DE19831210A1 - Method and device for two-dimensional separation of biomolecules - Google Patents

Method and device for two-dimensional separation of biomolecules

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DE19831210A1
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gel
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separation
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DE1998131210
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Brigitte Wittmann-Liebold
Christian Scheler
Christian Wurzel
Andreas Reuter
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WITA PROTEOMICS AG, 14513 TELTOW, DE
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Wita Wittmann Inst Of Tec GmbH
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    • G01N27/44773—Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis

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Abstract

The present invention relates to a method and to devices for the electrophoresis separation of gel biomolecules into one and two dimensions in an electrophoresis apparatus. This invention can essentially be used for separating proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleic acids or cellular complexes, etc. A first device according to this invention is characterised in that a combined electrophoresis chamber (1) comprises a central portion (2) with cooling members (3). These members are arranged under electrophoresis chambers (6, 7) which are formed on either side of the central portion (2) by a plurality of inner (4) and outer (5) plates interacting with isolation members (9) which can be removed or switched. The cooling members are also arranged under buffer vessels (8, 21). A second combined chamber is also provided for the electrophoresis separation of biomolecules or other mixtures of substances in the form of horizontally superposed gels into one or two dimensions, wherein said chamber comprises a base-wall plate as well as a cover plate. This invention further relates to a method for carrying out the separation into one and into two dimensions, as well as to the formulation of specific gels.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen in Gelen durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur und dient insbesondere der Auftrennung von beispielsweise Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen, Nukleinsäuren oder Zellkomplexen in Gelen (z. B. in Polyacrylamidgelen, Harnstoffgelen oder Agarosegelen) in zwei Dimensionen.The present invention relates to a method and a device for two-dimensional separation of Biomolecules in gels by electrophoresis in one Electrophoresis apparatus and is used in particular Separation of proteins, for example, Glycoproteins, lipoproteins, nucleic acids or Cell complexes in gels (e.g. in polyacrylamide gels, Urea gels or agarose gels) in two dimensions.

Proteine und Peptide sind Biopolymere, die zu Tausenden in jeder Zelle vorkommen; sie sind die unmittelbaren Genprodukte, die alle Zellprozesse katalysieren, stimulieren und regulieren. Ihre Struktur und Funktionsanalyse bildet die Basis für die Aufklärung aller wichtigen Zellvorgänge und ist die Grundlage zum Verständnis von Krankheitsprozessen auf der molekularen Ebene und in der molekularen Medizin, z. B. bei der Tumorentstehung und zur Entwicklung von Frühdiagnostika und neuen Therapeutika in der Pharmaindustrie. Wegen der oft sehr geringen Konzentrationen, in denen die Peptide und Proteine in der Zelle vorkommen, ist es notwendig, hochempfindliche Nachweismethoden und Trenntechniken für ihre Charakterisierung zu entwickeln. Proteins and peptides are biopolymers made up of thousands occur in every cell; they are the immediate ones Gene products that catalyze all cell processes, stimulate and regulate. Your structure and Functional analysis forms the basis for the clarification of all important cell processes and is the basis for Understanding of disease processes on the molecular Level and in molecular medicine, e.g. B. at the Tumor formation and the development of early diagnostics and new therapeutics in the pharmaceutical industry. Because of the often very low concentrations in which the Peptides and proteins occur in the cell, it is necessary, highly sensitive detection methods and Separation techniques for their characterization too develop.  

Proteine sind aus langen Ketten von Aminosäuren aufge­ baut und weisen eine für jedes Protein spezifische räumliche Struktur auf. Jedes Protein hat eine indivi­ duelle Aminosäurefolge, die Primärsequenz, die sich zu einer jeweils spezifischen Raumstruktur (3D-Struktur) auffaltet, die Träger der physiologischen Funktion im Zellgeschehen ist. Proteine nehmen als direkte Genpro­ dukte eine zentrale Stellung bei allen Lebensprozessen ein. Sie katalysieren die biosynthetischen Vorgänge als Enzyme, bauen den Organismus als Strukturproteine auf, bewerkstelligen Stofftransport und Signaltransduktion und spielen eine wesentliche Rolle bei der Translation der Erbinformation (Proteinbiosynthese) und bei allen Regulationsvorgängen. Eine einzelne Zelle enthält über 5000 unterschiedliche Proteine. Biosynthese und Expres­ sion jedes Proteins sind genauestens reguliert. In un­ terschiedlichen Geweben kommen verschiedene Expres­ sionsmuster zustande. Außerdem können posttranslatio­ nale Veränderungen in den Proteinen auftreten, wie z. B. Phosphorylierungen beim Hitzeschockprotein 27, die von physiologischer Bedeutung sind und in der zwei-dimen­ sionalen Elektrophorese ein charakteristisches Muster nach immunchemischer Anfärbung im Western-Blot ergeben. Daher ist es wichtig, die Expression nicht nur auf der Gen- und Botennukleinsäure (mRNA)-Ebene zu studieren, sondern auch die Proteine, ihre Zusammensetzung und Konzentration in den unterschiedlichen Zellen und Gewe­ ben, besonders beim Menschen, genauestens zu kennen. Nach der Totalsequenzierung ganzer Genome, wie z. B. dem aus Hefe oder wie im Humangenomprojekt konzipiert, kommt daher der Erforschung der Proteine und ihren Zellfunktionen eine zentrale Bedeutung zu. Wenn in ei­ nigen Jahren das menschliche Genom mit ca. 100 000 Ge­ nen bekannt sein wird, werden sich die Wissenschaftler mehr und mehr der Erforschung der durch die Gene ko­ dierten Proteine zuwenden müssen, was unter dem Begriff Proteomforschung zusammengefaßt wird. Nur ein Bruchteil dieser wichtigen Biomoleküle ist bisher auf der molekularen Ebene bekannt. Ohne die Strukturinformationen können jedoch die Vorgänge des Zellstoffwechsels und seiner regulatorischen Zusammenhänge nicht verstanden werden. Dies ist besonders bei der Aufklärung der Entstehung von Krankheiten unumgänglich. Viele der über 5000 Zellproteine sind weder in ihrer Struktur noch in ihrer Funktion bekannt. Um ihre biologische Bedeutung und physiologische Rolle zu verstehen, werden in modernen Forschungsprojekten Totalzellextrakte oder die Gesamtproteine aus Einzelzellinien in hochauflösenden zwei-dimensionalen Gelelektrophoresen (2DE) getrennt und sichtbar gemacht. Zellextrakte aus verschiedenen Gewebeproben, z. B. aus Tumorgewebe, können so miteinander und mit gesunden Gewebeproben verglichen und die Proteine durch proteinchemische und massenspektrometrische Analysen identifiziert und charakterisiert werden. Auf diese Weise lassen sich krankheits-assoziierte Proteine nachweisen, die als Marker zur Früherkennung der Krankheiten dienen oder den jeweiligen Grad der Krankheit, z. B. bei der Tumorentstehung, präzise charakterisieren können.Proteins are made up of long chains of amino acids builds and assign a specific to each protein spatial structure. Each protein has an individual duel amino acid sequence, the primary sequence that turns into a specific spatial structure (3D structure) unfolds the carrier of the physiological function in the Is cell happening. Proteins take as a direct gene pro products play a central role in all life processes on. They catalyze the biosynthetic processes as Enzymes, build the organism as structural proteins, accomplish mass transfer and signal transduction and play an essential role in translation genetic information (protein biosynthesis) and in all Regulatory processes. A single cell contains over 5000 different proteins. Biosynthesis and express sion of each protein are precisely regulated. In un Different expressions come from different fabrics pattern. In addition, posttranslatio nale changes in the proteins occur, such as. B. Phosphorylations in heat shock protein 27, which by are physiological meaning and in the two-dimen sional electrophoresis a characteristic pattern after immunochemical staining in a Western blot. Therefore, it is important not only on the expression Study gene and messenger nucleic acid (mRNA) level but also the proteins, their composition and Concentration in the different cells and tissues ben, especially in humans, to know exactly. After total sequencing of entire genomes, e.g. B. the from yeast or as designed in the human genome project, comes from researching proteins and their proteins Cell functions play a central role. If in egg the human genome with approx. 100,000 Ge the scientists will know more and more researching through the genes ko dated proteins must turn what is under the term  Proteome research is summarized. Just a fraction of these important biomolecules is currently on the known at the molecular level. Without that However, structural information can change the operations of the Cell metabolism and its regulatory Relationships are not understood. This is especially in the elucidation of the emergence of Diseases inevitable. Many of the over 5000 Cell proteins are neither in their structure nor in their Function known. To their biological importance and Understand physiological roles in modern Research projects total cell extracts or the Total proteins from single cell lines in high resolution two-dimensional gel electrophoresis (2DE) separately and made visible. Cell extracts from different Tissue samples, e.g. B. from tumor tissue, can compared with each other and with healthy tissue samples and the proteins through protein chemistry and mass spectrometric analyzes identified and be characterized. This way detect disease-associated proteins that act as Serve as markers for the early detection of diseases or the respective degree of the disease, e.g. B. at the Tumor development, can characterize precisely.

Da die Proteine oft nur in kleinsten Mengen exprimiert werden, ist es wichtig, hochsensitive Verfahren zur Trennung und Identifikation zu entwickeln. Um die ehrgeizigen, in die Zukunft weisenden Forschungsprojekte in Zusammenhang mit der Genomfunktionsanalyse bewerkstelligen zu können, sind neue, innovative Trenn- und Analyse-Techniken vonnöten.Because the proteins are often only expressed in very small amounts it is important to use highly sensitive processes for To develop separation and identification. To the ambitious, forward-looking Research projects related to the Genome function analysis are able to accomplish new, innovative separation and analysis techniques are required.

Ein- und zwei-dimensional durchgeführte Gelelektropho­ resen von Proteinen, Nukleinsäuren, oder anderen Biomo­ lekülen sind seit langem in der Biochemie, der pharma­ zeutischen Industrie, Medizinforschung und Laborpraxis eingeführte Techniken, um schnelle Auftrennungen, Ver­ gleiche von Trennmustern oder Qualitätskontrollen von Isolaten und Produkten durchzuführen. Die Elektrophore­ sekammern und ihr Zubehör (Powersupply, Kühlsysteme, Detektoren) sind längst zu unumgänglichem Inventar in jedem naturwissenschaftlichen, pharmazeutisch oder la­ bormedizinisch ausgerichteten Laboratorium geworden.One- and two-dimensional gel electrophoresis resen of proteins, nucleic acids, or other Biomo lekülen have long been in biochemistry, pharma  eutical industry, medical research and laboratory practice techniques introduced to make fast separations, ver same of separation patterns or quality controls of Perform isolates and products. The electrophoresis chambers and their accessories (powersupply, cooling systems, Detectors) have long been inevitable inventory any scientific, pharmaceutical or la laboratory that has been designed for boron medicine.

Für die Trennung von Biomolekülen in einer Trennrichtung (ein-dimensionale Elektrophorese, 1DE) stehen zahlreiche Elektrophoresekammersysteme und Trennmethoden zur Verfügung, die je nach anstehendem Trennproblem auf die speziellen Anwendungen adaptiert sind. Die Trennung einzelner Proben erfolgt zumeist in Kapillarröhrchen oder Gelstreifen und die Trennung multipler Proben wird zumeist in Flachgelen (Slabgelen) durchgeführt, bei denen Auftragstaschen am oberen Ende einer dünnen auspolymerisierten Gelschicht ausgespart sind. Diese Geltaschen werden beim Gießen durch Einbringung von sogn. Kämmen während der Polymerisation vorbereitet. In diese Taschen werden nach Polymerisation des Geles und Entfernung der Kämme die Proben eingebracht. Für Trennungen komplexer Protein- und Peptidmischungen in langen Gelen (< 10 cm) stehen weit weniger Kammersysteme zur Verfügung.For the separation of biomolecules in one Separation direction (one-dimensional electrophoresis, 1DE) there are numerous electrophoresis chamber systems and Separation methods are available, depending on the upcoming Separation problem adapted to the special applications are. Separation of individual samples is usually done in Capillary tubes or gel strips and the separation multiple samples are mostly in flat gels (slab gels) performed with job bags at the top a thin polymerized gel layer are. These gel pockets are made during pouring Introduction of sogn. Combing during the polymerization prepared. In these pockets are after Polymerization of the gel and removal of the combs Samples introduced. For separations of complex protein and Peptide mixtures stand in long gels (<10 cm) far fewer chamber systems available.

Die Auftrennung in zwei verschiedenen Dimensionen (2DE), bei denen unterschiedliche Bedingungen für die Auftrennung in den beiden Dimensionen gewählt werden (z. B. erste Dimension: Trennung nach Ladung, zweite Dimension: Trennung nach Molekülgröße) stehen keine einfach handbaren Komplettsysteme zur Verfügung, die sich zur Vollautomatisierung eignen. Gewöhnlich muß bei diesen Elektrophoresen jede Dimension in einer anderen Kammer durchgeführt und das nach der ersten Dimension gewonnene Trenngel auf das vorbereitete Gel der zweiten Dimension manuell aufgebracht und dort einpolymerisiert werden. Erst dann kann die elektrophoretische Trennung der Probe in der zweiten Dimension erfolgen. Die manuell durchgeführten Teilschritte sind zeitaufwendig, erfordern viel Geschicklichkeit und erlauben eine Perfektion und Reproduzierbarkeit nur bis zu einem gewissen Grad, in Abhängigkeit von der Person, die die Handhabung durchführt.The separation in two different dimensions (2DE), where different conditions for the Separation in the two dimensions can be selected (e.g. first dimension: separation by charge, second Dimension: separation according to molecular size) are not available easy to handle complete systems available that are suitable for full automation. Usually has to these electrophoresis every dimension in a different one Chamber carried out and that after the first dimension  separating gel obtained on the prepared gel of the second Dimension applied manually and polymerized there become. Only then can the electrophoretic separation of the sample in the second dimension. The manual steps are time consuming, require a lot of skill and allow one Perfection and reproducibility only up to one some degree, depending on the person who the Handling.

1DE Trennungen von Proteinen und Peptiden werden zumeist in kleinen Kammern in 5-11 cm langen polymerisierten Polyacrylamidgelen unterschiedlicher Quervernetzung und unterschiedlicher Dicke (z. B. 0.7 bis 1.5 mm) und Breite durchgeführt (in sogn. Slabgele). Hierzu werden auf das in flüssiger Form zwischen zwei Glasplatten gegossene Gel nach Polymerisierung die Proben aufgetragen und in einer Elektrophoreseapparatur für mehrere Stunden bei 500 bis 2000 Volt/20 cm aufgetrennt. Danach wird das Gel entnommen und zur Anfärbung der Substanzen in eine Färbelösung getaucht; danach zur Entfernung des Überschusses an Farbstoff in einer Entfärbelösung entfärbt und dabei werden die Substanzen sichtbar. Sie können durch Photographie oder durch Einscannen im Computer in ihrer Lage auf dem Gel dokumentiert werden, z. B. für Vergleiche mit anderen Proben. Es können zwischen dünnen Glasplatten auch sogn. trägerfreie Elektrophoresen durchgeführt werden, bei denen die zu trennenden Substanzen in einem dünnen Pufferfilm ohne jedweden Träger elektrophoretisch aufgetrennt werden. Für andere Biomoleküle, wie Nukleinsäuren oder hochmolekulare Komplexe werden z. B. auch Agarosegele zur Trennung verwandt. 1DE separations of proteins and peptides mostly in small chambers in 5-11 cm long polymerized polyacrylamide gels of different Cross-linking and different thicknesses (e.g. 0.7 up to 1.5 mm) and width (in sogn. Slabgele). This is done in liquid form poured gel between two glass plates The samples are applied and polymerized in a Electrophoresis apparatus for several hours at 500 to Separated 2000 volts / 20 cm. After that, the gel removed and for coloring the substances in a Dye solution dipped; then to remove the Excess dye in a decolorizing solution decolorized and the substances become visible. she can by photography or by scanning in Computers are documented in their position on the gel e.g. B. for comparisons with other samples. It can also sogn between thin glass plates. strapless Electrophoresis can be performed using the separating substances in a thin buffer film without any support can be separated electrophoretically. For other biomolecules, such as nucleic acids or high molecular complexes are e.g. B. also agarose gels used for separation.  

Alternativ zu den Slabgelen hat sich die Trennung in der ersten Dimension auch in feinen Glaskapillaren (i.D. 0.7 bis 1.5 mm) bewährt, in die die zunächst flüssige Gelmischung zur Polymerisation eingebracht wird und die Substanzmischung danach von oben eingespritzt wird. Die Kapillaren werden zunächst in einem Gelgießständer mit Gel versetzt, dann dort polymerisiert und erst nachdem sie in die Elektrophoresekammer verbracht worden sind, mit der Probensubstanz befüllt.As an alternative to the slabgelen, the separation into the first dimension also in fine glass capillaries (usually 0.7 to 1.5 mm), in which the first liquid gel mixture introduced for polymerization and then the mixture of substances from above is injected. The capillaries are initially in mixed with gel in a gel pouring stand, then there polymerized and only after it in the Electrophoresis chamber have been placed with the Sample substance filled.

Nach der Durchführung der unter Hochspannung aufgetrennten Proben müssen die Gele, die sehr weich und flexibel sind, vorsichtig aus den Kapillaren zur Einbringung in die Färbe-/Entfärbelösung ausgestoßen werden, wobei mechanische Defekte an den Gelen entstehen können. Wegen der schwierigen Handhabung werden zunehmend auch schmale Flachgele (2 × 5-10 cm dünne Streifengele), die als getrocknete Fertiggele kommerziell zur Verfügung stehen, für die 1DE verwandt (z. B. von der Fa. Pharmacia Biotech, Freiburg).After performing the under high voltage separated samples must be the gels that are very soft and are flexible, careful out of the capillaries Introduced into the dye / decolorization solution be mechanical defects on the gels can arise. Because of the difficult handling narrow gels (2 × 5-10 cm thin strip gels), which are used as dried gels are commercially available, related to the 1DE (e.g. from Pharmacia Biotech, Freiburg).

Zur Trennung in der zwei-dimensionalen Technik (2DE) müssen die Gele aus der ersten Dimension (die Gele aus den Kapillaren oder die Gelstreifen) für die Auftren­ nung in der zweiten Dimension durch manuelle Manipula­ tion auf ein entsprechend vorbereitetes Flachgel (Slabgel), das bereits vorpolymerisiert ist, aufgebet­ tet und auf dieses Flachgel aufpolymerisiert werden. Erst danach kann die Trennung in der zweiten Dimension in der entsprechenden Elektrophoresekammer für die 2. Dimension durchgeführt werden. Nach der Trennung er­ folgt die übliche Färbungs- und Entfärbungstechnik und Dokumentation der Ergebnisse. Verschiedene Gele und Puffersysteme für die Durchführung von gelelektrophore­ tischen Proteintrennungen in zwei Dimensionen sind be­ schrieben worden: In der zuerst beschriebenen Version werden z. B. Gemische von ribosomalen Proteinen in Harn­ stoffgelen getrennt, bei denen die pH-Bedingungen in den beiden Dimensionen variiert werden. Verfahren zur Auftrennung von hoch komplexen Proteinmischungen, z. B. aus intakten Zellen, Zellinien oder Geweben nutzen in der ersten Dimension Trennungen auf Grund verschiedener Ladung der Proteine durch Isoelektrofokussierung (IEF) und in der zweiten Dimension Trennungen nach Molekül­ größe in SDS-Natrium-dodecylsulfat-Gelen. Für die Durchführung der Isoelektrofokussierung werden entweder Immobilone oder Ampholine benutzt, die in das Gel ein­ gebracht werden. Mit der letzteren Technik gelingt es mehr als 10 000 Proteine eines Zellysates aufzutrennen; die erstere Technik mit Immobilonen ist für Trennungen von etwa 2000 Proteinen konzipiert. Bei Verwendung von Ampholiengradienten sind Trennungen von mehr als 10 000 Proteinen beschrieben worden (Klose und Kobalz, 1995) Diese hochauflösenden Proteingelelektrophorese-Techni­ ken werden für die moderne Proteomforschung, die Er­ mittlung der exprimierten Proteine einer Zelle und ih­ rer krankhaften Veränderungen, z. B. bei der Untersu­ chung der Tumorentstehung, genutzt. Die Krankheits-as­ soziierten Proteine können nach Auftrennung in der hochauflösenden zwei-dimensionalen Gelelektrophorese mittels proteinchemischer und massenspektrometrischer Verfahren identifiziert werden.For separation in two-dimensional technology (2DE) the gels from the first dimension (the gels from the capillaries or the gel strips) for the appearances manual manipulation in the second dimension tion on a suitably prepared flat gel (Slabgel), which is already prepolymerized, prayed tet and be polymerized onto this flat gel. Only then can the separation in the second dimension in the corresponding electrophoresis chamber for the 2nd Dimension to be performed. After the separation he follows the usual dyeing and decolorization technique and Documentation of the results. Different gels and Buffer systems for the implementation of gel electrophoresis table protein separations in two dimensions are  written: In the version described first z. B. Mixtures of ribosomal proteins in urine gels separated, in which the pH conditions in the two dimensions can be varied. Procedure for Separation of highly complex protein mixtures, e.g. B. from intact cells, cell lines or tissues the first dimension separations due to different Charging the proteins by isoelectrofocusing (IEF) and in the second dimension separations by molecule size in SDS sodium dodecyl sulfate gels. For the Carrying out isoelectrofocusing will either Immobilone or Ampholine used in the gel to be brought. The latter technique works to separate more than 10,000 proteins from a cell lysate; the former technique with immobilons is for separations designed from about 2000 proteins. When using Ampholia gradients are separations of more than 10,000 Proteins have been described (Klose and Kobalz, 1995) This high resolution protein gel electrophoresis techni for modern proteome research, the Er averaging the expressed proteins of a cell and ih rer pathological changes, e.g. B. at the Untersu development of the tumor. The disease as Associated proteins can be separated in the high resolution two-dimensional gel electrophoresis using protein chemical and mass spectrometric Procedures can be identified.

Die US 4,666,581 beschreibt eine Vorrichtung zur zwei­ dimensionalen Elektrophorese, bei welcher jedoch beide Gele nur in räumliche Nähe gebracht werden. Statt manueller Handhabung, die schwierig und fehlerbehaftet ist, wird hier eine Mechanik, ein komplizierter Drehmechanismus, zum Übertragen des Geles von der ersten Dimension zur zweiten Dimension eingesetzt. Die Puffergefäße sind nicht integriert. Der Stromfluß muß auf komplizierte Art und Weise über Filterstreifen sichergestellt werden.US 4,666,581 describes a device for two dimensional electrophoresis, but both Gels should only be brought into close proximity. Instead of manual handling that is difficult and flawed is a mechanic, a complicated one Rotating mechanism for transferring the gel from the first dimension to the second dimension. The Buffer vessels are not integrated. The current must flow  in a complicated way using filter strips be ensured.

Mit der US 4,874,490 wird ebenfalls ein System zur zwei-dimensionalen Elektrophorese beschrieben, wobei das Patent kein vollständig integriertes System offen­ bart und ein Gelgießgestell benötigt. Auch sind die Puffergefäße für die kathodischen und anodischen Puf­ ferlösungen nicht integrale Bestandteile der Kammer. Weiterhin ist in diesem System keine Kühlung inte­ griert. Es erfolgt die Trennung der ersten Dimension horizontal und in der zweiten Dimension vertikal. Die Gele müssen in der beschriebenen Konstruktion zwingend nacheinander in mehreren Schritten gegossen werden. Es muß zuerst die zweite Dimension in einem konventio­ nellen Gießständer außerhalb der Elektrophoresekammer gegossen werden. Nach dem Gießen müssen über das Gel der zweiten Dimension Dicht-/Isolierstreifen durch me­ chanische Manipulation eingefügt werden. Danach erst kann das Gel für die erste Dimension gegossen werden. Anschließend wird der Spacer wieder entfernt. Die Pro­ benaufgabe in größeren Mengen ist ungelöst. Beschrieben ist nur das Tränken einer Membran. Die Aufgabemenge und deren Aufkonzentrierung ist beschränkt.With US 4,874,490 is also a system for described two-dimensional electrophoresis, wherein the patent does not open a fully integrated system beard and a gel pouring rack needed. They are too Buffer vessels for the cathodic and anodic puf Solutions not integral parts of the chamber. Furthermore, no cooling is integrated in this system freezes. The first dimension is separated horizontally and in the second dimension vertically. The Gels must be used in the construction described be poured in succession in several steps. There must first be the second dimension in a convention pouring stand outside the electrophoresis chamber be poured. After pouring you need over the gel the second dimension sealing / insulating strips by me chanic manipulation. After that the gel can be poured for the first dimension. The spacer is then removed again. The pro Task in larger quantities is unsolved. Described is just soaking a membrane. The task quantity and their concentration is limited.

Weiterhin beschreibt die DE 42 44 082 A1 sowie die US 5,407,546 ein Verfahren und eine Vorrichtung zur hochauflösenden zwei-dimensionalen Elektrophorese. Wesentlich hierbei ist die selektive Rehydratisierung. Es wird ausdrücklich ein zusammenhängendes Gel ("Ein- Molekül") verwendet. Als Ausgangsmaterial können nur getrocknete Gele verwendet werden und diese müssen re­ hydratisiert und reäquilibiriert werden. Das geschieht vor und nach der ersten Dimension und gesondert wird das Gel der zweiten Dimension rehydratisiert. Es ist kein vollautomatischer Ablauf möglich, da das Gel der ersten Dimension in ein geheiztes Äquilibratorgefäß transferiert und umgepuffert werden muß. Damit liegt keine vollständige Integration vor.Furthermore, DE 42 44 082 A1 and describes US 5,407,546 a method and an apparatus for high-resolution two-dimensional electrophoresis. Selective rehydration is essential. A coherent gel (" Molecule "). Starting material can only be dried gels are used and these must be re be hydrated and re-equilibrated. This happens before and after the first dimension and separately the second dimension gel rehydrates. It is no fully automatic process possible because the gel of the  first dimension in a heated equilibrator tube must be transferred and rebuffered. With that lies no full integration before.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, mit welchen mit einfachen Mitteln in einer einzigen Apparatur mit selbstgegossenen Gelen und/oder getrockneten Fertig­ gelen effektive Gelelektrophoresen der ersten und zwei­ ten Dimension durchgeführt werden können.The invention is therefore based on the object To create methods and an apparatus with which with simple means in a single apparatus self-cast gels and / or dried ready effective gel electrophoresis of the first and two th dimension can be carried out.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Merkmale im kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1 und 9 im Zusammenwirken mit den Merkmalen im Oberbegriff. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen enthalten.This object is achieved by the Features in the characterizing part of claims 1 and 9 in cooperation with the features in the generic term. Advantageous embodiments of the invention are in the Subclaims included.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß eine Vollautomatisierung der gesamten 2DE einfach durchgeführt werden kann, indem die Gele für die Trennung in der ersten Dimension und die Gele für die Trennung in der zweiten Dimension nacheinander oder gleichzeitig vertikal zueinander angeordnet, als Gießgele oder Fertiggele in eine Elektrophorese- Kombikammer eingebracht und im Falle der gegossenen Gele voneinander isoliert polymerisiert werden, nachfolgend Pufferlösungen eingefüllt, z. B. ein Proteinextrakt auf die Gele der ersten Dimension aufgetragen und die elektrophoretische Auftrennung der ersten Dimension bei konstanter Temperatur oder bei fixiertem Temperaturgradienten mit z. B. ansteigender elektrischer Spannung durchgeführt, anschließend die Pufferlösung abgesaugt, die Isolierung aufgehoben, in die entstehenden Räume zwischen erster und zweiter Dimension Kontaktgel eingefüllt und auspolymerisiert, Pufferlösungen eingefüllt und die elektrophoretische Trennung der zweiten Dimension bei präzise eingestellter Temperatur und konstanter elektrischer Leistung oder steigender Stromstärke durchgeführt wird und abschließend die Gele z. B. mit Färbelösung entwickelt und die Proteine mit herkömmlichen Methoden auf den Gelen sichtbar gemacht werden.A particular advantage of the invention is that full automation of the entire 2DE is easy can be done by using the gels for the Separation in the first dimension and the gels for that Separation in the second dimension one after the other or arranged vertically to each other at the same time as Pouring gels or finished gels into an electrophoresis Combined chamber introduced and in the case of the cast Gels are polymerized isolated from each other, subsequently filled buffer solutions, e.g. B. a Protein extract on the gels of the first dimension applied and the electrophoretic separation of the first dimension at constant temperature or at fixed temperature gradient with z. B. increasing electrical voltage, then the Aspirated buffer solution, the insulation removed, in the emerging spaces between first and second  Dimension contact gel filled and polymerized, Buffer solutions filled and the electrophoretic Separation of the second dimension at precise set temperature and constant electrical Power or increasing current is carried out and finally the gels z. B. with staining solution developed and the proteins using conventional methods visualized on the gels.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die zwei-dimensionale Trennung in der erfindungsgemäßen Elektrophorese-Kombikammer nur mit einer einzigen Vorrichtung bewerkstelligt wird, die für die Durchführung beider Elektrophorese-Dimensionen einge­ richtet ist und die Elektrophorese-Kombikammer einen Kern mit Kühlelementen aufweist, wobei die Kühlelemente beidseitig des Kerns durch aus inneren Platten und äußeren Platten im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen gebildeten Gelkammern und Puffergefäßen angeordnet sind.Another advantage of the invention is that the two-dimensional separation in the invention Electrophoresis combination chamber with only one Device is accomplished for the Implementation of both electrophoresis dimensions is set up and the electrophoresis combination chamber is one Has core with cooling elements, the cooling elements on both sides of the core through from inner plates and outer panels in cooperation with removable or switchable insulating elements formed gel chambers and Buffer vessels are arranged.

Ein zusätzlicher Vorteil der Erfindung besteht darin, daß das Gießen der Gele vor dem Auftrag der Substanzen im neuen Kammersystem in demselben Raum erfolgt, in dem auch die Trennungen selber in den beiden Dimensionen der Elektrophorese durchgeführt werden. Es entfallen daher zwei separate Gelgießständer (jeweils einer für die erste und für die zweite Dimension). Die Gele für die beiden Elektrophorese-Dimensionen werden vor Beginn der Substanztrennung in der Elektrophorese-Kombikammer vorbereitet und stehen beim Start der jeweiligen Elektrophoresen bereit. Alle Manipulationen zum Gießen der Gele werden in einem Arbeitsgang vor Beginn des Probenauftrags gemacht. An additional advantage of the invention is that that pouring the gels before applying the substances in the new chamber system takes place in the same room in which also the separations themselves in the two dimensions electrophoresis. It does not apply therefore two separate gel pouring stands (one for each the first and for the second dimension). The gels for the two electrophoresis dimensions are before the start the separation of substances in the electrophoresis combination chamber prepared and stand at the start of each Electrophoresis ready. All manipulations for casting the gels are removed in one operation before the start of the Trial order made.  

Ebenfalls vorteilhaft ist eine optimale Kühlung, die sowohl in der Elektrophoresekammer (für beide Dimen­ sionen) als auch in den Pufferkammern für beide Dimen­ sionen sichergestellt wird.Optimal cooling is also advantageous both in the electrophoresis chamber (for both dimensions sions) as well as in the buffer chambers for both dimensions sions is ensured.

In bisherigen Techniken werden die Gele und die Puffer­ lösungen der ersten Dimension zumeist gar nicht gekühlt und die bisher realisierten Kühlungen für die 2. Dimen­ sion weisen Mängel auf (Temperaturdifferenzen innerhalb der Gele; ungenügende Kühlung der Puffer).In previous techniques, the gels and the buffers solutions of the first dimension mostly not cooled and the previously implemented cooling for the 2nd dimension sion have defects (temperature differences within the gel; insufficient cooling of the buffers).

Variable Programmierungen des Elektrophoreseablaufes (Stufenprogramme, Gradientenprogramme, Temperaturpro­ gramme etc.) lassen sich ausführen.Variable programming of the electrophoresis process (Step programs, gradient programs, temperature pro grams, etc.) can be carried out.

Die Elektrophorese-Kombikammer läßt sich auch für ein­ dimensionale Trenngele variabler Länge (z. B. 10 bis 30 cm) für die Auftrennung multipler Proben verwenden. Die Trennungen können in der Kombikammer reproduzierbar unter genau festgelegten Standardbedingungen durchge­ führt werden.The electrophoresis combination chamber can also be used for dimensional separating gels of variable length (e.g. 10 to 30 cm) for the separation of multiple samples. The Separations can be reproduced in the combination chamber carried out under precisely defined standard conditions leads.

Ebenso ist es auch möglich, die Elektrophorese-Kombi­ kammern für die Auftrennung mehrerer Proben, z. B. 20 Proben, in einem ein-dimensionalen SDS-Gel zu benutzen, wobei die Proben mit Hilfe eines Auftragskammes auf dem Gel der 2. Dimension aufgebracht werden. Ein entspre­ chender Einsatz mit Probentaschen wird eingebracht, wo sonst das Gel für die 1. Dimension enthalten ist.It is also possible to use the electrophoresis combination chambers for the separation of several samples, e.g. B. 20 Samples to use in a one-dimensional SDS gel, the samples with the help of an application comb on the 2nd dimension gel can be applied. A correspond Appropriate use with sample bags is introduced where otherwise the gel for the 1st dimension is included.

Die erfindungsgemäße Elektrophoresekombikammer enthält vorzugsweise zwei mal zwei Gele, deren Zahl sich belie­ big erweitern läßt. Die Gelpaare für die Trennung in der ersten Dimension werden parallel elektrophoretisch entwickelt und sind zunächst von den Gelen für die Durchführung der zweiten Dimension durch eine nicht­ leitende Isolierung getrennt, die danach beispielsweise mechanisch von außen ohne Aufschrauben der Kammer ent­ fernt und durch ein leitendes Medium ersetzt wird, das die Kontakte zu den Gelen für die Durchführung der zweiten Dimension herbeiführt. Die Gele für die erste und zweite Dimension werden jeweils paarweise nachein­ ander unter verschiedenen Bedingungen entwickelt, ohne daß das Gel von der ersten Dimension auf die zweite me­ chanisch transferiert werden muß. Die Elektrophorese- Kombikammer hat für beide Dimensionen eine integrierte Kühlvorrichtung und integrierte Füll- und Puffergefäße. Der Deckelaufsatz der Elektrophorese-Kombikammer enthält die elektrischen Sicherheitsverbindungen für die Verbindung mit dem Powersupply, die Verbindungen zum Kühlaggregat und alle notwendigen Einfüllstutzen für das Gießen der Gele, für das Eingießen der Elektrolysepuffer und die Einführung der Probe.The electrophoresis combi chamber according to the invention contains preferably two times two gels, the number of which was lets big expand. The gel pairs for the separation in the first dimension become electrophoretic in parallel developed and are initially from the gels for the Implementation of the second dimension by a non conductive insulation separated, for example mechanically from the outside without unscrewing the chamber  distant and is replaced by a conductive medium that the contacts to the gels for carrying out the second dimension. The gels for the first and the second dimension are each in pairs other developed under different conditions without that the gel from the first dimension to the second me has to be transferred in a chinese way. The electrophoresis Kombikammer has an integrated for both dimensions Cooling device and integrated filling and buffer vessels. The lid attachment of the electrophoresis combination chamber contains the electrical safety connections for the connection with the powersupply, the connections to the cooling unit and all necessary filler necks for pouring the gels, for pouring the Electrolysis buffer and the introduction of the sample.

Die erfindungsgemäße 1DE/2DE-Elektrophorese-Kombikammer dient z. B. der Trennung von komplexen Proteinmischungen für die Auftrennung von Proteinen aus Geweben, Zell­ linien oder Mikroorganismen, die mehr als 5000 Proteine enthalten können. In der Elektrophorese-Kombikammer können sowohl analytische als auch präparative Elektro­ phoresen durchgeführt werden, wobei je nach Stoffklasse z. B. isoelektrische Fokussierung und SDS-Elektrophorese oder Trennungen in Agarose, Harnstoff oder anderen Trennmedien Verwendung finden können. Die Kammer ist thermostatisierbar, enthält alle Puffergefäße für die Durchführung der ersten und zweiten Dimension und einen Aufsatz, der es erlaubt die Elektrophoresen unter hohen Spannungen z. B. bis 5000 Volt durchzuführen. Die Elek­ trophorese-Kombikammer dient z. B. der Identifizierung von krankheitsassoziierten Proteinen, zur Entwicklung von Markerproteinen bei der Erstellung von Frühdiagno­ sen von Krankheiten und zur Entwicklung neuartiger Pharmaka. Zellprozesse wie Embryonalentwicklung, Trans­ port- und Signaltransduktionsprozesse und Regulations- und Expressionsmuster können mit Hilfe der Elektropho­ rese-Kombikammer studiert werden. Sie eignet sich zur Auflösung von < 5000 Proteinen und ist damit ein vor­ zügliches Instrument für die Untersuchung in der Pro­ teomforschung, einem neuen Forschungs- und Entwick­ lungsgebiet in der medizinischen und pharmazeutischen Grundlagenforschung und für industrielle Anwendungen, z. B. bei der Untersuchung ganzer Zellinhalte und ihrer Veränderungen oder zur Untersuchung des Einflusses von Pharmaka auf die Zellprozesse.The 1DE / 2DE electrophoresis combination chamber according to the invention serves z. B. the separation of complex protein mixtures for the separation of proteins from tissues, cells lines or microorganisms that contain more than 5000 proteins can contain. In the electrophoresis combination chamber can use both analytical and preparative electro phoresis are carried out, depending on the substance class e.g. B. isoelectric focusing and SDS electrophoresis or separations in agarose, urea or others Separation media can be used. The chamber is thermostattable, contains all buffer vessels for the Implementation of the first and second dimensions and one Essay that allows electrophoresis under high Tensions z. B. up to 5000 volts. The elec trophorese combination chamber is used e.g. B. identification from disease-associated proteins, to development of marker proteins in the preparation of early diagnosis disease and the development of new types Pharmaceuticals. Cell processes such as embryonic development, trans port and signal transduction processes and regulation and  Expression patterns can be measured using the electropho rese combination chamber can be studied. It is suitable for Dissolution of <5000 proteins and is therefore a pre quick tool for investigation in the pro teom research, a new research and development area of application in medical and pharmaceutical Basic research and for industrial applications, e.g. B. when examining entire cell contents and their Changes or to study the influence of Pharmaceuticals on cell processes.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Es zeigen:The invention is based on in the Figures illustrated embodiments closer are explained. Show it:

Fig. 1 eine Explosivdarstellung der wesentlichen Kon­ struktionsteile der Elektrophorese-Kombikammer, Fig. 1 is an exploded view of the essential Kon structural parts of the electrophoresis chamber combination,

Fig. 2 den Aufbau des inneren Kernes, Fig. 2 shows the structure of the inner core,

Fig. 3 den inneren Kern mit angeordneter innerer Platte, Fig. 3 shows the inner core having arranged inner plate,

Fig. 4 die Elektrophorese-Kombikammer mit eingelegten Dichtungen und angeordneten Isolierungen, Fig. 4 shows the electrophoresis chamber combination with inserted gaskets and arranged insulations,

Fig. 5 die Elektrophorese-Kombikammer, einseitig komplett montiert mit Druckrahmen. Fig. 5 shows the electrophoresis combination chamber, completely assembled on one side with a pressure frame.

Die Elektrophorese-Kombikammer 1 zur Trennung von bei­ spielsweise komplexen Proteinmischungen ermöglicht die elektrophoretische Trennung nacheinander in zwei ver­ schiedenen Dimensionen, d. h. unter verschiedenen Bedin­ gungen.The electrophoresis combination chamber 1 for the separation of, for example, complex protein mixtures enables the electrophoretic separation in succession in two different dimensions, ie under different conditions.

Wie in Fig. 1 zu ersehen ist, besteht die Elektropho­ rese-Kombikammer 1 aus mehreren Teilen, die miteinander durch Verschraubung zusammengesetzt werden: den inneren Kern 2 zur effektiven Kühlung, beidseitig damit verbunden die inneren Platten 4 und die äußeren Platten 5, zwischen denen sich beidseitig je ein freier Raum für ein Flachgel (1. und 2. Dimension) befindet. Mit Hilfe einer Dichtung 19 werden diese Platten 4, 5 gegeneinan­ der gedichtet und gleichzeitig die Dicke des Geles festgelegt (z. B. 0.75 mm oder 1.5 mm). Während die in­ nere Platte 4 aus einem gut die Temperatur leitenden Material gefertigt ist (z. B. einer speziellen gut lei­ tenden Keramik, dünner Kunststoff), ist die äußere Platte 5 vorzugsweise aus einem transparenten Material (z. B. Glas), um maximale Durchsicht zu gewähren. Die äußeren Platten 5 werden durch beidseitiges Anschrauben je eines Druckrahmens 13 gehalten; Klammern werden nicht, wie sonst üblich, verwandt. Die untere Begren­ zung der Elektrophorese-Kombikammer 1 ist durch einen justier- und drehbaren Tisch gegeben, auf dem die Elek­ trophorese-Kombikammer 1 mittenfixiert ist. Auf der Elektrophorese-Kombikammer 1 befindet sich ein Aufsatz in Form eines Deckels 14, in den Zulauf 11 und Ablauf 12 für das thermostatisierte Kühlwasser und Einleitun­ gen für die Puffergefäße 8 und 21 der ersten und zwei­ ten Dimension (jeweils für den Anoden- und Kathodenpuf­ fer), für Einfüllstutzen und die Zuführungen der Elek­ troden eingearbeitet sind. Die Einleitungen für die Puffergefäße 8 und 21 dienen zunächst als Einfüllstut­ zen für das Eingießen der Gelflüssigkeiten. Der innere Kern 2 und die Druckrahmen 13 sind z. B. aus Polymerma­ terial (z. B. Acrylglas, Plexiglas) gefertigt und im Druckrahmen 13 sind Fenster in der Größe der Gele aus­ gespart, damit die Gießvorgänge der Gele und die Durch­ führung der Elektrophoresen leicht von außen beobachtet werden können.As can be seen in Fig. 1, the electrophoresis combination chamber 1 consists of several parts which are assembled together by screwing: the inner core 2 for effective cooling, connected on both sides to the inner plates 4 and the outer plates 5 , between them there is free space on both sides for a flat gel (1st and 2nd dimension). With the help of a seal 19 these plates 4 , 5 are sealed against each other and at the same time the thickness of the gel is fixed (e.g. 0.75 mm or 1.5 mm). While the inner plate 4 is made of a material that is a good conductor of temperature (e.g. a special ceramic material with good conductivity, thin plastic), the outer plate 5 is preferably made of a transparent material (e.g. glass) to allow maximum transparency. The outer plates 5 are held by screwing on both sides of a printing frame 13 ; Parentheses are not used as usual. The lower limit of the electrophoresis combination chamber 1 is given by an adjustable and rotatable table on which the electrophoresis combination chamber 1 is fixed in the middle. On the electrophoresis combination chamber 1 there is an attachment in the form of a lid 14 , in the inlet 11 and outlet 12 for the thermostatted cooling water and Einleitun conditions for the buffer vessels 8 and 21 of the first and two-th dimension (each for the anode and cathode puff fer), for filler neck and the leads of the electrodes are incorporated. The introductions for the buffer vessels 8 and 21 initially serve as fillers for pouring the gel liquids. The inner core 2 and the printing frame 13 are, for. B. from Polymerma material (z. B. Acrylic glass, plexiglass) and in the print frame 13 windows in the size of the gels are saved so that the pouring of the gels and the implementation of electrophoresis can be easily observed from the outside.

Der innere Kern 2 (Fig. 2) und die zwei inneren Platten 4 werden vom Hersteller verklebt (Fig. 3). Weiterhin sind Puffergefäße 8 und 21, die teilweise gleichzeitig Füllkammern für die Gele sind, angeordnet. Die inneren Platten 4 schließen das Kühllabyrinth 10 (Kühlmäander) dicht ab, haben aber Öffnungen zu den Puffergefäßen 8 der ersten Dimension (Puffer, 1. Dim.) und Puffergefä­ ßen 21 der zweiten Dimension (Puffer 2. Dim.), wie in Fig. 2 und 3 dargestellt. Die Kühlelemente 3, 10 sind unter den Gelen lokalisiert und kühlen nicht nur die Gele der ersten (Gel 1) und zweiten Dimension (Gel 2), sondern auch die Puffergefäße (Puffer 1. Dim und Puffer 2. Dim.).The inner core 2 ( Fig. 2) and the two inner plates 4 are glued by the manufacturer ( Fig. 3). Furthermore, buffer vessels 8 and 21 , which are partly simultaneously filling chambers for the gels, are arranged. The inner plates 4 close the cooling labyrinth 10 (cooling meander) tightly, but have openings to the buffer vessels 8 of the first dimension (buffer, 1st dimension) and buffer vessels 21 of the second dimension (buffer 2nd dimension), as shown in FIG FIG. 2 and 3. The cooling elements 3 , 10 are located under the gels and not only cool the gels of the first (gel 1) and second dimension (gel 2), but also the buffer vessels (buffer 1st dim. And buffer 2nd dim.).

In der Fig. 3 (Kern komplett verklebt; muß nach den Elektrophoresen nicht demontiert werden) ist rechts oben die Füllkammer 8 für das 1. Dim. Gel mit Füllröhre 17a für Gel 1 und gleichzeitig die Pufferkammer 8 für die erste Dimension (Lauf 1. Dimension) wiedergegeben.In Fig. 3 (core fully bonded, are need not be dismantled after the electrophoresis) is right above the filling chamber 8 for the 1st Dim gel with stuffing tube 17 a for Gel 1, while the buffer chamber 8 (for the first dimension run 1. . Dimension) reproduced.

Außerdem sind links oben die Füllkammer 17b mit Füllrohr für das 2. Dim. Gel und gleichzeitig die Puffergefäße 21 für die 2. Dimension (Lauf 2. Dim.) dargestellt. Die linke Füllkammer 17b endet unten mittig, um ein gleichmäßiges Eingießen der Gelflüssigkeit von unten nach oben zu ermöglichen, wobei eine Entlüftungsöffnung 18 mit einer schräg ausgebildeten oberen Begrenzung für ein gleichmäßiges, langsames und Luftblasen-freies Eingießen sorgt.In addition, the filling chamber 17 b with filling tube for the 2nd dimension gel and at the same time the buffer vessels 21 for the 2nd dimension (barrel 2nd dimension) are shown at the top left. The left filling chamber 17 b ends at the bottom in the middle in order to enable a uniform pouring in of the gel liquid from bottom to top, wherein a vent opening 18 with an obliquely designed upper boundary ensures smooth, slow and air bubble-free pouring.

In einer speziellen Ausführungsform ist die Elektrophorese-Kombikammer 1 oberflächenbeschichtet. Es handelt sich dabei um eine Oberflächenbeschichtung der die Medien Gel, Gellösungen und Pufferlösungen berührenden Teile mit amorphen Kohlenstoffschichten. Vorteile der Beschichtung sind, daß durch niedrige Oberflächenenergie ein Anhaften von Medienbestandteilen verhindert (analog zu Teflon) und somit die Entnahme des Gels nach der Trennung sowie die Reinigung des Gerätes erleichtert wird, die Schicht eine Hartstoffschicht ist und somit eine hohe Kratzfestigkeit aufweist und thermisch stabil ist. Alternativ können diese Oberflächen auch silanisiert werden.In a special embodiment, the electrophoresis combination chamber 1 is surface-coated. It is a surface coating of the parts in contact with the media gel, gel solutions and buffer solutions with amorphous carbon layers. Advantages of the coating are that the low surface energy prevents media components from sticking (analogous to Teflon), making it easier to remove the gel after separation and cleaning the device, the layer is a hard material layer and thus has a high scratch resistance and is thermally stable is. Alternatively, these surfaces can also be silanized.

Zur Durchführung der Elektrophorese werden folgende Arbeitsschritte absolviert:
The following steps are carried out to carry out electrophoresis:

  • 1. Im ersten Arbeitsschritt wird auf den kompletten Kernaufbau eine zweiteilige Dichtung 19 aufgelegt (Fig. 4).1. In the first step, a two-part seal 19 is placed on the complete core structure ( Fig. 4).
  • 2. Dann werden im zweiten Arbeitsschritt Isolier­ schläuche 9 (z. B. 0.75-1.5 mm Rundschläuche oder viereckiges Material, z. B. Silikon), in vorgegebene Vertiefungen eingezogen (Fig. 4). Diese dienen der seitlichen Abgrenzung des 1. Gels von dem 2. Gel und der seitlichen Begrenzung des 2. Gels nach außen.2. Then, in the second step, insulating tubes 9 (for example 0.75-1.5 mm round tubes or square material, for example silicone) are drawn into predetermined recesses ( FIG. 4). These serve to delimit the 1st gel from the 2nd gel and to delimit the 2nd gel from the outside.
  • 3. Als dritter Arbeitsschritt wird die äußere Glasplatte 5 aufgelegt.3. As a third step, the outer glass plate 5 is placed.
  • 4. Im vierten Schritt wird der Druckrahmen 13 aufge­ legt und mit den Schrauben festgespannt (Fig. 5).4. In the fourth step, the printing frame 13 is placed and tightened with the screws ( Fig. 5).
  • 5. Im fünften Schritt wird der bisher entstandene Kör­ per umgedreht und Schritt 1-4 für die Vorbereitung der Parallelgele analog wiederholt.5. In the fifth step, the previously created body by flipped and step 1-4 for preparation the parallel gels are repeated analogously.
  • 6. Im sechsten Schritt werden die zwei Gele in die zwischen den Isolierschläuchen 9 gebildete Gelkam­ mern 6 für die erste Dimension gegossen, danach so­ gleich die zwei Gele in die Gelkammern 7 für die zweite Dimension.6. In the sixth step, the two gels are numbers in the formed between the insulating sleeves 9 Gelkam 6 for the first dimension poured, thereafter the same as the two gels in the gel chambers 7 for the second dimension.
  • 7. Der Deckel 14 wird aufgesetzt und die Polymerisie­ rung wird z. B. über Nacht vorgenommen.7. The lid 14 is put on and the polymerisation is z. B. made overnight.
  • 8. Danach werden die Pufferlösungen eingefüllt und dann kann der Proteinextrakt nach hochtourigem Zen­ trifugieren auf die 1. Dim. Gele aufgetragen wer­ den. 8. The buffer solutions are then filled in and then the protein extract can go after high-speed Zen centrifuge onto the 1st dim. gels applied the.  
  • 9. Dann erfolgt die elektrophoretische Auftrennung in der ersten Dimension.9. The electrophoretic separation then takes place in the first dimension.
  • 10. Danach wird der 1. Dimension-Elektrophoresepuffer abgesaugt und die beiden Isolierschläuche 9, die die 1. Gele von den 2. Gelen trennen, von außen herausgezogen, was sehr leicht vonstatten geht, und die entstehenden freien Kapillaren zwischen den Ge­ len durch Einfüllen von Stackinggelflüssigkeit be­ füllt, so daß nach Polymerisierung dieser Flüssig­ keiten der Kontakt zwischen dem jeweils ersten und zweiten Gel gegeben ist.10. Then the 1st dimension electrophoresis buffer is suctioned off and the two insulating tubes 9 , which separate the 1st gels from the 2nd gels, are pulled out from the outside, which is very easy to do, and the resulting free capillaries between the gels by filling of stacking gel liquid fills, so that after polymerization of these liquids, the contact between the first and second gel is given.
  • 11. Dann wird die Elektrophorese in der zweiten Dimen­ sion durchgeführt.11. Then electrophoresis in the second dimen sion carried out.
  • 12. Nach Durchführung der Elektrophorese in der zweiten Dimension werden die Verschraubungen gelöst, die Gele zusammen mit den äußeren Glasplatten 5 abge­ löst und in ein Färbe- und Entfärbebad gegeben. Da­ nach sind die Gele für die Dokumentation bereit.12. After performing the electrophoresis in the second dimension, the screw connections are loosened, the gels are loosened together with the outer glass plates 5 and placed in a staining and decolorizing bath. Then the gels are ready for documentation.
  • 13. Die Durchführung neuer Gele ist nach Säuberung der Gelplatten und der Füll- und Puffergefäße sofort wieder möglich.13. The implementation of new gels is after cleaning the Gel plates and the filling and buffer vessels immediately possible again.

Durch Montage mehrerer Einheiten können bis zu 10 2DE- Gele in einem Arbeitsgang durchgeführt werden.By assembling several units, up to 10 2DE- Gels can be carried out in one operation.

Beim Gießen der Gele der ersten Dimension werden die Gele als Flachgele in dem durch Füllrohr 17a und Gel­ kammer 6 gebildeten U-Rohr gegossen und polymerisieren dort aus. Dazu wird zuerst ein Stopgel mit hoher Quer­ vernetzung gegossen, das den unteren Bereich des U-Rohrs ausfüllen soll. Die nach Zugabe eines Polymerisa­ tionsstarters noch flüssige Gellösung wird hierfür in das äußere Pufferreservoir der ersten Dimension gege­ ben, wobei das Gel nur den unteren Bereich des U-Rohres ausfüllt. Es reicht etwa 10 mm über das untere Ende der beiden als Isolierschläuche ausgebildeten Isolierele­ mente hinaus.When pouring the gels of the first dimension, the gels are cast as flat gels in the U-tube formed by filling tube 17 a and gel chamber 6 and polymerize there. For this purpose, a stop gel with high cross-linking is first poured, which should fill the lower area of the U-tube. The gel solution, which is still liquid after the addition of a polymerization initiator, is placed in the outer buffer reservoir of the first dimension, the gel filling only the lower area of the U-tube. It extends about 10 mm beyond the lower end of the two insulating elements designed as insulating sleeves.

Nach dem Auspolymerisieren wird das Separationsgel für die erste Dimension gegossen. In diesem Gel wird die Proteintrennung z. B. durch Isoelektrofokussierung durchgeführt. Zum Gießen wird die noch flüssige Separa­ tionsgellösung in das zweite (weiter innen gelegene) Pufferreservoir der ersten Dimension über die Füllkam­ mern 8 eingegossen, bis der Bereich der ersten Dimen­ sion zwischen den beiden Isolierelemente 9 vollständig gefüllt ist. Das Gießen der Gele erfolgt unter konstan­ ter Temperatur, (z. B. bei 20°C, wozu die Kühlung ange­ schaltet ist) bis das Gel auspolymerisiert ist.After the polymerization, the separation gel for the first dimension is poured. In this gel the protein separation z. B. performed by isoelectrofocusing. For casting, the still liquid separation gel solution is poured into the second (further inside) buffer reservoir of the first dimension via the filling chambers 8 until the region of the first dimension between the two insulating elements 9 is completely filled. The gels are poured at constant temperature (e.g. at 20 ° C, for which the cooling is switched on) until the gel has polymerized.

Das Gel der zweiten Dimension wird zwischen den beiden Isolierelementen 9 von unten in die Apparatur eingegos­ sen, indem die Gellösung über das Gießreservoir der zweiten Dimension eingefüllt wird. Die Gellösung fließt von dort über das Füllrohr 17b nach unten und tritt in der Mitte der Gelkammer 7 aus. Die Luft wird durch den Gießvorgang automatisch nach oben verdrängt und kann über die Entlüftungsöffnung entweichen, bis die Gellö­ sung den Bereich der zweiten Dimension vollständig ge­ füllt hat.The gel of the second dimension is poured between the two insulating elements 9 into the apparatus from below, by filling the gel solution through the pouring reservoir of the second dimension. The gel solution flows from there through the filler pipe 17 b downwardly and exits in the middle of the gel compartment. 7 The air is automatically displaced upwards by the pouring process and can escape through the vent until the gel solution has completely filled the area of the second dimension.

Das Gel polymerisiert bei konstanter Temperatur (z. B. durch Kühlung auf 20°C) aus.The gel polymerizes at constant temperature (e.g. by cooling to 20 ° C).

Im folgenden wird die Durchführung der ersten Dimension beschrieben.The following is the implementation of the first dimension described.

Die beiden Pufferreservoire (8) der ersten Dimension werden einmal mit einer alkalischen und einer sauren Pufferlösung gefüllt (z. B. 0,1N NaOH; 7% v/v H3PO4). Die eine Pufferlösung fließt dabei in das U-Rohr bis zum Stopgel hinein, während die andere das Separations­ gel überschichtet. Das Separationsgel wird dann mit ei­ ner Schutzlösung höherer Dichte als der Puffer über­ schichtet (z. B. 6% (w/v) Glycerin, 4 M Harnstoff, 1,5% (w/v) Ampholyte in H2O). Die Proben können durch Unter­ schichten unter die Schutzlösung auf das Separationsgel der 1. Dimension über Einfüllöffnung 20 aufgetragen werden. Die elektrophoretische Trennung erfolgt dann z. B. unter konstanter Temperatur (z. B. Kühlung auf 18°C) mit einem Spannungsgradienten von anfänglich z. B. 100 V bis z. B. 3000 V über mehrerer Stunden. Nach dem Ende der Trennung werden die Pufferlösungen abgesaugt.The two buffer reservoirs ( 8 ) of the first dimension are filled once with an alkaline and an acidic buffer solution (e.g. 0.1N NaOH; 7% v / v H3PO4). One buffer solution flows into the U-tube up to the stop gel, while the other overlays the separation gel. The separation gel is then overlaid with a protective solution of higher density than the buffer (e.g. 6% (w / v) glycerol, 4 M urea, 1.5% (w / v) ampholyte in H2O). The samples can be applied to the separation gel of the 1st dimension via filler opening 20 by sub-layers under the protective solution. The electrophoretic separation then takes place, for. B. under constant temperature (z. B. cooling to 18 ° C) with a voltage gradient of initially z. B. 100 V to z. B. 3000 V over several hours. After the separation has ended, the buffer solutions are suctioned off.

Bei der Durchführung einer 2DE muß die Probe immer auf das Gel der ersten Dimension aufgetragen werden; die aufgetrennten Banden nach der ersten Dimension werden dann in der zweiten Dimension weiter aufgetrennt.When performing a 2DE, the sample must always be open the first dimension gel is applied; the separate bands after the first dimension then further separated in the second dimension.

Vor Beginn der elektrophoretischen Trennung in der zweiten Dimension werden die drei Isolierelemente 9 durch Herausziehen nach außen entfernt. Der Hohlraum zwischen den Gelen der ersten und zweiten Dimension wird mit einem Kontaktgel (z. B. Agarose) gefüllt, das schnell auspolymerisiert. Dann werden die beiden Puf­ fergefäße 21 der zweiten Dimension mit Laufpuffer (z. B. SDS-Laufpuffer: 192 mM Glycin, 25 mM Tris-Base, 5 µM Bromphenolblau in H2O) gefüllt. Die Trennung erfolgt unter Temperierung auf z. B. 15°C, z. B. bei konstanter Leistung oder mit einer Stromstärke von z. B. 40 mA pro Gel in den ersten 20 Minuten und dann mit 75 mA pro Gel. Die Trennung ist mit Erreichen des Markerfarbstof­ fes Bromphenolblau am Ende des Geles beendet. Die Elek­ trophorese-Kombikammer wird auseinandergeschraubt und das Gel zur Entwicklung und Färbung entfernt.Before the start of the electrophoretic separation in the second dimension, the three insulating elements 9 are removed by pulling them outwards. The cavity between the gels of the first and second dimensions is filled with a contact gel (e.g. agarose) that polymerizes quickly. Then the two buffer vessels 21 of the second dimension are filled with running buffer (eg SDS running buffer: 192 mM glycine, 25 mM Tris base, 5 μM bromophenol blue in H2O). The separation takes place with temperature control on z. B. 15 ° C, e.g. B. at constant power or with a current of z. B. 40 mA per gel in the first 20 minutes and then with 75 mA per gel. The separation is ended when the marker dye bromophenol blue is reached at the end of the gel. The electrophoresis combination chamber is unscrewed and the gel is removed for development and staining.

Das Elektrophoresegel wird nun nach Stand der Technik weiterbehandelt und z. B. in eine Wanne mit Fixierlösung gegeben. Durch Silberfärbung können die Proteine in ng- Mengen für analytische Zwecke sichtbar gemacht werden oder mittels z. B. Coomassie Brilliant Blue für mikro­ präparative Zwecke (z. B. anschließender enzymatischer Spaltung und Sequenzierung) behandelt werden. Alterna­ tiv kann das Gel nach Blotten für Immunofärbungen mit entsprechenden Antikörpern entwickelt werden. Diese Schritte sind nicht Bestandteil der Erfindung, aber un­ erläßlich, um die Proteine nach erfolgter Trennung sichtbar zu machen.The electrophoresis gel is now state of the art treated and z. B. in a tub with fixative given. The proteins can be stained in silver by Quantities are made visible for analytical purposes  or by means of z. B. Coomassie Brilliant Blue for micro preparative purposes (e.g. subsequent enzymatic Cleavage and sequencing). Alterna After blotting, the gel can also be used for immunostaining corresponding antibodies are developed. This Steps are not part of the invention, but un indispensable to the proteins after separation make visible.

Die Gele werden im vorliegenden Ausführungsbeispiel als Flachgele (nicht mehr als Rundgele) aber schmaler als in den bisherigen Flachgel-Systemen ausgeführt. Die Breite des Geles kann durch Wahl verschieden breiter Dichtstreifen, Schläuche etc.) variabel gehalten wer­ den, so daß sowohl analytische als auch mikropräpara­ tive Gele gemacht werden können. In den üblichen käuf­ lichen Flachgel-Elektrophorese-Kombikammern werden Fer­ tiggele bestimmter Breiten und Dicken verwandt. Außer­ dem werden bei dem vorliegenden Verfahren Ampholine (lösliche Zwittermoleküle) anstelle von immobilisierten Zwitterionen (Immobilone) benutzt, um den pH-Gradienten im Gel aufzubauen. Prinzipiell ließen sich in der er­ findungsgemäßen Vorrichtung aber auch Immobilone ver­ wenden; jedoch sind die Trenneigenschaften dieser Gele bisher weniger gut als die mit Ampholinen erzeugten.The gels are in the present embodiment as Flat gels (no more than round gels) but narrower than in the previous flat gel systems. The The width of the gel can vary by choice Sealing strips, hoses, etc.) are kept variable the so that both analytical and micro preparation tive gels can be made. In the usual purchase union flat gel electrophoresis chambers are Fer tiggele related widths and thicknesses. Except which become ampholines in the present process (soluble hermaphrodite molecules) instead of immobilized Hermaphrodite ions (Immobilone) used to adjust the pH gradient build up in the gel. In principle, he can inventive device but also Immobilone ver turn; however, the separation properties of these gels are so far less good than those produced with ampholines.

Vorteile der beschriebenen Elektrophorese-Kombikammern sind:
Advantages of the electrophoresis combination chambers described are:

  • - Variable Breiten der Gele;- variable widths of the gels;
  • - längere Trennstrecken, ohne daß die Gele beschädigt werden können;- longer separation distances without damaging the gels can be;
  • - Einsatz variabler Proteinmengen in der gleichen Appa­ ratur;- Use of variable amounts of protein in the same appa ratur;
  • - kein Transfer des Geles von der ersten auf die zweite Dimension nötig;- no transfer of the gel from the first to the second Dimension necessary;
  • - keine Rehydratisierung wie bei Fertiggelen notwendig; - no rehydration necessary as with pre-filled gels;  
  • - bei Verwendung von Fertiggelen keine Anwendung erhöh­ ter Temperatur wie dies bei Rehydratisierungsschrit­ ten angewandt wird;- Do not increase application when using pre-filled gels temperature like this with rehydration step ten is applied;
  • - sowohl Fertiggelstreifen als auch selbst-gegossene Gele können verwendet werden.- Both ready-made gel strips and self-cast Gels can be used.
  • - präzise Fixierung des Geles relativ zur 2. Dimension;- precise fixation of the gel relative to the 2nd dimension;
  • - Pufferreservoire mit im Kammersystem eingebunden;- Buffer reservoirs integrated in the chamber system;
  • - Kühlung beider Gele routinemäßig durchführbar;Cooling of both gels can be carried out routinely;
  • - die Kühlung ermöglicht identische Temperaturprofile für beide Parallelgele durch mäanderförmige Zwangs­ führung des Kühlmediums; keine unterschiedlichen Strömungsverhältnisse;- The cooling enables identical temperature profiles for both parallel gels due to meandering constraints management of the cooling medium; no different Flow conditions;
  • - Kühlung aller Puffergefäße (für die 1. und 2. Dim);- Cooling of all buffer vessels (for the 1st and 2nd dim);
  • - Einführung des sog. Stoppgels (dient zur mechanischen nicht aber elektrischen Abtrennung des Geles der er­ sten Dimension zu einem dazugehörigen Puffergefäß);- Introduction of the so-called stop gel (used for mechanical but not electrical separation of the gel he most dimension to an associated buffer vessel);
  • - gleichzeitiges Gießen beider Dimensionen möglich; da­ her Zeitersparnis, da die Gele vor Gebrauch erst po­ lymerisieren müssen; d. h. beide Gele können gleich­ zeitig auspolymerisieren (z. B. über Nacht) und sind dann frühmorgens gebrauchsfertig;- simultaneous casting of both dimensions possible; there saves time since the gels only po before use have to lymerize; d. H. both gels can be the same polymerize early (e.g. overnight) and are then ready for use early in the morning;
  • - die Trennung erfolgt horizontal, nicht vertikal, ohne daß Kippvorgänge notwendig sind. Die Stellung der Kammer ändert sich nicht während des Gelgießens und bei der Elektrophorese. Die Apparatur steht nach der Montage aufrecht, d. h. platzsparend.- The separation is horizontal, not vertical, without that tipping is necessary. The position of the Chamber does not change during gel pouring and in electrophoresis. The apparatus is after the Assembly upright, d. H. space-saving.

Nach Durchführung der ersten Dimension ist neu, daß die Isolierschläuche 9 oder Isolierstreifen 9 ohne Öffnen der Kammer nach der ersten Dimension entfernt werden. Volle Automatisierung ist möglich bei Einsatz eines Schrittmotors zum Entfernen der Isolierelemente 9. Neu ist ebenfalls die Einführung einer leitenden Kon­ taktflüssigkeit (z. B. auf Agarose-Basis) in den entste­ henden Hohlraum zwischen dem Gel der 1. und der 2 Dim., damit der elektrische Übergang zur 2. Dimension gewähr­ leistet ist ohne daß eine Umpufferung notwendig wird. Die Umpufferung kann aber durchaus stattfinden, indem der entstehende Zwischenraum nach Entfernen der Iso­ lierschläuche 9 mit Pufferlösung gespült wird.After the first dimension has been carried out, it is new that the insulating tubes 9 or insulating strips 9 are removed after the first dimension without opening the chamber. Full automation is possible when using a stepper motor to remove the insulating elements 9 . Also new is the introduction of a conductive contact liquid (e.g. based on agarose) into the resulting cavity between the gel of the 1st and 2nd dimensions, so that the electrical transition to the 2nd dimension is guaranteed without one Buffering becomes necessary. The buffering can take place by rinsing the resulting space after removing the Iso lierschläuche 9 with buffer solution.

In der zweiten Dimension ist neu, daß das Füllen der Gellösung für die zweite Dimension von unten bei auf­ rechter Stellung der Elektrophorese-Kombikammer er­ folgt. Die Lösung wird automatisch langsam eingefüllt (wegen des Durchmessers der Füllkammer), so daß jegli­ che Blasenbildung vermieden wird, womit man sonst bei den meisten Kammern zu kämpfen hat.What is new in the second dimension is that the filling of the Gel solution for the second dimension from below on right position of the electrophoresis combination chamber follows. The solution is automatically filled in slowly (because of the diameter of the filling chamber), so that any che blistering is avoided, with which one would otherwise struggles with most chambers.

Neu ist ebenfalls die nach oben angeschrägte Entlüf­ tungsöffnung 18 der 2. Dim., so daß alle Luft entwei­ chen kann.Also new is the upward sloping vent 18 of the 2nd dim., So that all air can escape.

Dies ist möglich, weil das Gel in der Gelkammer 7 zwar vertikal steht, aber die Proteine horizontal (von rechts nach links oder von links nach rechts, je nach Wahl der Elektrodenanschlüsse) getrennt werden.This is possible because the gel in the gel chamber 7 is vertical, but the proteins are separated horizontally (from right to left or from left to right, depending on the choice of electrode connections).

Es können in dem System auch sog. Fertiggele, d. h. de­ hydratisierte Gele in der Elektrophorese-Kombikammer verwendet werden.So-called pre-gels, i.e. H. de hydrated gels in the electrophoresis combination chamber be used.

Dabei ist auf einer Trägerfolie ein streifenförmiges Gel (1. Dimension) aufgebracht. Neben diesem Streifen ist ein flächiges Gel (2. Dimension) in einem gewissen Abstand aufgebracht.There is a strip-shaped on a carrier film Gel (1st dimension) applied. In addition to this strip is a flat gel (2nd dimension) in a certain Distance applied.

Die Gele auf der Trägerfolie werden auf Platte 4 über den Kühlelementen 3 gelegt.The gels on the carrier film are placed on plate 4 above the cooling elements 3 .

Anschließend wird die äußere Dichtung 19 sowie die Iso­ lierelemente 9 (je eine links und rechts vom Gel der ersten Dimension) eingesetzt.Then the outer seal 19 and the insulating elements 9 (one on the left and one on the right of the gel of the first dimension) are used.

Die Glasplatte 5 wird aufgelegt und der Druckrahmen 13 befestigt.The glass plate 5 is placed on and the printing frame 13 is attached.

Rehydratisierungslösungen für beide Gele werden in die Puffergefäße 8 und 21 eingefüllt. Rehydration solutions for both gels are filled into the buffer vessels 8 and 21 .

Die Gele werden rehydratisiert.The gels are rehydrated.

Die integrierten Puffergefäße der ersten Dimension wer­ den mit Pufferlösung gefüllt und der Strom eingeschal­ tet.The integrated buffer vessels of the first dimension filled with buffer solution and the power was switched on tet.

Nach Beendigung der Auftrennung werden die Puffer und dann die Isolierelemente 9 entfernt.After the separation, the buffers and then the insulating elements 9 are removed.

Umpufferungslösung kann durchgepumpt werden.The buffer solution can be pumped through.

Die Pufferlösung für die zweite Dimension wird einge­ füllt.The buffer solution for the second dimension is inserted fills.

Die zweite Auftrennung wird gestartet.The second separation is started.

Eine alternative Konstruktion ist die Verwendung von dünnwandigen, hochelastischen Schläuchen als Isoliere­ lemente 9. Die Abtrennung des freibleibenden Raumes zur Aufnahme des Geles der ersten Dimension wird entweder durch einen Schlauch, der u-förmig (eventuell in einer vorgesehenen Rille in einer der Platten) eingelegt ist, realisiert oder durch zwei Schläuche, die jeweils an einem Ende verschlossen sind. Die Abdichtung erfolgt dadurch, daß der Schlauch mit einem Fluid (Flüssigkeit oder Gas) gefüllt wird. Durch ausreichenden Innendruck erfolgt die Abdichtung gegen die inneren und äußeren Platten 4 und 5. Nach dem Gießen des Stopgeles kann das Gel der ersten Dimension gegossen werden. Die Begren­ zung des Geles der zweiten Dimension erfolgt analog mit einem u-förmigen Schlauch oder einem am Ende verschlos­ senen Schlauch. Nach der Trennung der ersten Dimension wird der Schlauch evakuiert aber nicht aus dem System entfernt. In den entstehenden Raum zwischen erster und zweiter Dimension wird Agarosegelpufferlösung zur Her­ stellung einer elektrisch leitenden Verbindung zwischen den Gelen eingefüllt. Die anderen Abläufe erfolgen wie oben beschrieben.An alternative construction is the use of thin-walled, highly elastic hoses as insulating elements 9 . The free space for receiving the gel of the first dimension is separated either by a tube which is inserted in a U-shape (possibly in a groove provided in one of the plates) or by two tubes which are each closed at one end. The seal is made by filling the hose with a fluid (liquid or gas). Adequate internal pressure seals against the inner and outer plates 4 and 5 . After pouring the stop gel, the gel of the first dimension can be poured. Limitation of the gel of the second dimension is carried out analogously with a U-shaped tube or a tube which is closed at the end. After the first dimension has been separated, the hose is evacuated but not removed from the system. In the resulting space between the first and second dimensions, agarose gel buffer solution is filled to produce an electrically conductive connection between the gels. The other processes are as described above.

Eine vorteilhafte Ausbildung besteht darin, daß dieser Schlauch mit einem adhäsiv nur auf einer der Platten 4 oder 5 fixiert ist oder auf einer der Platten 4 oder 5 festsitzend in einer Nut geführt ist, so daß sicherge­ stellt wird, daß sich der Schlauch nach der Evakuierung nur auf einer Platte 4 oder 5 befindet.An advantageous embodiment consists in that this tube is fixed with an adhesive only on one of the panels 4 or 5 or on one of the plates 4 or 5 is guided tightly in a groove, so that sicherge assumed that the tube after the evacuation located only on a plate 4 or 5 .

Eine Variante dieser Konstruktion bzw. der Methode ist es, den Schlauch nach abgelaufener Trennung der ersten Dimension zu entfernen. Durch das Evakuieren wird die Entfernung wesentlich vereinfacht.A variant of this construction or method is it, the hose after separation of the first one has expired Remove dimension. By evacuating the Removal much easier.

Die Erfindung ist nicht beschränkt auf die hier darge­ stellten Ausführungsbeispiele. Vielmehr ist es möglich, durch Kombination und Modifikation der genannten Mittel und Merkmale weitere Ausführungsvarianten zu realisie­ ren, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. The invention is not limited to the Darge here presented embodiments. Rather, it is possible by combining and modifying the means mentioned and features to realize other design variants ren without departing from the scope of the invention.  

BezugszeichenlisteReference list

11

Elektrophorese-Kombikammer
Electrophoresis combination chamber

22nd

Kern
core

33rd

Kühlelemente
Cooling elements

44th

innere Platte
inner plate

55

äußere Platte
outer plate

66

Gelkammer
Gel chamber

77

Gelkammer
Gel chamber

88th

Puffergefäße und Füllkammer für die 2. Dimension samt Einlässen
Buffer vessels and filling chamber for the 2nd dimension including inlets

99

Isolierelemente
Insulating elements

1010th

Kühllabyrinth
Cooling labyrinth

1111

Zulauf Kühlflüssigkeit
Coolant inlet

1212th

Ablauf Kühlflüssigkeit
Coolant drain

1313

Druckrahmen
Print frame

1414

Deckel
cover

1515

Spannelemente
Clamping elements

1616

Sichtfenster
Viewing window

1717th

a Füllkammern für die 1. Dimension
a Filling chambers for the 1st dimension

1717th

b Füllkammer mit Einlaß für die 2. Dimension
b Filling chamber with inlet for the 2nd dimension

1818th

Entlüftungsöffnungen
Vents

1919th

Flächendichtung
Surface seal

2020th

Einfüllöffnung für Probe und 1. Dim. Gel
Filling opening for sample and 1st dim. Gel

2121

Puffergefäße samt Einlässe für 2. Dimension
Buffer vessels with inlets for 2nd dimension

Claims (24)

1. Verfahren zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Stoffgemischen in Gelen, Polymerträgern oder für die ein-dimensionale trägerfreie Trennung durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur dadurch gekennzeichnet, daß
  • - die Gele für die Trennung in der ersten Dimension und die Gele für die Trennung in der zweiten Dimension nacheinander oder gleichzeitig vertikal zueinander angeordnet als Gießgele oder Fertiggele in eine Elektrophorese-Kombikammer eingebracht und voneinander isoliert polymerisiert bzw. rehydratisiert werden,
  • - nachfolgend Pufferlösungen eingefüllt, ein Biomolekülgemisch auf die Gele der ersten Dimension aufgetragen und die elektrophoretische Auftrennung der ersten Dimension bei konstanter Temperatur oder bei fixiertem Temperaturgradienten durchgeführt,
  • - anschließend die Pufferlösung abgesaugt, die Isolierung aufgehoben, in die entstehenden Räume zwischen erster und zweiter Dimension Kontaktgel eingefüllt und auspolymerisiert, Pufferlösungen eingefüllt und die elektrophoretische Trennung der zweiten Dimension bei präzise eingestellter Temperatur und konstanter elektrischer Leistung oder steigender Stromstärke durchgeführt wird und
  • - abschließend die Gele entwickelt und die Proteine mit herkömmlichen Methoden sichtbar gemacht werden.
1. A method for the two-dimensional separation of biomolecules or other substance mixtures in gels, polymer carriers or for the one-dimensional carrier-free separation by electrophoresis in an electrophoresis apparatus, characterized in that
  • the gels for the separation in the first dimension and the gels for the separation in the second dimension are placed one after the other or at the same time vertically to one another as pouring gels or ready-to-use gels in an electrophoresis combination chamber and polymerized or rehydrated in isolation from one another,
  • - subsequently filled in buffer solutions, a biomolecule mixture is applied to the gels of the first dimension and the electrophoretic separation of the first dimension is carried out at constant temperature or with a fixed temperature gradient,
  • - Then the buffer solution is suctioned off, the insulation is removed, contact gel is filled in and polymerized in the spaces formed between the first and second dimensions, buffer solutions are filled in and the electrophoretic separation of the second dimension is carried out at a precisely set temperature and constant electrical power or increasing current and
  • - Finally, the gels are developed and the proteins are made visible using conventional methods.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Trennung die Gele in der Elektrophorese- Kombikammer vertikal stehen und die Trennung der Proteine in der ersten Dimension vertikal und in der zweiten Dimension horizontal erfolgt.2. The method according to claim 1, characterized in that  to separate the gels in electrophoresis Combination chamber stand vertically and the separation of the Proteins in the first dimension vertically and in the second dimension is horizontal. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele der ersten Dimension als Flachgele in einem U-förmigen Rohr gegossen werden, wobei zuerst ein Stoppgel und nachfolgend das Separationsgel gegossen wird und sowohl Gießvorgänge als auch Polymerisationsvorgänge bei konstanter Temperatur mit aktivierter Kühlung erfolgen.3. The method according to claim 1, characterized in that the gels of the first dimension as flat gels in be poured into a U-shaped tube, being first a stop gel and then the separation gel is poured and both casting processes as well Polymerization processes at constant temperature with activated cooling. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele der zweiten Dimension in zwei Schritten gegossen werden derart, daß in einem ersten Schritt ein Dichtgel und nach dessen Polymerisation in einem zweiten Schritt die Gellösung von unten aufsteigend gegossen wird derart, daß die Luft nach oben verdrängt und das Gel anschließend bei konstanter Temperatur mit aktivierter Kühlung polymerisiert wird.4. The method according to claim 1, characterized in that the second dimension gels in two steps be poured in such a way that in a first step a sealing gel and after its polymerization in a second step, the gel solution from below is poured in such a way that the air after displaced at the top and then the gel constant temperature with activated cooling is polymerized. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Breite und die Dicke der Gele variierbar ist. 5. The method according to claim 1, characterized in that the width and the thickness of the gels can be varied.   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufhebung der Isolierungen durch körperliches Entfernen von Dichtungen oder Schalten mittels Volumen- bzw. Durchmesserverringerungen von Dich­ tungsschläuchen realisiert wird.6. The method according to claim 1, characterized in that the removal of the insulation by physical Remove seals or switch using Volume or diameter reduction from you hoses is realized. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ablauf der zweidimensionalen Elektrophorese automatisiert durchgeführt wird.7. The method according to claim 1, characterized in that the course of two-dimensional electrophoresis is carried out automatically. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele und die Pufferlösungen von der gleichen Kühlung temperiert werden.8. The method according to claim 1, characterized in that the gels and the buffer solutions of the same Cooling can be tempered. 9. Vorrichtung zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen in Gelen durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur, dadurch gekennzeichnet, daß eine Elektrophorese-Kombikammer (1) einen Kern (2) mit Kühlelementen (3) aufweist, wobei die Kühlelemente (3) zwischen den beidseitig des Kerns (2) durch innere Platten (4) und äußere Platten (5) im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen (9) gebildeten Gelkammern (6, 7) und Puffergefäßen (8) angeordnet sind. 9. Device for the two-dimensional separation of biomolecules in gels by electrophoresis in an electrophoresis apparatus, characterized in that an electrophoresis combination chamber ( 1 ) has a core ( 2 ) with cooling elements ( 3 ), the cooling elements ( 3 ) between the two sides of the core ( 2 ) by inner plates ( 4 ) and outer plates ( 5 ) in cooperation with removable or switchable insulating elements ( 9 ) formed gel chambers ( 6 , 7 ) and buffer vessels ( 8 ) are arranged. 10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Kühlelemente (3) durch ein mäanderförmiges Kühllabyrinth (10) mit Zulauf (11) und Ablauf (12) gebildet sind.10. The device according to claim 9, characterized in that the cooling elements ( 3 ) by a meandering cooling labyrinth ( 10 ) with inlet ( 11 ) and outlet ( 12 ) are formed. 11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Kühllabyrinth (10) die Puffergefäße (8) und (21) umschließt.11. The device according to claim 10, characterized in that the cooling labyrinth ( 10 ) encloses the buffer vessels ( 8 ) and ( 21 ). 12. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die inneren Platten (4) aus einem gut tempera­ turleitenden Material und die äußeren Platten (5) aus einem transparenten Material bestehen.12. The apparatus according to claim 9, characterized in that the inner plates ( 4 ) consist of a good temperature-conducting material and the outer plates ( 5 ) consist of a transparent material. 13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die inneren Platten (4) aus Keramik oder Kunststoff und die äußeren Platten (5) aus Glas oder transparentem Kunststoff bestehen.13. The apparatus according to claim 12, characterized in that the inner plates ( 4 ) made of ceramic or plastic and the outer plates ( 5 ) consist of glass or transparent plastic. 14. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die äußeren Platten (5) durch einen Druckrahmen (13) gehalten werden und ein Deckel (14) die Elek­ trophorese-Kombikammer (1) nach oben abschließt. 14. The apparatus according to claim 9, characterized in that the outer plates ( 5 ) are held by a pressure frame ( 13 ) and a cover ( 14 ) closes the electrophoresis combination chamber ( 1 ) upwards. 15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Druckrahmen (13) über Spannelemente (15) beidseitig befestigt wird und Sichtfenster (16) zur Prozeßkontrolle aufweist.15. The apparatus according to claim 14, characterized in that the printing frame ( 13 ) via clamping elements ( 15 ) is fastened on both sides and has viewing windows ( 16 ) for process control. 16. Vorrichtung nach Anspruch 1, 9 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die untere Begrenzung der Elektrophorese- Kombikammer (1) durch einen justier- und drehbaren Tisch realisiert ist, auf welchem die Elektro­ phorese-Kombikammer (1) fixiert ist.16. The apparatus of claim 1, 9 or 14, characterized in that the lower limit of the electrophoresis combination chamber ( 1 ) is realized by an adjustable and rotatable table on which the electro-combination chamber ( 1 ) is fixed. 17. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Deckel (14) Ein- und Ausleitungen für das Kühlmedium sowie zu den Puffergefäßen (8) und Gelkammern (6,7) und die Anschlüsse für die Elektroden der 1. und 2. Dimension aufweist.17. The apparatus according to claim 14, characterized in that the cover ( 14 ) inlets and outlets for the cooling medium and to the buffer vessels ( 8 ) and gel chambers ( 6 , 7 ) and the connections for the electrodes of the 1st and 2nd dimension having. 18. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Kern (2) aus Polymermaterial wie Acrylglas, Keramik oder Plexiglas besteht.18. The apparatus according to claim 9, characterized in that the core ( 2 ) consists of polymer material such as acrylic glass, ceramic or plexiglass. 19. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelkammern (6, 7) mit Füllrohren (17) verbunden sind und Entlüftungsöffnungen (18) angeordnet sind. 19. The apparatus according to claim 9, characterized in that the gel chambers ( 6 , 7 ) with filling tubes ( 17 ) are connected and ventilation openings ( 18 ) are arranged. 20. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen inneren Platten (4) und äußeren Platten (5) Dichtungen (19) angeordnet sind.20. The apparatus according to claim 9, characterized in that between the inner plates ( 4 ) and outer plates ( 5 ) seals ( 19 ) are arranged. 21. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierelemente (9) mit Vertiefungen zusam­ menwirken.21. The apparatus according to claim 9, characterized in that the insulating elements ( 9 ) cooperate with depressions. 22. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die die Medien Gele und/oder Gellösungen und/oder Pufferlösungen berührenden Teile der Elek­ trophorese-Kombikammer (1) oberflächenbeschichtet sind.22. The apparatus according to claim 9, characterized in that the media gels and / or gel solutions and / or buffer solutions contacting parts of the electrophoresis combination chamber ( 1 ) are surface coated. 23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenbeschichtung aus amorphen Kohlenstoffschichten besteht oder durch Silanisieren realisiert wird.23. The device according to claim 22, characterized, that the surface coating is made of amorphous Carbon layers exist or through Silanizing is realized. 24. Vorrichtung zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Substanzgemischen in Gelen, Polymeren oder trägerfreien Medien durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur, dadurch gekennzeichnet, daß alle für die Durchführung einer zwei­ dimensionalen Trennung notwendigen Baugruppen in einer Elektrophorese-Kombikammer 1, bestehend aus einem Kern 2 mit Kühlelementen 3, wobei die Kühlelemente 3 zwischen den beidseitig des Kerns durch innere Platten 4 und äußere Platten 5 im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen 9 gebildeten Trennkammern 6, 7, Puffergefäße 8, 21 und Aufnahmen für Elektroden angeordnet sind, vollständig integriert sind und die Durchführung der zwei-dimensionalen Auftrennung vollständig automatisiert werden kann, ohne daß im Ablauf der zwei-dimensionalen Trennung eine Manipulation an den Gelen selber erfolgt.24. Device for the two-dimensional separation of biomolecules or other substance mixtures in gels, polymers or carrier-free media by electrophoresis in an electrophoresis apparatus, characterized in that all the assemblies necessary for carrying out a two-dimensional separation in an electrophoresis combination chamber 1 , consisting of a Core 2 with cooling elements 3 , the cooling elements 3 being arranged between the separation chambers 6 , 7 , buffer vessels 8 , 21 and receptacles for electrodes formed between the core on both sides by inner plates 4 and outer plates 5 in cooperation with removable or switchable insulating elements 9 are and the implementation of the two-dimensional separation can be fully automated without manipulation of the gels themselves in the course of the two-dimensional separation.
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