DE19827239A1

DE19827239A1 - New polyspecific binding agents useful for treatment, prevention and diagnosis of cancer and autoimmune diseases comprises variable domains of heavy and light chains of immuoglobulins bound by a peptide

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Publication number: DE19827239A1
Application number: DE19827239A
Authority: DE
Inventors: Roland Kontermann; Hans-Harald Sedlacek; Rolf Mueller
Original assignee: Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH; Hoechst Marion Roussel Inc
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1998-06-18
Publication date: 1999-12-23

Abstract

An single chain, multiple antigen-binding molecule (I), is new and comprises variable domains of the heavy and light chains of immunoglobulin (VH) and (VL) with different specificities and functional parts. An single chain, multiple antigen-binding molecule, is new and comprises variable domains of: (1) a heavy chain of an immunoglobulin (VH) with a first specificity (A); (2) a light chain of an immunoglobulin (VL) with a second specificity (B); (3) a heavy chain of an immunoglobulin (VH) with the specificity (B); and (4) a light chain of an immunoglobulin (VL) with the specificity (A); and their functional parts, where the VH and VL domains are bound by a peptide (P), in the form of a VH-VL or VL-VH construct. Independent claims are also included for the following: (1) a nucleic acid (II) encoding (I); (2) a vector (III) comprising (II); (3) a host cell (IV) comprising (II) or (III); (4) a diagnostic kit (V) comprising (I); and (5) production of (I).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül, mit verschiedenen variablen Domänen einer schweren bzw. einer leichten Kette eines Immunglobulins, die in Form eines VH-VL-Konstruktes verbunden sind, welche wiederum über ein Peptid miteinander verbunden sind, sowie deren Herstellung und Verwendung als Arzneimittel oder Diagnostikum.The present invention relates to a single chain, multiple antigen binding Molecule with different variable domains of a heavy or a light Chain of an immunoglobulin, which are connected in the form of a VH-VL construct, which in turn are linked to each other via a peptide, and their Manufacture and use as a medicine or diagnostic.

Bispezifische Antikörper, die zwei verschiedene Antigene, z. B. ein Tumorzellober flächenantigen und ein Effektormolekül erkennen, finden eine breite Anwendung in der experimentellen Immuntherapie (Fanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12, 101-124 (1992); van de Winkel et al., Immunol. Today 18, 562-564 (1997)). Zu den Effektorfunktionen, die durch bispezifische Antikörper rekrutiert werden, zählen u. a. solche, die natürlicherweise im Organismus vorkommen, wie z. B. zytotoxische und phagozytierende Zellen, Komplementkomponenten, Zytokine und thrombolytische und fibrinolytische Enzyme als auch körperfremde Effektormoleküle, wie z. B. Toxine, Prodrug-konvertierende Enzyme und Radionuklite. So führte z. B. die Injektion bispezifischer Antikörper gegen das Hodgkins's-Tumor-assoziierte Antigen CD30 und die T-Zell-Antigene CD3 bzw. CD28 in xenotransplantierte Tumoren zur Rekrutierung und Stimulierung von zytotoxischen T-Zellen und zur Induktion einer tumoriziden Aktivität (Renner et al., Science 264, 833, 1994). In einem anderen Ansatz wurde ein bispezifischer Antikörper gegen CD30 und alkalische Phosphatase dazu benutzt, das Enzym an die Tumorstelle zu rekrutieren und damit die untoxische Vorstufe eines Wirkstoffes in einen toxischen Wirkstoff zu überführen (Sahin et al. Cancer Res. 50, 6944-6948, 1990).Bispecific antibodies that contain two different antigens, e.g. B. a tumor cell top surface antigen and recognize an effector molecule are widely used in experimental immunotherapy (Fanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12, 101-124 (1992); van de Winkel et al., Immunol. Today 18, 562-564 (1997)). To the Effector functions that are recruited by bispecific antibodies include: a. those that occur naturally in the organism, such as. B. cytotoxic and phagocytic cells, complement components, cytokines and thrombolytic and fibrinolytic enzymes as well as foreign body effector molecules, such as B. toxins, Prodrug converting enzymes and radionuclites. So z. B. the injection bispecific antibody against the Hodgkins's tumor-associated antigen CD30 and the T cell antigens CD3 and CD28 in xenografted tumors Recruitment and stimulation of cytotoxic T cells and induction of one tumoricidal activity (Renner et al., Science 264, 833, 1994). In another A bispecific antibody against CD30 and alkaline phosphatase was used used to recruit the enzyme to the tumor site and thus the non-toxic To convert the precursor of an active substance into a toxic active substance (Sahin et al. Cancer Res. 50, 6944-6948, 1990).

Eine Alternative zur Injektion des gereinigten bispezifischen Antikörpers ist die Expression und Sekretion dieser bispezifischen Antikörper durch in vitro oder in vivo transfizierte Zellen. Der Vorteil dieser Strategie ist, daß die Produktion des bispezi fischen Antikörpers von der transduzierten Zelle in vivo erfolgt und somit keine aufwendige Produktion und Reinigung des bispezifischen Antikörpers vor einer Injektion notwendig ist. Darüber hinaus kann durch Wahl geeigneter Expressions systeme die Expression des bispezifischen Antikörpers lokal, in Organen oder einem Tumor oder auch systemisch gesteuert werden.An alternative to injecting the purified bispecific antibody is Expression and secretion of these bispecific antibodies by in vitro or in vivo transfected cells. The advantage of this strategy is that the production of the bispezi fish antibody from the transduced cell in vivo and thus none complex production and cleaning of the bispecific antibody in front of a Injection is necessary. In addition, by choosing suitable expressions systems the expression of the bispecific antibody locally, in organs or a Tumor or can also be controlled systemically.

Bispezifische Antikörper können beispielsweise durch chemische Quervernetzung (Nisonoff et al., Nature 194, 355, 1962) hergestellt werden. Bei der chemischen Quervernetzung monoklonaler bzw. polyklonaler Antikörpermoleküle tierischen Ursprungs kann ein nicht geringer Anteil inaktiviert werden. Zusätzlich entstehen sowohl Hetero- als auch Homodimere. Homodimere müssen durch aufwendige Verfahren von den gewünschten Heterodimeren abgetrennt werden. Hybridomzellen, die bispezifische Antikörper produzieren, sogenannte Hybrid- Hybridome, lassen sich nur relativ aufwendig herstellen, da hier zwei verschiedene Hybridome miteinander fusioniert werden müssen (Milstein et al., Nature 305, 537, 1983). Der Anteil an funktionellen Heterodimeren ist relativ gering, theoretisch nur 10%, da die schweren und leichten Ketten der beiden Antikörpermoleküle beliebig miteinander assoziieren können. Als Ausgangsmaterial werden hauptsächlich murine monoklonale Antikörper verwendet, welche wiederum für den Menschen immunogen sind.Bispecific antibodies can, for example, by chemical cross-linking (Nisonoff et al., Nature 194, 355, 1962). In the chemical Cross-linking of animal monoclonal or polyclonal antibody molecules A not insignificant proportion can be inactivated. In addition arise both hetero and homodimers. Homodimers have to be elaborate Processes are separated from the desired heterodimers. Hybridoma cells that produce bispecific antibodies, so-called hybrid Hybridomas can only be produced with relatively great effort, since there are two different ones Hybridomas must be fused together (Milstein et al., Nature 305, 537, 1983). The proportion of functional heterodimers is relatively small, in theory only 10% because the heavy and light chains of the two antibody molecules are arbitrary can associate with each other. The main raw materials are murine monoclonal antibodies are used, which in turn are for humans are immunogenic.

Verschiedene bivalente bzw. bispezifische Antikörpermoleküle können auch rekom binant hergestellt und in Bakterien bzw. eukaryotischen Zellen exprimiert werden (WO 93/06217). Allen rekombinanten Antikörpermolekülen ist gemein, daß für ihre Herstellung sowohl murine als auch humane Ausgangsmoleküle verwendet werden können. Unterschiedliche Methoden wurden entwickelt, um bispezifische rekombinante Antikörpermoleküle möglichst effizient herstellen zu können. Mit diesen Methoden lassen sich unterschiedliche Gruppen von Molekülen herstellen.Different bivalent or bispecific antibody molecules can also be recom binant produced and expressed in bacteria or eukaryotic cells (WO 93/06217). All recombinant antibody molecules have in common that for their Production of both murine and human starting molecules can be used can. Different methods have been developed to bispecific to be able to produce recombinant antibody molecules as efficiently as possible. With Using these methods, different groups of molecules can be produced.

Bei einer Gruppe von Molekülen werden die variablen Teile der Antikörper mit konstanten Immunglobulindomänen (Fc, CH3, CL) fusioniert, um eine Dimerisierung zu erreichen (Hu et al., Cancer Res. 56, 3055-3061 (1994); Hayden et al., ther. Immunol. 1, 3-15 (1994)). Hierbei erfolgt jedoch keine Selektion für heterodimere Moleküle, so daß auf diese Weise überwiegend bivalente Homodimere entstehen. Die Expression dieser Moleküle in funktioneller Form ist zudem auf eukaryotische Zellen beschränkt.In the case of a group of molecules, the variable parts of the antibodies are included constant immunoglobulin domains (Fc, CH3, CL) fused to dimerization (Hu et al., Cancer Res. 56, 3055-3061 (1994); Hayden et al., ther. Immunol. 1, 3-15 (1994)). However, there is no selection for heterodimers Molecules so that predominantly bivalent homodimers are formed in this way. The expression of these molecules in functional form is also due to eukaryotic Cells limited.

Bei einer weiteren Gruppe von Molekülen werden die variablen Teile der Antikörper mit Peptiden bzw. Proteindomänen aus anderen Proteinen zur Herstellung von biva lenten bzw. bispezifischen Molekülen fusioniert (Plückthun und Pack Immunotechnol. 3, 83-105 (1997)). Auch hier erfolgt in der Regel eine Bildung von Homo- wie auch Heterodimeren aufgrund der zufälligen Assoziation. Zusätzlich enthalten diese Moleküle einen z. T. erheblichen Anteil von Fremdsequenzen, so daß mit einer deutlichen Immunogenität zu rechnen ist.Another group of molecules are the variable parts of the antibodies with peptides or protein domains from other proteins for the production of biva lent or bispecific molecules fused (Plückthun and Pack Immunotechnol. 3, 83-105 (1997)). Here, too, is usually formed Homo- as well as heterodimers due to the random association. In addition do these molecules contain a z. T. considerable proportion of foreign sequences, so that a clear immunogenicity can be expected.

Bei einer dritten Gruppe von Molekülen werden geringfügige Modifikationen von rekombinanten Fv-Fragmenten, in der Regel einzelkettige Fv-Fragmente (scFv), zur Herstellung von bivalenten bzw. bispezifischen Molekülen verwendet (Holliger und Winter, Curr. Opin. Biotechnol. 4, 446-449 (1993). Hierzu zählen die Dimerisierung durch zusätzliche Cysteine am C-Terminus der scFv-Ketten (MacCartney et al., Protein Engin. 8, 301-314 (1994). Hierbei entstehen jedoch sowohl Homo- als auch Heterodimere und bei der Expression in Bakterienzellen entstehen nicht funktionelle Aggregate. Tandem-scFv-Moleküle der Struktur scFv(A)-Linker-scFv(B) (Mallender und Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206, 1914) lassen sich sowohl in Bakterien als auch in eukaryotischen Zellen exprimieren. Hierbei können jedoch z. T. auch nicht funktionelle Assoziationen der vier variablen Domänen erfolgen.In a third group of molecules, minor modifications of recombinant Fv fragments, usually single-chain Fv fragments (scFv), for Production of bivalent or bispecific molecules used (Holliger and Winter, curr. Opin. Biotechnol. 4, 446-449 (1993). These include dimerization by additional cysteines at the C-terminus of the scFv chains (MacCartney et al., Protein engine. 8: 301-314 (1994). However, this creates both homo- and Heterodimers and when expressed in bacterial cells are non-functional Aggregates. Tandem scFv molecules of the structure scFv (A) linker scFv (B) (Mallender and Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206, 1914) can be found both in bacteria and also express in eukaryotic cells. However, z. T. also not functional associations of the four variable domains take place.

Die rekombinante Antikörpertechnologie hat in den letzten Jahren zur Entwicklung neuer kleiner, bivalenter bzw. bispezifischer Antikörperfragmente geführt. Solche Moleküle stellen z. B. die "Diabodies" dar (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993). Dabei handelt es sich um variable VH- und VL-Domänen der Immunglobuline, die durch einen sehr kurzen Linker miteinander verbunden sind. Dieser Linker ist zu kurz, um eine Zusammenlagerung der VH- und VL-Domäne einer Kette zu bewirken, wie es bei einzelkettigen Fv-Fragmenten geschieht. Dadurch lagern sich die VH- und VL-Domänen zweier Ketten zu einem Dimer zusammen, so daß Moleküle mit zwei Bindungsstellen entstehen (Perisic et al., Structure 2, 1217-1226, 1994). Bispezifische "Diabodies" entstehen durch die Expression von zwei Ketten der Struktur VH(A)-VL(B) und VH(B)-VL(A) in einer Zelle. Hierbei bedeutet VL die variable (V) Domäne der leichten (L) Kette und VH die variable Domäne (V) der schweren (H) Kette eines Immunglobulins, wobei diese variablen Domänen das Antigen (A) bzw. (B) binden. Durch die Zusammenlagerung der VH-Teile mit den VL-Teilen entstehen heterodimere Fragmente mit funktionell aktiven Bindungsstellen. Bakteriell exprimierte bispezifische "Diabodies" wurden bereits erfolgreich für die Rekrutierung von verschiedenen Effektormolekülen, Immunglobuline, C1q oder Enzyme bzw. Effektorzellen, wie z. B. zytotoxische T- Lymphozyten, eingesetzt (Kontermann et al., Nature Biotechnol. 15, 629 (1997); Holliger et al., Protein Engin. 9, 299 (1996); Nature Biotechnol. 15, 632 (1997) Zhu et al., Bio Technol. 14, 192 (1996); FitzGerald et al., Protein Engin. 10, 1221 (1997); Krebs et al., J. Biol. Chem. 273, 2858 (1998)).Recombinant antibody technology has developed in recent years new small, bivalent or bispecific antibody fragments. Such Molecules represent e.g. B. the "Diabodies" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993). These are variable VH and VL domains of Immunoglobulins linked by a very short linker. This linker is too short to combine the VH and VL domains a chain, as happens with single-chain Fv fragments. This causes the VH and VL domains of two chains to form a dimer together so that molecules with two binding sites are formed (Perisic et al., Structure 2, 1217-1226, 1994). Bispecific "diabodies" are created by the Expression of two chains of the structure VH (A) -VL (B) and VH (B) -VL (A) in one Cell. Here VL means the variable (V) domain of the light (L) chain and VH the variable domain (V) of the heavy (H) chain of an immunoglobulin, this variable domains bind the antigen (A) or (B). Through the assembly of the VH parts with the VL parts result in heterodimeric fragments with functional active binding sites. Bacterially expressed bispecific "diabodies" were found already successfully for the recruitment of different effector molecules, Immunoglobulins, C1q or enzymes or effector cells, such as. B. cytotoxic T- Lymphocytes, used (Kontermann et al., Nature Biotechnol. 15, 629 (1997); Holliger et al., Protein Engin. 9, 299 (1996); Nature biotechnol. 15, 632 (1997) Zhu et al., Bio Technol. 14, 192 (1996); FitzGerald et al., Protein Engin. 10, 1221 (1997); Krebs et al., J. Biol. Chem. 273, 2858 (1998)).

"Diabodies" haben jedoch folgende Nachteile:
Da die beiden VH(A)-VL(B) und VH(B)-VL(A) Ketten physisch nicht miteinander verbunden sind, können in gleichem Maße Homo- wie Heterodimere entstehen, die ein sehr aufwendiges Reinigungsverfahren für die Heterodimere notwendig machen. Des weiteren kommt es zu einer Dissoziation der Dimere, wie es bereits für scFv- Fragmente gezeigt wurde (Glockshuber et al., Biochem. 29, 1362-1367 (1990)). Zur Lösung dieser Probleme wurden Disulfid-stabilisierte "Diabodies" (FitzGerald et al., Protein Engin. 10, 1221-1225, 1997) oder "knob-into-hole-Diabodies" (Zhu et al., Protein Sci. 6, 781-788, 1997) entwickelt. Deren Herstellung ist jedoch mit einem erheblichen Aufwand verbunden. Zudem wird für die gentechnische Expression eines bispezifischen "Diabody" für jede Kette eine Signalsequenz und eine Ribosomenbindestelle benötigt, was sehr aufwendig ist. Zusätzlich können nicht äquimolare Mengen der variablen Domänen exprimiert werden, was den Anteil an nicht funktionellen Homodimeren erhöht.However, "diabodies" have the following disadvantages:
Since the two VH (A) -VL (B) and VH (B) -VL (A) chains are not physically connected to each other, homo- and heterodimers can be formed to the same extent, which necessitates a very complex cleaning process for the heterodimers. Furthermore, the dimers dissociate, as has already been shown for scFv fragments (Glockshuber et al., Biochem. 29, 1362-1367 (1990)). To solve these problems, disulfide-stabilized "diabodies" (FitzGerald et al., Protein Engin. 10, 1221-1225, 1997) or "knob-into-hole diabodies" (Zhu et al., Protein Sci. 6, 781 -788, 1997). However, their production is associated with considerable effort. In addition, for the genetic expression of a bispecific "diabody", a signal sequence and a ribosome binding site are required for each chain, which is very complex. In addition, non-equimolar amounts of the variable domains can be expressed, which increases the proportion of non-functional homodimers.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, mehrfach-antigenbindende Moleküle zu finden, die die beschriebenen Nachteile der sogenannten "Diabodies" nicht haben und die in überwiegend homogener Form auf einfach Art und Weise hergestellt werden können.The object of the present invention was therefore, multi-antigen-binding molecules to find the disadvantages of the so-called "diabodies" not described have and the predominantly homogeneous form in a simple way can be produced.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein einzelkettiges, mehrfach antigenbindendes Molekül enthaltend folgende Komponenten:
The present invention therefore relates to a single-chain, multi-antigen-binding molecule comprising the following components:

a) eine variable Domäne einer schweren Kette eines Immunglobulins (VH) mit einer ersten Spezifität (A) und funktionelle Teile hiervon,a) a variable domain of a heavy chain of an immunoglobulin (VH) with a first specificity (A) and functional parts thereof,
b) eine variable Domäne einer leichten Kette eines Immunglobulins (VL) mit einer zweiten Spezifität (B) und funktionelle Teile hiervon,b) a variable domain of a light chain of an immunoglobulin (VL) with a second specificity (B) and functional parts thereof,
c) eine variable Domäne einer schweren Kette eines Immunoglobulins (VH) mit der Spezifität (B) und funktionelle Teile hiervon, sowiec) a variable domain of a heavy chain of an immunoglobulin (VH) with the specificity (B) and functional parts thereof, and
d) eine variable Domäne einer leichten Kette eines Immunglobulions (VL) mit der Spezifität (A) und funktionelle Teile hiervon,d) a variable domain of an immunoglobulin light chain (VL) with the Specificity (A) and functional parts thereof,

wobei die Domänen VH und VL in Form eines VH-VL-Konstruktes und die beiden VH-VL-Konstrukte über ein Peptid (P) verbunden sind.the domains VH and VL in the form of a VH-VL construct and the two VH-VL constructs are linked via a peptide (P).

In einer weiteren Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Molekül mehr als zwei der genannten VH-VL-Konstrukte. Hierdurch können Moleküle erhalten werden die mehrere Spezifitäten (A), (B), (C) usw. enthalten.In a further embodiment, the molecule according to the invention contains more than two of the VH-VL constructs mentioned. In this way, molecules can be obtained which contain several specificities (A), (B), (C) etc.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die einzelnen VH-VL-Konstrukte über deren variable Domäne mit gleicher Spezifität gebunden. Eine besonders bevorzugte Struktur eines erfindungsgemäßen Moleküls ist in Fig. 1 dargestellt.In a preferred embodiment, the individual VH-VL constructs are bound with the same specificity via their variable domain. A particularly preferred structure of a molecule according to the invention is shown in FIG. 1.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die einzelnen Spezifitäten im wesentlichen identisch. Der Begriff "im wesentlichen identisch" bedeutet gemäß der vorliegenden Erfindung, daß die molekulare Struktur der Domänen durchaus unterschiedlich sein kann, deren Spezifität, d. h. die spezifische antigenbindende Funktion jedoch erhalten bleibt. Hieraus ergibt sich, daß das erfindungsgemäße Molekül nicht nur eine vollständige variable Domäne einer schweren bzw. leichten Kette eines Immunoglobulins enthalten kann, sondern auch deren funktionelle Teile d. h. die Teile, die ihre spezifische antigenbindende Eigenschaft erhalten haben. Beispielsweise gehören im Sinne der vorliegenden Erfindung hierzu auch künstliche Konstrukte, die aus den einzelnen CDR-Teilen ("complementary determining regions") von variablen Domänen eines Immunglobulins aufgebaut sind (Jones, P.T. et al. Nature, 321, 522, 1986; Riechmann, L. et al. Nature 332, 323, 1988; Verhoeyen, M. et al. Science, 239, 1534, 1988). In a further preferred embodiment, the individual specificities are in the essentially identical. The term "substantially identical" means according to the present invention that the molecular structure of the domains is quite can be different, the specificity, d. H. the specific antigen binding Function remains however. It follows from this that the invention Molecule not just a complete variable domain of a heavy or light Chain of an immunoglobulin can contain, but also their functional parts d. H. the parts that have retained their specific antigen-binding properties. For the purposes of the present invention, for example, this also includes artificial ones Constructs that consist of the individual CDR parts ("complementary determining regions ") of variable domains of an immunoglobulin (Jones, P.T. et al. Nature, 321, 522, 1986; Riechmann, L. et al. Nature 332, 323, 1988; Verhoeyen, M. et al. Science, 239, 1534, 1988).

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Domänen VH und VL über einen Peptid-Linker (L) in Form eines VH-L-VL-Konstruktes verbunden. Der Linker sollte hierbei im allgemeinen möglichst kurz, vorzugsweise ca. 1-20 Aminosäuren insbesondere ca. 1-5 Aminosäuren lang sein. Besonders bevorzugt ist ein Linker mit der Sequenz GGGGS.In a preferred embodiment, the domains VH and VL are over one Peptide linker (L) linked in the form of a VH-L-VL construct. The linker should generally as short as possible, preferably about 1-20 amino acids in particular be about 1-5 amino acids long. A linker is particularly preferred with the sequence GGGGS.

Im Gegensatz zum Linker (L) kann das verbindende Peptid (P) beliebig lang sein. Bevorzugt ist jedoch ein Peptid (P) mit ca. 12-40 Aminosäuren, insbesondere mit ca. 12-20 Aminosäuren, vor allem mit ca. 14 Aminosäuren. Besonders bevorzugt ist ein Peptid (P) das die Aminosäuresequenz GGGGSGGRASGGGS oder GGGGSGGRASGGGGS enthält und insbesondere ein Peptid (P), das aus der genannten Aminosäuresequenz besteht.In contrast to the linker (L), the connecting peptide (P) can be of any length. However, a peptide (P) with approximately 12-40 amino acids, in particular with, is preferred approx. 12-20 amino acids, especially with approx. 14 amino acids. Particularly preferred is a peptide (P) which has the amino acid sequence GGGGSGGRASGGGS or GGGGSGGRASGGGGS contains and in particular a peptide (P), which from the amino acid sequence mentioned exists.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Molekül als eine weitere Komponente einen Effektor (E). Dieser Effektor kann an das erfindungsgemäße Molekül direkt oder gegebenenfalls über ein Bindeglied (B) gebunden sein. Besonders bevorzugt ist es, wenn das Bindeglied (B) eine Protease- Spaltsequenz, vorzugsweise eine PSA (Prostataspezifisches Antigen)-, Cathepsin-, Plasminogen- und/oder Plasminogenaktivator-Spaltsequenz enthält.In a further preferred embodiment, the invention contains Molecule as an additional component an effector (E). This effector can the molecule according to the invention directly or optionally via a link (B) be bound. It is particularly preferred if the link (B) is a protease Cleavage sequence, preferably a PSA (prostate-specific antigen), cathepsin, Contains plasminogen and / or plasminogen activator cleavage sequence.

Die Protease-Spaltsequenz ist deshalb besonders bevorzugt, da hierdurch der Effektor von dem erfindungsgemäßen Molekül mit Hilfe einer Protease abgetrennt werden kann. Die Trennung ist besonders dann vorteilhaft, wenn durch direkte oder über das Bindeglied vermittelte indirekte Bindung des Effektors an das erfindungsgemäße Molekül die Aktivität des Effektors inhibiert wird.The protease cleavage sequence is therefore particularly preferred since Effector separated from the molecule of the invention using a protease can be. The separation is particularly advantageous if by direct or Indirect binding of the effector to the mediated via the link molecule of the invention the activity of the effector is inhibited.

Da Proteasen besonders in Bereichen von Entzündungen oder in Tumoren vorhanden sind, werden dort die Effektoren, welche vorzugsweise aufgrund ihrer Bindung über eine Protease-Spaltsequenz an das erfindungsgemäße Molekül inaktiviert sind, in hohem Maße lokal freigesetzt. Durch die Wahl geeigneter Zielstrukturen für das erfindungsgemäße Molekül, beispielsweise mit einer Spezifität für Antigene auf Tumorzellen, für Antigene auf Tumorassoziierten Endothelzellen oder für Antigene auf Entzündungszellen, wie z. B. Lymphozyten oder Makrophagen, kann zusätzlich eine Anreicherung des erfindungsgemäßen Moleküls mit dem Effektor im Bereich beispielsweise einer Entzündung oder eines Tumors erreicht werden.Because proteases particularly in areas of inflammation or in tumors are there, the effectors, which are preferably due to their Binding to the molecule according to the invention via a protease cleavage sequence are inactivated, released to a high degree locally. By choosing more suitable Target structures for the molecule according to the invention, for example with a specificity for antigens on tumor cells, for antigens on tumor-associated endothelial cells or for antigens on inflammatory cells, such as. B. lymphocytes or macrophages, can additionally enrich the molecule of the invention with the Effector in the area of inflammation or a tumor, for example become.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können auch mehrere Effektoren an dem erfindungsgemäßen Molekül direkt oder indirekt gebunden sein.According to the present invention, multiple effectors can also be on the Molecule according to the invention may be bound directly or indirectly.

Proteasen oder die dazugehörigen Spaltsequenzen sind beispielsweise in DE 197 04 301.1 im Detail aufgeführt.Proteases or the associated cleavage sequences are, for example, in DE 197 04 301.1 listed in detail.

Ein Beispiel eines bevorzugten erfindungsgemäßen Moleküls mit einem Effektor, der über ein Bindeglied an das Molekül gebunden ist, ist in Fig. 2 schematisch dargestellt.An example of a preferred molecule according to the invention with an effector which is bound to the molecule via a link is shown schematically in FIG. 2.

Die Auswahl der einzelnen Komponenten des erfindungsgemäßen Moleküls richtet sich im allgemeinen nach dem Anwendungsgebiet.The selection of the individual components of the molecule according to the invention is directed generally according to the area of application.

Soll das erfindungsgemäße Molekül als Diagnostikum verwendet werden, so ist beispielsweise in einer weiteren Ausführungsform die erste Spezifität (A) gegen ein zu analysierendes Molekül gerichtet und die zweite Spezifität (B) direkt oder indirekt gegen einen Analyten. Beispielsweise kann der Analyt ein radioaktives Molekül, ein fluoreszierendes Molekül oder ein Enzym, welches durch seine enzymatische Aktivität eine Vorstufe eines Analyten in einen aktiven Analyten überführt, sein.If the molecule according to the invention is to be used as a diagnostic agent, then for example, in a further embodiment, the first specificity (A) against molecule to be analyzed and the second specificity (B) directly or indirectly against an analyte. For example, the analyte can be a radioactive molecule fluorescent molecule or an enzyme characterized by its enzymatic Activity converts a precursor of an analyte into an active analyte.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erste Spezifität (A) gegen ein zu analysierendes Molekül gerichtet, die zweite Spezifität (B) gegen ein anderes zu analysierendes Molekül und der Effektor (E) ist ein Analyt, beispielsweise ein radioaktives Molekül, ein fluoreszierendes Molekül und/oder ein Enzym, wie oben bereits näher erläutert.In a further preferred embodiment, the first specificity (A) is against molecule to be analyzed, the second specificity (B) towards another analyzing molecule and the effector (E) is an analyte, for example a radioactive molecule, a fluorescent molecule and / or an enzyme as above already explained in more detail.

Das erfindungsgemäße Molekül kann jedoch auch als sogenannter multifunktioneller Ligand verwendet werden. Hierzu ist es vorteilhaft, wenn das Peptid (P) und/oder der Effektor (E) ein fusiogenes Peptid enthält. Der multifunktionelle Ligand dient zur zielzellspezifischen Übertragung von Nukleotidsequenzen und ist im allgemeinen ein Protein, welches einen zielzellspezifischen Liganden, einen Genkonstrukt- spezifischen Liganden und ein fusiogenes Peptid enthält. Mit Hilfe derartiger multifunktioneller Liganden können Genkonstrukte, d. h. Nukleinsäurekonstrukte spezifisch an eine Zielzelle gebunden werden und das fusiogene Peptid ermöglicht die Penetration des Nukleinsäurekonstruktes durch die Zellmembran hindurch in den Zellkern und damit auch die Freisetzung aus dem Endosom.However, the molecule according to the invention can also be used as a so-called multifunctional Ligand can be used. For this purpose, it is advantageous if the peptide (P) and / or the effector (E) contains a fusiogenic peptide. The multifunctional ligand is used for target cell-specific transfer of nucleotide sequences and is generally a Protein, which is a target cell-specific ligand, a gene construct contains specific ligands and a fusiogenic peptide. With the help of such multifunctional ligands can gene constructs,. H. Nucleic acid constructs be specifically bound to a target cell and the fusiogenic peptide enables the penetration of the nucleic acid construct through the cell membrane into the Cell nucleus and thus the release from the endosome.

Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Moleküls als multifunktionellen Liganden ist es vorteilhaft, wenn die erste Spezifität (A) gegen eine Zielzelle gerichtet ist und die zweite Spezifität (B) gegen einen Vektor. Der Vektor ist im allgemeinen eine Nukleinsäure, ein kationisches Peptid oder Protein, ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer oder ein kationisches Porphgoin.When using the molecule according to the invention as a multifunctional Ligands, it is advantageous if the first specificity (A) against a target cell is directed and the second specificity (B) against a vector. The vector is in generally a nucleic acid, a cationic peptide or protein cationic lipid, a cationic polymer or a cationic porphgoin.

Beispiele für zielzellspezifische Liganden, für Membranstrukturen auf der Zielzelle für zielzellspezifische Liganden und für Genkonstrukt-spezifische Liganden, welche sich von Immunglobulinen ableiten, d. h. VH- und VL-Domänen enthalten, wie auch von Peptiden mit fusiogener Eigenschaft sind im Detail in der DE 196 49 645.4 beschrieben.Examples of target cell-specific ligands, for membrane structures on the target cell for target cell-specific ligands and for gene construct-specific ligands which derived from immunoglobulins, d. H. VH and VL domains included, as well of peptides with a fusiogenic property are described in detail in DE 196 49 645.4 described.

Das erfindungsgemäße Molekül eignet sich auch zur Prophylaxe und/oder als Therapeutikum.The molecule according to the invention is also suitable for prophylaxis and / or as Therapeutic.

Hierzu ist beispielsweise die erste Spezifität (A) gegen eine Zellmembran, wie beispielsweise gegen Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten, Granulozyten, hämatopoietische Zellen, Endothelzellen, glatte Muskelzellen, quergestreifte Muskelzellen, Epithelzellen, Leberzellen, Nierenzellen, Gliazellen, Zellen des Stützgewebes, Tumorzellen oder Leukämiezellen, oder gegen Proteine der extrazellulären Matrix, des Komplementsystems, des Gerinnungssystems, des Kininsystems, des Blutplasmas, des Stützgewebes, oder gegen Cytokine oder Chemokine, oder gegen körpereigene oder körperfremde Toxine, oder gegen Arzneimittel, beispielsweise Digitalis, und/oder gegen Infektionserreger, wie z. B. bakterielle, virale und/oder parasitäre Infektionserreger, gerichtet.For this purpose, for example, the first specificity (A) against a cell membrane, such as for example against lymphocytes, macrophages, monocytes, granulocytes, hematopoietic cells, endothelial cells, smooth muscle cells, striated Muscle cells, epithelial cells, liver cells, kidney cells, glial cells, cells of the Support tissue, tumor cells or leukemia cells, or against proteins of the extracellular matrix, the complement system, the coagulation system, the Kininsystem, the blood plasma, the supporting tissue, or against cytokines or Chemokines, or against the body's own or foreign toxins, or against Medicines, for example digitalis, and / or against infectious agents, such as. B. bacterial, viral and / or parasitic infectious agents.

Die zweite Spezifität (B) kann beispielsweise gegen eine Zellmembran von z. B. Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten oder Granulozyten gerichtet sein, mit der Folge, daß deren Vernetzung mit einer Zielstruktur dort zu zytotoxischen immunmodulierenden oder entzündlichen Vorgängen führen kann.The second specificity (B) can, for example, against a cell membrane of e.g. B. Lymphocytes, macrophages, monocytes or granulocytes can be targeted with the Consequence that their cross-linking with a target structure there to cytotoxic immunomodulating or inflammatory processes.

Sie kann auch gegen Cytokine, Chemokine oder Wachstumsfaktoren gerichtet sein mit der Folge, daß deren Vernetzung mit einer Zielstruktur dort immunmodulierende oder proliferative Vorgänge auslösen kann. Sie kann auch gegen Proteine des Komplementsystems gerichtet sein, welche dessen Aktivierung initiieren, verstärken oder inhibieren. Die Vernetzung eines solchen Proteins mit einer Zielstruktur kann dort je nach Wahl des Proteins entzündliche und zytolytische bzw. antientzündliche und zytoprotektive Reaktionen auslösen. Sie kann auch gegen Proteine des Gerinnungssystems gerichtet sein, welche dessen Aktivierung initiieren, verstärken oder inhibieren. Die Vernetzung eines solchen Proteins mit der Zielstruktur kann je nach Wahl des Proteins Thrombosen induzieren oder verhindern. Weiter kann sie gegen fibrinolytische Proteine, welche zur Auflösung von Fibringerinnsel an der Zielstruktur führen, gegen Enzyme, welche an der Zielstruktur die unwirksame Vorstufe eines Wirkstoffes in einen aktiven, z. B. zytotoxischen Wirkstoff überführen können, gegen Peptidhormone oder Steroidhormone, gegen den konstanten Teil eines Immunglobulins, gegen einen Mediator, wie beispielsweise Histamin, Serotonin, Leukotrien, Prostacyclin oder Kinin, gegen Infektionserreger oder gegen Tumorzellen gerichtet sein.It can also be directed against cytokines, chemokines or growth factors with the result that their networking with a target structure there immunomodulating or can trigger proliferative processes. It can also be used against proteins of the Complement system that initiate its activation, reinforce or inhibit. The networking of such a protein with a target structure can there, depending on the choice of protein, inflammatory and cytolytic or anti-inflammatory and trigger cytoprotective reactions. It can also be used against proteins of the Coagulation system, which initiate its activation, strengthen or inhibit. The networking of such a protein with the target structure can ever induce or prevent thrombosis at the choice of protein. She can go on against fibrinolytic proteins, which are used to dissolve fibrin clots at the Lead target structure against enzymes, which on the target structure the ineffective Precursor of an active ingredient in an active, e.g. B. transfer cytotoxic agent can, against peptide hormones or steroid hormones, against the constant part an immunoglobulin against a mediator, such as histamine, Serotonin, leukotriene, prostacyclin or kinin, against infectious agents or against Tumor cells.

Cytokine als Zielstrukturen oder Monozyten, Makrophagen und/oder Lymphozyten als Zielstrukturen können durch das erfindungsgemäße Molekül mit Infektions- oder Tumorantigenen vernetzt werden und hierdurch in vivo eine verstärkte Immunreaktion gegen das Antigen auslösen. Vorteilhaft ist es hierbei, zu dem erfindungsgemäßen Molekül das jeweilige Antigen vom Infektionserreger oder vom Tumor und gegebenenfalls auch das Cytokin hinzuzugeben und den vernetzten Komplex lokal zu verabreichen oder zu injizieren.Cytokines as target structures or monocytes, macrophages and / or lymphocytes can be targeted by the molecule according to the invention with infection or Tumor antigens are cross-linked and thereby an increased in vivo Trigger immune response against the antigen. It is advantageous here to the Molecule according to the invention the respective antigen from the infectious agent or from Tumor and possibly also add the cytokine and the cross-linked To be administered or injected complex locally.

Die zweite Spezifität (B) kann auch gegen körpereigene oder körperfremde Toxine gerichtet sein, so daß entweder eine Neutralisierung des Toxins und Phagozytose oder aber eine toxische Reaktion auf die Zielstruktur bewirkt werden kann. Weiter kann sie gegen Arzneimittel, wie z. B. Digitalis, gerichtet sein, so daß eine Komplexierung und Elimination des Arzneimittels bewirkt werden kann. The second specificity (B) can also be used against the body's own or foreign toxins be directed so that either neutralization of the toxin and phagocytosis or a toxic reaction to the target structure can be caused. Further it can be used against medicines such as B. Digitalis, be directed so that a Complexation and elimination of the drug can be effected.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erlaubt das erfindungsgemäße Molekül mit Effektor die Vernetzung zweier gleicher oder unterschiedlicher Zielstrukturen mit einem oder mehreren Effektor/en.In a further preferred embodiment, the invention allows Molecule with effector, the networking of two identical or different ones Target structures with one or more effector (s).

Als Effektoren eignen sich beispielsweise eine Transmembrandomäne, ein Glykophospholipidanker, der den Liganden bindende Teil eines Rezeptors; der Ligand für einen Rezeptor oder die den Rezeptor bindende Teilsequenz des Liganden; ein Peptidhormon; ein Cytokin; ein Wachstumsfaktor; ein Wachstumsfaktorinhibitor; ein Chemokin; ein Interferon; ein Mediator; ein kreislaufwirksames Peptid; ein Enzym, welches eine inaktive Vorstufe eines Wirkstoffes in einen aktiven Wirkstoff überführt; ein Protein, welches die Gerinnung aktiviert oder inhibiert; ein Protein, welches die Fibrinolyse aktiviert oder inhibiert ein Protein, welches das Komplementsystem aktiviert oder inhibiert; eine oder mehrere konstante Domänen eines Immunglobulins; ein zytotoxisches Peptid; ein anderes, einzelkettiges, mehrfach-, insbesondere zweifach-antigenbindendes Molekül; ein Tumorantigen oder das Antigen eines Infektionserregers, wie beispiels weise ein bakterielles Antigen oder ein virales Antigen; ein Peptid enthaltend Cystein zur Herstellung von Dimeren des erfindungsgemäßen Moleküls; und/oder ein di- bzw. multimerisierendes Peptid (Plückthun und Pack, Immunotechnol. 3, 83-105 (1997)).A transmembrane domain, for example, are suitable as effectors Glycophospholipid anchor, the ligand binding part of a receptor; of the Ligand for a receptor or the partial sequence of the receptor binding Ligands; a peptide hormone; a cytokine; a growth factor; a Growth factor inhibitor; a chemokine; an interferon; a mediator; a circulatory peptide; an enzyme, which is an inactive precursor of a Active ingredient converted into an active ingredient; a protein that prevents clotting activated or inhibited; a protein that activates or inhibits fibrinolysis a protein that activates or inhibits the complement system; one or several constant domains of an immunoglobulin; a cytotoxic peptide; a other, single chain, multiple, especially double antigen binding Molecule; a tumor antigen or the antigen of an infectious agent, such as wise a bacterial antigen or a viral antigen; containing a peptide Cysteine for the production of dimers of the molecule according to the invention; and or a di- or multimerizing peptide (Plückthun and Pack, Immunotechnol. 3, 83-105 (1997)).

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure kodierend für ein erfindungsgemäßes Molekül. Die Nukleinsäure ist im allgemeinen eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA.Another object of the present invention is encoding a nucleic acid for a molecule according to the invention. The nucleic acid is generally a DNA or RNA, preferably a double-stranded DNA.

Für die gegebenenfalls gewünschte Sekretion des erfindungsgemäßen Expressionsproduktes enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure am 5'-Ende eine Nukleotidsequenz kodierend für eine Signal- oder Transmembransequenz (siehe z. B. DE 196 39 103.2 oder DE 196 51 443.6). Ein Beispiel für geeignete Signal- oder Transmembransequenzen ist die Signalsequenz für das Immunglobulin (DNA- Position ≦ 63 bis ≧ 107, die Signalsequenz für das CEA (DNA-Position ≦ 33 bis ≧ 134) oder die Signalsequenz des Human Respiratory Syncytial Virus Glycoproteins (cDNA der Aminosäuresequenzen ≦ 38 bis ≧ 50 oder 48 bis 65). For the optionally desired secretion of the invention Expression product contains the nucleic acid of the invention at the 5 'end Nucleotide sequence coding for a signal or transmembrane sequence (see e.g. B. DE 196 39 103.2 or DE 196 51 443.6). An example of suitable signal or Transmembrane sequences is the signal sequence for the immunoglobulin (DNA Position ≦ 63 to ≧ 107, the signal sequence for the CEA (DNA position ≦ 33 to ≧ 134) or the signal sequence of the Human Respiratory Syncytial Virus glycoprotein (cDNA of the amino acid sequences ≦ 38 to ≧ 50 or 48 to 65).

In einer weiteren Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure am 5'-Ende einen Promotor und/oder Aktivator. Der Aktivator ist vorzugsweise zellspezifisch, zellzyklusspezifisch, methabolisch-spezifisch und/oder durch einen Wirkstoff aktivierbar oder suprimierbar. Derartige Aktivatorsequenzen einschließlich ihrer Kombinationen sind in EP 97101507.8, DE 196 17 851.7, DE 196 39 103.2, DE 196 51 443.6, DE 197 04 301.1, EP 97102547.3 bzw. DE 197 10 643.9 beschrieben. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte sind in den Fig. 3 und 4 schematisch dargestellt.In a further embodiment, the nucleic acid according to the invention contains a promoter and / or activator at the 5 'end. The activator is preferably cell-specific, cell cycle-specific, metabolic-specific and / or can be activated or suppressed by an active ingredient. Such activator sequences including their combinations are described in EP 97101507.8, DE 196 17 851.7, DE 196 39 103.2, DE 196 51 443.6, DE 197 04 301.1, EP 97102547.3 and DE 197 10 643.9. Particularly preferred nucleic acid constructs according to the invention are shown schematically in FIGS. 3 and 4.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure am 5'-Ende des Startkodons die Sequenz GCCACC oder GCCGCC, welche eine Verstärkung der Translation bewirken kann.In a preferred embodiment, the nucleic acid according to the invention contains at the 5 'end of the start codon the sequence GCCACC or GCCGCC, which is a Translation.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen Vektor enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäure. Der Vektor kann hierbei ein viraler oder nicht-viraler Vektor sein, vorzugsweise ein nicht-viraler Vektor, der insbesondere ausgewählt ist aus einem kationischen Lipid, einem kationischen Polymer, einem kationischen Peptid oder einem kationischen Porphyrin.Another embodiment of the present invention relates to one Vector containing the nucleic acid according to the invention. The vector can be a viral or non-viral vector, preferably a non-viral vector that is particularly selected from a cationic lipid, a cationic Polymer, a cationic peptide or a cationic porphyrin.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Moleküle wird die beschriebene Nukleinsäure in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein geeignetes Plasmid kloniert, in eine geeignete Zelle, beispielsweise in eine Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle eingebracht, die so transformierte oder transfizierte Zelle kultiviert und das Expressionsprodukt gegebenenfalls isoliert. Die Methoden sind dem Fachmann allgemein bekannt und beispielsweise bei Sambrook J. et al. Molecular Cloning, A. Laboratory Handbook 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 näher beschrieben.To produce the molecules according to the invention, the one described is Nucleic acid in an expression vector, for example a suitable plasmid cloned into a suitable cell, for example into a bacterial, yeast, insect or introduced into mammalian cells that cultivate the transformed or transfected cell and optionally isolating the expression product. The methods are that Generally known to those skilled in the art and, for example, by Sambrook J. et al. Molecular Cloning, A. Laboratory Handbook 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Described in more detail in 1989.

In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung exprimieren diese Zellen ein erfindungsgemäßes Molekül mit einem Effektor, wobei dieser Effektor vorzugsweise eine Transmembrandomäne ist.In a particular embodiment of the present invention, these express Cells an inventive molecule with an effector, said effector is preferably a transmembrane domain.

So kann beispielsweise die DNA-Sequenz kodierend für die Transmembransequenz des menschlichen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (DNA-Position ≦ 1485 bis ≧ 1554) oder die DNA-Sequenz kodierend für die Signal- und Transmembranregion des menschlichen Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Glykoproteins G (Aminosäuren 1 bis 63 oder deren Teilsequenz Aminosäuren 38 bis 63) oder die DNA-Sequenz kodierend für die Signal- und Transmembranregion der Influenzavirus-Neuraminidase (Aminosäuren 7 bis 35 oder die Teilsequenz Aminosäuren 7 bis 27) zwischen der Promotorsequenz und der DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Moleküls oder auch am 3' Ende des Gens eingefügt werden.For example, the DNA sequence can be coding for the transmembrane sequence of the human macrophage colony stimulating factor (DNA position ≦ 1485 to ≧ 1554) or the DNA sequence coding for the signal and Human respiratory syncytial virus transmembrane region (RSV) glycoproteins G (amino acids 1 to 63 or their partial sequence amino acids 38 to 63) or the DNA sequence coding for the signal and transmembrane region of the Influenza virus neuraminidase (amino acids 7 to 35 or the partial sequence Amino acids 7 to 27) between the promoter sequence and the DNA sequence of the molecule of the invention or at the 3 'end of the gene.

Zur Verankerung des Wirkstoffes in die Zellmembran der das erfindungsgemäße Molekül exprimierenden Zellen kann jedoch auch eine Nukleotidsequenz kodierend für einen Glykophospholipid-Anker in das Nukleinsäurekonstrukt eingefügt werden.To anchor the active ingredient in the cell membrane of the invention However, cells expressing molecules can also encode a nucleotide sequence for a glycophospholipid anchor are inserted into the nucleic acid construct.

Die Einfügung eines Glykophospholipid-Ankers erfolgt im allgemeinen am 3' Ende der Nukleotidsequenz kodierend für das erfindungsgemäße Molekül und kann zusätzlich zur Einfügung einer Signalsequenz erfolgen.A glycophospholipid anchor is generally inserted at the 3 'end of the nucleotide sequence coding for the molecule according to the invention and can in addition to inserting a signal sequence.

Glykophospholipid-Anker sind beispielsweise für das CEA, für das N-CAM und für weitere Membranproteine, wie beispielsweise Thy-1, beschrieben worden.Glycophospholipid anchors are for example for the CEA, for the N-CAM and for other membrane proteins, such as Thy-1, have been described.

Durch diese Transmembranregion exprimiert die jeweilige Zelle das erfindungsgemäße Molekül auf der Zellmembran und erhält somit einen "Rezeptor", der für diejenigen Ziel- oder Effektorstrukturen spezifisch ist, welche durch die antigenbindenden Teile des erfindungsgemäßen Moleküls erkannt werden.The respective cell expresses this through this transmembrane region molecule according to the invention on the cell membrane and thus receives a "receptor", which is specific to those target or effector structures which are characterized by the antigen-binding parts of the molecule according to the invention can be recognized.

Ein anderer bevorzugter Rezeptor ist die transmembran- bzw. signaltransduzierende Domäne eines Rezeptors, beispielsweise der T-Zellrezeptor oder der M-CSF- Rezeptor. Hierdurch kann die das erfindungsgemäße Molekül auf der Zellmembran exprimierende Zelle durch Bindung der Zielstrukturen zu spezifischen Funktionen aktiviert werden. Derartige spezifische Funktionen können beispielsweise eine zytotoxische Reaktionen von T-Lymphozyten, Phagozytosereaktionen von Makrophagen und Granulozyten oder Exozytosereaktionen von Granulozyten, Monozyten und Makrophagen sein. Another preferred receptor is the transmembrane or signal transducing Domain of a receptor, for example the T cell receptor or the M-CSF Receptor. As a result, the molecule according to the invention can be on the cell membrane expressing cell by binding the target structures to specific functions to be activated. Such specific functions can include, for example cytotoxic reactions of T lymphocytes, phagocytosis reactions of Macrophages and granulocytes or exocytosis reactions of granulocytes, Be monocytes and macrophages.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Zelle enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor insbesondere eine Bakterien-, Insekten-, Hefe- oder Säugerzelle. Als Säugerzellen sind neben den allgemein bekannten Zellen zur Expression von Nukleinsäuren, wie z. B. CHO- oder BHK-Zellen, auch ein Lymphozyt, ein Makrophage, eine Gliazelle, eine Epithelzelle, eine Leberzelle, eine Nierenzelle, eine Knochenmarkszelle, eine Endothelzelle, eine glatte oder quergestreifte Muskelzelle oder ein Fibroblast geeignet.Another object of the present invention is therefore a cell containing a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention in particular a bacterial, insect, yeast or mammalian cell. As mammalian cells are in addition to the generally known cells for the expression of nucleic acids, such as e.g. B. CHO or BHK cells, also a lymphocyte, a macrophage, a glial cell, an epithelial cell, a liver cell, a kidney cell, a bone marrow cell, one Endothelial cell, a smooth or striated muscle cell, or fibroblast suitable.

Die zuletzt genannten Zellen sind insbesondere für eine gentherapeutische Anwendung geeignet, da diese Zellen, welche das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt enthalten, einem Patienten lokal oder parenteral, z. B. intravenös, intraarteriell, in eine Körperhöhle, in ein Organ oder subkutan injiziert werden können, um so zur Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung zu dienen.The latter cells are especially for a gene therapy Suitable application because these cells, which the inventive Contain nucleic acid construct, a patient locally or parenterally, e.g. B. injected intravenously, intraarterially, into a body cavity, into an organ or subcutaneously can be used to prevent or treat a disease.

Für die gentherapeutische Behandlung von Erkrankungen können jedoch auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte direkt dem Patienten lokal, in eine Körperhöhle, in ein Organ, in das Blutgefäßsystem, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden.However, for the gene therapy treatment of diseases Nucleic acid constructs according to the invention directly to the patient locally, in a Body cavity, in an organ, in the blood vessel system, subcutaneously or intramuscularly be administered.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Arzneimittel enthaltend ein erfindungsgemäßes Molekül, eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, einen erfindungsgemäßen Vektor oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie ein Diagnostikum enthaltend ein erfindungsgemäßes Molekül, welches auch gegen einen Analyten gerichtet ist, wie oben bereits näher beschrieben.Another object of the present invention is therefore also a pharmaceutical containing a molecule according to the invention, a nucleic acid according to the invention, a vector according to the invention or a cell according to the invention and a Diagnostic agent containing a molecule according to the invention, which is also against an analyte is directed, as already described in more detail above.

Das erfindungsgemäße Molekül, die erfindungsgemäße Nukleinsäure, der erfindungsgemäße Vektor oder die erfindungsgemäße Zelle eignen sich somit zur Therapie, Prophylaxe oder Diagnose von beispielsweise Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Entzündungserkrankungen, Erkrankungen des Blutes, insbesonderes des Blutgerinnungs- und/oder Blutkreislaufsystems, Erkrankungen des Nervensystems und/oder Infektionserkrankungen.The molecule according to the invention, the nucleic acid according to the invention, the The vector according to the invention or the cell according to the invention are therefore suitable for Therapy, prophylaxis or diagnosis of, for example, tumor diseases, Autoimmune diseases, inflammatory diseases, diseases of the blood, especially the blood coagulation and / or blood circulation system, diseases of the nervous system and / or infectious diseases.

Die Wahl der einzelnen Komponenten richtet sich hierbei im allgemeinen nach der Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände. Im folgenden werden die einzelnen Komponenten und deren Verwendungen allgemein und beispielhaft näher beschrieben:
Für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Gegenstandes kann, wie bereits in Fig. 3 und 4 beispielhaft dargestellt, das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt an seinem 5'-Ende mit dem 3'-Ende einer Nukleinsaure kodierend für eine Signalsequenz und diese wiederum an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende einer Promotorsequenz verknüpft.The choice of the individual components generally depends on the use of the objects according to the invention. The individual components and their uses are described in more detail below in general and by way of example:
For the manufacture of an article according to the invention, as in Fig. 3 and exemplified 4 nucleic acid construct of the invention at its 5 'end to the 3' end of a nucleic acid can encoding a signal sequence and those with in turn at its 5 'end linked to the 3 'end of a promoter sequence.

Zu den auszuwählenden Promotorsequenzen gehören beispielsweise uneingeschränkt aktivierbare Promotoren und Aktivatorsequenzen, wie beispiels weise der Promotor der RNA-Polymerase III, der Promotor der RNA-Polymerase II, der CMV-Promotor und/oder -Enhancer, der SV40 Promotor; oder virale Promotor- und Aktivatorsequenzen, wie beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, HIV.The promoter sequences to be selected include, for example promoters and activator sequences that can be activated without restriction, such as the promoter of RNA polymerase III, the promoter of RNA polymerase II, the CMV promoter and / or enhancer, the SV40 promoter; or viral promoter and activator sequences such as HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, HIV.

Bei Verwendung des HlV-Promotors wird vorzugsweise die gesamte LTR-Sequenz einschließlich der TAR-Sequenz [Position ≦ -453 bis ≧ 80, Rosen et al., Cell 41, 813 (1985)] als virusspezifischer Promotor eingesetzt.When using the HIV promoter, the entire LTR sequence is preferred including the TAR sequence [position ≦ -453 to ≧ 80, Rosen et al., Cell 41, 813 (1985)] as a virus-specific promoter.

Andere auszuwählende Promotorsequenzen sind z. B. metabolisch aktivierbare Promotor- und Enhancersequenzen, wie beispielsweise der durch Hypoxie induzierbare Enhancer, zellzyklusspezifisch aktivierbare Promotoren, wie beispielsweise der Promotor des cdc25C Gens, des cdc25B Gens, des Cyclin A Gens, des cdc2 Gens, des B-myb Gens, des DHFR-Gens oder des E2F-1 Gens oder aber Bindesequenzen für zellzyklusspezifisch auftretende oder aktivierte Transkriptionsfaktoren. Zu diesen Bindesequenzen gehören beispielsweise Bindesequenzen für c-myc Proteine. Zu diesen Bindesequenzen sind Monomere oder Multimere der als Myc E-Box bezeichneten Nukleotidsequenz [5'-GGAAGCAGACCAGGTGGTCTGCTTCC-3'] zu zählen.Other promoter sequences to be selected are e.g. B. metabolically activatable Promoter and enhancer sequences, such as that by hypoxia inducible enhancers, cell cycle-specific activators, such as for example the promoter of the cdc25C gene, the cdc25B gene, the cyclin A Gene, the cdc2 gene, the B-myb gene, the DHFR gene or the E2F-1 gene or else binding sequences for cell cycle-specific occurring or activated Transcription factors. These binding sequences include, for example Binding sequences for c-myc proteins. To these binding sequences are monomers or multimers of the nucleotide sequence referred to as Myc E-Box [5'-GGAAGCAGACCAGGTGGTCTGCTTCC-3 '] to count.

Weitere auszuwählende Promotorsequenzen sind z. B. Tetrazyklin aktivierbare Promotoren, wie beispielsweise der Tetrazyklin-Operator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor, oder Chimäre Promotoren. Ein chimärer Promotor stellt die Kombination einer stromaufwärts gelegenen zellspezifisch, metabolisch oder virusspezifisch aktivierbaren Aktivatorsequenz mit einem stromabwärts gelegenen Promotormodul dar, welches die Nukleotidsequenz CDE-CHR oder E2FBS-CHR enthält, an welche suppressive Proteine binden, die hierdurch die Aktivierung der stromaufwärts gelegenen Aktivatorsequenz in G₀- und G₁-Phase des Zellzyklus hemmen können (WO 96/06943; Lucibello et al., EMBO J. 14, 12(1994)).Further promoter sequences to be selected are e.g. B. Tetracycline activatable promoters, such as the tetracycline operator in combination with a corresponding repressor, or chimeric promoters. A chimeric promoter represents the combination of an upstream cell-specific, metabolically or virus-specific activator sequence with a downstream promoter module which contains the nucleotide sequence CDE-CHR or E2FBS-CHR, to which suppressive proteins bind, which hereby activates the upstream activator sequence in G ₀ and G ₁ phase of the cell cycle can inhibit (WO 96/06943; Lucibello et al., EMBO J. 14, 12 (1994)).

Andere auszuwählende Promotorsequenzen sind z. B. zellspezifisch aktivierbare Promotoren, wie vorzugsweise Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die bevorzugt in ausgewählten Zellen gebildet werden.Other promoter sequences to be selected are e.g. B. cell-specific activatable Promoters, such as preferably promoters or activator sequences Promoters or enhancers of such genes that code for proteins that are preferably formed in selected cells.

Zum Beispiel sind im Sinne der Erfindung in folgenden Zellen Promotoren für fol gende Proteine bevorzugt zu verwenden:
Promotor- und Aktivatorsequenzen, die in Endothelzellen aktiviert werden, sind genregulatorische Sequenzen aus Genen, die beispielsweise für folgende Proteine kodieren: Hirn-spezifischer, endothelialer Glucose-1-Transporter, Endoglin, VEGF-Rezeptor-1 (flt-1), VEGF-Rezeptor-2 (flk-1, KDR), til-1 oder til-2, B61-Rezeptor (Eck- Rezeptor), B61, Endothelin, im speziellen Endothelin B oder Endothelin-1, Endothelin-Rezeptoren, insbesondere der Endothelin B-Rezeptor, Mannose-6- Phosphat-Rezeptoren, von Willebrand Faktor, IL-1α, IL-1β, IL-1-Rezeptor, Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1) oder synthetische Aktivatorsequenzen, die aus oligomerisierten Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, die preferentiell oder selektiv in Endothelzellen aktiv sind, bestehen. Ein Beispiel hierfür ist der Transkriptionsfaktor GATA-2, dessen Bindestelle im Endothelin-1 Gen 5'-TTATCT-3' ist.For example, in the context of the invention, promoters for the following proteins should preferably be used in the following cells:
Promoter and activator sequences that are activated in endothelial cells are gene regulatory sequences from genes that code for the following proteins, for example: brain-specific, endothelial glucose-1 transporter, endoglin, VEGF receptor-1 (flt-1), VEGF- Receptor-2 (flk-1, KDR), til-1 or til-2, B61 receptor (corner receptor), B61, endothelin, in particular endothelin B or endothelin-1, endothelin receptors, in particular endothelin B- Receptor, Mannose-6 Phosphate Receptors, von Willebrand Factor, IL-1α, IL-1β, IL-1 Receptor, Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1) or synthetic activator sequences that result from oligomerized binding sites for transcription factors that are preferential or are selectively active in endothelial cells. An example of this is the transcription factor GATA-2, whose binding site in the endothelin-1 gene is 5'-TTATCT-3 '.

Promotoren oder Aktivatorsequenzen, die in Zellen in Nachbarschaft aktivierter Endothelzellen aktiviert werden, sind genregulatorische Sequenzen aus Genen, die beispielsweise für folgende Proteine kodieren: VEGF, wobei die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen die 5' flankierende Region, die 3' flankierende Region, das c-Src-Gen oder das v-Src-Gen sind, oder Steroid-Hormonrezeptoren und deren Promotorelemente, insbesondere der Maus-Mammatumor-Virus- Promotor.Promoters or activator sequences that are activated in nearby cells Endothelial cells are activated, gene regulatory sequences from genes that For example, code for the following proteins: VEGF, the gene regulatory Sequences for the VEGF gene the 5 'flanking region, the 3' flanking region Region that is the c-Src gene or the v-Src gene, or steroid hormone receptors and their promoter elements, in particular the mouse mammary tumor virus Promoter.

Promotoren oder Aktivatorsequenzen, die in Muskelzellen, insbesondere glatten Muskelzellen aktiviert werden, sind genregulatorische Sequenzen aus Genen, die beispielsweise für folgende Proteine kodieren: Tropomyosin, α-Actin, α-Myosin, Rezeptor für PDGF, Rezeptor für FGF, MRF-4, Phosphofructokinase A, Phosphoglyceratemutase, Troponin C, Myogenen, Rezeptoren für Endothelin A, Desmin, VEGF (s. o.), "artifizielle" Promotoren, oder Promotoren muskelspezifischer Transkriptionsfaktoren, wie Faktoren der Helix-Loop-Helix (HLH)-Familie (MyoD, Myf-5, Myogenen, MRF4) oder das Zinkfingerprotein GATA-4.Promoters or activator sequences that are particularly smooth in muscle cells Muscle cells are activated are gene regulatory sequences from genes that code for the following proteins, for example: tropomyosin, α-actin, α-myosin, Receptor for PDGF, receptor for FGF, MRF-4, phosphofructokinase A, Phosphoglycerate mutase, troponin C, myogens, receptors for endothelin A, Desmin, VEGF (see above), "artificial" promoters, or muscle-specific promoters Transcription factors, such as factors of the Helix-Loop-Helix (HLH) family (MyoD, Myf-5, myogens, MRF4) or the zinc finger protein GATA-4.

Die HLH-Proteine sowie GATA-4 zeigen muskelspezifische Transkription nicht nur mit Promotoren von muskelspezifischen Genen, sondern auch im heterologen Kontext, so auch mit artifiziellen Promotoren. Derartige artifizielle Promotoren sind beispielsweise multiple Kopien der (DNA) Bindestelle für muskelspezifische HLH- Proteine wie der E-Box (Myo D) (z. B. 4× AGCAGGTGTTGGGAGGC) oder multiple Kopien der DNA Bindestelle für GATA-4 des α-Myosin-Heavy Chain Gens (z. B. 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCGGATGGGGAGATAGAGG3')
Promotoren und Aktivatorsequenzen, die in Gliazellen aktiviert werden, sind z. B. genregulatorische Sequenzen, aus Genen, die beispielsweise für folgende Proteine kodieren: das Schwannzell-spezifische Protein Periaxin, Glutaminsynthetase, das Gliazell-spezifische Protein (Glial fibrillary acid protein = GFAP), das Gliazellprotein S100b, IL-6, CNTF, 5-HT-Rezeptoren, TNFα, IL-10, Insulin-like Growth Factor Receptor I and II oderVEGF (s. o.).The HLH proteins and GATA-4 show muscle-specific transcription not only with promoters of muscle-specific genes, but also in a heterologous context, including with artificial promoters. Such artificial promoters are, for example, multiple copies of the (DNA) binding site for muscle-specific HLH proteins such as the E-Box (Myo D) (e.g. 4 × AGCAGGTGTTGGGAGGC) or multiple copies of the DNA binding site for GATA-4 of the α-myosin Heavy chain gens (e.g. 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCGGATGGGGAGATAGAGG3 ')
Promoters and activator sequences that are activated in glial cells are e.g. B. gene regulatory sequences from genes which code for example for the following proteins: the Schwann cell-specific protein periaxin, glutamine synthetase, the glial cell-specific protein (Glial fibrillary acid protein = GFAP), the glial cell protein S100b, IL-6, CNTF, 5- HT receptors, TNFα, IL-10, insulin-like growth factor receptor I and II or VEGF (see above).

Promotoren und Aktivatorsequenzen, die in blutbildenden Zellen aktiviert werden, sind z. B. Promotorsequenzen für Gene eines Cytokins oder seines Rezeptors, die in blutbildenden Zellen oder in benachbarten Zellen, wie beispielsweise dem Stroma, exprimiert sind.Promoters and activator sequences that are activated in hematopoietic cells, are z. B. promoter sequences for genes of a cytokine or its receptor, which in hematopoietic cells or in neighboring cells, such as the stroma, are expressed.

Hierzu gehören Promotorsequenzen aus Genen, die beispielsweise für folgende Cytokine und ihre Rezeptoren kodieren: Stem Cell Factor-Receptor, Stem Cell Factor, IL-1α, IL-1-Rezeptor, IL-3, IL-3-Rezeptor (α-subunit), IL-3-Rezeptor (β-subunit), IL-6, IL-6-Rezeptor, GM-CSF, GM-CSF-Rezeptor (α-Kette), Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1), wobei der Promotor von IRF-1 durch IL-6 gleichermaßen aktiviert wird wie durch IFNγ oder IFNβ, Erythropoietin oder Erythropoietin-Rezeptor.These include promoter sequences from genes, for example for the following Coding cytokines and their receptors: stem cell factor receptor, stem cell Factor, IL-1α, IL-1 receptor, IL-3, IL-3 receptor (α-subunit), IL-3 receptor (β-subunit), IL-6, IL-6 receptor, GM-CSF, GM-CSF receptor (α chain), interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1), the promoter of IRF-1 by IL-6 is activated in the same way as by IFNγ or IFNβ, erythropoietin or Erythropoietin receptor.

Promotoren und Aktivatorsequenzen, die in Lymphozyten und/oder Makrophagen aktiviert werden, sind beispielsweise die Promotor- und Aktivatorsequenzen der Gene kodierend für Cytokine, Cytokinrezeptoren und Adhäsionsmoleküle und Rezeptoren für das Fc-Fragment von Antikörpern, wie z. B. IL-1-Rezeptor, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-2-Rezeptor, IL-3, IL-3-Rezeptor (α-subunit), IL-3-Rezeptor (β-subunit), IL4, IL-4-Rezeptor, IL-5, IL-6, IL-6-Rezeptor, Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1), wobei der Promotor von IRF-1 durch IL-6 gleichermaßen aktiviert wird wie durch IFNγ oder IFNβ, IFNγ Responsive Promotor, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IFNγ, GM-CSF, GM-CSF-Rezeptor (α-Kette), IL-13, LIF, Makrophagen-Colony Stimulating Factor (M-CSF)-Rezeptor, Typ I und II Makrophagen Scavenger Rezeptoren, MAC-1 (Leukozytenfunktionsantigen), LFA-1α (Leukozytenfunktionsantigen) oder p150,95 (Leukozytenfunktionsantigen).Promoters and activator sequences found in lymphocytes and / or macrophages are activated, for example, the promoter and activator sequences Genes coding for cytokines, cytokine receptors and adhesion molecules and Receptors for the Fc fragment of antibodies, such as. B. IL-1 receptor, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-2 receptor, IL-3, IL-3 receptor (α-subunit), IL-3 receptor (β-subunit), IL4, IL-4 receptor, IL-5, IL-6, IL-6 receptor, interferon regulatory factor 1 (IRF-1), the promoter of IRF-1 being activated by IL-6 as well as by IFNγ or IFNβ, IFNγ Responsive Promoter, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IFNγ, GM-CSF, GM-CSF receptor (α chain), IL-13, LIF, macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) receptor, type I and II macrophage scavenger receptors, MAC-1 (Leukocyte function antigen), LFA-1α (leukocyte function antigen) or p150.95 (Leukocyte function antigen).

Promotor- und Aktivatorsequenzen, die in Synovialzellen aktiviert werden, sind beispielsweise die Promotorsequenzen von Genen kodierend für Matrix- Metalloproteinasen (MMP), wie z. B. MMP-1 (interstitielle Kollagenase), MMP-3 (Stromelysin/Transin) oder Tissue Inhibitors of Metalloproteinases (TIMP), wie TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3.Promoter and activator sequences that are activated in synovial cells are for example the promoter sequences of genes coding for matrix Metalloproteinases (MMP) such as e.g. B. MMP-1 (interstitial collagenase), MMP-3 (Stromelysin / Transin) or Tissue Inhibitors of Metalloproteinases (TIMP), such as TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3.

Promotoren und Aktivatorsequenzen, die in Leukämiezellen aktiviert werden, sind beispielsweise Promotoren von Genen, die für folgende Proteine kodieren: c-myc, HSP-70, bcl-1/cyclin D-1, bcl-2, IL-6, IL-10, TNFα, TNFβ, HOX-11, BCR-Abl, E2A- PBX-1, PML-RARA (Promyelocytic Leukemia - Retinoic Acid Receptor) oder c-myc, wobei c-myc-Proteine an und aktivieren Multimere der als Myc E-Box bezeichneten Nukleotidsequenz (5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3') binden.Promoters and activator sequences that are activated in leukemia cells for example promoters of genes which code for the following proteins: c-myc, HSP-70, bcl-1 / cyclin D-1, bcl-2, IL-6, IL-10, TNFα, TNFβ, HOX-11, BCR-Abl, E2A- PBX-1, PML-RARA (Promyelocytic Leukemia - Retinoic Acid Receptor) or c-myc, where c-myc proteins turn on and activate multimers called Myc E-Box Bind nucleotide sequence (5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3 ').

Promotoren oder Aktivatorsequenzen, die in Tumorzellen aktiviert werden, sind z. B. genregulatorische Nukleotidsequenzen, mit der Transkriptionsfaktoren, gebildet oder aktiv in Tumorzellen, interagieren.Promoters or activator sequences that are activated in tumor cells are e.g. B. gene regulatory nucleotide sequences with which transcription factors are formed or actively interact in tumor cells.

Im Sinne dieser Erfindung zählen zu den bevorzugten Promotoren oder Aktivator sequenzen genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die besonders in Krebszellen oder Sarkomzellen gebildete Proteine kodieren. So wird bei kleinzelligen Bronchialkarzinomen bevorzugt der Promotor des N-CAM-Proteins, bei Ovarialkarzinomen der Promotor des "Hepatitis growth factor"-Rezeptors oder des L-Plastin und bei Pankreaskarzinomen der Promotor des L-Plastins oder des polymorphen epithelialen Mucins (PEM) verwendet.For the purposes of this invention, the preferred promoters or activators are sequences gene regulatory sequences or elements from genes that are special encode proteins formed in cancer cells or sarcoma cells. So at small cell bronchial carcinomas prefer the promoter of the N-CAM protein Ovarian cancer promoter of the "hepatitis growth factor" receptor or L-plastin and in pancreatic carcinomas the promoter of L-plastin or polymorphic epithelial mucins (PEM) are used.

Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß durch die Verknüpfung der einzelnen Komponenten eine heterodimere Assoziation begünstigt wird, so daß überwiegend einzelkettige, mehrfach-antigenbindende Moleküle entstehen. Ferner wird die Dissoziation der Dimere, wie es bereits für scFv-Fragmente gezeigt werden konnte (s. z. B. Glockshuber et al., Biochem. 29, 1362-1367, 1990) reduziert. Somit können die erfindungsgemäßen Moleküle weniger aufwendig und in homogenerer Form hergestellt werden als die sogenannten "Diabodies", selbst wenn diese disulfidstabilisiert sind oder in Form von "knob-into-hole-Diabodies" vorliegen.A major advantage of the present invention is that by linking of the individual components a heterodimeric association is favored, so that predominantly single-chain, multi-antigen-binding molecules are formed. Further will dissociate the dimers as already shown for scFv fragments could (see e.g. Glockshuber et al., Biochem. 29, 1362-1367, 1990) reduced. Consequently the molecules of the invention can be less complex and more homogeneous Form are manufactured as the so-called "diabodies", even if these are disulfide stabilized or are in the form of "knob-into-hole diabodies".

Desweiteren ist für die Herstellung des erfindungsgemäßen Moleküls nur eine Signalsequenz und eine Ribosomenbindestelle (RBOS) notwendig. Im Gegensatz hierzu werden bei den erfindungsgemäßen "Diabodies" für jede Kette eine Signalsequenz und eine RBS benötigt. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß bei den erfindungsgemäßen Molekülen äquimolare Mengen der variablen Domänen exprimiert werden, während bei der Expression der zwei Ketten von "Diabodies" nicht äquimolare Mengen entstehen können und dadurch der Anteil an nichtfunktionellen Homodimeren erhöht wird.Furthermore, there is only one for the preparation of the molecule according to the invention Signal sequence and a ribosome binding site (RBOS) necessary. In contrast for this purpose, in the "diabodies" according to the invention, one for each chain Signal sequence and an RBS required. Another advantage of the present Invention is that in the molecules of the invention equimolar amounts of variable domains are expressed while expressing the two chains of "diabodies" non-equimolar amounts can arise and thus the proportion on non-functional homodimers is increased.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Moleküls ist, daß es sich einfach und in funktioneller Form sowohl in Bakterien wie auch in Hefen, Bacculoviren sowie eukaryotischen Zellen exprimieren lassen. Zudem besteht neben der Sekretion der erfindungsgemäßen Moleküle die Möglichkeit, diese auch intrazellulär bzw. -membranständig zu exprimieren (s. z. B. Biocca & Cattaneo, Trends Gell Biol. 5, 248-252 (1995)). Another advantage of the molecule according to the invention is that it is simple and in functional form in bacteria as well as in yeasts, bacculoviruses as well have eukaryotic cells expressed. In addition to secretion, there is also Molecules according to the invention the possibility of also intracellularly or to express membrane-bound (see e.g. Biocca & Cattaneo, Trends Gell Biol. 5, 248-252 (1995)).

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Moleküle ist, daß sie sowohl als Diagnostikum, als auch als Wirkstoff zur Prophylaxe und/oder Therapie einer Erkrankung, wie bispezifische Antikörper, breit einsetzbar sind.Another advantage of the molecules of the invention is that they are both Diagnostic agent, as well as an active ingredient for prophylaxis and / or therapy of a Disease, such as bispecific antibodies, can be used widely.

Die Gene von Effektoren und Promotorsequenzen sind im Hinblick auf die gewünschte Anwendung und unter Berücksichtigung der zu transduzierenden Zielzelle auszuwählen. Beispielsweise sind bei folgenden Erkrankungen folgende Kombinationen von Promotorsequenzen und Gene für Effektoren zu wählen:The genes of effectors and promoter sequences are in terms of desired application and taking into account the transduced Select target cell. For example, the following are the following diseases To choose combinations of promoter sequences and genes for effectors:

Therapie von TumorenTherapy of tumors

Für die Therapie von Tumoren dienen als Zielzellen beispielsweise proliferierende Endothelzellen, oder der Endothelzelle benachbarte Stromazellen und Muskelzellen, oder Tumorzellen oder Leukämiezellen, als Promotoren beispielsweise endothelzellspezifische und zellzyklusspezifische, oder zellunspezifische oder muskelzellspezifische und zellzyklusspezifische, oder tumorzellspezifische (solide Tumoren, Leukämien) und zellzyklusspezifische Promotoren, und als Effektoren beispielsweise folgende Gene:
Gene von Inhibitoren der Zellproliferation sind zum Beispiel vom Retinoblastomprotein (pRb=p110) oder die verwandten p107 und p130 Proteine. Das Retinoblastomprotein (pRb/p110) und die verwandten p107 und p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt sind solche Gene von Zellzyklusinhibitoren zu verwenden, welche Mutationen für die Inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Beispiele für diese Mutationen wurden beschrieben für das p110. In analoger Weise wird die DNA-Sequenz für das p107 Protein oder das p130 Protein mutiert. Desweiteren ist das Gen vom p53 Protein geeignet. Das Protein p53 wird in der Zelle entweder durch Bindung an spezielle Proteine, wie beispielsweise MDM2, oder durch Oligomerisierung des p53 über das dephosphorylierte c terminale Serin inaktiviert. Bevorzugt wird somit eine DNA-Sequenz für ein p53 Protein verwendet, welches C-terminal um das Serin 392 verkürzt ist. Weitere geeignete Gene sind das Gen vom p21 (WAF-1), vom p16 Protein, von anderen cdk-Inhibitoren, vom GADD45 Protein oder vom bak Protein.For the therapy of tumors, target cells, for example, proliferating endothelial cells, or stromal cells and muscle cells adjacent to the endothelial cell, or tumor cells or leukemia cells, serve as promoters, for example endothelial cell-specific and cell cycle-specific, or cell-unspecific or muscle cell-specific and cell cycle-specific, or tumor cell-specific leukemia-specific (solid tumor) -specific (solid tumors) , and as effectors, for example, the following genes:
Genes of inhibitors of cell proliferation are, for example, of the retinoblastoma protein (pRb = p110) or the related p107 and p130 proteins. The retinoblastoma protein (pRb / p110) and the related p107 and p130 proteins are inactivated by phosphorylation. Those genes of cell cycle inhibitors which have mutations for the inactivation sites of the expressed proteins are preferably to be used without their function being impaired thereby. Examples of these mutations have been described for p110. The DNA sequence for the p107 protein or the p130 protein is mutated in an analogous manner. The p53 protein gene is also suitable. The protein p53 is inactivated in the cell either by binding to special proteins, such as MDM2, or by oligomerizing the p53 via the dephosphorylated c-terminal serine. A DNA sequence is therefore preferably used for a p53 protein which is shortened by the serine 392 at the C-terminal. Other suitable genes are the gene from p21 (WAF-1), from p16 protein, from other cdk inhibitors, from GADD45 protein or from bak protein.

Gene von Gerinnung induzierenden Faktoren und Angiogeneseinhibitoren sind zum Beispiel vom Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1), PAI-2, PAI-3, Angiostatin, Interferone (IFNα, IFNβ oder IFNγ), Platelet factor 4, IL-12, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, Leukemia Inhibitory Factor (LIF) oder Tissue Factor (TF) und dessen gerinnungsaktive Fragmente.Genes from coagulation-inducing factors and angiogenesis inhibitors are known to Example of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), PAI-2, PAI-3, angiostatin, Interferons (IFNα, IFNβ or IFNγ), platelet factor 4, IL-12, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, Leukemia inhibitory factor (LIF) or tissue factor (TF) and its coagulation-active fragments.

Gene von zytostatischen und zytotoxischen Proteinen, sind zum Beispiel vom Perforin, Granzym, IL-2, IL-4, IL-12, Interferone, wie beispielsweise IFN-α, IFNβ oder IFNγ, TNF, wie TNFα oder TNFβ, Oncostatin M, Sphingomyelinase oder Magainin und Magainin-Derivate.Genes of cytostatic and cytotoxic proteins are, for example, from Perforin, granzyme, IL-2, IL-4, IL-12, interferons such as IFN-α, IFNβ or IFNγ, TNF, such as TNFα or TNFβ, Oncostatin M, Sphingomyelinase or Magainin and Magainin derivatives.

Gene von Induktoren von Entzündungen sind zum Beispiel vom IL-1, IL-2, RANTES (MCP-2) monocyte chemotactic and activating factor (MCAF), IL-8, macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -β), neutrophil activating protein-2 (NAP-2), IL-3, IL-5, human leukemia inhibitory factor (LIF), IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Cobra venum factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welchem dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktionell entsprechen, d. h. welche an den Komplementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen, menschlichen Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b, von Spaltprodukten des menschlichen Komplementfaktors C3, welche funktio nell und strukturell dem CVF ähneln, oder von bakteriellen Proteinen, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Salmonella typhimurium, "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus, Moduline besonders von gram-negativen Bakterien, "Major outer membrane protein" von Legionellen oder von Haemophilus influenza Typ B oder von Klebsiellen oder M- Moleküle von Streptokokken Gruppe G.Genes from inflammation inducers are for example from IL-1, IL-2, RANTES (MCP-2) monocyte chemotactic and activating factor (MCAF), IL-8, macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -β), neutrophil activating protein-2 (NAP-2), IL-3, IL-5, human leukemia inhibitory factor (LIF), IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Cobra venum factor (CVF) or partial sequences from the CVF, which the functionally correspond to human complement factor C3b, d. H. which of the Can bind complement factor B and after splitting by factor D a C3 Convertase represent human complement factor C3 or its partial sequence C3b, of cleavage products of the human complement factor C3, which functio similar in structure and structure to CVF, or bacterial proteins which Activate complement or trigger inflammation, such as Porine by Salmonella typhimurium, "clumping" factors of Staphylococcus aureus, Moduline especially of gram-negative bacteria, "Major outer membrane protein" from Legionella or from Haemophilus influenza type B or from Klebsiell or M- Group G. Streptococcal Molecules

Gene von Enzymen für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika, sind zum Beispiel von Enzymen, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in aktive Zytostatika (Drugs) spalten. Derartige Substanzen und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Mullen, Pharmac. Ther 63, 199 (1994)) und Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) übersichtlich beschrieben worden. Beispielsweise kann die DNA-Sequenz eines der folgenden Enzyme zu verwenden: Herpes Simplex Virus thymidinkinase, Varizella Zoster Virus Thymidinkinase, bakterielle Nitroreduktase, bakterielle β-Glucuronidase, pflanzliche β-Glucuronidase aus Secale cereale, humane β-Glucuronidase, humane Carboxypeptidase (CB) zum Beispiel CB-A der Mastzelle, CB-B des Pankreas oder bakterielle Carboxypeptidase, bakterielle β-Laktamase, bakterielle Cytosinedeaminase, humane Katalase bzw. Peroxidase, Phosphatase, im besonderen humane alkalische Phosphatase, humane saure Prostataphosphatase oder Typ 5 saure Phosphatase, Oxidase, im besonderen humane Lysyloxidase oder humane saure D-Aminooxidaseperoxidase, im besonderen humane Gluthationperoxidase, humane eosinophile Peroxidase oder humane Schilddrüsenperoxidase, β-Galaktosidase oder α-Galaktosidase. Besonders bevorzugt ist eine β-Galaktosidase zur Umwandlung des Prodrug Daunomycin-β-D- galaktopyranosid in das Zytostatikum Daunomycin.Genes of enzymes for the activation of precursors of cytostatics are known for Example of enzymes that convert inactive prodrugs into active ones Split cytostatics (drugs). Such substances and the associated ones Prodrugs and drugs have already been developed by Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Mullen, Pharmac. Ther 63, 199 (1994)) and Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) has been clearly described. For example, the DNA sequence can be one of the use the following enzymes: herpes simplex virus thymidine kinase, varicella Zoster virus thymidine kinase, bacterial nitroreductase, bacterial β-glucuronidase, vegetable β-glucuronidase from Secale cereale, human β-glucuronidase, human carboxypeptidase (CB) for example CB-A of the mast cell, CB-B of the pancreas or bacterial carboxypeptidase, bacterial β-lactamase, bacterial cytosine deaminase, human catalase or peroxidase, phosphatase, im special human alkaline phosphatase, human acidic prostate phosphatase or type 5 acid phosphatase, oxidase, in particular human lysyl oxidase or human acidic D-aminooxidase peroxidase, especially human Gluthation peroxidase, human eosinophilic peroxidase or human Thyroid peroxidase, β-galactosidase or α-galactosidase. Especially a β-galactosidase is preferred for converting the prodrug daunomycin-β-D- galactopyranoside in the cytostatic drug daunomycin.

Therapie von Autoimmunerkrankungen und EntzündungenTherapy of autoimmune diseases and inflammation

Für die Therapie von Autoimmunerkrankungen und Entzündungen dienen als Zielzellen beispielsweise proliferierende Endothelzellen oder Makrophagen und/oder Lymphozyten oder Synovialzellen, als Promotoren beispielsweise endothelzellspezifische und zellzyklusspezifische, oder makrophagen- und/oder lymphozytenspezifische und/oder zellzyklusspezifische, oder synovialzellspezifische und/oder zellzyklusspezifische Promotoren, und als Effektoren beispielsweise folgende Gene:
Gene für die Therapie von Allergien sind zum Beispiel von IFNβ, IFNγ, IL-10, Antikörper bzw. Antikörperfragmenten gegen IL-4, löslichen IL-4-Rezeptoren, IL-12 oder TGFβ.For the therapy of autoimmune diseases and inflammation, the target cells are, for example, proliferating endothelial cells or macrophages and / or lymphocytes or synovial cells, and the promoters are, for example, endothelial cell-specific and cell cycle-specific, or macrophage and / or lymphocyte-specific and / or cell cycle-specific, or synovial cell-specific and / or cell-specific and / or cell-specific and / or cell-specific the following genes as effectors:
Genes for the treatment of allergies are, for example, IFNβ, IFNγ, IL-10, antibodies or antibody fragments against IL-4, soluble IL-4 receptors, IL-12 or TGFβ.

Gene für die Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Organen sind zum Beispiel von IL-10, TGFβ, löslichen IL-1-Rezeptoren, löslichen IL-2-Rezeptoren, IL-1-Rezeptorantagonisten oder lösliche IL-6-Rezeptoren.Genes for the prevention of rejection of transplanted organs are used for Example of IL-10, TGFβ, soluble IL-1 receptors, soluble IL-2 receptors, IL-1 receptor antagonists or soluble IL-6 receptors.

Gene für die Therapie von Antikörper-mediierten Autoimmunerkrankungen sind zum Beispiel von TGFβ, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-12, löslichen IL-4-Rezeptoren, löslichen IL-6-Rezeptoren, immunsuppressiven Antikörpern oder dessen V_H- und V_L-enthaltende Fragmente.Genes for the therapy of antibody-mediated autoimmune diseases are, for example, TGFβ, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-12, soluble IL-4 receptors, soluble IL-6 receptors, immunosuppressive antibodies or their V _H - and V _L - containing fragments.

Gene für die Therapie von zellmediierten Autoimmunerkrankungen sind zum Beispiel von IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, TNFα oder TNFβ, IL-13, einem immunsuppressiven Antikörper oder dessen V_H- und V_L-enthaltende Fragmente.Genes for the therapy of cell-mediated autoimmune diseases are, for example, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, TNFα or TNFβ, IL-13, an immunosuppressive antibody or its V _H - and V _L -containing fragments.

Gene von Inhibitoren der Zellproliferation, zytostatische oder zytotoxische Proteine und Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika sind bereits oben näher beschrieben worden.Genes from inhibitors of cell proliferation, cytostatic or cytotoxic proteins and enzymes for the activation of precursors of cytostatics are already above have been described in more detail.

Gene für die Therapie der Arthritis sind beispielweise Strukturgene, deren exprimier tes Protein die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmt und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördert.Genes for the therapy of arthritis are, for example, structural genes whose express protein directly or indirectly inhibits inflammation in the joint, for example and / or the reconstitution of extracellular matrix (cartilage, connective tissue) in the Joint promotes.

Hierzu gehören zum Beispiel IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1-RA), da IL-1-RA die Bindung von IL-1α, β inhibiert; löslicher IL-1-Rezeptor; da löslicher IL-1-Rezeptor IL-1 bindet und inaktiviert; IL-6, da IL-6 die Sekretion von TIMP und Superoxiden erhöht und die Sekretion von IL-1 und TNFα durch Synovialzellen und Chondrozyten vermindert; löslicher TNF-Rezeptor, da löslicher TNF-Rezeptor TNF bindet und inaktiviert; IL-4, da IL-4 die Bildung und Sekretion von IL-1, TNFα und MMP inhibiert; IL-10, da IL-10 die Bildung und Sekretion von IL-1, TNFα und MMP inhibiert und die Sekretion von TIMP erhöht; Insulin-like growth factor (IGF-1), da IGF-1 die Synthese von extrazellulärer Matrix stimuliert; TGFβ, im speziellen TGFβ1 und TGFβ2, da TGFβ die Synthese von extrazellulärer Matrix stimuliert; Superoxiddismutase oder TIMP, im speziellen TIMP-1, TIMP-2 oder TIMP-3.These include, for example, IL-1 receptor antagonist (IL-1-RA), since IL-1-RA Inhibition of IL-1α, β inhibition; soluble IL-1 receptor; because soluble IL-1 receptor IL-1 binds and inactivates; IL-6, since IL-6 is the secretion of TIMP and super oxides increases and the secretion of IL-1 and TNFα by synovial cells and chondrocytes reduced; soluble TNF receptor because soluble TNF receptor binds TNF and inactivated; IL-4 because IL-4 is responsible for the formation and secretion of IL-1, TNFα and MMP inhibited; IL-10 because IL-10 is responsible for the formation and secretion of IL-1, TNFα and MMP inhibited and increased secretion of TIMP; Insulin-like growth factor (IGF-1) since IGF-1 stimulates the synthesis of extracellular matrix; TGFβ, especially TGFβ1 and TGFβ2, since TGFβ stimulates the synthesis of extracellular matrix; Superoxide dismutase or TIMP, in particular TIMP-1, TIMP-2 or TIMP-3.

Therapie des blutbildenden SystemsTherapy of the hematopoietic system

Für die Therapie der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes dienen als Zielzellen beispielsweise proliferierende, unreife Zellen des blutbildenden Systems oder Stromazellen benachbart den blutbildenden Zellen, als Promotoren beispielsweise für blutbildende Zellen spezifische und/oder zellzyklusspezifische, oder zellunspezifische und zellzyklusspezifische Promotoren, und als Effektoren beispielsweise folgende Gene: Gene für die Therapie der Anämie sind zum Beispiel vom Erythropoietin.For the therapy of poor formation of blood cells serve as Target cells, for example, proliferating, immature cells of the hematopoietic system or stromal cells adjacent to the hematopoietic cells, as promoters for example, specific for and / or cell cycle-specific for blood-forming cells, or cell-unspecific and cell cycle-specific promoters, and as effectors for example the following genes: genes for the treatment of anemia are for example from erythropoietin.

Gene für die Therapie der Leukopenie sind zum Beispiel vom G-CSF, GM-CSF oder M-CSF.Genes for the therapy of leukopenia are for example from G-CSF, GM-CSF or M-CSF.

Gene für die Therapie der Thrombozytopenie sind zum Beispiel vom IL-3, Leukemia Inhibitory Factor (LIF), IL-11 oder Thrombopoietin.Genes for the therapy of thrombocytopenia are, for example, from IL-3, leukemia Inhibitory factor (LIF), IL-11 or thrombopoietin.

Therapie des NervensystemsTherapy of the nervous system

Für die Therapie von Schäden des Nervensystems dienen als Zielzellen beispielsweise Gliazellen oder proliferierende Endothelzellen, als Promotoren beispielsweise Gliazell-spezifische und zellzyklusspezifische oder Endothelzell spezifische und zellzyklusspezifische, oder unspezifische und zellzyklusspezifische Promotoren, und als Effektoren beispielsweise folgende Gene:
Gene für neuronale Wachstumsfaktoren sind zum Beispiel vom FGF, Nerve growth factor (NGF), Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4) oder Ciliary neurotrophic factor (CNTF).For the therapy of damage to the nervous system, target cells, for example, are glial cells or proliferating endothelial cells, promoters, for example, glia cell-specific and cell cycle-specific or endothelial cell-specific and cell cycle-specific, or non-specific and cell cycle-specific promoters, and as effectors, for example, the following genes:
Genes for neuronal growth factors include FGF, nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3), neurotrophin-4 (NT-4) or ciliary neurotrophic factor (CNTF) .

Gene für Enzyme sind zum Beispiel Gene der Tyrosinhydroxylase oder Dopadecarboxylase.Genes for enzymes are, for example, genes of tyrosine hydroxylase or Dopadecarboxylase.

Gene für Cytokine und deren Inhibitoren, welche die neurotoxische Wirkung von TNFα inhibieren oder neutralisieren, sind zum Beispiel vom TGFβ; von löslichen TNF-Rezeptoren, da TNF-Rezeptoren TNFα neutralisieren; von IL-10, da IL-10 die Bildung von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4 inhibiert; von löslichen IL-1-Rezeptoren wie IL-1-Rezeptor I oder IL-1-Rezeptor II, da lösliche IL-1-Rezeptoren die Aktivität von IL-1 neutralisieren; vom IL-1-Rezeptor-Antagonist oder von löslichen IL-6-Rezeptoren. Genes for cytokines and their inhibitors, which the neurotoxic effect of Inhibiting or neutralizing TNFα are, for example, from TGFβ; of soluble TNF receptors because TNF receptors neutralize TNFα; of IL-10 because IL-10 is the Formation of IFNγ, TNFα, IL-2 and IL-4 inhibited; of soluble IL-1 receptors such as IL-1 receptor I or IL-1 receptor II because soluble IL-1 receptors inhibit the activity of Neutralize IL-1; from the IL-1 receptor antagonist or from soluble IL-6 receptors.

Therapie des Blutgerinnungs- und BlutkreislaufsystemsTherapy of the blood coagulation and blood circulation system

Für die Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems dienen als Zielzellen beispielsweise Endothelzellen, proliferierende Endothelzellen, somatische Zellen in Nachbarschaft von Endothelzellen und glatte Muskelzellen oder Makrophagen, als Promotoren beispielsweise zellunspezifische und zellzyklusspezifische, oder für Endothelzellen, glatte Muskelzellen oder Makrophagen spezifische und zellzyklusspezifische Promotoren, und als Effektoren beispielsweise folgende Gene:
Gene für die Inhibition der Gerinnung oder für die Förderung der Fibrinolyse sind zum Beispiel vom Tissue Plasminogen Activator (tPA), Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA), von Hybriden von tPA und uPA, vom Protein C, Hirudin, von Serin Proteinase lnhibitoren (Serpine), wie beispielsweise C-1S-Inhibitor, α1-Antitrypsin oder Antithrombin III, oder vom Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI).For the treatment of disorders of the blood coagulation and blood circulation system, target cells, for example, are endothelial cells, proliferating endothelial cells, somatic cells in the vicinity of endothelial cells and smooth muscle cells or macrophages, promoters, for example, cell-unspecific and cell cycle-specific, or endothelial cells, smooth muscle cells or macrophages-specific and cell cycle-specific , and as effectors, for example, the following genes:
Genes for the inhibition of coagulation or for the promotion of fibrinolysis are for example from the tissue plasminogen activator (tPA), urokinase-type plasminogen activator (uPA), from hybrids of tPA and uPA, from protein C, hirudin, from serine proteinase inhibitors ( Serpine), such as C-1S inhibitor, α1-antitrypsin or antithrombin III, or the tissue factor pathway inhibitor (TFPI).

Gene für die Förderung der Gerinnung sind zum Beispiel vom F VIII, F IX, von Willebrand factor, F XIII, PAI-1, PAI-2 oder Tissue Factor and Fragmente hiervon.Genes for promoting coagulation are, for example, from F VIII, F IX, from Willebrand factor, F XIII, PAI-1, PAI-2 or tissue factor and fragments thereof.

Gene für Angiogenesefaktoren sind zum Beispiel vom VEGF oder FGF.Genes for angiogenesis factors are, for example, from VEGF or FGF.

Gene für die Blutdrucksenkung sind zum Beispiel vom Kallikrein oder Endothelzell "nitric oxide synthase".Genes for lowering blood pressure are, for example, from kallikrein or endothelial cells "nitric oxide synthase".

Gene für die Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen nach Verletzungen der Endothelschicht sind zum Beispiel von einem antiproliferativen, zytostatischen oder zytotoxischen Protein oder von einem Enzym zur Aufspaltung von Vorstufen von Zytostatika in Zytostatika, wie bereits oben aufgeführt, oder von einem Fusionsprotein eines dieser Wirkstoffe mit einem Liganden, beispielsweise einem Antikörper oder Antikörperfragmenten, der für Muskelzellen spezifisch ist.Genes for inhibiting smooth muscle cell proliferation after injury the endothelial layer are, for example, of an antiproliferative, cytostatic or cytotoxic protein or from an enzyme to break down precursors from cytostatics to cytostatics, as listed above, or from one Fusion protein of one of these active ingredients with a ligand, for example one Antibodies or antibody fragments that are specific for muscle cells.

Gene für weitere Blutplasmaproteine sind zum Beispiel vom Albumin, C1-Inaktivator, Serum Cholinesterase, Transferrin oder 1-Antritrypsin. Genes for other blood plasma proteins are, for example, from albumin, C1 inactivator, Serum cholinesterase, transferrin or 1-antritrypsin.

Prophylaxe, und/oder Therapie von InfektionserkrankungenProphylaxis and / or therapy of infectious diseases

Für Impfungen dienen als Zielzellen beispielweise Muskelzellen oder Makrophagen und/oder Lymphozyten, als Promotoren beispielsweise unspezifische und zellzyklusspezifische oder zielzellspezifische und zellzyklusspezifische Promotoren, und als Effektoren beispielsweise Gene für die Prophylaxe von Infektionserkrankungen
Als Wirksubstanz wird im allgemeinen die DNA eines vom Infektionserreger gebildeten Proteins ausgewählt, welches durch Auslösen einer Immunreaktion, d. h. durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T-Lymphozyten, zur Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte Neutralisationsantigene werden als Impfantigene bereits angewandt (siehe z. B. Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992).For vaccinations, for example, muscle cells or macrophages and / or lymphocytes serve as target cells, promoters, for example, non-specific and cell cycle-specific or target cell-specific and cell cycle-specific promoters, and effectors, for example, genes for the prophylaxis of infectious diseases
The active substance selected is generally the DNA of a protein formed by the infectious agent, which leads to neutralization and / or killing of the pathogen by triggering an immune reaction, ie by antibody binding and / or by cytotoxic T-lymphocytes. Such so-called neutralization antigens are already used as vaccine antigens (see, for example, Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992).

Bevorzugt im Sinne der Erfindung ist eine Nukleinsäure kodierend für Neutralisationsantigene folgender Erreger: Influenza A-Virus, HlV, Tollwut-Virus, HSV (Herpes Simplex Virus), RSV (Respiratory Syncytial Virus), Parainfluenza- Virus, Rotavirus, VZV (Varizella Zoster Virus), CMV (Cytomegalo-Virus), Masern- Virus, HPV (Humanes Papillomvirus), HBV (Hepatitis B-Virus), HCV (Hepatitis C- Virus), HDV (Hepatitis D-Virus), HEV (Hepatitis E-Virus), HAV (Hepatitis A-Virus), Vibrio Cholera-Antigen, Borrelia Burgdorferi, Helicobacter pylori oder Malaria- Antigen.A nucleic acid coding for is preferred in the sense of the invention Neutralization antigens of the following pathogens: influenza A virus, HIV, rabies virus, HSV (Herpes Simplex Virus), RSV (Respiratory Syncytial Virus), Parainfluenza Virus, rotavirus, VZV (varicella zoster virus), CMV (cytomegalo virus), measles Virus, HPV (Human Papilloma Virus), HBV (Hepatitis B Virus), HCV (Hepatitis C- Virus), HDV (hepatitis D virus), HEV (hepatitis E virus), HAV (hepatitis A virus), Vibrio cholera antigen, Borrelia Burgdorferi, Helicobacter pylori or malaria Antigen.

Zu derartigen Wirksubstanzen im Sinne der vorliegenden Erfindung gehört auch die DNA eines Antiidiotyp-Antikörpers oder seiner Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen (die "complementary determining regions") Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen (s. o.).Such active substances in the sense of the present invention also include DNA of an anti-idiotype antibody or its antigen-binding fragments, its antigen binding structures (the "complementary determining regions") Copies of the protein or carbohydrate structure of the neutralization antigen Represent infectious agents (see above).

Derartige Antiidiotyp-Antikörper und ihre Spaltprodukte können besonders Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen und sind beispielsweise bei Hawkins et al. (J. Immunother 14, 273 (1993)) und Westerink und Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993)) übersichtlich beschrieben.Such anti-idiotype antibodies and their cleavage products can be special Replace and are carbohydrate antigens in bacterial infectious agents for example in Hawkins et al. (J. Immunother 14, 273 (1993)) and Westerink and Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993)) clearly described.

Andere Effektoren sind beispielsweise Gene von "Tumorvakzinen". Hierzu gehören Antigene auf Tumorzellen, wie zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt.Other effectors are, for example, genes from "tumor vaccines". This includes Antigens on tumor cells, such as from Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) and Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, Munich (1992) clearly presented.

Weitere Beispiele stellen die Gene von folgenden Antigene bzw. von folgenden Antiidiotypantikörper dar: Sialyl Lewis; Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden; von Onkogenen exprimierte Proteine; Blutgruppenantigene und deren Vorläufer; Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin; oder Antigene auf Heat Shock Proteinen.Further examples are the genes of the following antigens or of the following Anti-idiotype antibodies: Sialyl Lewis; Peptides on tumors derived from T cells be recognized; proteins expressed by oncogenes; Blood group antigens and their forerunners; Antigens on the polymorphic epithelial mucin; or antigens on heat shock proteins.

Für die Therapie von chronischen Infektionserkrankungen dienen als Zielzellen beispielweise Leberzellen, Lymphozyten und/oder Makrophagen, Epithelzellen oder Endothelzellen, als Promotoren bespielsweise virusspezifische oder zellspezifische und zellzyklusspezifische Promotoren, und als Effektoren beispielsweise folgende Gene:
Gene, kodierend für ein Protein, welches zytostatische, apoptotische oder zytotoxische Wirkungen aufweist, oder kodierend für ein Enzym, welches eine Vorstufe einer antiviralen oder zytotoxischen Substanz in die aktive Substanz spaltet.For the treatment of chronic infectious diseases, the target cells are, for example, liver cells, lymphocytes and / or macrophages, epithelial cells or endothelial cells, promoters, for example virus-specific or cell-specific and cell cycle-specific promoters, and the following genes as effectors:
Genes coding for a protein which has cytostatic, apoptotic or cytotoxic effects, or coding for an enzyme which cleaves a precursor of an antiviral or cytotoxic substance into the active substance.

Gene kodierend für antivirale Proteine, wie antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren wie beispielsweise IFNα, IFNβ, IFN-γ, TNFβ, TNFα, IL-1 oder TGFβ, oder Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen V_H und V_L enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker verbundene V_H und V_L Fragmente, wie bereits beschrieben. Antikörper gegen Virusantigen sind beispielsweise: anti HBV, anti HCV, anti HSV, anti HPV, anti HIV, anti EBV, anti HTLV, Anti Coxackie Virus oder anti Hantaan Virus.Genes coding for antiviral proteins, such as antiviral cytokines and growth factors such as, for example, IFNα, IFNβ, IFN-γ, TNFβ, TNFα, IL-1 or TGFβ, or antibodies of a specificity which inactivates the respective virus or contains its V _H and V _L Fragments or its V _H and V _L fragments connected via a linker, as already described. Antibodies against virus antigens are, for example: anti HBV, anti HCV, anti HSV, anti HPV, anti HIV, anti EBV, anti HTLV, anti coxackie virus or anti Hantaan virus.

Ein anderes antiviral wirkendes Protein ist ein Rev bindendes Protein. Diese Proteine binden an die Rev-RNA und inhibieren Rev-abhängige posttranskriptionelle Stufen der Retrovirus-Genexpression. Beispiele für Rev-bindende Proteine sind:
RBP9-27, RBP1-8U, RBP1-8D oder Pseudogene von RBP1-8.Another antiviral protein is a Rev binding protein. These proteins bind to the Rev-RNA and inhibit Rev-dependent post-transcriptional stages of retrovirus gene expression. Examples of Rev binding proteins are:
RBP9-27, RBP1-8U, RBP1-8D or pseudogenes of RBP1-8.

Gene kodierend für antibakterielle Proteine, wie beispielsweise Antikörper, die bak terielle Toxine neutralisieren oder Bakterien opsonieren. Beispielsweise gehören hierzu Antikörper gegen Meningokokken C oder B, E. coli, Borrelia, Pseudomonas Helicobacter pylori oder Staphylococcus aureus.Genes coding for antibacterial proteins, such as antibodies, the bak neutralize terial toxins or opsonize bacteria. For example, include Antibodies against meningococcal C or B, E. coli, Borrelia, Pseudomonas Helicobacter pylori or Staphylococcus aureus.

Die folgenden Figuren und Beispiele söllen die Erfindung näher erläutern, ohne sie darauf zu beschränken.The following figures and examples are intended to explain the invention in more detail without it to limit it.

Beschreibung der FigurenDescription of the figures

Fig. 1 beschreibt schematisch den Aufbau eines einzelkettigen, zweifach antigenbindenden Moleküls Fig. 1 schematically describes the structure of a single chain, double antigen-binding molecule

Fig. 2 beschreibt schematisch ein einzelkettiges, zweifach-antigenbindendes Molekül mit Effektor. Fig. 2 illustrates schematically a single chain, double-antigen-binding molecule with effector.

Fig. 3 und Fig. 5 beschreiben schematisch Nukleinsäurekonstrukte kodierend für ein einzelkettiges, zweifach-antigenbindendes Molekül FIGS. 3 and FIG. 5 schematically describe nucleic acid constructs coding for a single chain, double-antigen-binding molecule

Fig. 4 beschreibt schematisch ein Nukleinsäurekonstrukt kodierend für ein einzelkettiges, zweifach-antigenbindendes Molekül mit Effektor. Fig. 4 schematically describes a nucleic acid construct coding for a single chain, double-antigen-binding molecule with effector.

Fig. 6 zeigt die Rekrutierung der β-Galaktosidase an plastikgebundenem CEA durch das erfindungsgemäße einzelkettige, zweifach-antigenbindende Protein (scDb-CEAGal) im Vergleich zu Diabodies gegen CEA und E-coli β-Galaktosidase (CEAGal). Als negative Kontrolle wude eine Mikrotiterplatte mit BSA beschichtet. Fig. 6, the recruitment of β-galactosidase to plastic bonded CEA shows by the inventive single chain, double-antigen-binding protein (SCDB CEAGal) compared with diabodies against CEA and E-coli β-galactosidase (CEAGal). A microtiter plate was coated with BSA as a negative control.

Fig. 7 zeigt die Rekrutierung der β-Galaktosidase durch scDb-CEAGal, welches von Säugerzellen sekretiert wurde, wobei verschiedene Mengen an scDb-CEAGal und β-Galaktosidase in CEA-beschichteten Mikrotiterplatten eingesetzt wurden. Als Substrat wurde o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid eingesetzt. Als negative Kontrolle wurde eine Mikrotiterplatte mit BSA beschichtet. Figure 7 shows recruitment of β-galactosidase by scDb-CEAGal secreted by mammalian cells using different amounts of scDb-CEAGal and β-galactosidase in CEA-coated microtiter plates. O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside was used as the substrate. A microtiter plate was coated with BSA as a negative control.

Fig. 8A zeigt das Absterben von LoVo-Zellen in Anwesenheit des erfindungsgemäßen einzelkettigen, zweifach-antigenbindenden Proteins (scDb), β-Galaktosidase (β-Gal), Daunomycin-β-D-galaktopyranosid (prodrug) und/oder Daunomycin (drug). Fig. 8A shows single chain of the present invention, double-antigen-binding protein (SCDB), β-galactosidase (β-Gal), daunomycin-β-D-galactopyranoside (prodrug) and / or daunomycin (drug) the death of LoVo cells in the presence .

Fig. 8B zeigt Kontrollexperimente mit einer CEA-negativen Zellinie (A549). FIG. 8B illustrates control experiments with a CEA negative cell line (A549).

BeispieleExamples Beispiel 1example 1 Herstellung und bakterielle Expression eines einzelkettigen, zweifach-anti genbindenden ProteinsProduction and bacterial expression of a single chain, double anti gene binding protein

Die Herstellung eines einzelkettigen, zweifach-antigenbindenden Proteins wird am Beispiel eines Proteins, das die Antigene "Carcinoembryonic Antigen" (CEA) und E. coli β-Galaktosidase erkennt, dargestellt:
Folgende DNA-Sequenzen wurden in Richtung 5' zu 3' wie folgt zusammengefügt:
The production of a single-chain, double-antigen-binding protein is illustrated using the example of a protein which recognizes the antigens "Carcinoembryonic Antigen" (CEA) and E. coli β-galactosidase:
The following DNA sequences were joined in the direction 5 'to 3' as follows:

- LacZ-Promotor- LacZ promoter
- bakterielle, ribosomale Bindestruktur (AAGGAG)- bacterial, ribosomal binding structure (AAGGAG)
- bakterielle Signalsequenz pelB (Power et al., Gene 113, 95-99 (1992))- bacterial signal sequence pelB (Power et al., Gene 113, 95-99 (1992))
- VH-anti-CEA (Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137 (1997))VH-anti-CEA (Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137 (1997))
- Linker GGGS (Kontermann et al., (1997))- Left GGGS (Kontermann et al., (1997))
- VL-anti-β-Galaktosidase (Kontermann et al., (1997))- VL anti-β-galactosidase (Kontermann et al., (1997))
- verbindendes Peptid GGGGSGGRASGGGGS- connecting peptide GGGGSGGRASGGGGS
- VH-anti-β-Galaktosidase (Kontermann et al., (1997))- VH anti-β-galactosidase (Kontermann et al., (1997))
- Linker GGGGS- Left GGGGS
- VL-anti-CEA (Kontermann et al., (1997))VL-anti-CEA (Kontermann et al., (1997))
- Myc-Epitop für Antikörper 9E10 EQKLISEEDLN (Munro & Pelham, Cell 46, 291-300 (1986))- Myc epitope for antibody 9E10 EQKLISEEDLN (Munro & Pelham, Cell 46, 291-300 (1986))
- Polyhistidin HHHHHH zur Reinigung mittels IMAC (Kontermann et al., (1997)).- Polyhistidine HHHHHH for cleaning using IMAC (Kontermann et al., (1997)).

Die Verknüpfung des Konstrukts wurde über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der verschiedenen DNA-Sequenzen mitgeführt wurden, ermöglicht (Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137 (1997)).The linkage of the construct was carried out via suitable restriction sites which are via PCR amplification carried out at the termini of the different DNA sequences were made possible (Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137 (1997)).

Die Verknüpfung erfolgte mit Hilfe von dem Fachmann bekannten, für die Restrik tionsstellen spezifischen Enzyme und DNA-Ligasen. Die Enzyme sind käuflich zu erwerben. Das Konstrukt wurde in den bakteriellen Expressionsvektor pAB1 (Kontermann et al., (1997)) einkloniert.The linkage was carried out with the help of the person skilled in the art for the restriction site specific enzymes and DNA ligases. The enzymes are commercially available too acquire. The construct was expressed in the bacterial expression vector pAB1 (Kontermann et al., (1997)).

Für die Klonierung wurden die Oligonukleotid-Primer LMB2 und LMB3 (Kontermann R.E. (1997), supra) sowie
VK-NotFor: 5'-TTG TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT GCC AGC ACC-3',
scDb-AscBack: 5'-TGC ATG CTA GGG CGC GCC TCG GGC GGA GGT GGC TCA CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT GG-3',
scDb-AscForK: GCT CGG TAA GGC GCG CCC ACC GCT GCC ACC GCC TCC ACC TAG GAC GGT CAG GTT GGT CCC-3' und
pelB-Metminus: 5'-TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG GCC CAG GT-3' verwendet.For the cloning, the oligonucleotide primers LMB2 and LMB3 (Kontermann RE (1997), supra) and
VK-NotFor: 5'-TTG TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT GCC AGC ACC-3 ',
scDb-AscBack: 5'-TGC ATG CTA GGG CGC GCC TCG GGC GGA GGT GGC TCA CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT GG-3 ',
scDb-AscForK: GCT CGG TAA GGC GCG CCC ACC GCT GCC ACC GCC TCC ACC TAG GAC GGT CAG GTT GGT CCC-3 'and
pelB-Metminus: 5'-TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG GCC CAG GT-3 'used.

Hierzu wurden aus dem Diabody CEAGal (Kontermann, R.E. (1997)) mit Hilfe der Primer LMB2 und LMB3 die Fragmente VHB-VLA (Fragment 1) und VHA-VLB (Fragment 2) amplifiziert und Gel-gereinigt. Fragment 1 wurde anschließend mit den Primern VK-NotFor und scDb-AscBack amplifiziert, um eine Ascl-Stelle und 7 Aminosäuren des Linkers einzuführen. Fragment 2 wurde mit den Primern LMB3 und scDb-AscForλ amplifiziert, um eine Ascl-Stelle und 8 Aminosäuren des Linkers einzuführen. Die Fragmente wurden mit Ascl und Notl (Fragment 1) und Sfil und Ascl (Fragment 2) hydrolysiert und in den bakteriellen Expressionsvektor pAB1 (Kontermann, R.E. (1997)) kloniert. Das resultierende Insert kodiert ein einzelkettiges Polypeptid, worin VHA-VLB über einen 15 aminosäurelangen Linker mit der Sequenz GGGGSGGRASGGGGS an VHB-VLA gebunden ist.For this purpose, the diabody CEAGal (Kontermann, R.E. (1997)) was developed with the help of Primers LMB2 and LMB3 the fragments VHB-VLA (fragment 1) and VHA-VLB (Fragment 2) amplified and gel purified. Fragment 1 was then with the Primers VK-NotFor and scDb-AscBack amplified to one Ascl site and 7 Introduce amino acids of the linker. Fragment 2 was primed with LMB3 and scDb-AscForλ amplified to one Ascl site and 8 amino acids of the linker introduce. The fragments were with Ascl and Notl (fragment 1) and Sfil and Ascl (fragment 2) hydrolyzed and into the bacterial expression vector pAB1 (Kontermann, R.E. (1997)). The resulting insert is encoded single chain polypeptide, wherein VHA-VLB has a 15 amino acid long linker is bound to VHB-VLA with the sequence GGGGSGGRASGGGGS.

Das Plasmid wurde anschließend in TG1-Bakterien eingeführt und diese mit den dem Fachmann geläufigen Methoden kultiviert (Kontermann et al., (1997)).The plasmid was then introduced into TG1 bacteria and these with the methods cultivated by a person skilled in the art (Kontermann et al., (1997)).

Die Bakterien wurden aufgeschlossen und das einzelkettige, zweifach-antigen bindende Protein durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) (Hochuli et al., Bio/Techn. 6, 1321-1325 (1988)) aus der periplasmatischen Präpara tion gereinigt. Details dieser Methode sind bei Kontermann et al., (1997) beschrieben.The bacteria were disrupted and the single chain, double antigen binding protein by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) (Hochuli et al., Bio / Techn. 6, 1321-1325 (1988)) from the periplasmic preparation tion cleaned. Details of this method can be found in Kontermann et al., (1997) described.

Das gereinigte Protein hat ein Molekulargewicht von 60 kDa, wie durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Gelfiltration gezeigt wurde. Etwa 200-300 µg dieses Moleküls konnten pro Liter Bakterienkultur gereinigt werden. Das bakteriell exprimierte, einzelkettige, zweifach-antigenbindende Protein reagierte im ELISA mit CEA sowie β-Galaktosidase und war in der Lage, das Enzym zu plastikgebundenem CEA zu rekrutieren, wie anhand der Konversion von o-Nitrophenyl-β-D- galaktopyranosid gezeigt werden konnte (Fig. 6). Weiterhin konnte dieses einzelkettige, zweifach-antigenbindende Protein lebende wie auch fixierte CEA- exprimierende LoVo-Zellen durch Rekrutierung von β-Galaktosidase und Umsatz des Substrats 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) anfärben. Hierzu wurden LoVo-Zellen mit 10 µg/ml des entsprechenden antigenbindenden Proteins mit 10 µg/ml β-Galaktosidase und X-Gal (0,8 mg/ml in PBS, 3mM- Kaliumeisen(III)-cyanid 3mM Kaliumeisen(II)-cyanid) inkubiert. Keine Färbung war mit verschiedenen Kontrollzellen (A549, HEK293) bzw. mit einem Diabody gegen Hühnereilysozym und β-Galaktosidase (HELGal; Kontermann et al., (1997)) zu beobachten.The purified protein has a molecular weight of 60 kDa, as shown by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and gel filtration. About 200-300 µg of this molecule could be purified per liter of bacterial culture. The bacterially expressed, single-chain, double-antigen-binding protein reacted in the ELISA with CEA and β-galactosidase and was able to recruit the enzyme to plastic-bound CEA, as was shown by the conversion of o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside ( Fig. 6). Furthermore, this single-chain, double-antigen-binding protein was able to live and also fix CEA-expressing LoVo cells by recruiting β-galactosidase and converting the substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal ) stain. For this purpose, LoVo cells with 10 µg / ml of the corresponding antigen-binding protein with 10 µg / ml β-galactosidase and X-Gal (0.8 mg / ml in PBS, 3mM potassium iron (III) cyanide 3mM potassium iron (II) - cyanide) incubated. No staining was observed with various control cells (A549, HEK293) or with a diabody against chicken egg lysozyme and β-galactosidase (HELGal; Kontermann et al., (1997)).

Beispiel 2Example 2 Eukaryotische Expression eines einzelkettigen, zweifach-antigenbindenden ProteinsEukaryotic expression of a single chain, double antigen binding protein

Für die Expression in eukaryotischen Zellen wurde die kodierende Region des einzelkettigen, zweifach-antigenbindenden Proteins in einen eukaryotischen Expressionsvektor kloniert (pSecTagA, Invitrogen), wobei die bakterielle Signal sequenz durch die Ig-K-Signalsequenz, die bereits im Vektor enthalten ist, ersetzt wurde.For the expression in eukaryotic cells, the coding region of the single chain, double antigen binding protein into a eukaryotic Expression vector cloned (pSecTagA, Invitrogen), the bacterial signal Sequence replaced by the Ig-K signal sequence, which is already contained in the vector has been.

Hierzu wurde das einzelkettige Konstrukt mit den Primern LMB2 und pelB-Metminus amplifiziert, wodurch Methionin des pelB-Leaders (Position 21) durch Threonin ersetzt wurde. Anschließend wurde mit Sfil und EcoRI hydrolysiert und in den Vektor pSecTagA kloniert. Das reife einzelkettige antigenbindende Protein enthält 7 zusätzliche Aminosäuren (AAQPATA) am N-Terminus der VHA-Domäne.For this purpose, the single-chain construct with the primers LMB2 and pelB-Metminus amplified, causing methionine of the pelB leader (position 21) by threonine was replaced. It was then hydrolyzed with Sfil and EcoRI and into the vector pSecTagA cloned. The mature single chain antigen binding protein contains 7 additional amino acids (AAQPATA) at the N-terminus of the VHA domain.

Das Plasmid wurde mit Lipofectamin (Gibco) transient in eukaryotischen HEK 293 Zellen transfiziert. Stabile Zellen wurden in Gegenwart von Zeocin selektiert. Mit diesen Zellen konnte in Immunofluoreszenzexperimenten eine Anfärbung des endoplasmatischen Retikulums ER und des Golgi-Apparates nachgewiesen werden. Ferner konnte die Sekretion des einzelkettigen, zweifach-antigenbindenden Proteins durch Immunpräzipitation eines 60 kDa Proteins aus dem Überstand 35S-Met- markierter Zellen sowie durch Reinigung mittels immobilisierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC) nachgewiesen werden. Das gereinigte Protein ist funktionell in der Bindung von β-Galaktosidase und CEA-beschichteten Mikrotiterplatten bzw. der Rekrutierung von β-Galaktosidase zu plastikgebundenem CEA aktiv (Fig. 7).The plasmid was transiently transfected with lipofectamine (Gibco) in eukaryotic HEK 293 cells. Stable cells were selected in the presence of Zeocin. With these cells, staining of the endoplasmic reticulum ER and the Golgi apparatus could be demonstrated in immunofluorescence experiments. Furthermore, the secretion of the single-chain, double-antigen-binding protein could be demonstrated by immunoprecipitation of a 60 kDa protein from the supernatant 35S-Met-labeled cells and by purification by means of immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The purified protein is functionally active in the binding of β-galactosidase and CEA-coated microtiter plates or the recruitment of β-galactosidase to plastic-bound CEA ( FIG. 7).

Beispiel 3Example 3 In vitro Enzymrekrutierung durch Kokultivierung mit einzelkettigen, zweifach- antigenbindendem Protein sezernierenden ZellenIn vitro enzyme recruitment by cocultivation with single-chain, double antigen-binding protein secreting cells

Durch Kokultivierung von das einzelkettige, zweifach-antigenbindende Protein produzierenden HEK 293-Zellen und CEA-positiven LoVo-Zellen wurde die Rekrutie rung in vitro untersucht. Dazu wurden zunächst die das erfindungsgemäße Protein produzierenden Zellen mit den LoVo-Zellen in Transwell-Zellkulturschalen (Costar), bei denen die beiden Zellinien durch eine Membran getrennt sind, kultiviert. Nach zwei Tagen wurde β-Galaktosidase (10 µg/ml) dazugegeben und die Rekrutierung durch Zugabe des Substrates X-Gal nachgewiesen. Eine spezifische Färbung war bei Kokultivierung mit den das einzelkettige, zweifach-antigenbindende Protein produzierenden Zellen festzustellen, während Kontrollexperimente mit nicht transfizierten HEK 293-Zellen keine Färbung zeigten.By cocultivating the single chain, double antigen binding protein producing HEK 293 cells and CEA positive LoVo cells became the recruit tion examined in vitro. For this purpose, the protein of the invention was first producing cells with the LoVo cells in Transwell cell culture dishes (Costar), in which the two cell lines are separated by a membrane. After β-galactosidase (10 µg / ml) was added for two days and the recruitment detected by adding the substrate X-Gal. A specific stain was when cocultivated with the single-chain, double-antigen-binding protein producing cells during control experiments with not transfected HEK 293 cells showed no staining.

Ebenfalls negativ waren Experimente, bei denen die LoVo-Zellen durch A549-Zellen (CEA-negativ) ersetzt wurden, bzw. Experimente, bei denen die das einzelkettige, zweifach-antigenbindende Protein produzierenden Zellen mit Enzym und Substrat inkubiert wurden. Letzteres verdeutlicht, daß die das einzelkettige, zweifach-anti genbindende Protein produzierende Zellen selbst nicht zur Bindung des Enzyms in der Lage sind.Experiments in which the LoVo cells were replaced by A549 cells were also negative (CEA negative), or experiments in which the single-chain, double antigen-binding protein-producing cells with enzyme and substrate were incubated. The latter shows that the single-chain, double anti gene-binding protein-producing cells themselves do not bind the enzyme in are able.

In einem weiteren Experiment wurden die das einzelkettige, zweifach-antigen bindende Protein sekretierenden HEK 293-Zellen und die LoVo-Zellen direkt mit einem Inokulationsverhältnis von 1 : 4 bis 1 : 24 kokultiviert. Um die HEK 293-Zellen von den LoVo-Zellen zu unterscheiden, wurden erstere vor Zugabe der LoVo-Zellen mit CM-Dil (Molecular Probes) gefärbt (rote Fluoreszenz). Nach zwei Tagen wurde β-Galaktosidase zugegeben und die Bindung an Zellen durch Zugabe von X-Gal (10 µg/ml) bzw. durch indirekte Immunfluoreszenz mit einem anti-β-Galaktosidase Antikörper (Biotrend) nachgewiesen. Auch in diesen Experimenten zeigt sich eine spezifische Rekrutierung des Enzyms zu den LoVo-Zellen, während die HEK 293- Zellen nicht gefärbt wurden. Negativ waren Kontrollexperimente mit nicht transfizierten HEK 293-Zellen. Diese Experimente belegen, daß das einzelkettige, zweifach-antigenbindende Protein spezifisch und selektiv Tumorzellen erkennt.In another experiment, they became the single-chain, double-antigen binding protein-secreting HEK 293 cells and the LoVo cells directly an inoculation ratio of 1: 4 to 1:24. To the HEK 293 cells The LoVo cells were differentiated before the LoVo cells were added stained with CM-Dil (Molecular Probes) (red fluorescence). After two days β-galactosidase added and binding to cells by adding X-gal (10 µg / ml) or by indirect immunofluorescence with an anti-β-galactosidase Antibodies (Biotrend) detected. One can also see one in these experiments specific recruitment of the enzyme to the LoVo cells, while the HEK 293- Cells were not stained. Control experiments were not negative transfected HEK 293 cells. These experiments show that the single-chain, double and antigen-binding protein specifically and selectively recognizes tumor cells.

In weiteren Experimenten wurde die Konvertierung von nicht-toxischem Daunomy cin-β-D-galaktopyranosid in das zytotoxische Daunomycin untersucht. Durch einstündige Inkubation von LoVo-Zellen mit gereinigtem, einzelkettigen, zweifach- antigenbindenden Protein (10 µg/ml) sowie die anschließende einstündige Inkubation bei 37° mit β-Galaktosidase (1 µg/ml) und Daunomycin-β-D- galaktopyranosid (2 µM) konnte eine spezifische Kernlokalisation des entstehenden Daunomycins mittels Autofluoreszenz der Substanz nachgewiesen werden, vergleichbar der Färbung durch direkte Inkubation mit Daunomycin. Keine Kern färbung war in Abwesenheit von einzelkettigem, zweifach-antigenbindenden Protein bzw. β-Galaktosidase sowie mit Kontrollzellen (HEK 293; einzelkettiges, zweifach antigenbindendes Protein produzierende HEK 293) festzustellen. Diese Experimente belegen, daß das einzelkettige, zweifach-antigenbindende Protein in der Lage ist, ein Enzym an eine Tumorzelle zu rekrutieren und daß dieses Enzym zur Konvertierung einer nicht toxischen Vorstufe in eine toxische Substanz eingesetzt werden kann.In further experiments, the conversion of non-toxic Daunomy cin-β-D-galactopyranoside was investigated in the cytotoxic daunomycin. By one-hour incubation of LoVo cells with purified, single-chain, double antigen binding protein (10 µg / ml) and the subsequent one hour Incubation at 37 ° with β-galactosidase (1 µg / ml) and daunomycin-β-D- galactopyranoside (2 µM) was able to localize the resulting nucleus Daunomycins are detected by means of autofluorescence of the substance comparable to staining by direct incubation with daunomycin. No core staining was in the absence of single chain, double antigen binding protein or β-galactosidase and with control cells (HEK 293; single-chain, double antigen-binding protein-producing HEK 293). These experiments prove that the single-chain, double-antigen-binding protein is able to to recruit an enzyme to a tumor cell and that this enzyme to Conversion of a non-toxic precursor to a toxic substance is used can be.

In weiteren Experimenten kann dieser Effekt dazu benutzt werden, Tumorzellen spezifisch abzutöten. In further experiments, this effect can be used to tumor cells specifically kill.

Hierzu wurden die LoVo-Zellen in 96-well Platten mit dem einzelkettigen, zweifach- antigenbindenden Protein (10 µg/ml) und anschließend mit Daunomycin-β-D- galaktopyranosid (5 µM) eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Das Absterben der Zellen wurde nach 2 Tagen mittels eines WST-Tests (Boehringer Mannheim) analysiert (Fig. 8). Hierbei war das Absterben der Zellen bei der Umwandlung des Prodrug in das Drug annähernd genausogut wie in Anwesenheit des Drug (Fig. 8A). In Abwesenheit einer Komponente oder mit CEA-negativen A549-Zellen wurde im wesentlichen keine Wirkung festgestellt (Fig. 8B).For this purpose, the LoVo cells were incubated in 96-well plates with the single-chain, double-antigen-binding protein (10 µg / ml) and then with daunomycin-β-D-galactopyranoside (5 µM) for one hour at 37 ° C. The cell death was analyzed after 2 days by means of a WST test (Boehringer Mannheim) ( FIG. 8). Here, the cell death when converting the prodrug to the drug was almost as good as in the presence of the drug ( Fig. 8A). In the absence of a component or with CEA negative A549 cells, essentially no effect was found ( Fig. 8B).

Beispiel 4Example 4 Herstellung von Konstrukten zur intrazellulären Expression von einzelkettigen, zweifach-antigenbindenden ProteinenProduction of constructs for the intracellular expression of single-chain, double antigen binding proteins

Für die intrazelluläre Expression des einzelkettigen, zweifach-antigenbindenden Proteins wird die DNA des Gens für das einzelkettige, zweifach-antigenbindende Protein mit unterschiedlichen Primern amplifiziert:
For the intracellular expression of the single-chain, double-antigen-binding protein, the DNA of the gene for the single-chain, double-antigen-binding protein is amplified with different primers:

- transmembranes einzelkettiges, zweifach-antigenbindendes Protein (TM-scDAP). Hierfür wird ein Primer verwendet, der am 3'-Ende des Gens die Transmem brandomäne von PDGFR einfügt- Transmembrane single chain, double antigen binding protein (TM-scDAP). For this purpose, a primer is used, which is the transmembrane at the 3 'end of the gene brand domain from PDGFR
- (LPFKVVVISAIIALVVLTIISLIILIMLWQKKPRYES)- (LPFKVVVISAIIALVVLTIISLIILIMLWQKKPRYES)
- Endoplasmatisches Retikulum lokalisiertes einzelkettiges (single chain), zweifach (double)-antigenbindendes Protein (ER-scDAP). Hierfür wird ein Primer verwendet, der am 3'-Ende des Gens ein ER-Retentionssignal einfügt (SEKDEL).- endoplasmic reticulum localized single chain, double-antigen binding protein (ER-scDAP). For this a primer is used used that inserts an ER retention signal at the 3 'end of the gene (SECOND).
- zytoplasmatisch lokalisiertes einzelkettiges, zweifach-antigenbindendes Protein (cyto-scDAP). Hierfür wird ein Primer benutzt, der am 5'-Ende des Gens die Signalsequenz durch ein Methionin und eine Kozaksequenz zur optimalen Translationsinitiation ersetzt.- cytoplasmic localized single chain, double antigen binding protein (cyto-scDAP). For this purpose, a primer is used, which at the 5 'end of the gene Signal sequence through a methionine and a Kozak sequence for optimal Translation initiation replaced.
- kernlokalisiertes einzelkettiges, zweifach-antigenbindendes Protein (nuc-scDb). Hierfür werden Primer benutzt, die am 5'-Ende des Gens die Signalsequenz durch ein Methionin und eine Kozaksequenz zur optimalen Translationsinitiation erset zen und am 3'-Ende des Gens eine Kernlokalisierungssequenz einfügen (PKKKRKVGGGT; die Kernlokalisierungssequenz ist unterstrichen).- core localized single chain, double antigen binding protein (nuc-scDb). For this, primers are used which pass the signal sequence at the 5 'end of the gene a methionine and a Kozak sequence for optimal translation initiation zen and insert a nuclear localization sequence at the 3 'end of the gene (PKKKRKVGGGT; the core localization sequence is underlined).

Diese Fragmente werden in geeigneten eukaryotischen Expressionsvektoren kloniert (pSecTagA bzw. pcDNA3; Invitrogen). Die resultierenden Konstrukte (TM- scDAP, ER-scDAP, cyto-scDAP, nuc-scDAP, sowie sec-scDAP (= sezerniertes Protein; siehe Beispiel 2) werden anschließend in eukaryotische Zellen (3T3) transient transfiziert und die Lokalisierung des exprimierten Proteins durch Immunfluoreszenz mit Hilfe eines anti-Myc-Epitop-Antikörpers untersucht. Für die Konstrukte sec-scDAP, ER-scDAP und TM-scDAP kann eine Färbung, wie sie für den sekretorischen Weg typisch ist, nachgewiesen werden, während cyto-scDAP eine diffuse Lokalisierung im Zytoplasma und nuc-scDAP eine Kernlokalisierung zeigt. These fragments are expressed in appropriate eukaryotic expression vectors cloned (pSecTagA or pcDNA3; Invitrogen). The resulting constructs (TM- scDAP, ER-scDAP, cyto-scDAP, nuc-scDAP, and sec-scDAP (= secreted Protein; see example 2) are then in eukaryotic cells (3T3) transiently transfected and the localization of the expressed protein by Immunofluorescence was investigated using an anti-Myc epitope antibody. For the Constructs sec-scDAP, ER-scDAP and TM-scDAP can be a stain as it is for the secretory pathway is typical, can be demonstrated while cyto-scDAP diffuse localization in the cytoplasm and nuc-scDAP core localization shows.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül enthaltend folgende Komponenten:

(a) eine variable Domäne einer schweren Kette eines Immunglobulins (VH) mit einer ersten Spezifität (A) und funktionelle Teile hiervon,
(b) eine variable Domäne einer leichten Kette eines Immunglobulins (VL) mit einer zweiten Spezifität (B) und funktionelle Teile hiervon,
(c) eine variable Domäne einer schweren Kette eines Immunoglobulins (VH) mit der Spezifität (B) und funktionelle Teile hiervon, sowie
(d) eine variable Domäne einer leichten Kette eines Immunglobulins (VL) mit der Spezifität (A) und funktionelle Teile hiervon,

wobei die Domänen VH und VL in Form eines VH-VL-Konstruktes verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden VH-VL-Konstrukte über ein Peptid (P) ver bunden sind.1. Single-chain, multi-antigen-binding molecule containing the following components:

(a) a variable domain of an immunoglobulin heavy chain (VH) with a first specificity (A) and functional parts thereof,
(b) a variable domain of an immunoglobulin light chain (VL) with a second specificity (B) and functional parts thereof,
(c) an immunoglobulin heavy chain variable domain (VH) with specificity (B) and functional parts thereof, and
(d) an immunoglobulin light chain variable domain (VL) with specificity (A) and functional parts thereof,

wherein the domains VH and VL are connected in the form of a VH-VL construct, characterized in that the two VH-VL constructs are connected via a peptide (P).

2. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als zwei VH-VL-Konstrukte enthalten sind.2. Single chain, multi-antigen binding molecule according to claim 1, characterized characterized in that more than two VH-VL constructs are included.

3. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die VH-VL-Konstrukte über Domänen mit gleicher Spezifität verbunden sind.3. Single chain, multi-antigen binding molecule according to claim 1 or 2, characterized characterized that the VH-VL constructs over domains with the same specificity are connected.

4. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Spezifitäten (A) und (B) im wesentlichen identisch sind.4. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of claims 1-3, characterized in that the specificities (A) and (B) are essentially identical.

5. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Domänen VH und VL über einen Peptid-Linker (L) in Form eines VH-L-VL-Konstruktes verbunden sind. 5. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of claims 1-4, characterized in that the domains VH and VL via a peptide linker (L) in Form of a VH-L-VL construct are connected.

6. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker (L) ca. 1-20 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 1-5 Aminosäuren lang ist.6. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to claim 5, characterized characterized in that the linker (L) about 1-20 amino acids, preferably about 1-5 Amino acids is long.

7. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker (L) die Aminosäuresequenz GGGGS enthält.7. Single chain, multi-antigen binding molecule according to claim 5, characterized characterized in that the linker (L) contains the amino acid sequence GGGGS.

8. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid (P) ca. 12-40 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 12-20 Aminosäuren, insbesondere ca. 14 Aminosäuren lang ist.8. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of claims 1-7, characterized in that the peptide (P) approx. 12-40 amino acids, preferably approx. 12-20 amino acids, especially about 14 amino acids long.

9. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid (P) die Aminosäuresequenz GGGGSGGRASGGGS oder GGGGSGGRASGGGGS enthält.9. Single chain, multi-antigen binding molecule according to claim 8, characterized characterized in that the peptide (P) has the amino acid sequence GGGGSGGRASGGGS or GGGGSGGRASGGGGS contains.

10. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Molekül als eine weitere Komponente einen oder mehrere Effektor/en (E) enthält.10. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of claims 1-9, characterized in that said molecule is a further component or contains several effector (s).

11. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Effektor (E) über ein Bindeglied (B) an das genannte Molekül gebunden ist.11. Single chain, multi-antigen binding molecule according to claim 10, characterized characterized in that the effector (E) via a link (B) to said molecule is bound.

12. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindeglied (B) eine Protease-Spaltsequenz, vorzugsweise eine PSA-, Cathepsin-, Plasminogen- und/oder Plasminogenaktivator-Spaltsequenz enthält.12. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to claim 11, characterized characterized in that the link (B) a protease cleavage sequence, preferably one Contains PSA, cathepsin, plasminogen and / or plasminogen activator cleavage sequence.

13. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Spezifität (A) gegen ein zu analysierendes Molekül gerichtet ist und die zweite Spezifität (B) gegen einen Analyten gerichtet ist. 13. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of claims 1-12, characterized in that the first specificity (A) against a to be analyzed Molecule is directed and the second specificity (B) is directed against an analyte.

14. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt ein radioaktives Molekül, ein fluoreszierendes Molekül und/oder ein Enzym ist.14. Single chain, multi-antigen binding molecule according to claim 13, characterized characterized in that the analyte is a radioactive molecule, a fluorescent molecule and / or is an enzyme.

15. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 10-12, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Spezifität (A) gegen ein zu analysierendes Molekül gerichtet ist, die zweite Spezifität (B) gegen ein anderes zu analysierendes Molekül gerichtet ist und der Effektor (E) ein Analyt ist.15. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of claims 10-12, characterized in that the first specificity (A) against a to be analyzed Molecule is directed, the second specificity (B) against another to be analyzed Molecule is directed and the effector (E) is an analyte.

16. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt ein radioaktives Molekül, ein fluoreszierendes Molekül und/oder ein Enzym ist.16. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to claim 15, characterized characterized in that the analyte is a radioactive molecule, a fluorescent molecule and / or is an enzyme.

17. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid (P) und/oder der Effektor (E) ein fusiogenes Peptid enthält.17. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of claims 1-12, characterized in that the peptide (P) and / or the effector (E) a fusiogenes Contains peptide.

18. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Spezifität (A) gegen eine Zielzelle gerichtet ist und die zweite Spezifität (B) gegen einen Vektor.18. Single chain, multi-antigen binding molecule according to claim 17, characterized characterized in that the first specificity (A) is directed against a target cell and the second specificity (B) against a vector.

19. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor eine Nukleinsäure, ein kationisches Peptid oder Protein, ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer oder ein kationisches Porphyrin ist.19. Single chain, multi-antigen binding molecule according to claim 18, characterized characterized in that the vector is a nucleic acid, a cationic peptide or protein, is a cationic lipid, a cationic polymer or a cationic porphyrin.

20. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Spezifität (A) gegen eine Zellmembran, insbesondere gegen Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten, Granulozyten, hämatopoietische Zellen, Endothelzellen, glatte Muskelzellen, quergestreifte Muskelzellen, Epithelzellen, Leberzellen, Nierenzellen, Gliazellen, Zellen des Stützgewebes, Tumorzellen oder Leukämiezellen, oder gegen Proteine der extrazellulären Matrix, des Komplementsystems, des Gerinnungssystems, des Kininsystems, des Blutplasmas, des Stützgewebes, oder gegen Cytokine oder Chemokine, oder gegen körpereigene oder körperfremde Toxine, oder gegen Arzneimittel, insbesondere Digitalis, und/oder gegen Infektionserreger, wie insbesondere bakterielle, virale und/oder parasitäre Infektionserreger, gerichtet ist.20. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of claims 1-12, characterized in that the first specificity (A) against a cell membrane, especially against lymphocytes, macrophages, monocytes, granulocytes, hematopoietic cells, endothelial cells, smooth muscle cells, striated Muscle cells, epithelial cells, liver cells, kidney cells, glial cells, cells of the Support tissue, tumor cells or leukemia cells, or against proteins of the extracellular matrix, the complement system, the coagulation system, the Kininsystem, the blood plasma, the supporting tissue, or against cytokines or Chemokines, or against the body's own or foreign toxins, or against Medicines, especially digitalis, and / or against infectious agents, such as in particular bacterial, viral and / or parasitic infectious agents.

21. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-12 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Spezifität (B) gegen eine Zellmembran, insbesondere gegen Lymphozyten, Makrophagen, Monzyten oder Granulozyten, gegen Cytokine, Chemokine oder Wachstumsfaktoren, gegen Proteine des Komplementsystems, gegen Proteine des Gerinnungssystems, gegen fibrinolytische Proteine, gegen Enzyme, welche an der Zielstruktur die unwirksame Vorstufe eines Wirkstoffes in einen aktiven, insbesondere zytotoxischen Wirkstoff überführen können, gegen Peptidhormone oder Steroidhormone, gegen den konstanten Teil eines Immunglobulins, gegen einen Mediator, wie insbesondere gegen Histamin, Serotonin, Leukotrien, Prostacyclin oder Kinin, gegen Infektionserreger, gegen Tumorzellen, gegen Monozyten, Makrophagen und/oder Lymphozyten, gegen körpereigene oder körperfremde Toxine, gegen Arzneimittel, insbesondere Digitalis, gerichtet ist.21. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of claims 1-12 and 20, characterized in that the second specificity (B) against a cell membrane, especially against lymphocytes, macrophages, monocytes or granulocytes Cytokines, chemokines or growth factors, against proteins of the complement system, against proteins of the coagulation system, against fibrinolytic proteins, against enzymes, which the ineffective precursor of an active ingredient in a can transfer active, in particular cytotoxic active ingredient, against Peptide hormones, or steroid hormones, against the constant part of one Immunoglobulins, against a mediator, especially against histamine, Serotonin, leukotriene, prostacyclin or kinin, against infectious agents, against Tumor cells, against monocytes, macrophages and / or lymphocytes, against endogenous or foreign toxins, against drugs, in particular Digitalis.

22. Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-12, 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Effektor (E) ausgewählt ist aus einer Transmembrandomäne, einem Glykophospholipidanker, dem Liganden bindende Teil eines Rezeptors, einem Liganden für einen Rezeptor oder der den Rezeptor bindenden Teilsequenz des Liganden, einem Peptidhormon, einem Cytokin, einem Wachstumsfaktor, einem Wachstumsfaktorinhibitor, einem Chemokin, einem Interferon, einem Mediator, einem kreislaufwirksamen Peptid, einem Enzym, welches eine inaktive Vorstufe eines Wirkstoffes in einen aktiven Wirkstoff überführt; einem Protein, welches die Gerinnung aktiviert oder inhibiert; einem Protein, welches die Fibrinolyse aktiviert oder inhibiert; einem Protein, welches das Komplementsystem aktiviert oder inhibiert; einer oder mehreren konstanten Domänen eines Immunglobulins; einem zytotoxischen Peptid; einem anderen, einzelkettigen, mehrfach-, insbesondere zweifach-antigenbindenden Molekül; einem Tumorantigen oder einem Antigen eines Infektionserregers, wie beispielsweise einem bakteriellen Antigen oder einem viralen Antigen; einem Peptid enthaltend Cystein und/oder einem di- bzw. multimerisierenden Peptid.22. Single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of claims 1-12, 20 and 21, characterized in that the effector (E) is selected from a Transmembrane domain, a glycophospholipid anchor, the ligand binding part a receptor, a ligand for a receptor or the receptor binding partial sequence of the ligand, a peptide hormone, a cytokine, a Growth factor, a growth factor inhibitor, a chemokine, a Interferon, a mediator, a circulatory peptide, an enzyme, which is an inactive precursor of an active ingredient in an active ingredient transferred; a protein that activates or inhibits coagulation; one Protein that activates or inhibits fibrinolysis; a protein that Complement system activated or inhibited; one or more constant Domains of an immunoglobulin; a cytotoxic peptide; another, single-chain, multiple, in particular double antigen-binding molecule; one Tumor antigen or an antigen of an infectious agent, such as a bacterial antigen or a viral antigen; containing a peptide Cysteine and / or a di- or multimerizing peptide.

23. Nukleinsäure kodierend für ein einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-22.23. Nucleic acid coding for a single-chain, multi-antigen-binding molecule any of claims 1-22.

24. Nukleinsäure nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Nukleinsäure am 5'-Ende eine Nukleotidsequenz kodierend für eine Signal- oder Transmembransequenz enthält.24. Nucleic acid according to claim 23, characterized in that said Nucleic acid at the 5 'end encoding a nucleotide sequence for a signal or Contains transmembrane sequence.

25. Nukleinsäure nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Nukleinsäure am 5'-Ende einen Promotor und/oder Aktivator enthält.25. Nucleic acid according to claim 23 or 24, characterized in that said Contains nucleic acid at the 5 'end of a promoter and / or activator.

26. Nukleinsäure nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Aktivator zellspezifisch, zellzyklusspezifisch, metabolisch-spezifisch und/oder durch einen Wirkstoff aktivierbar oder suprimierbar ist.26. Nucleic acid according to claim 25, characterized in that the activator cell-specific, cell cycle-specific, metabolic-specific and / or by one Active ingredient can be activated or suppressed.

27. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 23-26, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Nukleinsäure am 5'-Ende des Startkodons die Sequenz GCCACC oder GCCGCC enthält.27. Nucleic acid according to one of claims 23-26, characterized in that the called nucleic acid at the 5 'end of the start codon the sequence GCCACC or GCCGCC contains.

28. Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 23-27.28. Vector containing a nucleic acid according to one of claims 23-27.

29. Vektor nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein viraler oder nicht-viraler Vektor ist. 29. Vector according to claim 28, characterized in that the vector is a viral or is non-viral vector.

30. Vektor nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der nicht-virale Vektor ausgewählt ist aus einem kationischen Lipid, einem kationischen Polymer; einem kationischen Peptid oder einem kationischen Porphgoin.30. Vector according to claim 29, characterized in that the non-viral vector is selected from a cationic lipid, a cationic polymer; one cationic peptide or a cationic porphgoin.

31. Zelle enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 23-27 oder einen Vektor nach Anspruch 28 oder 29.31. Cell containing a nucleic acid according to one of claims 23-27 or a vector according to claim 28 or 29.

32. Zelle nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle.32. Cell according to claim 31, characterized in that the cell is a bacterial, yeast, Insect or mammalian cell.

33. Zelle nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Säugerzelle ein Lymphozyt, ein Makrophage, eine Gliazelle, eine Epithelzelle, eine Leberzelle, eine Nierenzelle, eine Knochenmarkzelle, eine Endothelzelle, eine glatte oder quergestreifte Muskelzelle oder ein Fibroblast ist.33. Cell according to claim 32, characterized in that the mammalian cell is a lymphocyte, a macrophage, a glial cell, an epithelial cell, a liver cell, a kidney cell, a Bone marrow cell, an endothelial cell, a smooth or striated muscle cell or is a fibroblast.

34. Verfahren zur Herstellung eines einzelkettigen, mehrfach-antigenbindenden Moleküls, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zelle nach Anspruch 31 oder 32 kultiviert und das Expressionsprodukt gegebenenfalls isoliert wird.34. Process for producing a single-chain, multi-antigen-binding molecule, characterized in that a cell according to claim 31 or 32 cultivated and the Expression product is isolated if necessary.

35. Arzneimittel enthaltend ein einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-12 und 17-22, eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 23-27, einen Vektor nach einem der Ansprüche 28-30 oder eine Zelle nach einem der Ansprüche 31-33.35. Medicament containing a single-chain, multi-antigen-binding molecule any of claims 1-12 and 17-22, a nucleic acid according to any of claims 23-27, a vector according to any one of claims 28-30 or a cell according to any of the Claims 31-33.

36. Diagnostikum enthaltend ein einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 13-16.36. Diagnostic agent containing a single-chain, multi-antigen-binding molecule any of claims 13-16.

37. Verwendung eines einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1-22, einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 23-27, eines Vektors nach einem der Ansprüche 28-30 oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 31-33 zur Therapie, Prophylaxe oder Diagnose von Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Entzündungserkrankungen, Erkrankungen des Blutes, insbesondere des Blutgerinnungs- und/oder Blutkreislaufsystems, Erkrankungen des Nervensystems und/oder Infektionserkrankungen.37. Use of a single-chain, multi-antigen-binding molecule according to one of the Claims 1-22, a nucleic acid according to any one of claims 23-27, a vector according to one of claims 28-30 or a cell according to one of claims 31-33 for Therapy, prophylaxis or diagnosis of tumor diseases, Autoimmune diseases, inflammatory diseases, diseases of the blood, especially of the blood coagulation and / or blood circulation system, diseases of the Nervous system and / or infectious diseases.