DE19831382A1 - Humanes m¶3¶G-cap-spezifisches Kernimportrezeptorprotein mit einer neuen Domänenstruktur, dessen Herstellung und Verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Polypetid (Fig. 1) oder eine funktionelle Variante davon, welches vorzugsweise mittels einer Nukleinsäure erhältlich ist und als ein 5'-2,2,7,terminalen trimethyl-Guanosin(m¶3¶G-)Cap spezifischer Kernimportrezeptor in Zellen fungiert. Die Erfindung findet vorzugsweise Verwendung als Arzneimittel und Diagnostika.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein humanes 5'-2,2,7-terminale Trimethyl- Guanosin (im folgenden: m₃G)-Cap-spezifisches Kernimportrezeptorprotein, erhältlich durch Kern-, Cytosolextraktion und Expression rekombinanter Nuklein­ säuren, sowie deren Verwendung insbesondere als Arzneimittel, Diagnostikum.

Die Zielsteuerung von Proteinen (Protein Targeting) innerhalb der Zelle ist von besonderer Bedeutung, da vielversprechende diagnostische und pharmazeutische Anwendungen in Aussicht gestellt werden.

Neubiosynthetisierte Proteine enthalten Signale, die ihren endgültigen Bestim­ mungsort in der Zelle determinieren. So auch im Fall des sogenannten Protein- Importwegs in den Kern aus dem Cytosol, welcher durch einen nukleären Poren Komplex (NPC) erfolgt und im Allgemeinen durch einen sättigbaren Transport­ rezeptor, der spezifisch ein nukleäres Lokalisationssignal (NLS) erkennt, vermittelt wird (Görlich und Mattaj (1996), Science, 107, 1513, insbesondere Tabelle 1; Nigg (1997), Nature, 386; 779; Ohno et al. (1998), Cell, 92, 327).

Die sogenannten basischen NLS bestehen zumeist aus einer oder einer Ansamm­ lung von mehreren basischen Aminosäuren (Übersicht in Dingwall and Laskey (1991), Trends Biochem. Sci., 16, 478). Die Proteine, die ein solches basisches NLS aufweisen, werden im folgenden als karyophile Proteine bezeichnet.

Görlich beschreibt die Isolierung eines Transportrezeptors, sogenanntes Importin bestehend aus den komplexen heterodimeren Untereinheiten α (60 kD) und β (90 kD). Importin α enthält ein N-terminales Motiv, die Importin β binding (im folgenden: IBB) Domäne, die die Komplexformierung mit Importin β vermittelt sowie eine C-terminale Domäne, die die NLS-Bindungsstelle herstellt und aus acht sogenannten "armadillo" Wiederholungsmotiven besteht (Görlich et al. (1996), EMBO J., 15, 1810; Moroianu et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2008; Weis et al. (1996), EMBO J., 15, 1818). Mittels Importin β erfolgt die Bindung des NLS-Importin-Komplexes an die NPC (Chi et al. (1995), J. Cell. Biol., 130, 265; Görlich et al. (1995), Curr. Biol., 5, 383 und (1995) Nature, 377, 246; Imamoto et al. (1995), FEBS Lett., 368, 415; Moroianu et al. (1995), Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2008). Diese werden ebenfalls als Karyopherin α/β (Moroianu et al. 1995 supra; Radu et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1769) bezeichnet.

Die Translokation des Komplexes durch die Kernpore benötigt zusätzliche energie­ liefernde Transportfaktoren wie GTP und Ran (Melchior et al. (1993) J. Cell. Biol., 123, 1649; Moore und Blobel (1993), Nature, 365, 661) sowie p10/NTF2 (Moore und Blobel, (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10212; Paschal und Gerace (1995), J. Cell. Biol., 129, 925).

In aktuellen Untersuchungen, die sich mit den Transportsignalen von hnRNP A1 und K beschäftigten, konnte ein neuer Protein-Importweg identifiziert werden, der sich von der bekannten basischen NLS-Erkennung unterscheidet (Pollard et al. (1996), Cell, 86, 985; Michael et al. (1997), EMBO J., 16, 3587). Hierbei ist der Import von hnRNP A1 in den Kern von einem 38 Aminosäuren langen Transportsignal, sogenanntes M9, abhängig, welches keine Sequenzähnlichkeit mit den basischen NLS aufweist (Siomi und Dreyfuss (1995), J. Cell. Biol., 129, 551; Weighart et al. (1995), J. Cell. Sci., 108, 545; Michael et al. (1995), Cell, 83 415). M9 wird direkt von Transportin erkannt (Pollard et al. 1996, Cell, 86, 985; Nakielny et al., Exp. Cell. Res., 1996, 261; Fridell et al., J. Cell. Sci. 1997, 1325). Im Gegensatz zu Importin β ist Transportin ohne eine α Untereinheit funktionell, während die Bindung an den NPC und die Ran-abhängige Translokation des hnRNP A1/Transportin-Komplexes in den Kern auf analoge Weise zu Importin β erfolgt (Nakielny et al. (1996), Exp. Cell. Res., 229, 261; Izaurralde et al. (1997), J. Cell. Biol., 137, 27). Ein Homolog zu Transportin, Kap104p, welches ein bestimmte Gruppe von mRNA-bindenden Proteinen importiert, wurde in der Hefe beschrieben (Aitchinson et al. (1996) Science, 274, 624).

Zwei weitere Importin β-ähnliche Proteine, Kap123p/Yrb4p und Pse1p, werden für den Kernimport von ribosomalen Proteinen in der Hefe vermutet (Rout et al. (1997), Cell, 89, 715; Schlenstedt et al. (1997), EMBO J., 16, 6237). Diese neuen Importin α unabhängigen Transportrezeptoren sind alle Mitglieder der großen Familie der Importin β-ähnlichen Transportfaktoren (Fornerod et al. (1997), EMBO J., 16; 807, Görlich et al. (1997) J: Cell. Biol., 138, 65).

Der Mechanismus des Imports der kernspezifischen spliceosomalen U snRNP ist jedoch weitgehend unbekannt. Jedes snRNP Partikel besteht aus einem (U1, U2 und U5) oder zwei (U4/U6) snRNA Molekülen sowie einem gemeinsamen Satz von acht Grundproteinen (B, B', D1, D2, D3, E, F und G, sogenannte Sm Proteine), die an jede der m₃G-Cap enthaltende snRNAs U1, U2, U4 und U5 gebunden sind und sich hinsichtlich der jeweiligen snRNA in spezifischen weiteren assoziierten Pro­ teinen unterscheiden (Will und Lührmann (1997), Curr. Opin. Cell. Biol., 9, 320).

Mit der Ausnahme des U6 snRNP, welches den Kern nicht verläßt (Vankan et al. (1990), EMBO J., 9, 1075) ist die Biogenese der snRNPs von einem bidirektionalen Transport der snRNA durch die Kernmembran abhängig. Die snRNAs (U1, U2, U4 und U5) werden spezifisch mit einer 5'terminalen 7 monomethyl-Guanosin (m⁷G-) Cap Struktur synthetisiert, während die Sm Proteine im Zytoplasma entstehen und ohne Bindung an U snRNA nicht in den Kern wandern. Vielmehr werden neu synthetisierte U snRNAs transient in das Zytoplasma exportiert, wo sie an der spezifischen snRNA Sm Bindungsstelle die Sm Proteine binden, um einen Ribo­ nucleoprotein-Komplex zu bilden (sogenanntes Sm Core nach Mattaj und De Robertis (1985), Cell, 40, 111; Raker et al. (1996), EMBO J. 15, 2256). Die stabile Assoziation aller Sm Proteine ist für die Hypermethylierung des m⁷G-Cap zum m₃G- Cap essentiell (Mattaj (1986) Cell, 46, 905; Plessel et al. (1994), Mol. Cell. Biol., 14, 4160). Nach diesen Vorgängen und der Prozessierung des 3'Endes wird der reife snRNP Partikel in einer Rezeptor- und Energie-abhängigen Weise zurück in den Kern transportiert (Neuman de Vegvar und Dahlberg (1995) Mol. Cell. Biol., 10, 3365).

Beschrieben ist das NLS des U1 snRNP in Xenopus laevis Oozyten, welches eben­ falls komplexer Natur ist. Zum einen durch das m₃G-Cap (Fischer und Lührmann (1990), Science, 249, 786; Hamm et al., (1990) Cell, 62, 569), zum anderen durch einen nicht näher charakterisierten Teil in der Sm Grunddomäne (Sm Core NLS; Fischer et al. (1993) EMBO J. 12, 573). Nicht alle spliceosomalen snRNAs benötigen in gleichem Ausmaß das m₃G-Cap für den Kerntransport in Oozyten. Während U1 und U2 snRNA das m₃G-Cap für den Transport in den Kern auf jeden Fall benötigen, können U4 und U5 snRNAs den Kern auch als ApppG-Cap Derivate erreichen, auch wenn die Effizienz dadurch erheblich reduziert wird (Fischer et al. (1991), J. Cell. Biol., 113, 705; Michaud und Golgfarb (1992) J. Cell. Biol., 116, 851). Auch wenn das m₃G-Cap für den Kerntransport der snRNAs U4 und U5 nicht essentiell ist, beschleunigt es deren Transport jedoch erheblich. Dies zeigt, daß das m₃G-Cap eine Signalfunktion für den Import von allen U snRNAs besitzt (Fischer et al., J. Cell. Biol., 1994, 971; Marshallsay und Lührmann, 1994, Nucleic Acids Res, 13, 222).

Die Erfindung hat daher zur Aufgabe ein Polypeptid bereitzustellen, welches spezifisch mit m₃G-Cap interagiert und als m₃G-Cap-spezifischer Kernimport­ proteinrezeptor in vivo und in vitro verwendet wird.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein 45 kD Protein aus zytoplasmatischen Extrakten von HeLa-Zellen mit hoher Spezifität für m₃G-Cap Strukturen bereitgestellt wird.

Kernimportrezeptorprotein im Sinne dieser Erfindung bedeutet, daß das Polypeptid zum einen als Rezeptor wirkt und zum anderen den Transport von rezeptierten Molekülen aus dem Cytosol (Zytoplasma) in den Kern mediiert.

m₃G-Cap-spezifischer Kernimportproteinrezeptor im Sinne dieser Erfindung bedeutet, daß der obig definierte Kernimportrezeptor spezifisch Moleküle mit m₃G- Cap Strukturen rezeptiert, d. h. im weitesten Sinne erkennt, und deren Transport in den Kern mediiert, sowohl "in vitro" als auch "in-vivo".

m₃G-Cap enthaltende Moleküle im Sinne dieser Erfindung bedeutet, daß diese dem erfindungsgemäßen m₃G-Cap-spezifischen Kernimportproteinrezeptor zugänglich sind. Denkbar sind daher auch Fusionsmoleküle aus m₃G-Cap und Protein oder anderen biologisch relevanten Molekülen.

Unter "in vivo" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Umsetzung, d. h. eine Reaktion, verstanden, die innerhalb eines lebenden Organismus abläuft.

Unter "in vitro" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Umsetzung, d. h. eine Reaktion, verstanden, die außerhalb eines lebenden Organismus abläuft.

"Cap" im Sinne dieser Erfindung hat die Bedeutung, wie sie dem Fachmann auf dem Gebiet der U snRNA und snRNP Arbeiten bekannt ist.

Zur Ausführung der Erfindung wird mit Hilfe eines UV-crosslinking Assay sowie dem synthetischen Substrat (m₃G)pppAmpUmpA-Oligonukleotid (m₃G-Cap-Oligo) als Substrat die Identifizierung eines potentiellen m₃G-Cap bindenden Proteins durchgeführt. Nach der UV-Bestrahlung von cytosolischen S100 Extrakten, die das am 3'Ende radioaktiv mit [³²P]pCp markierte m₃G-Cap-Oligo, enthalten werden die Proteine mittels SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE) und Autoradiographie die vernetzten radioaktiv markierten Proteinen analysiert. Fig. 3A und 3B zeigen, daß eine radioaktiv markierte Hauptbande mit einem apparenten Molekulargewicht von 45 kD (Pfeilspitze in Fig. 3A und 3B) und drei weniger intensiv markierte Proteine mit den Molekulargewichten 25, 35 und 150 kD reproduzierbar detektiert werden.

Die im folgenden erfindungswesentliche m₃G-Cap Spezifität für das erfindungsgemäße Polypeptid, vorzugsweise ein 45 kD Protein, wird mit Hilfe von Kompetitionsstudien mit verschiedenen unmarkierten Cap-Strukturen erkannt Während ein 10 000-facher Überschuß an m⁷GpppG- oder ApppG-Cap Dinukleotid nur sehr geringe Effekte auf die Effektivität des UV-Crosslinks mit dem radioaktiv markierten m₃G-Cap-Oligo an das 45 kD Protein zeigen (Fig. 3A, Spuren 2-4 und 5-7), reicht ein 10- bis 100-facher Überschuß an unmarkiertem m₃G-Cap Oligo aus, um die Bindung an das 45 kD Protein vollständig zu unterbinden (Fig. 3A, Spuren 9-11). Im Gegensatz dazu, konnte nur bei einem 1000-fachen Überschuß des unmarkierten m₃G-Cap-Oligo eine signifikante Inhibierung der Crosslinking Nebenprodukte beobachtet werden (mit Ausnahme eines 150 kD Proteins). Zudem inhibierte ein synthetisches m₃GpppG-Cap Dinukleotid um eine Größenordnung weniger effektiv die Bindung an das 45 kD Protein als das urimarkierte m₃G-Cap- Oligo (Fig. 3A, vergleiche Spuren 8-11 mit 12-15).

Das aufgabengemäße Polypeptid, vorzugsweise ein 45 kD Protein, bindet sowohl an isolierte m₃G-Cap-Strukturen und an native m₃G-Caps in der U1 snRNA als auch an nativen U1 snRNP-Partikeln. Dies konnte durch die Inhibierung des UV-Crosslinking des m₃G-Cap-Oligos an das 45 kD Protein durch U1 snRNA und U1 snRNP gezeigt werden (Fig. 3B, Spuren 2-5 und 11-14). Die Interaktion des 45 kD Proteins mit U1 snRNA oder U1 snRNP ist strikt von der Anwesenheit der 5'-terminalen m₃G-Cap-Struktur abhängig. U1 snRNA und U1 snRNP Präparationen, deren 5'-terminale Enden mit Hilfe von Oligonukleotid-gesteuerter Rnase H Hydrolyse entfernt wurden, konnten das UV-crosslinking vom m₃G-Cap-Oligo an das 45 kD Protein nicht inhibieren (Fig. 3B, Spuren 6-9 und 15-18). Gleiche Konzentrationen an m₃G-Cap Oligo, U1 snRNA oder U1 snRNP sind ausreichend, um vollständig die Vernetzung des 45 kD Protein mit dem radioaktiv markierten m₃G-Cap-Oligo zu inhibieren (vergleiche Fig. 3A und 3B). Dieses Experiment zeigt, daß weder zusätzliche RNA-Sequenzen, noch Sm Core Proteine die Affinität des 45 kD Protein für die 5'-terminale m₃G-Cap-Struktur von U1 snRNA/snRNP erhöhen konnte.

Daher ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung das aufgabengemäße Polypeptid als solches mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 oder einer funktionellen Variante davon, und Teile davon mit mindestens sechs Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens zwölf Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 65 Aminosäuren und vor allem mit 360 Aminosäuren (nachfolgend "erfindungsgemäßes Polypeptid" oder "Snurportin 1" genannt).

Beispielsweise kann ein ca. 6-12, vorzugsweise ca. 8 Aminosäuren-langes Polypeptid ein Epitop enthalten, das nach Kopplung an einen Träger zur Herstellung von spezifischen poly- oder monoklonalen Antikörper dient. Polypeptide mit einer Länge von mindestens ca. 65 Aminosäuren können auch direkt ohne Träger zur Herstellung von poly- oder monoklonalen Antikörper dienen.

Unter dem Begriff "funktionelle Variante" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Polypeptide, die funktionell mit dem erfindungsgemäßen Peptid verwandt sind, d. h. eine m₃G-Cap-spezifische Kernimportrezeptoraktivität aufweisen. Unter Varianten versteht man ebenfalls allelische Varianten oder Polypeptide, die von anderen menschlichen Zellen bzw. Gewebe abstammen. Im Sinne dieser Erfindung gelten darunter Polypeptide, die von verschiedenen menschlichen Individuen stammen.

Im weiteren Sinne versteht man darunter auch Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität von ca. 70%, vorzugsweise von ca. 80%, insbesondere von ca. 90%, vor allem von ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 haben. Ferner zählen hierzu auch Deletion des Polypeptids im Bereich von ca. 1-65, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-6 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptids wesentlich verändert wird. Daneben zählen hierzu auch Fusionsproteine, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion eines humanen m₃G-Cap spezifischen Kernimportreteptors haben oder erst nach Abspaltung des Fusionsanteils die spezifische Funktion bekommen können. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit einem Anteil von insbesondere nicht-humanen Sequenzen von ca. 1-150, vorzugsweise ca. 1-100, insbesondere ca. 1-65, vor allem ca. 1-30 Aminosäuren. Beispiele von nicht-humanen Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, z. B. aus der Galactosidase von E. coli oder ein sogenannter Histidin-Tag, z. B. ein Met-Ala-His6-Tag. Ein Fusionsprotein mit einem sogenannten Histidin-Tag eignet sich besonders vorteilhaft zur Reinigung des exprimierten Proteins über Metallionen-haltige Säulen, beispielsweise über eine Ni²⁺-NTA-Säule. "NTA" steht für den Chelator "nitrilotriacetic acid" (Qiagen GmbH, Hilden).

Die Teile des erfindungsgemäßen Polypeptids repräsentieren beispielsweise Epitope, die spezifisch von Antikörpern erkannt werden können.

Diese für das erfindungsgemäße Polypeptid codierende cDNA kodiert für 360 Aminosäuren (AS) mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 45 kD (Fig. 3A). Eine Datenbanksuche mit dem humanen Snurportin 1 zeigte überraschenderweise eine hohe Homologie im N-terminalen Bereich (AS 27 bis 65, Fig. 5B zu der IBB Domäne vom Importin α (31% Identität, 62% Ähnlichkeit mit hSRP1, ähnliche Übereinstimmungen wurden mit hRch1, xImpα und ySRP1 beobachtet, Fig. 5B). Darüber hinaus sind AS-Bereiche in der IBB-Domäne von Snurportin 1 sehr homolog zu BB Domänensequenzen von anderen Mitgliedern der Importin-Familie (Görlich et al., EMBO J., 1996, 1810; Weis et al., 1996, supra; hervorgehoben durch schwarze Punkte in Fig. 5B). Im Gegensatz zur ausgedehnten N-terminalen IBB-Domäne ist der C-terminale Teil von Snurportin 1 strukturell unterschiedlich von Importin α (z. B. weniger als 10% Sequenzidentität mit dem C-Terminus von hSRP1). Insbesondere konnte keine signifikante Sequenzhomologie zwischen Snurportin 1 und der arm-Wiederholungsdomäne von Importin α detektiert werden (Fig. 5B).

Insbesondere die genannten Teile des Polypeptids können auch mit Hilfe der klassischen Peptidsynthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden. Sie eignen sich insbesondere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpressionsbanken durchsucht werden können, um so zu weiteren funktionellen Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids zu gelangen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Polypeptid ein rekombinant hergestelltes Protein. Darunter wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Protein verstanden, welches dadurch hergestellt wurde, daß eine das Protein codierende DNA-Sequenz in eine Wirtszelle eingebracht und dort zur Expression gebracht wird. Das Protein kann dann anschließend aus der Wirtszelle und/oder aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Die Wirtszelle ist dabei vorzugsweise ein Bakterium (z. B. E. coli Stämme wie DH5, HB101 oder BL21), Hefen (z. B. Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris), Pilze (z. B. Aspergillus spec.), Säugetierzellinien (z. B. 293-, Vero-, HeLa-, Cos- oder BHK- Zellen), Insektenzellinien oder ein Protist (Mikroalgen oder Protozoen, z. B. der Gattung Tetrahymena wie z. B. definiert in Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag, 1985, 1-2). Besonders bevorzugt wird Snurportin von der Wirtszelle sekretiert. Die Herstellung derartiger Wirtszellen zur Produktion eines rekombinanten Snurportin kann nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.

Eine Übersicht über verschiedene Expressionssysteme findet man z. B. in Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516 und in Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544). Expressionsvektoren sind in großem Umfang in der Literatur beschrieben. Sie enthalten neben einem Selektionsmarkergen und einem die Replikation in dem gewählten Wirt sicherstellenden Replikationsursprung in der Regel einen bakteriellen oder viralen Promotor, sowie meist ein Terminationssignal für die Transkription. Zwischen Promotor und Terminationssignal befinden sich mindestens eine Restriktionsschnittstelle oder ein Polylinker, die die Insertion einer codierenden DNA-Sequenz ermöglichen. Als Promotorsequenz kann, sofern sie in dem gewählten Wirtsorganismus aktiv ist, die natürlicherweise die Transkription des entsprechenden Gens steuernde DNA-Sequenz verwendet werden. Diese Sequenz kann aber auch gegen andere Promotor-Sequenzen ausgetauscht werden. Es kön­ nen sowohl Promotoren verwendet werden, die eine konstitutive Expression des Gens bewirken, als auch induzierbare Promotoren, die eine gezielte Regulation der Expression des nachgeschalteten Gens erlauben. Bakterielle und virale Promotor­ sequenzen mit diesen Eigenschaften sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Regulatorische Sequenzen zur Expression in Mikroorganismen (z. B. E. coli, S. cerevisiae) sind ausreichend in der Literatur beschrieben. Promotoren, die eine besonders starke Expression des hochgeschalteten Gens erlauben, sind z. B. der T7-Promotor (Studier et al., Methods in Enzymology (1990), 185, 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (Eds), Promotors, Structure and Function; Praeger, New York, (1982), 462-481; DeBoer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25), Ip1, rac (Boros et al., Gene (1986), 42, 97-100).

Die Transformation der Wirtszelle mit der für das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden DNA kann in der Regel nach Standardmethoden durchgeführt werden, wie z. B. beschrieben in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Press, New York). Die Kultivierung der Wirtszelle erfolgt in Nährmedien, die den Bedürfnissen der jeweils verwendeten Wirtszelle entsprechen, insbesondere unter Berücksichtigung von pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration, Belüftung, Antibiotika, Vitaminen, Spurenelementen usw.

Die Expressionsvektoren können beispielsweise prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokarvotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z. B. der T7 Expressionsvektor pGM10 (Martin, 1996), welcher für einen N-terminalen Met-Ala-His6-Tag kodiert, der eine vorteilhafte Reinigung des exprimierten Proteins über eine Ni2+-NTA-Säule ermöglicht. Als eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae eignen sich z. B. die Vektoren p425Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al., Nucl. Acids Res., 1994, (22), 5767), für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus- Vektoren wie in EP-B1-0127839 oder EP-B1-0549721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. SV40-Vektoren, welche allgemein erhältlich sind.

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die Wirtszelle geeignete regulatorische Sequenzen, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (s. z. B. EP-B1-0154133), den ADH-2-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674), den Baculovirus-Polyhedrin-Prnmotor für die Expression in Insektenzellen (s. z. B. EP-B1-0127839) oder den frühen SV40- Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (Mouse Mammary Tumour Virus; Lee et al. (1981) Nature, 214, 228).

Die Reinigung des von den Wirtszellen produzierten Enzyms kann nach herkömm­ lichen Reinigungsmethoden wie Fällung, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Gelfiltration, HPLC Reverse Phase Chromatographie usw. erfolgen.

Durch Modifikation der in den Wirtszellen exprimierten, für das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden DNA läßt sich in der Wirtszelle ein Polypeptid herstellen, welches aufgrund bestimmter Eigenschaften leichter aus dem Kulturmedium isoliert werden kann. So besteht die Möglichkeit, das zu exprimierende Protein als Fusionsprotein mit einer weiteren Polypeptidsequenz zu exprimieren, deren spezifische Bindungseigenschaften die Isolierung des Fusionsproteins über Affinitätschromatographie ermöglichen (z. B. Hopp et al. (1988), Bio/Technology, 6, 1204-1210; Sassenfeld (1990), Trends Biotechnol., 8, 88-93).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Nukleinsäure kodierend für einen m₃G-Cap-spezifischen Kernimportrezeptorprotein mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 2 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 15 oder 20 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 100 Nukleotiden, vor allem mit mindestens 300 Nukleotiden (nachfolgend "erfindungsgemäße Nukleinsäure" genannt).

Die vollständige Nukleinsäure kodiert für ein Protein mit 360 Aminosäuren und einer­ molekularen Masse von 45 kDa. Die Expression der Nukleinsäure in E. coli führt zu einem Protein, welches ähnliche enzymatische Aktivitäten aufweist, wie die eines humanen m₃G-Cap-spezifischen Kernimportrezeptors.

Weitere Experimente gemäß der vorliegenden Erfindung bestätigten, daß es sich bei der Nukleinsäure um eine Nukleinsäure handelt, die für ein humanes Snurportin 1 kodiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA, und insbesondere eine DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 2.

Unter dem Begriff "funktionelle Variante" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure, die funktionell mit dem humanen m₃G-Cap- spezifischen Kernimportrezeptor verwandt ist und insbesondere humanen Ursprungs ist. Beispiele verwandter Nukleinsäuren sind bespielsweise Nukleinsäuren aus unterschiedlichen humanen Zellen bzw. Geweben oder allelische Varianten. Auch umfaßt die vorliegende Erfindung Varianten von Nukleinsäuren, die von verschiedenen menschlichen Individuen stammen können.

Im weiteren Sinne versteht man unter dem Begriff "Varianten" gemäß der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren, die eine Homologie, insbesondere eine Sequenzidentität von ca. 60%, vorzugsweise von ca. 75%, insbesondere von ca. 90% und vor allem von ca. 95% aufweisen.

Die Teile der erfindungsgemäßen Nukleinsäure können beispielsweise zur Herstellung einzelner Epitope, als Sonden zur Identifizierung weiterer funktioneller Varianten oder als Antisense-Nukleinsäuren verwendet werden. Beispielsweise eignet sich eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 8 Nukleotiden als Antisense- Nukleinsäure, eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 15 Nukleotiden als Primer beim PCR-Verfahren, eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 20 Nukleotiden für die Identifizierung weiterer Varianten und eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 100 Nukleotiden als Sonde.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen. Die nicht- kodierenden Sequenzen sind beispielsweise Intronsequenzen oder regulatorische Sequenzen, wie Promotor- oder Enhancer-Sequenzen, zur kontrollierten Expression des m₃G-Cap spezifischen Kernimportrezeptors.

In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure daher in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor enthalten.

Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, vorzugsweise Adenovirusvektoren, insbesondere replikationsdefiziente Adenovirusvektoren, oder Adenoassoziierte Virusvektoren, z. B. ein Adenoassoziierter Virusvektor, der ausschließlich aus zwei insertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR) besteht.

Geeignete Adenovirusvektoren sind beispielsweise in McGrory, W.J. et al. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman, Y. et. al. (1982) in "Eukaryotic Viral Vectors" (Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, New York; Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280; Karlsson, S. et al. (1986) EMBO J. 5, 2377 oder WO 95/00655 beschrieben.

Geeignete Adeno-assoziierte Virusvektoren sind beispielsweise in Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97; WO 95/23867; Samulski, R.J. (1989) J. Virol, 63, 3822; WO 95/23867; Chiorini, J.A. et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531 oder Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793 beschrieben.

Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert. Hierzu eignen sich Lipidmischungen wie bei Felgner, P.L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84, 7413; Behr, J.P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982; Felgner, J.H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 oder Gao, X. & Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195 beschrieben. Bei der Herstellung der Liposomen wird die DNA ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die DNA vollständig von den Liposomen komplexiert wird.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann beispielsweise chemisch anhand der in Fig. 2 offenbarten Sequenz oder anhand der in Fig. 1 offenbarten Peptidsequenz unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (s. z. B. Uhlman, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No. 4). Eine weitere Möglichkeit, die erfindungsgemäße Nukleinsäure in die Hand zu bekommen, ist die Isolierung aus einer geeigneten Genbank, beispielsweise aus einer humanen Genbank, anhand einer geeigneten Sonde (s. z. B. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York). Als Sonde eignen sich beispielsweise einzelsträngige DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 100 bis 1000 Nucleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 200 bis 500 Nucleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300 bis 400 Nucleotiden, deren Sequenz aus der Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 2 abgeleitet werden kann.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auch auf Antikörper, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid spezifisch reagieren, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immunogen sind oder durch Koppelung an geeignete Träger, wie z. B. bovines Serumalbumin, immunogen gemacht bzw. in ihrer Immunogenität gesteigert werden können.

Die Antikörper sind entweder polyklonal oder monoklonal. Die Herstellung, die auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellt, erfolgt beispielsweise nach allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder den genannten Teilen davon, gegebenenfalls in Anwesenheit von z. B. Freund's Adjuvant und/oder Aluminiumhydroxidgelen (s. z. B. Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z. B. über Säulenchromatographie reinigen. Bevorzugt wird eine Affinitätsreinigung der Antikörper, bei der beispielsweise das C-terminale DAN-Fragment an eine NHS- aktivierte HiTrap-Säule gekoppelt wurde.

Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293) hergestellt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und/oder zur Beeinflussung des Zellmetabolismus, insbesondere bei der Immunsuppression, vor allem bei Transplantationen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, beispielsweise eine sogenannten Antisense- Nukleinsäure, oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit pharmazeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfsstoffen formuliert wird.

Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel geeignet, das die erfindungsgemäße Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen komplexierter Form enthält.

Als geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe eignen sich z. B. eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren etc.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Diagnostikum enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder erfindungsgemäße Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe und ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und/oder zur Analyse des Zellmetabolismus, insbesondere des Immunstatus, vor allem bei Transplantationen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder erfindungsgemäße Antikörper mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen versetzt werden.

Beispielsweise können gemäß der vorliegenden Erfindung anhand der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ein Diagnostikum auf der Basis der Polymerasekettenreaktion (PCR-Diagnostik, z. B. gemäß EP-0200362) oder eines Northern Blots hergestellt werden. Diese Tests beruhen auf der spezifischen Hybridisierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit dem komplementären Gegenstrang üblicherweise der entsprechenden mRNA. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann hierbei auch modifiziert sein, wie z. B. in EP 0063879 beschrieben. Vorzugsweise wird ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment mittels geeigneter Reagenzien, z. B. radioaktiv mit α-P³²-dATP oder nicht-radioaktiv mit Biotin, nach allgemein bekannten Methoden markiert und mit isolierter RNA, die vorzugsweise an geeignete Membranen aus z. B. Zellulose oder Nylon gebunden wurde, inkubiert. Zudem ist es vorteilhaft, die isolierte RNA vor der Hybridisierung und Bindung an eine Membran der Größe nach, z. B. mittels Agarose- Gelelektrophorese, aufzutrennen. Bei gleicher Menge an untersuchter RNA aus jeder Gewebeprobe kann somit die Menge an mRNA bestimmt werden, die spezifisch durch die Sonde markiert wurde.

Ein weiteres Diagnostikum enthält das erfindungsgemäße Polypeptid bzw. die oben näher beschriebenen immunogenen Teile davon. Das Polypeptid bzw. Teile davon, die vorzugsweise an eine Festphase, z. B. aus Nitrocellulose oder Nylon, gebunden sind, können beispielsweise mit der zu untersuchenden Körperflüssigkeit z. B. Blut, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Autoimmunantikörper reagieren zu können. Der Antikörper-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter Antihuman-IgG- oder Antihuman- IgM-Antikörper nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispielsweise um ein Enzym, wie Peroxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwesenheit und die Menge an anwesenden Autoimmunantikörpern kann somit über die Farbreaktion leicht und schnell nachgewiesen werden.

Ein anderes Diagnostikum enthält die erfindungsgemäßen Antikörper selbst. Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise eine Gewebeprobe des Menschen leicht und schnell dahingehend untersucht werden, ob das betreffende Polypeptid vorhanden ist. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antikörper-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft auch einen Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren, wie z. B. Inhibitoren oder Stimulatoren enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder die erfindungsgemäßen Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

Ein geeigneter Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren ist z. B. das sogenannte "Two-Hybrid System" (Fields, S. & Sternglanz, R. (1994) Trends in Genetics, 10, 286). Bei diesem Test wird eine Zelle, beispielsweise eine Hefezelle, mit einem oder mehreren Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das das erfindungsgemäße Polypeptid und eine DNA- Bindedomäne eines bekannten Proteins, beispielsweise von GaI4 oder LexA aus E. coli, enthält und/oder ein Fusionsprotein exprimieren, das ein unbekanntes Polypeptid und eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne, beispielsweise von GaI4, Herpesvirus VP16 oder B42, enthält. Zudem enthält die Zelle ein Reportergen, beispielsweise das LacZ-Gen aus E. coli, "Green Fluorescence Protein" oder die Aminosäure-Biosynthesegene der Hefe His3 oder Leu2, das durch regulatorische Sequenzen, wie z. B. den IexA-Promotor/Operator oder durch eine sogenannte "Upstream Activation Sequence" (UAS) der Hefe kontrolliert wird. Das unbekannte Polypeptid wird beispielsweise durch ein DNA-Fragment kodiert, das aus einer Genbank, beispielsweise aus einer humanen Genbank, stammt. Üblicherweise wird gleich eine cDNA-Genbank mit Hilfe der beschriebenen Expressionsvektoren in Hefe hergestellt, so daß der Test unmittelbar danach durchgeführt werden kann.

Beispielsweise wird in einem Hefe-Expressionsvektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die IexA- DNA-Bindedomäne kloniert, so daß ein Fusionsprotein aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid und der LexA-DNA-Bindedomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. In einem anderen Hefe-Expressionsvektorwerden cDNA-Fragmente aus einer cDNA-Genbank in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die GaI4- Transkriptions-Aktivierungsdomäne kloniert, so daß ein Fusionsprotein aus einem unbekannten Polypeptid und der GaI4-Transkriptions-Aktivierungsdomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. Die mit beiden Expressionsvektoren transformierte Hefe, die beispielsweise Leu2- ist, enthält zusätzlich eine Nukleinsäure, die für Leu2 kodiert, und durch den LexA-Prnmotor/Operator kontrolliert wird. Im Falle einer funktionellen Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und dem unbekannten Polypeptid bindet die GaI4- Transkriptions-Aktivierungsdomäne über die LexA-DNA-Bindedomäne an den LexA- Promotor/Operator, wodurch dieser aktiviert und das Leu2-Gen exprimiert wird. Dies hat zur Folge, daß die Leu2-Hefe auf Minimalmedium, das kein Leucin enthält, wachsen kann.

Bei Verwendung des LacZ- bzw. "Green Fluorescence Protein"-Reportergens anstelle eines Aminosäure-Biosynthesegens kann die Aktivierung der Transkription dadurch nachgewiesen werden, daß sich blau- bzw. grün-fluoreszierende Kolonien bilden. Die Blau- bzw. Fluoreszenzfärbung läßt sich aber auch leicht im Spectrophotometer z. B. bei 585 nM im Falle einer Blaufärbung quantifizieren.

Auf diese Weise können Expressionsgenbanken leicht und schnell auf Polypeptide durchsucht werden, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid interagieren. Anschließend können die gefundenen neuen Polypeptide isoliert und weiter charakterisiert werden.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des "Two-Hybrid-Systems" ist die Beeinflussung der Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem bekannten oder unbekannten Polypeptid durch weitere Substanzen, wie z. B. chemische Verbindungen. Auf diese Weise lassen sich auch leicht neue wertvolle chemisch synthetisierbare Wirkstoffe auffinden, die als Therapeutikum eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht nur auf ein Verfahren zum Auffinden von polypeptidartigen Interaktoren bestimmt, sondern erstreckt sich auch auf ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die mit dem oben beschriebenen Protein-Protein-Komplex interagieren können. Derartige peptidartige, wie auch chemische Interaktoren werden daher im Sinne der vorliegenden Erfindung als funktionelle Interaktoren bezeichnet, die eine inhibierende oder eine stimulierende Wirkung haben können.

Im folgenden werden Experimente erläutert, die das erfindungsgemäße Polypeptid - Snurportin 1 - näher charakterisieren.

Reinigung des erfindungsgemäßen Polypeptids, ein 45 kD m₃G-Cap-bindenden Proteins, genannt Snurportin 1 und Nachweis seiner Aktivität.

Für die Reinigung des Proteins wurde ein zytosolischer S100 Extrakt aus HeLa- Zellen zunächst über eine CM-Sepharose-Säule gereinigt und der Snurportin 1 enthaltende Durchlauf mittels einer Q-Sepharose Chromatographie aufgetrennt. Die Snurportin 1 enthaltenden Fraktionen (getestet durch den UV-Crosslinking Assay) wurden anschließend auf eine m₃G-Cap Affinitätssäule geladen. Hiefür wurde biotinyliertes m₃G-Cap-Oligo (m₃GpppAmpUmpA-/CH₂)6-Biotin) an eine Streptavidin- Agarose-Säule gebunden. Die gebundenen Proteine wurden mit steigenden NaCl- Konzentrationen von der Säule eluiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Ein sauberes Protein, das erfindungsgemäße Polypeptid, mit einem apparenten Molekulargewicht von 45 kD wurde mit einer Salzkonzentration von 0,6 bis 1 M NaCl von der Säule eluiert (Fig. 4A, Spuren 9-11). Das gereinigte 45 kD Protein konnte effizient mit radioaktiv markiertem m₃G-Cap-Oligo mit Hilfe von UV-Licht quervernetzt werden (Fig. 4B). Diese Experimente zeigen, daß das erfindungsgemäße Polypeptid, das aus HeLa S100 Extrakten gereinigt wurde, notwendig und ausreichend für die Formierung des 45 kD UV cross-link ist. Dies bedeutet, daß das 45 kD Protein die m₃G-Cap bindende Aktivität trägt.

Snurportin 1 enthält eine IBB Domäne, aber verfügt nicht über die bekannte armadillo-Wiederholungen.

Um das Protein zu klonieren, wurden durch Microsequenzierung Petidsequenzen von dem gereinigten Protein generiert. Alle fünf generierten Peptidsequenzen konnten in der Gen Bank in einem EST (expressed sequence tag) gefunden werden (Fig. 5A). Diese Snurportin 1 codierende cDNA kodiert für 360 Aminosäuren (AS) mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 45 kD (Fig. 3A). Eine Datenbanksuche mit dem humanen Snurportin 1 zeigte überraschenderweise eine hohe Homologie im N-terminalen Bereich (AS 27 bis 65, Fig. 3B) zu der IBB Domäne vom Importin α (31% Identität, 62% Ähnlichkeit mit hSRP1, ähnliche Übereinstimmungen wurden mit hRch1, xImpα und ySRP1 beobachtet, Fig. 3B). Darüber hinaus sind AS-Bereiche in der IBB-Domäne von Snurportin 1 sehr homolog zu IBB Domänensequenzen von anderen Mitgliedern der Importin α Familie (Görlich et al., 1996; supra; Weis et al., 1996; supra hervorgehoben durch schwarze Punkte in Fig. 5B). Im Gegensatz zur ausgedehnten N-terminalen IBB- Domäne ist der C-terminale Teil von Snurportin 1 strukturell unterschiedlich von Importin α (z. B. weniger als 10% Sequenzidentität mit dem C-Terminus von hSRP1). Insbesondere konnte keine signifikante Sequenzhomologie zwischen Snurportin 1 und der "armadillo"-Wiederholungsdomäne von Importin α detektiert werden (Fig. 5B). Dies bedeutet, daß keine evolutionäre Konservierung der C-terminalen Regionen dieser beiden Proteine besteht.

Snurportin 1 weist überraschenderweise eine Gesamtsequenzhomologie mit verschiedenen ORF (open reading frames) von Maus ESTs (z. B. AA571557, mehr als 90% Identität), einem Drosophila EST (AA541081, mehr als 40% Identität) und mit einem C. elegans Protein unbekannter Funktion (ACC AF024493) aufweist. Die Homologie zwischen Snurportin 1 und dem C. elegans Protein ist nicht auf die N- terminale IBB-Domäne begrenzt (43% Identität, 59% Ähnlichkeit; siehe Fig. 5B). Es zeigt sich daher, daß das Protein das funktionelle Homolog zu Snurportin 1 darstellt.

Die Identifizierung des C. elegans Homologs zeigt, daß Snurportin 1 evolutionär konserviert wurde und daher eine essentielle spezifische Funktion als Kernimportrezeptorprotein inne hat.

Snurportin 1 bindet Importin β in vitro in Abhängigkeit von der IBB-Domäne.

Die Anwesenheit einer IBB-Domäne am N-Terminus von Snurportin 1 bewirkt, daß der Kerntransport von m₃G-Cap haltigen Molekülen mediiert wird. Der Nachweis erfolgt mittels einer in-vitro Bindung des erfindungsgemäßen Polypeptids an Importin β.

Histidine-Fusionsproteine von Gesamt-Snurportin oder N-terminalen Deletionsmutanten des erfindungsgemäßen Polypeptids (Δ1-65 Snurportin 1 bewirkt eine fehlende IBB-Domäne gemäß Fig. 3B) und ebenso Gesamt hSRP1α und Xenopus Importin α wurden mit in vitro translatiertem ³⁵S-markiertem Importin β inkubiert. Die Protein-Komplexe wurden anschließend mit Ni-NTA-Agarosebeads präzipitiert und die Bindung von Importin β wurde mittels SDS-PAGE mit anschließender Autoradiographie analysiert. Importin β copräzipitierte mit Gesamt- Snurportin 1, hSRP1α und Importin α, jedoch nicht mit Δ1-65 Snurportin 1 (Fig. 6A, Spuren 1-4). Snurportin 1 bindet Importin β nachweislich in vitro und die N-terminale IBB-Domäne ist für diese Bindung notwendig.

Die C-terminale Domäne von Snurportin 1 besitzt eine m₃G-Cap-bindende Aktivität.

Importin α benötigt seine C-terminale Domäne, um die NLS von karyophilen Proteinen zu binden (Cortes et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7633). Um zu untersuchen, ob die C-terminale Domäne von Snurportin 1 analog in die Bindung des m₃G-Cap-NLS von snRNPs involviert ist, wurden Quervernetzungsstudien mit dem m₃G-Cap-Oligo und Deletionsmutanten von Snurportin 1 durchgeführt. Hierzu konnte gereinigtes rekombinantes Snurportin 1, dem die N-terminalen Aminosäuren 1-65 (einschließlich der IBB-Domäne) fehlen, mit dem radioaktiv markierten m₃G- Cap-Oligo genauso effizient quervernetzt werden, wie das rekombinante Gesamt- Snurportin 1 (Fig. 4B, vergleiche Spuren 6 und 7). Eine Deletion der C-terminalen 32 AS konnte die Quervernetzung nicht unterbinden. Die Deletion von zusätzliche 120 AS vom C-terminalen Ende konnte dagegen die Bindung an das m₃G-Cap-Oligo vollständig unterbinden. Deshalb kann davon ausgegangen werden, daß der mittlere Teil der C-terminalen Region von Snurportin 1 für die Bindung an das m₃G-Cap verantwortlich ist.

Snurportin 1 stimuliert den Kernimport von U snRNP in Xenopus Oozyten in Abhängigkeit der IBB-Domäne

Die Rolle von Snurportin 1 beim Kerntransport von U snRNPs wurde durch Mikroinjection in Xenopus laevis Oozyten untersucht. Zunächst wurde m₃G-Cap modifiziertes HeLa U1 und US snRNA zusammen mit ApppG-Cap modifizierter U6 snRNA in das Zytoplasma von Oozyten mikroinjiziert. Nach einer Stunde erhielten die Oozyten eine zweite Injektion mit gereinigtem Snurportin 1 oder Puffer. Der Kerntransport wurde 3, 5 und 8 Stunden später untersucht (Fig. 5). U6 snRNA wurde als Kontrolle injiziert, da Untersuchungen gezeigt hatten, daß diese RNA über den Weg der karyophilen Proteine in den Kern transportiert wird (vgl. Michaud und Goldfarb (1991), J. Cell. Biol., 112, 215 und (1992), J. Cell. Biol. 116, 851). Die exogene Zugabe von Snurportin 1 stimulierte den Kernimport von U1 und U5 snRNA signifikant um ca. 50-70%, während kein Effekt auf die ApppG-Cap modifizierte U6 snRNA beobachtet werden konnte (Fig. 7A, vergleiche Spuren 4-12 oberer Teil mit den Spuren 13-21 im mittleren Teil und für die Quantifizierung Fig. 7B). Die gleiche Stimulation des Kernimports konnte mit aus HeLa-Zellen affinitätsgereinigtem exogen zugegebenem Snurportin 1 beobachtet werden. Zusammengefaßt zeigen diese Ergebnisse, daß Snurportin 1 ein neuartiger snRNP-spezifischer Kernimportfaktor ist.

Importin α benötigt eine intakte IBB-Domäne für seine Funktion (Görlich et al., 1996; supra, Weis et al., 1996; supra). Um die Rolle der IBB-Domäne von Snurportin 1 beim Kerntransport von snRNPs zu untersuchen, wurde ebenfalls die N-terminale Deletionsmutantate von Snurportin 1 (Δ1-65 Snurportin 1) zusammen mit m₃G-Cap modifiziertem U1 und U5 snRNAs in Oozyten mikroinjiziert. Dieser Mutante fehlt die IBB-Domäne, jedoch verfügt sie noch über die volle m₃G-Cap-Bindungsfähigkeit (siehe Fig. 6B, Spur 7). Δ1-65 Snurportin 1 konnte nicht nur den Kernimport von snRNPs nicht beschleunigen, sondern inhibierte sogar stark den Import der m₃G- Cap-modifizierten U1 und U5 snRNAs (Fig. 7A, Spuren 22-30). Der ungehinderte Transport von ApppG-Cap modifizierter U6 snRNA (Fig. 7A, Spuren 22-30) schließt einen unspezifischen Effekt von Δ1-65 Snurportin 1 auf den Kernimport aus. Dies zeigt, daß der U1 und U5 snRNA-Import aufgrund einer Kompetition zwischen Δ1-65 Snurportin 1 und dem endogenen Xenopus laevis Snurportin 1 für das m₃G- Cap bedingt ist. Diese Ergebnisse begründen die essentielle Rolle der IBB-Domäne für die Funktion von Snurportin 1. Zugleich unterstreicht die Hemmung des Kernimports von U1 und U5 snRNAs durch die Δ1-65 Deletionsmutante von Snurportin 1 die entscheidende Rolle von Snurportin 1 beim m₃G-Cap-abhängigen Kernimport in Xenopus Oozyten.

Snurportin 1 beschleunigt den Kernimport von U1 snRNPs in vitro in Digitonin­ permeabilisierten Zellen stark

Im Rahmen von "Kernimportassays" (siehe Beispiel, "in-vitro Transportsystem" nach Marshallsay und Lührmann (1994), EMBO J., 13, 222) wurden gereinigte HeLa U1 snRNP in Xenopus Oozyten injiziert. Als spezifische Kontrolle für den Kernimport wurde Δ5'U1 snRNP verwendet, bei dem durch DNA Oligonukleotid-induzierte Rnase H-vermittelte Hydrolyse 10 Nukleotide vom 5'-Terminus einschließlich des m₃G-Cap entfernt wurden. Die Proteinanteile beider Formen von U1 snRNPs wurden durch Modifizierung mit dem Fluoreszensfarbstoff Cy3 (im folgenden U1 snRNP* bzw: Δ5'U1 snRNP*) markiert. SDS-PAGE und Glycerin-Gradienten- Zentrifugation bestätigen, daß die snRNP Partikel durch die Markierungsmethode in Ihrer Integrität nicht beeinflußt wurden und der Grad der Markierung bei beiden Formen vergleichbar ist.

Wie in Fig. 8 gezeigt, wird intaktes U1 snRNP* wesentlich effizienter in Anwesenheit von zytosolischem HeLa S100 Extrakt in den Kern transportiert als Δ1-65 U1 snRNP*. In beiden Fällen war der Transport Energie- (Fig. 8, C und D) und Temperatur-abhängig. Diese Ergebnisse stimmen mit der Annahme überein, daß das endogene Snurportin 1 in HeLa-Zellzytosol signifikant zum Kernimport von U1 snRNPs beitragen sollte. Hierzu wurden Kompetitionsstudien mit unmarkierten U1 snRNPs oder m₃GpppG-Cap Dinukleotid durchgeführt. In der Anwesenheit von einem 100-fachen Überschuß an unmarkiertem Δ5'U1 snRNP war der Kernimport von intaktem U1 snRNP* um ca. 35-40% reduziert (vergleiche 8E mit 8A), während der Import von Δ5'U1 snRNP* vollständig inhibiert war (vergleiche 8F mit 8B). Dies bedeutet, daß exogene Δ5'U1 snRNP Partikel einen snRNP-Importrezeptor titrierten der im HeLa-Zellzytosol limitiert vorliegt und unterschiedlich von Snurportin 1 ist (möglicherweise der Sm-Core NLS Bindungsrezeptor).

Da ein signifikanter Anteil der intakten U1 snRNPs weiterhin in der Anwesenheit von kompetitivem Δ5'U1 snRNP importiert wurde, ist der Import dieser Partikel hauptsächlich m₃G-Cap-abhängig. Konsistent mit diesem Experiment konnte der Kernimport von U1 snRNP* durch einen Überschuß von intaktem unmarkiertem U1 snRNP (8G) oder durch die gleichzeitige Gabe von Δ5'U1 snRNP und synthetischem m₃GpppG-Cap Dinukleotid zu ca. 90% inhibiert werden (8H).

Um einen direkten Nachweis zu führen, daß Snurportin 1 für den Kerntransport in somatischen Zellen verantwortlich ist, wurden in Anwesenheit von rekombinantem Snurportin 1 in vitro Importstudien durchgeführt. Die Zugabe von Snurportin 1 zu zytosolischem S100-Extrakt führte zu einem signifikanten Anstieg in der Akkumulation von U1 snRNP* im Kern (bis zu 180% in der Anwesenheit von 100 pM exogenem Snurportin 1; vergleiche 8I mit 8A). Diese Stimulation ist strikt von einem m₃G-Cap abhängig, da Δ5'U1 snRNP* nicht in der Aufnahme in den Kern beschleunigt wird (8K). Darüberhinaus verhinderte die Vorinkubation von Snurportin 1 mit einem Überschuß an m₃GpppG-Cap Dinukleotid die Stimulation des U1 snRNP-Imports durch Snurportin 1. Schließlich benötigt in Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus den Studien mit Xenopus Oozyten (Fig. 5) die Stimulation des Kernimports durch exogenes Snurportin 1 die Anwesenheit seiner N-terminalen IBB- Domäne im Snurportin 1. Die Zugabe von 100 pM des Δ1-65 Snurportin 1 zu zytosolischem S100-Extrakt aus HeLa-Zellen beschleunigte nicht, sondern inhibierte eher den U1 snRNP Import um ca. 30-40% (vergleiche 8L und 8A). Wie erwartet inhibierte Δ1-65 Snurportin 1 nicht den Import von Δ5'U1 snRNP* (vergleiche 8M mit 8K und 8B). Zusammengefaßt belegen diese Daten, daß in HeLa-Zellen zumindest zwei verschiedene Importrezeptoren den Kernimport von U1 snRNP mediieren. Diese sind Snurportin 1 und wahrscheinlich der Sm-Core-NLS Rezeptor. Außerdem trägt Snurportin 1 signifikant zu der Akkumulierung von U1 snRNP im Kern somatischer Zellen bei.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann in allen Zellen verwendet werden, vorzugsweise jedoch in Säugetierzellen und menschlichen Zellen. Prinzipiell ist es ausführbar für alle Moleküle, die eine m₃G-Cap-Struktur enthalten.

In einer besonderen Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid an der beschriebenen IBB-Domäne spezifisch deletiert. Hierzu werden die Aminosäuren 1-65 am erfindungsgemäßen Polypeptid - im folgenden Δ1-65 Snurportin 1 bezeichnet - deletiert.

Dieses Δ1-65 Snurportin 1 kann vorzugsweise unter Verwendung eines beschriebenen gentherapeutischen Vektors nach dem für den Fachmann bekannten Methoden in der Zielzelle, vorzugsweise Säugetierzellen und menschliche Zellen, überexprimiert werden. Dies geschieht zur Verhinderung des Kernimports von m₃G- Cap haltigen Molekülen.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Deletionspolypeptid erfolgt vorzugsweise als rekombinantes Protein unter Verwendung bekannter rekombinanter Methoden, vorzugsweise aus der Nukleinsäure gemäß Fig. 2B.

Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung eine Nuklensäure oder eine funktionelle Variante (wie definiert für Snurportin 1) gemäß Fig. 2B erhältlich aus der Nukleinsäure gemäß Fig. 1B codierend für Δ1-65 Snurportin 1. Die Fig. 2B zeigt die notwendige Sequenz unter Einbringung eines Startcodons ATG nach bekannten rekombinanten Methoden, wodurch sie entsprechend der Lehre zur beschriebenen Nukleinsäure (Fig. 1B) exprimiert und den weiteren beschriebenen Anwendungen, insbesondere als Arzneimittel und Diagnostika, zugänglich ist. Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäure (Fig. 2B) im Rahmen eines gentherapeutischen Vektors zur gewünschten Überexpression des Δ1-65 Snurportin 1 in Zellen.

In Fig. 2B ist die Aminosäuresequenz von Δ1-65 Snurportin 1 gegeben, welches als Expressionsprodukt erhalten werden kann nach den bereits beschriebenen Methoden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Möglichkeit der Erkennung, Identifizierung, Quantifizierung, Isolierung und Reinigung von m₃G-Cap-haltigen Molekülen in Gegenwart von Snurportin 1 oder Δ1-65 Snurportin 1 im Rahmen von in vitro Experimenten.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterungen der Erfindung, ohne dieselbe auf in den Beispielen beschriebenen Produkte und Ausführungsformen einzuschränken.

Beispiele Material und Methoden

Alle Enzyme für DNA-Manipulationen wurden von New England Biolabs gekauft. RNA Polymerase und Rnasin wurden von Promega bezogen. Pfu Polymerase wurde bei Stratagene und RNaseH wurde von Boehringer Mannheim bezogen. Die Cap-Homologe ApppG und m7GpppG wurde bei Pharmacia gekauft. M₃GpppG wurde wie beschrieben synthetisiert und gereinigt (Iwase et al. (1989), Nucleic Acids Res., 17, 8979). Radioaktiv-markierte Triphosphatnukleotide und [³²P]pCp wurden von Amersham bezogen. Sequenzierungen wurden mit einem automatischen Sequenzierer unter Benutzung von Taq-Polymerase und doppelsträngigen Templaten (PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator cycle sequencing kit) von Applied Biosystems durchgeführt.

Präparation von snRNPs und snRNAs

Die Herstellung von Kernextrakten aus HeLa-Zellen (Computer Cell Culture, Mons, Belgium) ist bei Dignam (Dignam et al. (1983), nucleic Acids Res., 11, 1475) beschrieben. Native U1 und U5 snRNPs wurden durch Affinitätschromatographie mit dem monoklonalen Antikörper (mAb) H20, der kovalent an CnBr-aktivierte Sepharose 4B (Bochnig et al. (1987), Eur. J. Biochem, 168, 461) gebunden wurde und durch Chromatographie an MonoQ (Bach et al. (1987), Methods Enzymol., 181, 232) gewonnen. Für Kompetitionsstudien und Verdaus mit Rnase H wurden U1 snRNPs auf 12 µg/ml durch Zentrifugation bei 160 000 × g (2,5 h, 4°C) aufkonzentriert. Um die 5'-Enden von U1 snRNA zu entfernen, wurden U1 snRNPs (60 µg) mkit 10 U RNase H und einem DNA-Oliginukleotid (5'-CAGGTAAGTAT-3', 1,4 µg/µl) in einem Volumen von 50 µl inkubiert (Lamond und Sproat (1994), RNA processing: A Practical Approach, IRL Press, Oxford UK, 103 ff.). Verbleibende m₃G-Cap-tragende U1 snRNPs wurden aus dem Reaktionsansatz durch Immunpräzipitation mit 25 µl H20-mAb an Sepharose beads gekoppelt in einem Endvolumen von 100 µl PBS (pH 8) entfernt. Nach zwei Stunden Inkubation bei 4°C wurden die Proben kurz zentrifugiert und die Δ5'U1 snRNPs im Überstand gewonnen und mittels einer Amicon Ultrafiltrationszelle (Micrcon-100 Konzentrator) auf eine Konzentration von 30 µg/ml eingeengt. Die Reinheit und Intaktheit der Partikel wurde durch SDS-PAGE und Sedimentationsanalyse auf einem Glyceringradienten (5-20%, PBS, pH8) in einem Beckmann TLS-55-Rotor überprüft (Marshallsay und Lührmann, 1994, supra). U1, Δ5'U1 und U5 snRNA wurden isoliert wie bei Sumpter (Sumpter et al. (1992), Mol. Biol. Rep., 16, 229) beschrieben.

UV-Quervernetzungsstudien

Ein m₃G-Cap Oligonukleotid (m₃GpppAmpUmpA), das identisch zum 5'-Ende der HeLa U1 snRNA ist, wurde synthetisiert nach Sekine (Sekine et al. (1994) Nucleic Acids Symp. Ser., 31, 61; Sekine et al. (1996), J. Org. Chem., 61, 4412). Präparative [³²P]pCp Markierung der m₃G-Cap-Oligos (5 µg) wurde wie bei Fischer (Fischer et al. (1993), EMBO J., 12, 573) beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 250 µCi [³²P]pCp verwendet wurden. Nach einer Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation wurden die radioaktiv-markierten m₃G-Cap-Oligos auf einem 20%igen Polyacrylamidgel mit 7,5 M Harnstoff gereinigt. Für die Identifizierung der m₃G-Cap-bindenden Proteine in zytosolischen HeLa-Zellextrakten durch UV- Quervernetzung wurde ein pM [³²P]pCp 3'-Ende-markierte m₃G-Cap-Oligos (2,5 × 106 cpm/pM) für 10 min auf Eis mit entweder 25 µg S100 zytosolischem Extrakt oder 1,5 µg gereinigtem HeLa- oder rekombinantem Snurportin 1 in einem Volumen von 10 µl inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde anschließend bei 254 nm mit einer Sylvania G8T5 UV-Lampe für 5 min in einem Abstand von 2 cm bestrahlt. Die quervernetzten Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

Reinigung des 45 kD m₃G-Cap-bindenden Proteins

HeLa S100 Extrakt, präpariert wie bei Dignam (Dignam et al. (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1475) beschrieben, wurde an einer 240 ml CM-Sepharose-FF-Säule (Pharmacia) vorgereinigt. Hierzu wurden 960 ml des Extrakts (ca. 3,5 mg/ml Protein) über eine in Puffer D (25 mM HEPES-KOH, 100 mM NaCl, 2,5 mM MgCl₂, 0,25 mM EDTA, 8,7% Glycerin, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 0,1 mM Benzamidin, 10 µg/ml Bacitracin, pH 7,9) äquilibrierte Säule (Volumen 240 ml) aufgetrennt. Der Durchlauf, der das 45 kD m₃G-Cap-bindende Protein enthielt, wurde direkt auf eine Q-Sepharose-FF-Säule (Volumen 240 ml, Pharmacia) äquilibriert in Puffer D aufgetragen. Anschließend wurde mit 2 l Puffer D gewaschen und die gebundenen Proteine mit einem linearen NaCl-Gradienten (100-750 mM in Puffer D) über 900 ml eluiert. Aliquots (0,5 ml) wurde für 4 h bei 4°C gegen Puffer D dialysiert und auf eine m₃G-Cap-bindende Aktivität mittels des UV-Quervernetzungsassays analysiert. Die Aktivität eluierte größtenteils zwischen 170 und 280 mM NaCl. Diese Fraktionen wurden vereinigt (210 ml, 627 mg Protein), auf 100 mM NaCl in Puffer D verdünnt (ca. 1,6 mg/ml) und auf eine m₃G-Cap-Affinitätssäule aufgetragen (Herstellung der Säule siehe nächsten Abschnitt). Die Säulenmatrix wurde mit 10 Volumen Puffer D gewaschen und mit einer stufenweise erhöhten Salzkonzentration (je nach 2 ml 0,15; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 1 und 1,5 M NaCl in Puffer D) von der Säule eluiert. Ein 0,5 ml Aliquot jeder Fraktion wurde gegen Puffer D dialysiert und auf eine Konzentration von 30 µg/ml Protein mittels einer Amicon Ultrafiltrationszelle eingeengt. Anschließend wurde mittels des UV-Quervernetzungsassays die m₃G- Cap-bindende Aktivität nachgewiesen. Die Ausbeute betrug insgesamt 0,36 mg Protein, was 0,01% der Ausgangsproteinmenge entsprach

Präparation der m₃G-Cap-Affinitätssäule

Für die Affinitätsreinigung des m₃G-Cap-bindenden Proteins wurde ein biotinyliertes m₃G-Cap-Oligo (m₃GpppAmpUmpAp-(CH₂)6-Biotin) chemisch synthetisiert. Eine ausführliche Beschreibung des Protokolls wird an anderer Stelle publiziert werden (M. Sekine, M. Kadokure und T. Wakada, nicht veröffentlicht). Die Kopplung des biotinylierten m₃G-Cap-Oligos wurde nach Lamond und Sproat (1994, supra) durch­ geführt. 50 nM des biotinylierten m₃G-Cap-Oligos wurde an 1 ml geblockten Streptavidin-Agarose für 18 h bei 4°C in einem gleichen Volumen Bindungspuffer (25 mM Hepes-KOH, 500 mM KCL, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% Glycerin, pH 7,9) gebunden. Vor der Benutzung wurden die Beads mit 5 Volumen Puffer D gewaschen.

Mikrosequenzierung, cDNA-Klonierung und Expression von Snurportin 1

Die Mikrosequenzierung wurde von Toplab (München) durchgeführt. Gereinigtes Snurportin 1 wurde mit Lys-C verdaut, die Peptide mittels HPLC aufgetrennt und die AS-Sequenz verschiedener eluierter Fraktionen mittels eines ABI 477A Proteinsequenziergerätes bestimmt. Die folgenden Peptidsequenzen, die mit drei überlappenden EST der ATCC (GenBank accession Nummern: H43467, H08432, R 14245) wurden charakterisiert: (a) KYSSLEQSERRRRLLELQK, (b) KRLDYVNHARRLAEDD, (c) KRLAIVASRGSTSAYTK, (d) KLPEEEGLGEK, (e) KLTHK. Wie durch DNA-Sequenzierung festgestellt werden konnte, enthielt der Klon R14245 ein 1,6 kb großes Fragment mit einem ORF, der für alle fünf Snurportin 1 Peptidsequenzen kodierte. Für die Expression von His-Tag-Snurportin 1 und von N-terminalen Deletionsmutanten (Δ1-65 Snurportin 1) wurden entweder die komplette Snurportin 1 oder die für die AS 66-360 kodierende Sequenz aus einem pBluescript­ plasmid, das die gesamte Snurportin 1 cDNA enthielt (pBS/spn1), mittels PCR amplifiziert und in die Ncol/BamHl-Restriktionsschnittstellen des Plasmids pET28b (Novagen) umkloniert. Die resultierenden Plasmide (pET28b/spn1 und pET28b/Δ1-65spn1) wurden in den E. coli Bakterienstamm BL21[LysS] transformiert. Die transformierten Stämme wurden bis zu einer OD 600 von 0,8 inkubiert und die Proteinexpression mit Isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranosid für 4 h bei 30°C induziert. Die Zellen aus einer 2 l Kultur wurden mit Ultraschall für 1 min auf Eis in Resuspensionspuffer D (25 mM HEPES-KOH, 100 mM NaCl 2,5 mM MgCl₂, 1 mM PMSF, 0,1 mM Benzamidin, 10 µg/ml Bacitracin, 20 µg/ml Leupeptin, 5 mM Imidazol, 10 mM β Mercaptoethanol, pH 7,9) zur Lyse behandelt. Nach Klärung der Lösung durch Zentrifugation bei 25 000 g für 45 min. und 100 000 × g für 120 min. wurde der Überstand auf eine Nickel-nitrilo-Essigsäure (Ni-NTA) Agarosesäule (Qiagen) aufgetragen. Die gebundenen Proteine wurden mit Resuspensionspuffer, der 200 mM Imidazol und 8,7% Glycerin enthielt, eluiert. Für die weitere Reinigung wurden die Proteine für 2 h bei 4°C gegen Puffer D dialysiert und einer m₃G-Cap- Affinitätschromatographie wie oben beschrieben unterzogen. Die folgenden Primer wurden für die PCR-Amplifikation verwendet: (i) pET28b/spn1-for [5'-GGGCCATGGAAGAGTTGAGTCAGGCCCTG-3']; (ii) pET28b/Δ1-65/spn1-for [GGGCCATGGCTGAAGATGACTGGACAGGGATG-3'], (iii) pET28b/spn1-rev and pET28b/Δ1-65/spn1-rev [TTTGGATCCGCATTCTCCATGAGGCATC CAGGGTG-3'-]. Alle durch PCR erzeugte Konstrukte wurden durch Sequerizierung bestätigt. Die Expression und Reinigung von hSRP1α und Xenopus Importin α wurde bereits beschrieben (Weis et al., 1995; Görlich et al., 1994).

In vitro-Translation und Protein Bindungsassays

Importin β wurde mit Hilfe von Kaninchen Retikulozytenlysat durch in vitro- Translation des Plasmids pKW275 (Weis et al., 1996, supra) unter Benutzung des TnT Kits (Promega) nach Herstellerangaben hergestellt. Die Bindung von Snurportin 1, hSRP1α oder Importin α an Importin β mittels Ni-NTA-Beads wurde exakt wie bei Weis (Weis et al. (1996), supra) beschrieben durchgeführt.

Vorgehen bei der Markierung von RNA und U snRNPs

[³²P] pCp Markierung von Gel-gereinigten HeLa U1 und U5 snRNAs wurde wie bei Fischer (Fischer et al. (1993), EMBO J., 12, 573) beschrieben, durchgeführt. Die in vitro-Transkription der [³²P] pCp-markierten ApppG U6 snRNA wurde nach Fischer (Fischer et al. (1991), J. Cell. Biol. 113, 705) beschrieben durchgeführt.

Für in vitro Kernimportassays wurden die isolierten U1 snRNPs oder Δ5'-U1 snRNPs mit dem monofunktionalen reaktiven Fluoreszensfarbstoff Cy3 nach den Herstellerangaben (Amersham) durchgeführt. Die nicht gebundenen Farbstoffmoleküle wurden mittels Ultrafiltration in einer Amiconzelle und anschließender Dialyse mit PBS (pH 8) entfernt, bis keine Farbstoffmoleküle in den durchlaufenden Fraktionen mehr nachzuweisen waren. Die Sedimentationsanalyse der Fluoreszens-markierten snRNPs wurde wie oben beschrieben durchgeführt.

Oozyteninjektionen

Mikroinjektionen wurden wie bei Fischer (Fischer et al. (1993), supra) beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß OR-2 Puffer anstelle von MBS-Puffer verwendet wurde. Nach der Inkubation bei 18°C für die angegebenen Zeiträume, wurden die Oozyten in J-Puffer (70 mM NH₄Cl, 7 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 20 mM Tris-HCl, 10% Glycerin, pH 7,5) transferriert und manuell getrennt. Die RNA wurde gereinigt und analysiert wie beschrieben (Fischer et al., 1993, supra). Die Gele wurden mittels eines Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA) Phosphorimagersystems mit der Image Quant Software Version 3.0 quantifiziert.

Kernimportassays

Kernimportreaktionen wurden mit HeLa-Zellen durchgeführt, die auf Glasdeckgläschen zu einer Konfluenz von 50-70% in Dulbecco's modified Eagle medium (Gibco-BRL) mit 10% fötalem Kälberserum und Penicillin/Streptomycin (Gibco-BRL) bei 37°C, 5% CO₂ gewachsen waren. Nach der Permeabilistion mit Digitonin (Adams et al. (1990), J. Cell. Biol., 111, 807) wurden die Zellen mit eiskaltem Importpuffer (25 mM Hepes pH 7,9, 100 mM NaCl, 2,5 mM Mg Cl₂, 0,25 mM EDTA) gewaschen und mit 25 µl Importpuffer, der 0,2 mg/ml tRNA, 1 mM ATP, 1 mM Creatinphospat, 20 U/ml Creatin-Phosphokinase (Sigma), 4 µg/ml U1 snRNP* oder Δ5'-U1 snRNP* (markiert wie oben beschrieben) und 10 µl HeLa S100 zytosolischen Extrakt (5 mg/ml Protein) enthielt, inkubiert. Zusätzliche Reagenzien wurden wie in den Legenden der Abbildungen beschrieben zugegeben. Der Import- Mix wurde von ATP depletiert, in dem ATP, Creatinphosphat und Creatinphosphatkinase nicht zugegeben wurde und eine Vorinkubation für 30 min bei 25°C in der Anwesenheit von 20 U/ml Apyrase (Sigma) stattfand. Die Inkubation der Importreaktionen wurde bei 25°C für 30 min durchgeführt und die Reaktion beendet wie bei Marshallsay und Lührmann (1994, supra) beschrieben. Nachdem die Proben mit Fluoprep (bio Merieux) eingedeckt worden waren, wurden sie mit Hilfe des 50 × Objektives eines Leica DM/IRB Invers Fluorezens-Mikroskops analysiert und mit einer CCD-Kamera in digitalisierten Bilder gespeichert. Die Images wurden mit der Software Adobe Photoshop Version 3.0 prozessiert und mit der NIH Image Software Version 1.6 quantifiziert. Für jede Probe wurde die durchschnittliche Fluoreszens von ca. 100 zufällig ausgewählten Kernen aus mindestens drei unabhängige Assays berechnet und gemittelt.

Claims (23)

1. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid ein m₃G-Cap-spezifischer Kernimportrezeptorprotein ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 und 2 erhältlich aus zytoplasmatischen Extrakten von HeLa-Zellen.

4. Polypeptid nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine m₃G-Cap-spezifische Domäne enthält.

5. Antikörper gegen ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 bis 4.

6. Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 bis 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, wobei Fig. 2A Teil des Anspruchs ist.

7. Nukleinsäure erhältlich aus einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 6, kodierend für ein Deletionspolypeptid gemäß Fig. 2B, wobei Fig. 2B Teil des Anspruchs ist.

8. Nukleinsäure nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA ist.

9. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 2B erhältlich aus einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid keine IBB-Domäne enthält.

10. Nukleinsäure nach Anspruch 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen enthält.

11. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor, enthalten ist.

12. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure chemisch synthetisiert oder anhand einer Sonde aus einer Genbank isoliert wird.

13. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 9 immunisiert und gegebenenfalls die entstandenen Antikörper isoliert werden.

14. Arzneimittel enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 und/oder ein Polypeptid gemäß einer der Ansprüchen 1 bis 5 oder 9 und gegebenenfalls pharmazeutisch annehmbare Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

15. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und/oder zur Beein­ flussung des Zellmetabolismus, insbesondere bei der Immunsuppression, vor allem bei Transplantationen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 9 oder Antikörper gemäß Anspruch 5 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfsstoff formuliert wird.

16. Diagnostikum enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 9 oder Antikörper gemäß Anspruch 5 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

17. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und/oder zur Analyse des Zellmetabolismus, insbesondere des Immunstatus, vor allem bei Trans­ plantationen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 9 oder Antikörper gemäß Anspruch 5 pharmazeutisch annehmbaren Träger versetzt wird.

18. Test zur Identifizierung von funktionellen Interaktoren enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 9 oder Antikörper gemäß Anspruch 5 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

19. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 oder eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 9 zur Identifizierung funktioneller Interaktoren.

20. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 zum Auffinden von Varianten eines humanen m₃G-Cap-spezifischen Kernimportrezeptors, dadurch gekennzeichnet, daß eine Genbank mit der genannten Nukleinsäure abgesucht und die gefundene Variante isoliert wird.

21. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 als m₃G- Cap spezifischer Kernimportrezeptor und zum Transport von m₃G Cap enthaltender Moleküle in den Kern.

22. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 9 zur Erkennung und/oder Identifizierung von m₃G-Cap enthaltenden Molekülen.

23. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 9 zur Reinigung und Quantifizierung von m₃G-Cap enthaltenden Molekülen.