität abläuft. So ist insbesondere ein, gegen L- Asparaginsäure-β-Methylester (AME) resistenter coryneformer Mikroorganismen- Stamm mit reduzierter Citrat-Synthase-Aktivität geeignet (EP 0 551 614). To increase the number of copies of the gene, the pyruvate carboxylase gene is incorporated into a Gene construct or vector incorporated. The gene construct contains in particular that  Regulatory sequences associated with pyruvate carboxylase gene, preferably those that increase gene expression. For the installation of the pyruvate carboxylase Gene in a gene construct, the gene is preferably derived from a microorganism Strain of the genus Corynebacterium isolated and converted into an amino acid producing microorganism strain, in particular Corynebacterium or in Escherichia coli or Serratia marcescens, transformed. For the invention Methods are particularly suitable for genes from C. glutamicum or C. glutamicum ssp. flavum or C. glutamicum ssp. lactofermentum. After isolation of the gene and the in vitro recombination with known vectors (see, for example, Simon et al., Bio / Technology 1983, 1: 784 to 791; Eikmanns et al., Gene 1991, 102: 93 to 98) Transformation into the amino acid producing strains by electroporation (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 1991, 65: 299 to 304) or conjugation (Schaefer et al., J Bacteriol 1990, 172: 1663 to 1666). As host strains preferably those amino acid producers used in the synthesis of corresponding amino acid are deregulated and / or which have an increased export career Have activity for the corresponding amino acid. Furthermore, such Strains preferred that have an increased proportion of such Central metabolite metabolites that participate in the synthesis of the corresponding Amino acid are involved and / or strains that have a reduced proportion of the not involved in the synthesis of the corresponding amino acid Central metabolites contain, in particular on metabolites that are responsible for Competitive reactions are responsible; d. H. such strains are preferred at which compete with the corresponding amino acid biosynthetic pathway Biosynthetic pathway with reduced activity. So especially one against L- Aspartic acid β-methyl ester (AME) resistant coryneform microorganisms Suitable strain with reduced citrate synthase activity (EP 0 551 614).  

Nach Isolierung sind Pyruvat-Carboxylase-Gene mit Nukleotidsequenzen erhältlich, die für die unter SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder deren Allelvariationen kodieren bzw. die die Nukleotidsequenz von Nukleotid 165 bis 3587 gemäß SEQ ID No. 1 oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz aufweisen. Des weiteren sind Gene mit einem vorgeschalteten Promotor der Nukleotidsequenz von Nukleotid 20 bis 109 gemäß SEQ ID No. 1 oder eine im wesentlichen gleichwirkende DNA-Sequenz erhältlich. Allelvariationen bzw. gleichwirkende DNA-Sequenzen umfassen insbesondere funktionelle Derivate, die durch Deletion(en), Insertion(en) und/oder Substitution(en) von Nukleotiden aus entsprechenden Sequenzen erhältlich sind, wobei die Enzymaktivität bzw. -funktion erhalten bleibt oder sogar erhöht ist. Diese Pyruvat-Carboxylase-Gene werden vorzugsweise im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.After isolation, pyruvate carboxylase genes with nucleotide sequences are available those for those under SEQ ID No. 2 specified amino acid sequence or their Allelic variations encode the nucleotide sequence of nucleotides 165 to 3587 according to SEQ ID No. 1 or an essentially equivalent DNA sequence exhibit. Furthermore, genes with an upstream promoter are Nucleotide sequence from nucleotide 20 to 109 according to SEQ ID No. 1 or one in essential equivalent DNA sequence available. Allelic variations or equivalent DNA sequences include, in particular, functional derivatives that by deletion (s), insertion (s) and / or substitution (s) of nucleotides corresponding sequences are available, the enzyme activity or function is preserved or even increased. These pyruvate carboxylase genes will preferably used in the process according to the invention.

Dem Pyruvat-Carboxylase-Gen mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne zugeordnetem Regulatorgen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet sein, so daß das Gen in einer Genstruktur enthalten ist.The pyruvate carboxylase gene with or without an upstream promoter or with or without an associated regulatory gene can one or more DNA sequences be upstream and / or downstream, so that the gene is contained in a gene structure.

Dem Pyruvat-Carboxylase-Gen ist vorzugsweise der tac-Promotor (lacIQ-Gen) vorgeschaltet, wobei diesem insbesondere regulatorische Sequenzen zugeordnet sind.The pyruvate carboxylase gene is preferably preceded by the tac promoter (lacI Q gene), in particular regulatory sequences being assigned to it.

Durch Klonierung des Pyruvat-Carboxylase-Gens sind Plasmide erhältlich, die das Gen enthalten und zur Transformation eines Aminosäureproduzenten geeignet sind. Die durch Transformation erhältlichen Zellen, bei denen es sich vorzugsweise um transformierte Zellen von Corynebacterium handelt, enthalten das Gen in replizierbarer Form, d. h. in zusätzlichen Kopien auf dem Chromosom, wobei die Genkopien durch Rekombination an beliebigen Stellen des Genoms integriert werden, und/oder auf einem Plasmid oder Vektor. By cloning the pyruvate carboxylase gene, plasmids are obtainable which Contain gene and are suitable for the transformation of an amino acid producer. The cells obtainable by transformation, which are preferably transformed cells from Corynebacterium, contain the gene in replicable form, d. H. in additional copies on the chromosome, the Gene copies can be integrated by recombination anywhere in the genome, and / or on a plasmid or vector.  

AusführungsbeispielEmbodiment 1. Klonierung des Pyruvat-Carboxylase-Gens aus Corynebacterium glutamicum1. Cloning of the pyruvate carboxylase gene from Corynebacterium glutamicum

Ausgehend von konservierten Bereichen aller bisher bekannten Pyruvat-Carboxylase-(pyc-)Genen, von Saccharomyces cerevisiae (J Biol Chem 1988, 263 : 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315), Mensch (Biochim Biophys Acta 1994, 1227: 46-52), Maus (Proc Natl Acad Sci, USA 1993, 90: 1766-1770), Aedes aegypti (EMBL-GenBank: Accession Nr. L36530) sowie von Mycobacterium tubercolosis (EMBL-GenBank: Accession Nr. U00024) wurden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech). Die Primer entsprachen den Basen 810 bis 831 und 1015 bis 1037 des pyc- Gens von M. tuberculosis. Mit diesen Primern konnte mittels PCR nach der Standard­ methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) für nicht-degenerierte, homologe Primer ein Fragment von ca. 200 bp aus chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC 13032, die wie bei Eikmanns et al. (Microbiology 1994, 140: 1817-1828) beschrieben, isoliert wurde, amplifiziert werden. Die Größe von 200 bp entsprach der Erwartung für pyc-Gene. Das PCR- Produkt wurde wie bei Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463-5467) beschrieben, sequenziert. Die Sequenzierung wurde mit fluoreszenzmarkierten ddNTPs mit einer automatischen DNA-Sequenzierapparatur (Applied Biosystems) durchgeführt.Starting from conserved areas of all previously known pyruvate carboxylase (pyc) genes, from Saccharomyces cerevisiae (J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315), human (Biochim Biophys Acta 1994, 1227: 46-52), mouse (Proc Natl Acad Sci, USA 1993, 90: 1766-1770), Aedes aegypti (EMBL-GenBank: Accession No. L36530) and from Mycobacterium tubercolosis (EMBL-GenBank: Accession No. U00024), PCR primers were synthesized (MWG Biotech). The primers corresponded to bases 810 to 831 and 1015 to 1037 of the pyc M. tuberculosis gene. With these primers it was possible to use PCR according to the standard Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) for non-degenerate, homologous primers a fragment of approx. 200 bp from chromosomal DNA from C. glutamicum ATCC 13032, which, as in Eikmanns et al. (Microbiology 1994, 140: 1817-1828), was isolated, amplified become. The size of 200 bp corresponded to the expectation for pyc genes. The PCR Product was as in Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463-5467) described, sequenced. The sequencing was labeled with fluorescence ddNTPs with an automatic DNA sequencing apparatus (Applied Biosystems) carried out.

Ausgehend von diesem DNA-Fragment aus C. glutamicum wurden folgende homologe Oligonukleotide hergestellt:
The following homologous oligonucleotides were produced from this DNA fragment from C. glutamicum:

Die Oligonukleotide wurden als PCR-Primer zur Isolierung einer Sonde für das Gen der Pyruvat-Carboxylase (pyc) aus C. glutamicum verwendet. Die Primer wurden in eine PCR-Reaktion mit chromosomaler DNA von C. glutamicum und Digoxigenin-mar­ kierten Nukleotiden eingesetzt. Die Reaktion wurde nach der Vorschrift des 'PCR DIG Labeling Kits' der Firma Boehringer Mannheim durchgeführt. Mit diesem Ansatz konnte ein Digoxigenin-markiertes DNA-Fragment amplifiziert werden, das der erwarteten Größe von ca. 200 bp entsprach. Die so hergestellte pyc-Sonde wurde dann eingesetzt, um über Southern-Blot-Hybridisierung ein DNA-Fragment in der chromosomalen DNA von C. glutamicum zu identifizieren, auf dem das pyc-Gen lokalisiert ist. Hierzu wurden jeweils 2 bis 5 µg chromosomaler DNA von C. glutamicum WT mit den Restriktionsenzymen HindIII, SphI, SalI, DraI, EcoRI und BamHI geschnitten, die erhaltenen DNA-Fragmente 16 h bei 20 V in einem 0,8%igen Agarosegel gelelektrophoretisch ihrer Größe entsprechend aufgetrennt. Die in dem Agarosegel befindlichen DNA-Fragmente wurden nach einer Methode von Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503-517) denaturiert und vakuumunterstützt mit der VacuGene Blot Apparatur von Pharmacia LKB (Uppsala, Schweden) aus der Gelmatrix auf eine Nylon-Membran (Nytran N13 von Schleicher und Schüll, Dassel, Schweiz) transferiert, immobilisiert und die Digoxigeninmarkierung mittels NBT/X-Phosphat- Umsetzung durch alkalische Phosphatase nachgewiesen. Auf diese Weise konnten folgende, mit der pyc-DNA-Sonde hybridisierende chromosomale Fragmente nachgewiesen werden: ein 17 kb HindIII-Fragment, ein 6,5 kb SalI-Fragment und ein 1,35 kb EcoRI-Fragment.The oligonucleotides were used as PCR primers to isolate a probe for the gene the pyruvate carboxylase (pyc) from C. glutamicum used. The primers were in a PCR reaction with chromosomal DNA from C. glutamicum and Digoxigenin-mar Kiert nucleotides used. The reaction was carried out according to the protocol of the 'PCR DIG Labeling Kits' from Boehringer Mannheim. With this approach was able to amplify a digoxigenin-labeled DNA fragment that the expected size of about 200 bp. The pyc probe thus produced was then used to generate a DNA fragment in the via Southern blot hybridization identify chromosomal DNA from C. glutamicum on which the pyc gene is localized. For this purpose 2 to 5 µg chromosomal DNA from C. glutamicum WT with the restriction enzymes HindIII, SphI, SalI, DraI, EcoRI and BamHI cut, the DNA fragments obtained 16 h at 20 V in a 0.8% Agarose gel separated by gel electrophoresis according to their size. The one in the DNA fragments located in agarose gel were isolated by a method from Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503-517) denatured and vacuum-assisted with the VacuGene Blot apparatus from Pharmacia LKB (Uppsala, Sweden) from the gel matrix onto a Nylon membrane (Nytran N13 from Schleicher and Schüll, Dassel, Switzerland) transferred, immobilized and the digoxigenin labeling using NBT / X-phosphate Implementation demonstrated by alkaline phosphatase. That way following chromosomal fragments hybridizing with the pyc DNA probe a 17 kb HindIII fragment, a 6.5 kb SalI fragment and a 1.35 kb EcoRI fragment.

Das 17 kb HindIII-Fragment wurde isoliert und subkloniert. Dazu wurde eine Cosmid-Genbank aus chromosomaler DNA von C. glutamicum im Cosmid pHC79 verwendet, die das Genom von C. glutamicum zu 99% repräsentierte (Mol Microbiol 1992, 6: 317-326). Der E. coli-Stamm DH5α wurde mit dieser Genbank mittels der CaCl2-Methode von Sambrook et al. (Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Habour Laboratory Press) transformiert und zu ca. 300 Kolonien pro LB-Agarplatte mit 50 µg/l Kanamycin ausplattiert (insgesamt 5000 Kolonien). Anschließend wurden die erhaltenen Transformanden auf Nytran N13-Filter übertragen und diese zur alkalischen Lyse der Zellen und Denaturierung der DNA auf mit 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl getränktem Whatmann-Papier 5 min. inkubiert. Die darauffolgende Neutralisierung erfolgte mit 1 M Tris/HCl pH 7,5 und 1,5 M NaCl. Nach Inkubation der Filter in 2 × SSC wurde die freigesetzte DNA durch UV- Bestrahlung bei 366 nm auf dem Filter fixiert. Anschließend wurden die restlichen Zelltrümmer durch Schütteln in 3 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C entfernt. Die Filter wurden in dieser Form für die Hybridisierung mit einer spezifischen pyc-Sonde, wie bei Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503-517) beschrieben, verwendet. Es wurden 3 Transformanden identifiziert, die gegen die pyc-Sonde hybridisierten. Aus diesen Transformanden wurde die Cosmid-DNA mittels Plasmid-Präparation nach der Methode der alkalischen Lyse von Birnboim (Meth Enzymol 1983, 100: 243-255) isoliert und anschließend über Restriktion und Southern-Blot Analyse auf das Vorhandensein des HindIII-Fragments getestet. Das Cosmid pHC79-10, das ein 40 kb Insert enthielt, trug das 17 kb HindIII-Fragment vollständig und wurde weiter analysiert. Es zeigte sich, daß auch nach Restriktion mit den Endonukleasen SalI und EcoRI die gleichen hybridisierenden Fragmente wie in der chromosomalen DNA, d. h. ein 6,5 kb SalI- und ein 1,35 kb EcRI-Fragment, erhalten wurden. Das 17 kb HindIII- Fragment wurde durch Restriktion mit HindIII aus dem Cosmid isoliert und in den E. coli-Vektor pUC18, der ebenfalls mit HindIII geschnitten wurde, ligiert. Es wurde eine Restriktionsanalyse des Fragments in dem resultierenden Vektor pUCpyc erstellt. Die physikalische Kartierung des Fragments ist in Fig. 1 dargestellt. The 17 kb Hind III fragment was isolated and subcloned. For this purpose, a cosmid library of chromosomal DNA from C. glutamicum in the cosmid pHC79 was used, which represented the genome of C. glutamicum to 99% (Mol Microbiol 1992, 6: 317-326). The E. coli strain DH5α was analyzed with this library using the CaCl 2 method of Sambrook et al. (Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Habour Laboratory Press) and transformed to about 300 colonies per LB agar plate with 50 µg / l kanamycin (a total of 5000 colonies). The transformants obtained were then transferred to Nytran N13 filters and these were used for 5 min for alkaline lysis of the cells and denaturation of the DNA on Whatmann paper soaked with 0.5 M NaOH and 1.5 M NaCl. incubated. The subsequent neutralization was carried out with 1 M Tris / HCl pH 7.5 and 1.5 M NaCl. After incubating the filters in 2 × SSC, the released DNA was fixed on the filter by UV irradiation at 366 nm. The remaining cell debris was then removed by shaking in 3 × SSC, 0.1% SDS at 50 ° C. The filters were used in this form for hybridization with a specific pyc probe as described by Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503-517). Three transformants were identified that hybridized against the pyc probe. The cosmid DNA was isolated from these transformants by means of plasmid preparation according to the alkaline lysis method of Birnboim (Meth Enzymol 1983, 100: 243-255) and then tested for the presence of the HindIII fragment via restriction and Southern blot analysis. The cosmid pHC79-10, which contained a 40 kb insert, carried the 17 kb Hind III fragment completely and was further analyzed. It was shown that the same hybridizing fragments as in the chromosomal DNA, ie a 6.5 kb SalI and a 1.35 kb EcRI fragment, were obtained even after restriction with the endonucleases SalI and EcoRI. The 17 kb HindIII fragment was isolated from the cosmid by restriction with HindIII and ligated into the E. coli vector pUC18, which was also cut with HindIII. A restriction analysis of the fragment in the resulting vector pUCpyc was carried out. The physical mapping of the fragment is shown in Fig. 1.

2. Sequenzierung des Pyruvat-Carboxylase-Gens2. Sequencing of the pyruvate carboxylase gene

In weiteren Subklonierungsschritten wurden ein 0,85 kb SalI-EcoRI-Fragment, das 1,35 kb EcoRI-Fragment, ein 1,6 kb EcoRI-EcoRI-StuI-Fragment sowie ein 1,6 kb ClaI-Fragment, das partiell mit dem 0,85 kb SalI-EcoRI-Fragment überlappte, durch Restriktion mit den entsprechenden Restriktionsenzymen aus dem Plasmid pUCpyc isoliert. Durch Ligation wurden die Fragmente in den jeweils entsprechend restringierten Vektor pUC18 kloniert und anschließend nach Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463-5467) wie oben beschrieben sequenziert. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden mit dem Programmpaket HUSAR (Release 3.0) des Deutschen Krebsforschungszentrums (Heidelberg) analysiert. Die Sequenzanalyse der Fragmente ergab ein durchgehendes offenes Leseraster von 3576 bp, das für eine Proteinsequenz von 1140 Aminosäuren kodiert. Ein Vergleich der abgeleiteten Proteinsequenz mit der EMBL Gen-Datenbank (Heidelberg) ergab Ähnlichkeiten zu allen bekannten Pyruvat-Carboxylasen. Die höchste Identität (62%) wurde zur putativen Pyruvat-Carboxylase aus Mycobacterium tuberculosis (EMBL- GenBank: Accession Nr. U00024) gefunden. Die Ähnlichkeit betrug, unter Berücksichtigung konservierter Aminosäureaustausche, 76%. Ein Vergleich mit den Pyruvat-Carboxylasen anderer Organismen ergab 46 bis 47% identische und 64 bis 65% ähnliche Aminosäuren (Gene 1997, 191: 47-50; J Bacteriol 1996, 178: 5960-5970; Proc Natl Acad Sci USA 1993,9 0: 1766-1770; Biochem J 1996, 316: 631-637; EMBL-GenBank: Accession Nr. L36530; J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315). Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, daß das klonierte Fragment das Gen für die Pyruvat-Carboxylase aus C. glutamicum trägt. Die Nukleotidsequenz des Gens ist unter SEQ ID No. 1 und die entsprechende Aminosäuresequenz unter SEQ ID No. 2 angegeben. In further subcloning steps, a 0.85 kb SalI-EcoRI fragment, the 1.35 kb EcoRI fragment, a 1.6 kb EcoRI-EcoRI-StuI fragment and a 1.6 kb ClaI fragment that partially overlapped with the 0.85 kb SalI-EcoRI fragment Restriction with the corresponding restriction enzymes from the plasmid pUCpyc isolated. The fragments were correspondingly identified by ligation restricted vector pUC18 cloned and then according to Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463-5467) sequenced as described above. The The nucleotide sequences obtained were analyzed using the HUSAR (release 3.0) of the German Cancer Research Center (Heidelberg). The Sequence analysis of the fragments showed a continuous open reading frame of 3576 bp, which codes for a protein sequence of 1140 amino acids. A comparison of the derived protein sequence with the EMBL gene database (Heidelberg) Similarities to all known pyruvate carboxylases. The highest identity (62%) became the putative pyruvate carboxylase from Mycobacterium tuberculosis (EMBL- GenBank: Accession No. U00024) found. The similarity was below Consideration of conserved amino acid exchanges, 76%. A comparison with the Pyruvate carboxylases from other organisms gave 46 to 47% identical and 64 to 65% similar amino acids (Gene 1997, 191: 47-50; J Bacteriol 1996, 178: 5960-5970; Proc Natl Acad Sci USA 1993.9 0: 1766-1770; Biochem J 1996, 316: 631-637; EMBL-GenBank: Accession No. L36530; J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315). From these results it was concluded that the cloned fragment carrying the gene for pyruvate carboxylase from C. glutamicum. The Nucleotide sequence of the gene is listed under SEQ ID No. 1 and the corresponding one Amino acid sequence under SEQ ID No. 2 specified.  

3. Überexpression des Pyruvat-Carboxylase-Gens3. Overexpression of the pyruvate carboxylase gene

Zur Überexpression des Gens für die Pyruvat-Carboxylase aus C. glutamicum wurde das Gen aus dem Plasmid pUCpyc als 6,2 kb SspI-ScaI-Fragment in den E. coli-C. Glutamicum-Pendelvektor pEK0 (Gene 1991, 102: 93-98) kloniert, der mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und PstI geschnitten wurde. Mittels Klenow- Polymerase-Behandlung wurden die überhängenden Enden zu glatten Enden aufgefüllt (EcoRI) bzw. abgedaut (PstI), und der linearisierte Vektor wurde mit dem 6,2 kb SspI-ScaI-Fragment ligiert. Das erhaltene Konstrukt pEK0pyc wurde zunächst in den Stamm E. coli DH5α transformiert, die Plasmid-DNA auf den erhaltenen Transformanden isoliert und auf die Richtigkeit des Inserts durch Restriktion kontrolliert. Die DNA wurde anschließend in den Stamm SP733 durch Elektroporation eingebracht (FEMS Microbiol Lett 1989, 65: 299-304). Bei diesem Stamm handelt es sich um eine Mutante des restriktionsnegativen C. glutamicum Stammes R127 (Dechema Biotechnology Conference 1990, 4: 323-327, Verlag Chemie), die durch chemische Mutagenese erhalten worden war und sich dadurch auszeichnet, daß sie nicht auf Minimalmedium mit Pyruvat und Lactat als einziger Kohlenstoffquelle wachsen kann (Microbiology 1997, 143: 1095-1103). Dieser Phänotyp wird durch einen Defekt in der Pyruvat-Carboxylase hervorgerufen und konnte durch das Einbringen des Pyruvat-Carboxylase-Gens aus C. glutamicum komplementiert werden, d. h. der Stamm, der das Plasmid pEK0pyc trägt, war im Gegensatz zum Ausgangsstamm wieder in der Lage auf Minimalmedium mit Lactat als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Damit war auch der Beweis erbracht, daß das Gen für eine funktionelle Pyruvat-Carboxylase kodiert.The gene for pyruvate carboxylase from C. glutamicum was overexpressed the gene from the plasmid pUCpyc as a 6.2 kb SspI-ScaI fragment in the E. coli-C. Glutamicum pendulum vector pEK0 (Gene 1991, 102: 93-98) cloned with the Restriction endonucleases EcoRI and PstI were cut. Using Klenow Polymerase treatment, the overhanging ends became blunt ends filled in (EcoRI) or digested (PstI), and the linearized vector was compared with the 6.2 kb SspI-ScaI fragment ligated. The construct pEK0pyc obtained was initially transformed into the strain E. coli DH5α, the plasmid DNA on the obtained Transformants isolated and the correctness of the insert by restriction controlled. The DNA was then cut into strain SP733 Electroporation introduced (FEMS Microbiol Lett 1989, 65: 299-304). With this Strain is a mutant of the restriction-negative C. glutamicum Strain R127 (Dechema Biotechnology Conference 1990, 4: 323-327, publisher Chemistry), which had been obtained by chemical mutagenesis and thereby distinguishes that it is not the only medium with pyruvate and lactate Carbon source can grow (Microbiology 1997, 143: 1095-1103). This Phenotype is caused by a defect in pyruvate carboxylase and was able to introduce the pyruvate carboxylase gene from C. glutamicum be complemented, d. H. the strain carrying the plasmid pEK0pyc was in In contrast to the original strain, again able to use minimal medium with lactate to grow as the only carbon source. This also provided proof that the gene encodes a functional pyruvate carboxylase.

Darüber hinaus wurde das Plasmid pEK0pyc in den C. glutamicum Wildtyp ATCC 13032 durch Elektroporation transformiert. Der resultierende Stamm WT (pEK0pyc) wurde im Vergleich zum Wildtyp ATCC 13032 bezüglich seiner Pyruvat- Carboxylase-Aktivität untersucht. Die Stämme wurden in Komplexmedium (Luria- Bertani, Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) mit 0,5% Lactat und auf Minimalmedium mit 2% Lactat bzw. 4% Glukose gezüchtet, und der Pyruvat-Carboxylase-Test wurde entsprechend der Methode, wie sie bei Peters-Wendisch et al. (Microbiology 1997, 143: 1095-1103) beschrieben wurde, durchgeführt. Das Ergebnis der Analyse (Tabelle 1) zeigt, daß die Pyruvat-Carboxylase-Aktivität im pEK0-pyc-tragenden Stamm ca. 4-fach höher als im Ausgangsstamm war.In addition, the plasmid pEK0pyc in the C. glutamicum wild-type ATCC 13032 transformed by electroporation. The resulting strain WT (pEK0pyc)  was compared to the wild type ATCC 13032 with regard to its pyruvate Carboxylase activity examined. The strains were in complex medium (Luria- Bertani, Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) with 0.5% lactate and on minimal medium with 2% lactate or 4% Glucose was grown and the pyruvate carboxylase test was performed according to the Method as used in Peters-Wendisch et al. (Microbiology 1997, 143: 1095-1103) was carried out. The result of the analysis (Table 1) shows that the Pyruvate carboxylase activity in the pEK0-pyc-carrying strain is about 4 times higher than in Parent strain was.

4. Gesteigerte Akkumulation von Lysin durch Überexpression des Pyruvat- Carboxylase-Gens im Stamm C. glutamicum DG52-54. Increased accumulation of lysine by overexpression of pyruvate Carboxylase gene in strain C. glutamicum DG52-5

Zur Untersuchung der Auswirkung der Überexpression des Gens für die Pyruvat- Carboxylase in dem Lysin-Produktionsstamm DG52-5 (J Gen Microbiol 1988, 134: 3221-3229) wurde der Expressionsvektor pVWEX1 verwendet, der eine IPTG-indu­ zierbare Expression erlaubt. In diesen Vektor wurde das pyc Gen promotorlos hinein kloniert. Dazu wurden zunächst PCR-Primer (Primer 1 = Position 112-133; Primer 2 = Position 373 bis 355 in der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1) synthetisiert und 261 bp des promotorlosen Anfangsbereichs des Pyruvat- Carboxylase-Gens mittels PCR amplifiziert. Die Primer wurden so gewählt, daß Primer 1 eine PstI-Schnittstelle vermittelt und Primer 2 eine BamHI-Schnittstelle. Nach der PCR wurde das erhaltene 274 bp PCR-Produkt isoliert, zu Konkatemeren ligiert und anschließend mit den Restriktionsenzymen PstI und BamHI geschnitten. Der Restriktionsansatz wurde durch Ethanol-Fällung ankonzentriert und anschließend mit dem PstI-BamHI-geschnittenen Vektor pVWEX1 ligiert. Das erhaltene Konstrukt pVWEX1-PCR wurde durch Restriktion getestet. Der Endbereich des pyc Gens wurde durch RcaL-Klenow-SalI-Behandlung aus dem Vektor pEK0pyc isoliert und in den BamHI-Klenow-SalI behandelten Vektor pVWEX1-PCR ligiert. Das erhaltene Konstrukt pVWEX1pyc wurde durch Restriktionskartierung analysiert. Eine physikalische Karte des Plasmids ist in Fig. 2 gezeigt.The expression vector pVWEX1, which allows IPTG-inducible expression, was used to investigate the effect of the overexpression of the gene for the pyruvate carboxylase in the lysine production strain DG52-5 (J Gen Microbiol 1988, 134: 3221-3229). The pyc gene was cloned into this vector without a promoter. For this purpose, PCR primers (primer 1 = position 112-133; primer 2 = position 373 to 355 in the nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1) were first synthesized and 261 bp of the promoter-free initial region of the pyruvate carboxylase gene was amplified by means of PCR. The primers were chosen so that primer 1 mediates a PstI interface and primer 2 a BamHI interface. After the PCR, the 274 bp PCR product obtained was isolated, ligated to concatemera and then cut with the restriction enzymes PstI and BamHI. The restriction mixture was concentrated by ethanol precipitation and then ligated with the PstI-BamHI-cut vector pVWEX1. The pVWEX1-PCR construct obtained was tested by restriction. The end region of the pyc gene was isolated from the vector pEK0pyc by RcaL-Klenow-SalI treatment and ligated into the vector pVWEX1-PCR treated with BamHI-Klenow-SalI. The pVWEX1pyc construct obtained was analyzed by restriction mapping. A physical map of the plasmid is shown in Fig. 2.

Das Plasmid wurde durch Elektroporation in den C. glutamicum Stamm DG52-5 eingebracht. Als Kontrolle wurde der Stamm DG52-5 mit dem Vektor pVWEX1 ohne Insert transformiert und die L-Lysinausscheidung jeweils drei verschiedener Transformanden verglichen. Dazu wurden DG52-5(pVWEX1)1, 2 und 3 sowie DG52-5(pVWEX1pyc)3, 4 und 6 in Komplexmedium (2xTY; Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press; mit 50 µg/l Kanamycin) gezüchtet und das Fermentationsmedium CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603) jeweils aus den Vorkulturen getrennt beimpft. Das Medium enthielt zusätzlich Kanamycin, um die Plasmide stabil zu halten. Es wurden jeweils zwei parallele Ansätze durchgeführt, wobei einem Kolben 200 µg IPTG/ml zugesetzt wurde, während der zweite Kolben kein IPTG enthielt. Nach Kultivierung für 48 Stunden bei 30°C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Upm wurde die in das Medium akkumulierte Lysinmenge bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (J Chromat 1983, 266: 471-482). Das Ergebnis der Fermentation ist in Tabelle 2 dargestellt, wobei die angegebenen Werte Mittelwerte aus jeweils drei Experimenten mit unterschiedlichen Klonen darstellen. Es zeigte sich, daß die Überexpression des Pyruvat-Carboxylase- Gens zu einer um 50% gesteigerten Akkumulation von Lysin im Medium führt. Somit stellt die Nutzung des entdeckten und beschriebenen Gens für das anaplerotische Enzym Pyruvat-Carboxylase ein Verfahren dar, um die L-Lysinbildung entscheidend zu verbessern. The plasmid was electroporated into the C. glutamicum strain DG52-5 brought in. As a control, the strain DG52-5 with the vector pVWEX1 transformed without insert and the L-lysine excretion three different Compared transformants. For this purpose, DG52-5 (pVWEX1) 1, 2 and 3 as well DG52-5 (pVWEX1pyc) 3, 4 and 6 in complex medium (2xTY; Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; with 50 µg / l Kanamycin) and the fermentation medium CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603) inoculated separately from the pre-cultures. The medium contained additionally kanamycin to keep the plasmids stable. There were two each parallel batches were carried out, 200 µg IPTG / ml being added to a flask was while the second flask contained no IPTG. After cultivation for 48 Hours at 30 ° C on the rotary shaker at 120 rpm was in the medium accumulated amount of lysine determined. Determination of the amino acid concentration was carried out by means of high pressure liquid chromatography (J Chromat 1983, 266: 471-482). The result of the fermentation is shown in Table 2, the specified values mean values from three experiments each with different Represent cloning. It was shown that the overexpression of the pyruvate carboxylase Gene leads to a 50% increase in the accumulation of lysine in the medium. Thus, the use of the discovered and described gene for the anaplerotic enzyme pyruvate carboxylase is a method to prevent L-lysine formation to improve decisively.  

5. Gesteigerte Akkumulation von Threonin und Homoserin durch Überexpression des Pyruvat-Carboxylase-Gens im Stamm C. glutamicum DM368-35. Increased accumulation of threonine and homoserine Overexpression of the pyruvate carboxylase gene in the C. glutamicum strain DM368-3

Analog zu den Experimenten zur L-Lysin-Bildung wurde auch die Akkumulation von Threonin im Kulturüberstand durch Überexpression des Gens für die Pyruvat- Carboxylase untersucht. Hierzu wurde, wie unter Punkt 4 beschrieben, der Threoninproduktionsstamm C. glutamicum DM368-3 (Degussa AG) mit dem Plasmid pVWEX1pyc sowie zur Kontrolle mit dem Plasmid pVWEX1 transformiert und die Threoninausscheidung von jeweils drei verschiedenen Transformanden untersucht. Dazu wurden DM368-3(pVWEX1)1, 2 und 3 sowie DM368-3(pVWEX1pyc)1, 2 und 3 in Komplexmedium (2xTY mit 50 µg/l Kanamycin) gezüchtet und das Fermentationsmedium CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603) jeweils aus den Vorkulturen getrennt beimpft. Das Medium enthielt zusätzlich Kanamycin, um die Plasmide stabil zu halten. Es wurden zwei parallele Ansätze durchgeführt, wobei einem Kolben 200 µ IPTG/ml zugesetzt wurde, während der zweite Kolben kein IPTG enthielt. Nach Kultivierung für 48 Stunden bei 30°C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Upm wurde die in das Medium akkumulierte Threoninmenge bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte ebenfalls mittels Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie (J Chromat 1983, 266: 471-482). Das Ergebnis der Fermentation ist in Tabelle 3 dargestellt, wobei die angegebenen Werte Mittelwerte aus jeweils drei Experimenten mit unterschiedlichen Klonen darstellen. Es zeigte sich, daß die Überexpression des Pyruvat-Carboxylase-Gens zu einer ca. 40%igen Steigerung der Threoninkonzentration im Medium führt. Somit stellt die Nutzung des entdeckten und beschriebenen Gens für das anaplerotische Enzym Pyruvat- Carboxylase ein Verfahren dar, um die L-Threoninbildung entscheidend zu verbessern. Analogous to the experiments for L-lysine formation, the accumulation of Threonine in the culture supernatant by overexpression of the pyruvate gene Carboxylase examined. For this purpose, as described under point 4, the Threonine production strain C. glutamicum DM368-3 (Degussa AG) with the plasmid pVWEX1pyc and for control with the plasmid pVWEX1 transformed and the Threonine excretion of three different transformants was investigated. For this purpose, DM368-3 (pVWEX1) 1, 2 and 3 and DM368-3 (pVWEX1pyc) 1, 2 and 3 in complex medium (2xTY with 50 µg / l kanamycin) and that Fermentation medium CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603) each from the Inoculated separately. The medium also contained kanamycin to make up the Keep plasmids stable. Two parallel approaches were carried out, whereby 200 µ IPTG / ml was added to one flask while none was added to the second flask IPTG contained. After cultivation for 48 hours at 30 ° C on a rotary shaker the amount of threonine accumulated in the medium was determined at 120 rpm. The The amino acid concentration was also determined using high-pressure Liquid chromatography (J Chromat 1983, 266: 471-482). The result of Fermentation is shown in Table 3, with the values given averages from three experiments with different clones. It was found, that the overexpression of the pyruvate carboxylase gene is approximately 40% Increases the threonine concentration in the medium. Thus, the use of the discovered and described gene for the anaplerotic enzyme pyruvate Carboxylase is a process to decisively increase the formation of L-threonine improve.  

Des weiteren zeigte die Aminosäurekonzentrationsbestimmung, daß überraschenderweise der Stamm mit überexprimiertem Pyruvat-Carboxylase-Gen außerdem etwa 150% mehr Homoserin ins Medium ausschied als der Stamm mit nicht überexprimiertem Gen. Die entsprechenden Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 3 dargestellt. Sie machen deutlich, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren sowohl die Threonin- als auch die Homoserinbildung entscheidend verbessert werden kann. Furthermore, the amino acid concentration determination showed that Surprisingly, the strain with overexpressed pyruvate carboxylase gene in addition, about 150% more homoserine exited the medium than the strain with no overexpressed gene. The corresponding results are also in Table 3 shown. They make it clear that both the the threonine and homoserine formation can be significantly improved.  

Tabelle 1 Table 1

/Tabelle 2 / Table 2

Tabelle 3 Table 3

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims (37)

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie, bei dem die Pyruvat-Carboxylase-Aktivität durch genetische Veränderung des Enzyms und/oder die Pyruvat-Carboxylase- Genexpression eines die entsprechende Aminosäure produzierenden Mikroorganismus erhöht wird1. Process for the microbial production of amino acids of aspartate and / or Glutamate family, in which the pyruvate carboxylase activity by genetic modification of the enzyme and / or the pyruvate carboxylase Gene expression of one that produces the corresponding amino acid Microorganism is increased 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch Mutation des endogenen Pyruvat-Carboxylase-Gens ein Enzym mit höherer Pyruvat-Carboxylase-Aktivität erzeugt wird.2. The method according to claim 1, characterized, that by mutation of the endogenous pyruvate carboxylase gene an enzyme is generated with higher pyruvate carboxylase activity. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Genexpression der Pyruvat-Carboxylase durch Erhöhen der Genkopienzahl erhöht wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that the gene expression of pyruvate carboxylase by increasing the Gene copy number is increased. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung der Genkopienzahl das Pyruvat-Carboxylase-Gen in ein Genkonstrukt eingebaut wird. 4. The method according to claim 3, characterized, that to increase the gene copy number, the pyruvate carboxylase gene in a Gene construct is incorporated.   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen in ein Genkonstrukt eingebaut wird, das dem Pyruvat- Carboxylase-Gen zugeordnete regulatorische Gensequenzen enthält.5. The method according to claim 4, characterized, that the gene is built into a gene construct that the pyruvate Contains regulatory gene sequences assigned to carboxylase gene. 6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein die entsprechende Aminosäure produzierender Mikroorganismus mit dem das Gen enthaltende Genkonstrukt transformiert wird.6. The method according to claim 4 or 5, characterized, that a microorganism producing the corresponding amino acid with which the gene construct containing the gene is transformed. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium mit dem das Gen enthaltende Genkonstrukt transformiert wird.7. The method according to claim 6, characterized, that a microorganism of the genus Corynebacterium with which the gene containing gene construct is transformed. 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß für die Transformation ein Mikroorganismus eingesetzt wird, in dem die an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Enzyme dereguliert sind und/oder die eine erhöhte Exportcarrier-Aktivität für die entsprechende Aminosäure aufweisen.8. The method according to claim 6 or 7, characterized, that a microorganism is used for the transformation in which the enzymes involved in the synthesis of the corresponding amino acid are deregulated and / or have an increased export carrier activity for the have the corresponding amino acid. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß für die Transformation ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der einen erhöhten Anteil an den an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Zentralstoffwechselmetaboliten enthält. 9. The method according to any one of claims 6 to 8, characterized, that a microorganism is used for the transformation, the one increased share in the synthesis of the corresponding amino acid contains central metabolism involved.   10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß für die Transformation ein Mikroorganismus eingesetzt wird, bei dem ein zu dem entsprechenden Aminosäurebiosyntheseweg konkurrierender Biosyn­ theseweg mit verminderter Aktivität abläuft.10. The method according to any one of claims 6 to 9, characterized, that a microorganism is used for the transformation, in which a Biosyn competing with the corresponding amino acid biosynthetic pathway theseweg runs with reduced activity. 11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Pyruvat-Carboxylase-Gen aus einem Mikroorganismus-Stamm der Gattung Corynebacterium isoliert wird.11. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the pyruvate carboxylase gene from a microorganism strain of Genus Corynebacterium is isolated. 12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Genexpression durch Verstärkung der Transkriptionssignale erhöht wird.12. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that gene expression increases by amplifying the transcription signals becomes. 13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dem Pyruvat-Carboxylase-Gen der tac-Promotor vorgeschaltet wird.13. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the pyruvate carboxylase gene is preceded by the tac promoter. 14. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch dem tac-Promotor zugeordnete regulatorische Sequenzen.14. The method according to claim 13, marked by regulatory sequences assigned to the tac promoter. 15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Pyruvat-Carboxylase-Gen ein Gen mit einer für die unter SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz und deren Allelvariationen kodierenden Nukleotidsequenz eingesetzt wird.15. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that as a pyruvate carboxylase gene a gene with one for the under SEQ ID No. 2 given amino acid sequence and their allele variations  coding nucleotide sequence is used. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Pyruvat-Carboxylase-Gen ein Gen mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 165 bis 3587 gemäß SEQ ID No. 1 oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz eingesetzt wird.16. The method according to claim 15, characterized, that as a pyruvate carboxylase gene a gene with the nucleotide sequence of Nucleotide 165 to 3587 according to SEQ ID No. 1 or one essentially equivalent DNA sequence is used. 17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung von Lysin, Threonin, Homoserin, Glutamat und/oder Arginin.17. The method according to any one of the preceding claims for the production of Lysine, threonine, homoserine, glutamate and / or arginine. 18. Pyruvat-Carboxylase-Gen mit einer für die unter SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz und/oder deren Allelvariationen kodierenden Nukleotidsequenz.18. Pyruvate carboxylase gene with one for those under SEQ ID No. 2nd given amino acid sequence and / or their allele variations coding nucleotide sequence. 19. Pyruvat-Carboxylase-Gen nach Anspruch 18 mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 165 bis 3587 gemäß SEQ ID Nr. 1 oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz.19. Pyruvate carboxylase gene according to claim 18 with the nucleotide sequence of Nucleotide 165 to 3587 according to SEQ ID No. 1 or essentially one equivalent DNA sequence. 20. Pyruvat-Carboxylase-Gen nach Anspruch 18 oder 19 mit einem vorgeschalteten Promotor der Nukleotidsequenz von Nukleotid 20 bis 109 gemäß SEQ ID No. 1 oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA- Sequenz.20. Pyruvate carboxylase gene according to claim 18 or 19 with one upstream promoter of the nucleotide sequence of nucleotides 20 to 109 according to SEQ ID No. 1 or an essentially equivalent DNA Sequence. 21. Pyruvat-Carboxylase-Gen nach Anspruch 18 oder 19 mit vorgeschaltetem tac-Promotor. 21. Pyruvate carboxylase gene according to claim 18 or 19 with upstream tac promoter.   22. Pyruvat-Carboxylase-Gen nach Anspruch 21 mit dem Promotor zugeordneten regulatorischen Sequenzen.22. Pyruvate carboxylase gene according to claim 21 with the promoter assigned regulatory sequences. 23. Pyruvat-Carboxylase-Gen nach einem der Ansprüche 18 bis 20 mit diesem zugeordnete regulatorische Gensequenzen.23. Pyruvate carboxylase gene according to one of claims 18 to 20 with this assigned regulatory gene sequences. 24. Genstruktur, enthaltend ein Pyruvat-Carboxylase-Gen nach einem der Ansprüche 18 bis 23.24. Gene structure containing a pyruvate carboxylase gene according to one of the Claims 18 to 23. 25. Vektor, enthaltend ein Pyruvat-Carboxylase-Gen nach einem der Ansprüche 18 bis 23 oder eine Genstruktur nach Anspruch 24.25. Vector containing a pyruvate carboxylase gene according to one of the claims 18 to 23 or a gene structure according to claim 24. 26. Transformierte Zelle, enthaltend in replizierbarer Form ein Pyruvat- Carboxylase-Gen nach einem der Ansprüche 18 bis 23 oder eine Genstruktur nach Anspruch 24.26. Transformed cell containing, in replicable form, a pyruvate Carboxylase gene according to one of claims 18 to 23 or a gene structure according to claim 24. 27. Transformierte Zelle nach Anspruch 26, enthaltend einen Vektor nach Anspruch 25.27. A transformed cell according to claim 26, comprising a vector according to Claim 25. 28. Transformierte Zelle nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Gattung Corynebacterium angehört.28. Transformed cell according to claim 26 or 27, characterized, that it belongs to the genus Corynebacterium. 29. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß in dieser die an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Enzyme und/oder die am Export der entsprechenden Aminosäure beteiligten Enzyme dereguliert sind. 29. Transformed cell according to one of claims 26 to 28, characterized, that this involved in the synthesis of the corresponding amino acid Enzymes and / or the export of the corresponding amino acid involved enzymes are deregulated.   30. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen erhöhten Anteil an den an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Zentralstoffwechselmetaboliten enthält.30. Transformed cell according to one of claims 26 to 29, characterized, that they have an increased share in the synthesis of the corresponding Contains central metabolism involved in amino acid. 31. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen erniedrigten Anteil an den nicht an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Zentralstoffwechselmetaboliten enthält.31. Transformed cell according to one of claims 26 to 30, characterized, that they have a reduced share in the not in the synthesis of the corresponding amino acid metabolites involved contains. 32. Verwendung eines Pyruvat-Carboxylase-Gens zur Steigerung der Produktion von aus der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie stammenden Aminosäuren von Mikroorganismen.32. Use of a pyruvate carboxylase gene to increase Production of those from the aspartate and / or glutamate family Amino acids from microorganisms. 33. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein mutiertes Pyruvat-Carboxylase-Gen, das für ein Enzym mit erhöhter Pyruvat-Carboxylase-Aktivität kodiert, verwendet wird.33. Use according to claim 32, characterized, that a mutated pyruvate carboxylase gene that is responsible for an enzyme with increased Encoding pyruvate carboxylase activity is used. 34. Verwendung nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, daß der die entsprechende Aminosäure produzierende Mikroorganismus mit einem Genkonstrukt, das ein Pyruvat-Carboxylase-Gen enthält, transformiert wird. 34. Use according to claim 32 or 33, characterized, that the microorganism producing the corresponding amino acid with a gene construct containing a pyruvate carboxylase gene becomes.   35. Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Genkonstrukt zusätzlich regulatorische Gensequenzen enthält.35. Use according to claim 34, characterized, that the gene construct additionally contains regulatory gene sequences. 36. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß ein Pyruvat-Carboxylase-Gen aus Corynebacterium verwendet wird.36. Use according to one of claims 32 to 35, characterized, that a pyruvate carboxylase gene from Corynebacterium is used. 37. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß als Aminosäure-produzierender Mikroorganismus Corynebacterium verwendet wird.37. Use according to one of claims 32 to 36, characterized, that as an amino acid producing microorganism, Corynebacterium is used.
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