DE19823834A1 - Genetic process for the production of riboflavin - Google Patents

Abstract

The invention relates to a genetic method for producing riboflavin. The production of riboflavin in organisms is increased by specially selecting genes of the riboflavin biosynthesis or of the combination thereof in organisms, especially in bacteria, fungi, yeasts and plants, and of the expression thereof. The invention also relates to a nucleic acid fragment containing genes with the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 5 or the functional equivalents thereof, to expression vectors containing the nucleic acid fragments, and to organisms containing at least one nucleic acid fragment or at least one vector.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein genetisches Verfahren zur Herstellung von Riboflavin. Durch die spezielle Auswahl von Genen der Riboflavinbiosynthese bzw. deren Kombination in Organismen speziell in Bakterien, Pilzen, Hefen und Pflanzen und deren Expression wird die Riboflavinproduktion in diesen Organismen gesteigert.The present invention relates to a genetic method for Production of riboflavin. Through the special selection of genes riboflavin biosynthesis or their combination in organisms especially in bacteria, fungi, yeasts and plants and their Expression is the riboflavin production in these organisms increased.

Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäurefragment enthaltend Gene mit den Sequenzen SEQ ID NO. 1, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5 oder deren funktionellen Äquivalente, Expressionsvektoren enthaltend die Nukleinsäurefragmente und Organismen enthaltend mindestens ein Nukleinsäurefragment oder mindestens einen Vektor.The invention further relates to nucleic acid fragments containing Genes with the sequences SEQ ID NO. 1, SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 5 or their functional equivalents, expression vectors containing the nucleic acid fragments and organisms at least one nucleic acid fragment or at least one vector.

Vitamin-B2, auch Riboflavin genannt, wird von allen Pflanzen und einer Vielzahl von Mikroorganismen hergestellt. Für Mensch und Tier ist es essentiell, da sie nicht in der Lage sind, es zu synthetisieren. Riboflavin spielt eine wichtige Rolle im Meta­ bolismus. So ist es beispielsweise an der Verwertung von Kohlen­ hydraten beteiligt. Bei Vitamin B2-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten und ähnliche Hautschäden, Bindehautentzündungen, ver­ minderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme auf­ treten. Vitamin-B2 hat deshalb eine große wirtschaftliche Bedeu­ tung beispielsweise als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Es wird verschiedensten Lebensmitteln zugesetzt. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarbstoff, bei­ spielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc. verwendet.Vitamin B2, also called riboflavin, is found in all plants and a variety of microorganisms. For people and Animal is essential since they are unable to synthesize. Riboflavin plays an important role in meta bolism. For example, it is about the recycling of coal hydrates involved. With vitamin B2 deficiency, inflammation occurs Oral and pharynx mucous membranes, itching and inflammation in the Skin folds and similar skin damage, conjunctivitis, ver decreased visual acuity and clouding of the cornea. In infants and children can stop growing and lose weight to step. Vitamin B2 is therefore of great economic importance tion, for example, as a vitamin preparation for vitamin deficiency as well as a feed additive. It will be various foods added. In addition, it is also used as a food coloring used for example in mayonnaise, ice cream, pudding etc.

Die Herstellung von Vitamin B2 erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell (siehe z. B. Kurth et al., 1996, Riboflavin, in: Ull­ mann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). Bei den chemischen Herstellverfahren wird Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei relativ kostspielige Ausgangsprodukte, wie z. B. D-Ribose, ein­ gesetzt werden müssen.Vitamin B2 is produced either chemically or microbial (see e.g. Kurth et al., 1996, Riboflavin, in: Ull mann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). At The chemical manufacturing process usually uses riboflavin obtained as a pure end product in multi-stage processes, whereby relatively expensive raw materials, such as. B. D-Ribose must be set.

Eine Alternative zur chemischen Synthese von Riboflavin ist die fermentative Herstellung des Vitamin B2 durch Mikroorganismen. Als Ausgangsstoffe dienen dabei nachwachsende Rohstoffe, wie Zucker oder pflanzliche Öle. Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983), aber auch Hefen, wie z. B. Can­ dida, Pichia und Saccharomyces oder Bakterien, wie z. B. Bacillus, Clostridien oder Corynebakterien sind als Riboflavin-Produzenten beschrieben. In EP-A-0 405 370 und EP-A-0 821 063 wird die Her­ stellung von Riboflavin mit rekombinanten Bakterienstämmen be­ schrieben, wobei die Stämme durch Transformation mit Riboflavin- Biosynthesegenen aus Bacillus subtilis erhalten wurden.An alternative to the chemical synthesis of riboflavin is fermentative production of vitamin B2 by microorganisms. Renewable raw materials such as Sugar or vegetable oils. The production of riboflavin by Fermentation of mushrooms like Eremothecium ashbyii or Ashbya  gossypii is known (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., page 1183, 1983), but also yeasts, such as. B. Can dida, Pichia and Saccharomyces or bacteria, such as. B. Bacillus, Clostridia or Corynebacteria are as riboflavin producers described. In EP-A-0 405 370 and EP-A-0 821 063 the Her Provision of riboflavin with recombinant bacterial strains wrote, the strains by transformation with riboflavin Biosynthetic genes from Bacillus subtilis were obtained.

In Patent WO 95/26406 bzw. WO 93/03183 sowie in DE 44 20 785 wird die Klonierung der für die Riboflavin-Biosynthese spezifischen Gene aus den eukaryontischen Organismen Ashbya gossypii bzw. Saccharomyces cerevisiae, sowie Mikroorganismen, die mit diesen Genen transformiert wurden, und die Verwendung solcher Mikro­ organismen zur Riboflavinsynthese beschrieben.In patent WO 95/26406 or WO 93/03183 as well as in DE 44 20 785 the cloning of those specific for riboflavin biosynthesis Genes from the eukaryotic organisms Ashbya gossypii or Saccharomyces cerevisiae, as well as microorganisms with these Genes have been transformed, and the use of such micro organisms for riboflavin synthesis described.

In beiden Organismen katalysieren 6 Enzyme ausgehend von Guano­ sintriphosphat (GTP) und von Ribulose-5-Phosphat die Bildung von Riboflavin. Hierbei setzt die GTP-Cyclohydrolase-II (rib1-Gen­ produkt) GTP zu 2,5-Diamino-6-(ribosylamino)-4-(3H)-pyrimidi­ non-5-phosphat um. Diese Verbindung wird anschließend durch die 2,5-Diamino-6-(ribosylamino)-4-(3H)-pyrimidinon-5-phosphat Reduk­ tase (rib7 Genprodukt) zu 2,5-Diamino-ribitylamino-2,4-(1H,3H)- pyrimidin-5-phosphat reduziert und dann durch eine spezifische Deaminase (rib2-Genprodukt) zu 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(1H,3H)- pyrimidindion-5-phosphat deaminiert. Durch eine unspezifische Phosphatase wird daraufhin das Phosphat abgespalten.In both organisms, 6 enzymes catalyze starting from guano sintriphosphate (GTP) and ribulose-5-phosphate the formation of Riboflavin. Here, the GTP cyclohydrolase II (rib1 gene product) GTP to 2,5-diamino-6- (ribosylamino) -4- (3H) pyrimidi non-5-phosphate. This connection is then established by the 2,5-diamino-6- (ribosylamino) -4- (3H) -pyrimidinone-5-phosphate reduc tase (rib7 gene product) to 2,5-diamino-ribitylamino-2,4- (1H, 3H) - pyrimidine-5-phosphate and then reduced by a specific Deaminase (rib2 gene product) to 5-amino-6-ribitylamino-2,4- (1H, 3H) - pyrimidinedione-5-phosphate deaminated. Through an unspecific Phosphatase then cleaves the phosphate.

Ribulose-5-phosphat, neben GTP das zweite Ausgangsprodukt der letzten enzymatischen Schritte der Riboflavinbiosynthese, wird durch die 3, 4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase (rib3-Gen­ produkt) zu 3, 4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat (DBP) umgesetzt.Ribulose-5-phosphate, in addition to GTP, the second starting product of last enzymatic steps of riboflavin biosynthesis by the 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase (rib3 gene product) converted to 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate (DBP).

Sowohl DBP als auch 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(1H,3H)-Pyrimidin­ dion sind die Edukte der enzymatischen Synthese von 6,7-Dime­ thyl-8-ribityllumazin. Diese Reaktion wird durch das rib4-Gen­ produkt (DMRL-Synthase) katalysiert. DMRL wird daraufhin durch die Riboflavin-Synthase (rib5-Genprodukt) zu Riboflavin umgesetzt (Bacher et al. (1993), Bioorg. Chem. Front. Vol. 3, Springer Verlag).Both DBP and 5-amino-6-ribitylamino-2,4- (1H, 3H) pyrimidine dione are the starting materials for the enzymatic synthesis of 6,7-dime thyl-8-ribityllumazine. This reaction is caused by the rib4 gene product (DMRL synthase) catalyzed. DMRL will then go through the riboflavin synthase (rib5 gene product) converted to riboflavin (Bacher et al. (1993) Bioorg. Chem. Front. Vol. 3, Springer Publishing company).

Trotz dieser Fortschritte in der Herstellung von Riboflavin besteht nach wie vor ein Bedarf zur Verbesserung und Steigerung der Vitamin B2-Produktivität um den steigenden Bedarf zu decken und die Herstellung von Riboflavin effizienter zu gestalten. Despite these advances in the production of riboflavin there is still a need for improvement and improvement Vitamin B2 productivity to meet the growing need and to make the production of riboflavin more efficient.  

Es bestand daher die Aufgabe die Vitamin B2-Produktivität weiter zu verbessern. Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur ge­ steigerten Herstellung von Riboflavin mit einem Organismus, der in der Lage ist Riboflavin zu synthetisieren, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Aktivität der Enzyme 3,4-Dihydroxy-2- butanon-4-phosphat-Synthase, Dimethyl-8-ribityllumazin-Synthase und Riboflavin-Synthase oder deren Funktionsanalogen im Orga­ nismus erhöht, gelöst. Vorteilhaft wird das Verfahren zur gesteigerten Herstellung von Riboflavin mit einem Organismus, der in der Lage ist Riboflavin zu synthetisieren, durchgeführt, der zusätzlich die Kombination der Gene, die für die Enzyme 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase (= rib3-Genprodukt), Dimethyl-8-ribityllumazin-Synthase (= rib4-Genprodukt) und Ribo­ flavin-Synthase (= rib5-Genprodukt) oder deren Funktionsanalogen kodieren, enthält.The task therefore continued to be vitamin B2 productivity to improve. This task was accomplished through a method of ge increased production of riboflavin with an organism that is able to synthesize riboflavin records that the activity of the enzymes 3,4-dihydroxy-2- butanone 4-phosphate synthase, dimethyl 8-ribityllumazine synthase and riboflavin synthase or their functional analogues in the organization nism increased, solved. The method is advantageous for increased production of riboflavin with an organism, able to synthesize riboflavin, which is also the combination of the genes responsible for the enzymes 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase (= rib3 gene product), Dimethyl-8-ribityllumazine synthase (= rib4 gene product) and ribo flavin synthase (= rib5 gene product) or their functional analogs encode, contains.

Weiter vorteilhaft zur Steigerung der Vitamin-B2-Produktivität ist die Kombination von Steigerung der natürlichen Enzymaktivität und Einbringen der oben genannten Genkombination zur Erhöhung der Genexpression.Also beneficial for increasing vitamin B2 productivity is the combination of increasing natural enzyme activity and introducing the above-mentioned gene combination to increase the Gene expression.

Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für das erfindungsgemäße Ver­ fahren eignen sich prinzipiell alle Organismen, die in der Lage sind Riboflavin zu synthetisieren. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Riboflavin synthetisieren können. Aber auch Organismen, die aufgrund des Einbringens der kompletten Vitamin B2-Synthesegene in der Lage sind Riboflavin zu synthetisieren, sind für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Für das erfin­ dungsgemäße Verfahren sind Organismen wie Bakterien, Hefen, Pilze oder Pflanzen geeignet. Beispielhaft seien eukaryontische Orga­ nismen wie Pilze, die in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschrieben werden, wie Ashbya oder Eremothecium, Hefen wie Candida, Saccharomyces oder Pichia oder Pflanzen wie Arabidopsis, Tomate, Kartoffel, Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Roggen, Reis, Hirse, Baumwolle, Zuckerrübe, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Canola, Hafer, Tabak, Alfalfa, Salat oder die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies oder proka­ ryontische Organismen wie gram-positive oder gram-negative Bakte­ rien wie Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Cyanobacter, Escherichia oder Klebstella genannt. Bevorzugt wer­ den Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Coryne­ bacterium, Brevibacterium, Bacillus, Escherichia, Ashbya, Eremo­ thecium, Candida oder Saccharomyces oder Pflanzen wie Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Kartoffel oder Tomate. Besonders bevorzugt werden Organismen der Gattung und Art Ashbya gossypii, Eremo­ thecium ashbyii, Saccharomyces cerevisiae, Candida flaveri, Candida famata, Corynebakterium ammoniagenes oder Bacillus subtilis. Als Pflanzen werden besonders bevorzugt Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Kartoffel und Tomate.As organisms or host organisms for the Ver In principle, all organisms that are capable of driving are suitable are to be synthesized riboflavin. Organisms are preferred, that can naturally synthesize riboflavin. But also Organisms due to the introduction of the complete vitamin B2 synthesis genes are able to synthesize riboflavin, are suitable for the method according to the invention. For the invent Methods according to the invention are organisms such as bacteria, yeast, fungi or plants. Examples are eukaryotic organization nisms such as fungi, which are described in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) on page 15, Table 6, such as Ashbya or Eremothecium, yeasts such as Candida, Saccharomyces or Pichia or plants such as arabidopsis, tomato, potato, corn, soy, Rapeseed, barley, wheat, rye, rice, millet, cotton, sugar beet, Sunflower, flax, hemp, canola, oats, tobacco, alfalfa, lettuce or the different tree, nut and wine species or proka ryontic organisms such as gram-positive or gram-negative bacteria such as Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Cyanobacter, Escherichia or Klebstella called. Preferred who the organisms selected from the group of the genera Coryne bacterium, Brevibacterium, Bacillus, Escherichia, Ashbya, Eremo thecium, candida or saccharomyces or plants such as corn, soybeans, Rapeseed, barley, wheat, potatoes or tomatoes. Particularly preferred become organisms of the genus and species Ashbya gossypii, Eremo thecium ashbyii, Saccharomyces cerevisiae, Candida flaveri, Candida famata, Corynebacterium ammoniagenes or Bacillus  subtilis. Maize, soybean, Rapeseed, barley, wheat, potato and tomato.

Die erfindungsgemäße Kombination der rib-Gene rib3, rib4 und rib5 und/oder die Aktivitätserhöhung der Gene und ihrer Genprodukte führt zu einer deutlich gesteigerten Riboflavin-Produktivität. Die genannten Gene lassen sich prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die verwendeten Organismen einführen, vor­ teilhaft werden sie über Transformation, Transfektion, Elektro­ poration, mit der sog. Partikelgun oder über Mikroinjektion in die Organismen bzw. deren Zellen eingebracht. Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (2994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen. Als vorteilhaft seien beispielhaft Methoden wie das Einbringen der DNA über homologe oder heterologe Rekombination beispielsweise mit Hilfe des ura-3-Gens, speziell des ura-3-Gens von Ashbya, wie in der deutschen Anmeldung DE 198 01 120.2 beschrieben und/oder über die im folgenden beschriebene REMI-Methode (= "Restriktion-Enzyme- Mediated-Integration"), genannt.The combination of the rib genes rib3, rib4 and rib5 according to the invention and / or the increase in activity of the genes and their gene products leads to a significantly increased riboflavin productivity. The genes mentioned can in principle be used by all of those skilled in the art introduce known methods into the organisms used, before they become part of transformation, transfection, electro poration, with the so-called particle gun or via microinjection in the organisms or their cells introduced. For microorganisms the specialist can use appropriate methods in the textbooks of Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, by F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, by D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), by Kaiser et al. (2994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press or Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press. Be advantageous exemplary methods such as the introduction of DNA via homologous or heterologous recombination, for example using the ura-3 gene, especially the Ashbya ura-3 gene, as in the German application DE 198 01 120.2 described and / or on the REMI method described below (= "Restriction Enzyme- Mediated Integration ").

Die REMI-Technik basiert auf der Kotransformation eines linearen DNA-Konstruktes, das an beiden Enden mit derselben Restriktions­ endonuklease geschnitten wurde, zusammen mit der Restriktions­ endonuklease, die für diese Restriktion des DNA-Konstrukts ver­ wendet wurde, in einen Organismus. Die Restriktionsendonuklease schneidet daraufhin die genomische DNA des Organismus, in den das DNA-Konstrukt zusammen mit dem Restriktionsenzym eingebracht wurde. Dies führt zu einer Aktivierung der zelleigenen Reparatur­ mechanismen. Diese Reparaturmechanismen reparieren die durch die Endonuklease hervorgerufene Strangbrüche der genomischen DNA und bauen dabei mit einer gewissen Frequenz auch das kotransformierte DNA-Konstrukt mit ins Genom ein. In der Regel bleiben dabei die Restriktionsschnittstellen an beiden Enden der DNA erhalten.The REMI technique is based on the co-transformation of a linear one DNA construct that has the same restriction at both ends endonuclease was cut, along with the restriction endonuclease ver for this restriction of the DNA construct was applied to an organism. The restriction endonuclease then cuts the genomic DNA of the organism into which the DNA construct was introduced together with the restriction enzyme has been. This leads to activation of the cell's own repair mechanisms. These repair mechanisms repair those through the Endonuclease-induced strand breaks in genomic DNA and build the co-transformed with a certain frequency DNA construct into the genome. As a rule, they remain Restriction sites were obtained at both ends of the DNA.

Diese Technik wurde von Bölker et al. (Mol Gen Genet, 248, 1995: 547-552) für die Insertionsmutagenese von Pilzen beschrieben. Von Schiestl und Petes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991: 7585-7589) wurde die Methode zur Aufklärung, ob es bei Saccharo­ myces eine heterologe Rekombination gibt, verwendet. Zur stabilen Transformation und regulierten Expression eines induzierbaren Reportergens wurde die Methode von Brown et al. (Mol. Gen. Genet. 251, 1996: 75-80) beschrieben. Das System wurde bisher noch nicht als gentechnisches Werkzeug zur Optimierung von Stoffwechselwegen oder zur kommerzielle Überexpression von Proteinen eingesetzt.This technique was developed by Bölker et al. (Mol Gen Genet, 248, 1995: 547-552) for insertion mutagenesis of fungi. Von Schiestl and Petes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991: 7585-7589) was the method of clarifying whether it was at Saccharo myces gives a heterologous recombination. For stable Transformation and regulated expression of an inducible  Reporter gene was the method of Brown et al. (Mol. Gen. Genet. 251, 1996: 75-80). The system has not yet been used as a genetic engineering tool to optimize metabolic pathways or used for commercial overexpression of proteins.

Am Beispiel der Riboflavinsynthese wurde gezeigt, daß mit Hilfe der REMI-Methode Biosynthesegene in das Genom der oben genannten Organismen integriert werden kann und damit Produktionsverfahren zur Herstellung von Stoffwechselprodukten des Primär- oder Sekun­ därmetabolismus speziell von Biosynthesewegen beispielsweise von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin oder Tryptophan, Vita­ minen wie Vitamin A, B2, B6, B12, C, D, E, F, S-Adenosylmethionin, Biotin, Panthotensäure oder Folsäure, Carotinoiden wie β-Carotin, Lycopin, Canthaxanthin, Astaxanthin oder Zeaxanthin oder Prote­ inen wie Hydrolasen wie Lipasen, Esterasen, Amidasen, Nitrilasen, Proteasen, Mediatoren wie Cytokine z. B. Lymphokine wie MIF, MAF, TNF, Interleukine wie Interleukin 1, Interferone wie γ-Interferon, tPA, Hormone wie Proteohormone, Glykohormone, Oligo- oder Poly­ petidhormone wie Vassopressin, Endorphine, Endostatin, Angio­ statin, Wachstumsfaktoren Erythropoietin, Transkriptionsfaktoren, Integrine wie GPIIb/IIIa oder α_vβIII, Rezeptoren wie die ver­ schiedenen Glutamatrezeptoren, Angiogenesefaktoren wie Angio­ tensin optimiert werden können.Using the example of riboflavin synthesis, it was shown that with the help of the REMI method, biosynthesis genes can be integrated into the genome of the above-mentioned organisms and thus production processes for the production of metabolic products of primary or secondary metabolism, especially of biosynthetic pathways, for example of amino acids such as lysine, methionine, threonine or tryptophan, vitamins such as vitamin A, B2, B6, B12, C, D, E, F, S-adenosylmethionine, biotin, pantothenic acid or folic acid, carotenoids such as β-carotene, lycopene, canthaxanthin, astaxanthin or zeaxanthin or proteins such as Hydrolases such as lipases, esterases, amidases, nitrilases, proteases, mediators such as cytokines e.g. B. lymphokines such as MIF, MAF, TNF, interleukins such as interleukin 1, interferons such as γ-interferon, tPA, hormones such as proteohormones, glycohormones, oligo- or poly-petid hormones such as vassopressin, endorphins, endostatin, angio statin, growth factors erythropoietin, transcrine such as GPIIb / IIIa or α _v βIII, receptors such as the various glutamate receptors, angiogenesis factors such as angiosensin can be optimized.

Mit Hilfe der REMI-Methode können die erfindungsgemäßen Nuklein­ säurefragmente oder andere der oben genannten Gene an trans­ criptionsaktive Stellen im Genom plaziert werden.With the help of the REMI method, the nucleic acids according to the invention can acid fragments or other of the above genes to trans creation-active sites are placed in the genome.

Vorteilhafterweise werden die Nukleinsäuren zusammen mit einem mindestens einem Reportergen in ein DNA-Konstrukt kloniert, das in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo- oder Biolumineszenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Anti­ biotikaresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Glucosidasegene, Peroxidasegen oder Bio­ synthesegene wie die Riboflavingene, das Luciferasegen, β-Galactosidasegen, gfp-Gen, Lipasegen, Esterasegen, Peroxidase­ gen, β-Lactamasegen, Acetyl-, Phospo- oder Adenyltransferasegen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifi­ zieren, die eine bis zu Faktor 2 unterschiedliche Produktivität zeigen (siehe Fig. 1). Fig. 1 zeigt die Klone ITA-GS-15.2, ITA-GS-17.1 und ITA-GS-01, die nach Integration erhalten wurden, mit ihren unterschiedlichen Vitamin B2- (= Riboflavin)Produktivi­ täten. The nucleic acids are advantageously cloned together with at least one reporter gene into a DNA construct which is introduced into the genome. This reporter gene should allow easy detection via a growth, fluorescence, chemo- or bioluminescence assay or via a photometric measurement. Examples include reporter genes, anti-biotic resistance genes, hydrolase genes, fluorescence protein genes, bioluminescence genes, glucosidase genes, peroxidase genes or bio-synthesis genes such as the riboflavin genes, the luciferase gene, β-galactosidase gene, gfp gene, lipase gene, esterase gene, lactylase gene, β-genoxidase gene, β-genes gene, β-genes or called adenyltransferase gene. These genes enable the transcription activity and thus the expression of the genes to be measured and quantified easily. This makes it possible to identify genome sites that show up to a factor of 2 different productivity (see FIG. 1). Fig. 1 shows the clones ITA-GS-15.2, ITA-GS-17.1 and ITA-GS-01, which were obtained after integration, with their different vitamin B2- (= riboflavin) productivity.

Im Falle, daß die Biosynthesegene selber eine leichte Detektier­ barkeit ermöglichen, kann wie beispielsweise im Falle des Ribo­ flavins auf ein zusätzliches Reportergen verzichtet werden.In the event that the biosynthetic genes themselves are easy to detect enable availability, such as in the case of the Ribo flavins can be dispensed with an additional reporter gene.

Sollen mehrere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können. Auch Genfragmente, die für die jeweiligen Aktivi­ täten kodieren können in der REMI-Technik eingesetzt werden.If several genes are to be introduced into the organism, so can all be combined with a reporter gene in a single Vector or each individual gene with a reporter gene in each a vector are introduced into the organism, the different vectors introduced simultaneously or successively can be. Also gene fragments that are relevant for the respective activi coding can be used in REMI technology.

Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Integration von Bio­ synthesegenen in das Genom von Organismen eignen sich prinzipiell alle bekannten Restriktionsenzyme. Restriktionsenzyme, die nur 4 Basenpaare als Restriktionsschnittstelle erkennen, sind weniger bevorzugt, da sie zu häufig im Genom oder im zu integrierenden Vektor schneiden, bevorzugt sind Enzyme die 6, 7, 8 oder mehr Basenpaare als Schnittstelle erkennen wie BamHI, EcoRI, BglII, SphI, SpeI, XbaI, XhoI, NcoI, SalI, ClaI, KpnI, HindIII, SacI, PstI, Bpn1, NotI, SrfI oder SfiI um nur einige der möglichen Enzyme zu nennen. Von Vorteil ist, wenn die verwendeten Enzyme keine Schnittstellen mehr in der einzuführenden DNA haben, dies erhöht die Effizienz der Integration. In der Regel werden 5 bis 500 U, bevorzugt 10 bis 250, besonders bevorzugt 10 bis 100 U der Enzyme im REMI-Ansatz verwendet. Die Enzyme werden vorteilhaft in einer wäßrigen Lösung eingesetzt, die Substanzen zur osmotischen Stabilisierung wie Zucker wie Saccharose, Trehalose oder Glucose, Polyole wie Glycerin oder Polyethylenglycol, eine Puffer mit einer vorteilhaften Pufferung im Bereich von pH 5 bis 9, bevor­ zugt 6 bis 8, besonders bevorzugt 7 bis 8 wie Tris, MOPS, HEPES, MES oder PIPES und/oder Substanzen zur Stabilisierung der Nukleinsäuren enthalten wie anorganische oder organische Salze von Mg, Cu, Co, Fe, Mn oder Mo. Es können gegebenenfalls noch weitere Stoffe enthalten sein wie EDTA, EDDA, DTT, β-Mercapto­ ethanol oder Nukleasehemmstoffe. Es ist aber auch möglich die REMI-Technik ohne diese Zusätze durchzuführen.For the method according to the invention for the integration of bio In principle, genes of synthesis in the genome of organisms are suitable all known restriction enzymes. Restriction enzymes that only Recognize 4 base pairs as a restriction site are fewer preferred because they are too common in the genome or to be integrated Cut vector, enzymes 6, 7, 8 or more are preferred Recognize base pairs as an interface like BamHI, EcoRI, BglII, SphI, SpeI, XbaI, XhoI, NcoI, SalI, ClaI, KpnI, HindIII, SacI, PstI, Bpn1, NotI, SrfI or SfiI to name just a few of the possible ones To name enzymes. It is advantageous if the enzymes used no longer have interfaces in the DNA to be introduced, this increases the efficiency of integration. Usually 5 to 500 U, preferably 10 to 250, particularly preferably 10 to 100 U of Enzymes used in the REMI approach. The enzymes are beneficial in used an aqueous solution, the substances for osmotic Stabilization like sugar like sucrose, trehalose or glucose, Polyols such as glycerin or polyethylene glycol, a buffer with an advantageous buffering in the range of pH 5 to 9 before moves 6 to 8, particularly preferably 7 to 8 such as Tris, MOPS, HEPES, MES or PIPES and / or substances to stabilize the Nucleic acids contain like inorganic or organic salts of Mg, Cu, Co, Fe, Mn or Mo. It may still be other substances may be included such as EDTA, EDDA, DTT, β-mercapto ethanol or nuclease inhibitors. But it is also possible REMI technology without performing these additives.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem Temperaturbereich von 5 bis 80°C, bevorzugt von 10 bis 60°C, besonders bevorzugt von 20 bis 40°C durchgeführt. Für das Verfahren eignen sich alle bekannten Methoden zur Destabilisierung von Zellmembranen wie beispielsweise die Elektroporation, die Fusion mit beladenen Vesikeln oder die Destabilisierung über verschiedene Alkali- oder Erdalkalisalze wie Lithium, Rubidium- oder Calziumsalze bevorzugt sind die Lithiumsalze. The inventive method is in a temperature range from 5 to 80 ° C, preferably from 10 to 60 ° C, particularly preferred from 20 to 40 ° C. All are suitable for the process known methods for destabilizing cell membranes such as for example electroporation, the fusion with loaded Vesicles or the destabilization via various alkali or Alkaline earth metal salts such as lithium, rubidium or calcium salts are preferred are the lithium salts.  

Die Nukleinsäuren können nach dem Isolieren direkt oder nach Auf­ reinigung für die erfindungsgemäße Reaktion verwendet werden.The nucleic acids can be isolated directly or after opening Cleaning can be used for the reaction according to the invention.

Die Fig. 2 und 3 geben das erfindungsgemäße Verfahren in einem schematischen Überblick für die Integration der erfindungsgemäßen rib-Genkombination wieder. Die DNA wurde mit dem Enzym SpeI ge­ schnitten und in seiner Gegenwart wurde die DNA in die Organismen eingeführt. Zur leichteren Selektion wurde ein Kanamycin-Resi­ stenzgen im Fragment mit eingebaut, das von TEF-Promotoren- Sequenzen flankiert ist (sog. "direct repeat"). Über diese Sequenzen wird das Resistenzgen über eine Rekombination wieder entfernt (siehe Fig. 3). Figs. 2 and 3 show the inventive method in a schematic overview of the integration of the rib-gene combination of the invention again. The DNA was cut with the enzyme SpeI and in its presence the DNA was introduced into the organisms. For easier selection, a kanamycin resistance gene was incorporated in the fragment, which is flanked by TEF promoter sequences (so-called "direct repeat"). The resistance gene is removed again via a recombination via these sequences (see FIG. 3).

Das Einbringen der erfindungsgemäßen Kombination der rib-Gene in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.The introduction of the combination of the rib genes according to the invention In plants, in principle, all known to those skilled in the art Methods are done.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten­ transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektroporation, die Inkuba­ tion trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikro­ injektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans­ formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Die Transformation von Pflanzen mit Agro­ bacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Will­ mitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.The transfer of foreign genes into the genome of a plant is made referred to as transformation. There are the described Methods for transforming and regenerating plants Plant tissues or plant cells for transient or stable Transformation used. Protoplasts are suitable methods transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the use of a gene cannon, electroporation, the Inkuba tion of dry embryos in DNA-containing solution, the micro injection and Agrobacterium-mediated gene transfer. The methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S. D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 and in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). The construct to be expressed is preferably converted into a vector cloned, which is suitable for trans Agrobacterium tumefaciens form, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). The transformation of plants with agro Bacterium tumefaciens is used, for example, by Höfgen and Will mitzer in nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877.

Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transforma­ tion von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies sowie Leguminosen verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigne­ ten Medien kultiviert werden.Transformed with an expression vector according to the invention Agrobacteria can also transforma in a known manner tion of plants, especially crops such as cereals, Corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, Flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species as well as legumes are used, e.g. B. by wounded leaves or pieces of leaf  bathed in an agrobacterial solution and then in suitable media are cultivated.

Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.The genetically modified plant cells can do all of this Methods known to those skilled in the art can be regenerated. Appropriate Methods can be seen from S. D. Kung and R. Wu, Potrykus or Höfgen and Willmitzer.

Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten die Enzymaktivität der rib-Genprodukte in der Zelle zu erhöhen.There are a variety of ways in which the enzyme activity to increase rib gene products in the cell.

Eine Möglichkeit besteht darin; die endogenen rib-Gene 3, 4 und 5 so zu verändern, daß sie für Enzyme mit gegenüber den Ausgangs­ enzymen erhöhter rib 3, 4 bzw. 5-Aktivität kodieren. Eine andere Erhöhung der Enzymaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem durch Veränderung der katalytischen Zentren ein erhöhter Substratumsatz erfolgt oder indem die Wirkung von Enzym­ inhibitoren aufgehoben wird, das heißt sie weisen eine erhöhte spezifische Aktivität auf oder ihre Aktivität wird nicht gehemmt. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität in einer weiteren vorteil­ haften Ausführungsform durch Erhöhung der Enzymsynthese in der Zelle erfolgen, beispielsweise durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzymsynthese reprimieren oder durch Erhöhung der Aktivi­ tät von Faktoren oder Regulatorelementen, die eine verstärkte Synthese fördern, oder bevorzugt durch Einbringen weiterer Gen­ kopien. Durch diese Maßnahmen wird die Gesamtaktivität der Gen­ produkte in der Zelle erhöht, ohne die spezifische Aktivität zu verändern. Es kann auch eine Kombination dieser Methoden verwen­ det werden, das heißt Erhöhung der spezifischen Aktivität sowie Erhöhung der Gesamtaktivität. Diese Änderungen können prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die Nukleinsäure­ sequenzen der Gene, Regulationselemente oder deren Promotoren eingebracht werden. Hierzu können die Sequenzen beispielsweise einer Mutageneses wie einer "site directed mutagenesis" unter­ zogen werden wie sie in D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), Kapitel 6, Seite 193 ff beschrieben wird.One way is; the endogenous rib genes 3, 4 and 5 to change so that it is for enzymes with the starting encode increased rib 3, 4 or 5 activity. Another Enzyme activity can be increased, for example, by increasing by changing the catalytic centers Substrate turnover takes place or by the action of enzyme inhibitors is lifted, that is, they exhibit an increased specific activity on or their activity is not inhibited. Increased enzyme activity can also be another advantage adhere by increasing the enzyme synthesis in the Cell, for example by eliminating factors which repress the enzyme synthesis or by increasing the activi Factor or regulatory elements that are an amplified Promote synthesis, or preferably by introducing additional genes copies. Through these measures, the overall activity of the gene products in the cell increased without the specific activity change. A combination of these methods can also be used det, that is, increase in specific activity as well Increase in overall activity. In principle, these changes can into the nucleic acid via all methods known to the person skilled in the art sequences of genes, regulatory elements or their promoters be introduced. For this, the sequences can, for example a mutagenesis such as a "site directed mutagenesis" under are drawn as described in D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), Chapter 6, page 193 ff is described.

Von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-778) wird eine PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese beschrieben.By Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-778) a PCR method using dITP is used random mutagenesis.

Die Verwendung einer "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution wird von Stemmer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751) beschrieben. The use of an "in vitro" recombination technique for the molecular evolution is described by Stemmer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751).  

Von Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) wird die Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode beschrie­ ben.By Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) the combination of the PCR and recombination method is described ben.

Die veränderten Nukleinsäuresequenzen werden anschließend wieder über Vektoren in die Organismen zurückgebracht.The changed nucleic acid sequences are then again brought back into the organisms via vectors.

Es können zur Erhöhung der Enzymaktivitäten auch veränderte Pro­ motorbereiche vor die natürlichen Gene gebracht werden, so daß die Expression der Gene gesteigert wird und damit die Aktivität letztlich angehoben wird. Auch am 3'-Ende können Sequenzen einge­ bracht werden, die beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöhen und dadurch eine erhöhte Translation ermöglichen. Dies führt ebenfalls zu einer höheren Enzymaktivität.Modified Pro can also be used to increase enzyme activities engine areas are brought before the natural genes, so that the expression of the genes is increased and thus the activity is ultimately raised. Sequences can also be inserted at the 3 'end are brought, which, for example, increase the stability of the mRNA and thereby enable increased translation. this leads to also to a higher enzyme activity.

Vorzugsweise werden weitere Genkopien der rib-Gene 3, 4 und 5 gemeinsam in die Zelle eingebracht. Diese Genkopien können der natürlichen Regulation unterliegen, einer veränderten Regulation, wobei die natürlichen Regulationsregionen derart verändert wur­ den, das sie eine erhöhte Expression der Gene ermöglicht oder aber es können Regulationssequenzen fremder Gene oder sogar art­ fremder Gene verwendet werden.Further gene copies of the rib genes 3, 4 and 5 are preferred brought into the cell together. These gene copies can be the subject to natural regulation, a changed regulation, the natural regulatory regions have been changed in this way the one that enables increased expression of the genes or but regulatory sequences of foreign genes or even art foreign genes can be used.

Besonders vorteilhaft ist eine Kombination der oben genannten Methoden.A combination of the above is particularly advantageous Methods.

Unter Funktionsanalogen sind beispielsweise funktionelle Homologe der rib-Gene oder deren enzymatischen Aktivitäten, das heißt Enzyme, die dieselben enzymatischen Reaktionen wie die rib-Gene katalysieren, zu verstehen. Diese Gene führen ebenfalls zu einer vorteilhaften Erhöhung der Riboflavinbildung. Auch diese Funkti­ onsanalogen können in der oben genannten Art vorteilhaft muta­ genisiert bzw. verändert und damit ihre Aktivität gesteigert werden.Functional analogs include, for example, functional homologs the rib genes or their enzymatic activities, that is Enzymes that have the same enzymatic reactions as the rib genes catalyze to understand. These genes also lead to one advantageous increase in riboflavin formation. These functions too analogs can advantageously muta in the above-mentioned manner genized or changed and thus increased their activity become.

Die Funktionsanalogen sind vorteilhaft Gene oder Genprodukte, die beispielsweise aus eukaryontischen oder prokaryontischen Organis­ men stammen. Als eukaryontische Organismen seien beispielhaft Pilze, die in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschrieben werden, wie Eremothecium, Hefen wie Candida, Saccharomyces oder Pichia oder Pflanzen wie Arabidopsis, Tomate, Kartoffel, Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Roggen, Reis, Hirse, Baumwolle, Zuckerrübe, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Canola, Hafer, Tabak, Alfalfa, Salat oder die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies genannt. Als prokaryontische Organis­ men seien beispielhaft gram-positive oder gram-negative Bakterien genannt wie Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostri­ dium, Cyanobacter oder Escherichia genannt. Vorteilhaft stammen die Funktionsanalogen aus Pilzen wie Eremothecium, Hefen wie Saccharomyces oder Candida, gram-positiven Bakterien wie Bacillus oder Corynebacterium oder gram-negative Bakterien wie Escherichia cohi. Bevorzugt stammen die Funktionsanalogen aus den Organismen der Gattung und Art Eremothecium ashbyii, Saccharomyces cere­ visiae, Candida flaveri, Candida famata, Escherichia coli, Corynebacterium ammoniagenes oder Bacillus subtilis.The functional analogs are advantageous genes or gene products that for example from eukaryotic or prokaryotic organ men come. Examples are eukaryotic organisms Mushrooms found in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) on page 15, table 6, how eremothecium, Yeasts like Candida, Saccharomyces or Pichia or plants like Arabidopsis, tomato, potato, corn, soybean, rapeseed, barley, wheat, Rye, rice, millet, cotton, sugar beet, sunflower, flax, Hemp, canola, oats, tobacco, alfalfa, lettuce or the various Tree, nut and wine species called. As a prokaryotic organ Examples are gram-positive or gram-negative bacteria named like Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostri  called dium, Cyanobacter or Escherichia. Advantageously come the functional analogues from mushrooms like eremothecium, yeast like Saccharomyces or Candida, gram-positive bacteria like Bacillus or Corynebacterium or gram-negative bacteria like Escherichia cohi. The functional analogues preferably originate from the organisms of the genus and species Eremothecium ashbyii, Saccharomyces cere visiae, Candida flaveri, Candida famata, Escherichia coli, Corynebacterium ammoniagenes or Bacillus subtilis.

Vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kombination der Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 oder deren funktionelle Äquivalente.The combination is advantageous in the method according to the invention of the genes with the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 or their functional equivalents.

Unter funktionellen Äquivalenten der in der erfindungsgemäßen Kombination verwendeten Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 35% Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 40% Homologie, besonders bevorzugt mindestens 45% Homologie, ganz besonders bevorzugt 50% Homologie aufweisen. Die von den genannten Nukleinsäuren ab­ geleitete Aminosäuresequenz ist den Sequenzen SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 und SEQ ID No. 6 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen ins­ besondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus den in SEQ ID No. 1, SEQ ID No.3 und SEQ ID No.5 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wo­ bei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.Among functional equivalents that in the invention Combination used genes with the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5, for example, are allele variants understand the at least 35% homology derived on the Amino acid level, preferably at least 40% homology, especially preferably at least 45% homology, very particularly preferred Show 50% homology. Which depend on the nucleic acids mentioned amino acid sequence is the sequences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 6 can be seen. Allelic variants include ins special functional variants by deletion, insertion or substitution of nucleotides from the in SEQ ID No. 1, SEQ ID No.3 and SEQ ID No.5 shown sequence are available where at the enzymatic activity of the derived synthesized Proteins are preserved.

Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von den in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybri­ disierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten oder Prokaryonten als Ashbya gossypii wie oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereich, die über Ver­ gleiche mit den entsprechenden Genen aus E. coli und B. subtilis in dem Fachmann bekannterweise ermittelt werden können, ver­ wendet.Such DNA sequences can be started from the in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 described DNA sequences or parts of these sequences, for example with conventional hybri or the PCR technique from other eukaryotes or isolate prokaryotes as Ashbya gossypii as mentioned above. These DNA sequences hybridize under standard conditions the sequences mentioned. For hybridization be advantageous short oligonucleotides of the conserved area, which are ver same with the corresponding genes from E. coli and B. subtilis can be determined in a manner known to the person skilled in the art, ver turns.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC und in Gegenwart von 50% Formamid zu verstehen. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben.For example, temperatures are under standard conditions between 42 and 58 ° C in an aqueous buffer solution with a Concentration between 0.1 to 5 × SSC (1 × SSC = 0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.2) or additionally in the presence of 50% Formamide such as 42 ° C in 5 × SSC and in the presence of To understand 50% formamide. The experimental conditions for DNA hybridization are relevant textbooks on genetics  such as Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

Weiterhin sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 beispielsweise eukaryontische oder proka­ ryontische Homologe, verkürzte Sequenzen oder Einzelstrang-DNA zu verstehen.Furthermore, homologs of the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 for example eukaryotic or proka ryontic homologs, truncated sequences or single-stranded DNA understand.

Außerdem sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 Derivate wie beispielsweise Promotorvarian­ ten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotid­ sequenzen gemeinsam oder einzeln vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/­ oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionali­ tät bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.In addition, homologs of the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 derivatives such as promoter variants to understand. The promoters that have the specified nucleotide Sequences upstream or together can be performed by one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or deletion (s) have been changed without the functionality activity or effectiveness of the promoters are impaired. Of the promoters can further by changing their sequence increased in effectiveness or completely by more effective Promoters can also be exchanged for organisms of other species.

Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.Derivatives are also advantageously to be understood as variants whose nucleotide sequence has been changed before the start codon, that changes gene expression and / or protein expression, is preferably increased.

Bevorzugt lassen sich Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 oder ihre funktionellen Äquivalente aus Mikroorganismen der Gattungen Clostridium, Corynebacterium, Brevibacterium Cyano­ bacter, Bacillus, Eremothecium, Escherichia, Pichia, Ashbya oder Candida oder aus Pflanzen, besonders bevorzugt aus Mikroorganis­ men der Gattung und Art Bacillus subtilis, Corynebakterium ammoniagenes, Escherichia coli, Candida flaveri, Candida famata oder Pilzen, die in Indian Chem Engr. Section B., Vol. 37, No. 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschrieben werden, wie z. B. Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii, ganz besonders bevor­ zugt aus Mikroorganismen der Gattung und Art Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii isolieren. So können beispielsweise die zu rib 3, 4, 5 homologen Gene rib A, ribH und ribB, oder Genfrag­ menten aus diesen, aus Bacillus subtilis oder die zu rib3, 4, 5 homologen Genen rib B, rib E und rib C, oder Genfragmenten aus diesen aus E. coli in prokaryotischen Systemen zur Steigerung der Riboflavin-Ausbeute im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendet werden.Sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 or their functional equivalents from microorganisms of the genera Clostridium, Corynebacterium, Brevibacterium Cyano bacter, Bacillus, Eremothecium, Escherichia, Pichia, Ashbya or Candida or from plants, particularly preferably from microorganisms men of the genus and species Bacillus subtilis, Corynebacterium ammoniagenes, Escherichia coli, Candida flaveri, Candida famata or mushrooms found in Indian Chem Engr. Section B., Vol. 37, No. 1, 2 (1995) on page 15, Table 6, such as. B. Eremothecium ashbyii or Ashbya gossypii, especially before migrates from microorganisms of the genus and species Eremothecium ashbyii or isolate Ashbya gossypii. For example, the rib 3, 4, 5 homologous genes rib A, ribH and ribB, or gene question elements from these, from Bacillus subtilis or to rib3, 4, 5 homologous genes rib B, rib E and rib C, or gene fragments this from E. coli in prokaryotic systems to increase the Riboflavin yield advantageous in the process according to the invention be used.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.For optimal expression of heterologous genes in organisms it advantageously the nucleic acid sequences according to the im Organism used to change specific "codon usage". The "codon usage" can be based on computer evaluations  other, known genes of the organism in question easily determine.

Die Genexpression der rib-Gene 3, 4 und 5 kann vorteilhaft durch Erhöhen der rib3,4,5 Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die rib3,4 und 5 Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der rib3, 4 und 5 mRNA verbessert, oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird.The gene expression of the rib genes 3, 4 and 5 can advantageously by Increase rib3,4,5 gene copy number and / or by enhancement regulatory factors affecting rib3,4 and 5 gene expression influence positively, be increased. So can a reinforcement regulatory elements preferably at the transcriptional level done by stronger transcription signals such as promoters and Enhancer can be used. But there is also a reinforcement translation possible, for example, by the stability of the rib3, 4 and 5 mRNA improved, or the reading efficiency of this mRNA on the ribosomes is increased.

Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die rib-Gene 3, 4 und 5, oder homologer Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen rib-Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält.To increase the number of copies, the rib genes 3, 4 and 5, or homologous genes, for example in a nucleic acid fragment or be built into a vector, which preferably the regulatory gene sequences assigned to the respective rib genes or contains an analogously acting promoter activity.

Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken. Alternativ kann auch jedes der beschriebenen Gene in einen einzelnen Vektor gebracht und in den jeweiligen Produktionsorganismus transformiert werden.In particular, such regulatory sequences are used that increase gene expression. Alternatively, each of the described genes brought into a single vector and in the respective production organism can be transformed.

Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment sind die rib- Gensequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 oder deren funktionelle Äquivalente zu verstehen, die mit einem oder mehre­ ren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Gen­ expression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nucleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulations­ sequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenzen SEQ ID No. l, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5 oder deren funktionelle Äquivalente inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können auch allein vor die natürlichen Gene zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die rib-Gene können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.Under the nucleic acid fragment according to the invention, the rib- Gene sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 or their to understand functional equivalents that work with one or more Ren regulation signals advantageously to increase the gene expression were linked functionally. For example these regulatory sequences are sequences to the Bind inductors or repressors and so the expression of Regulate nucleic acid. In addition to these new regulations sequences or instead of these sequences the natural Regulation of these sequences before the actual structural genes still be present and possibly genetically modified be so that the natural regulation is switched off and the Expression of the genes was increased. The gene construct can also be built more simply, that means there were no additional ones Regulation signals in front of the sequences SEQ ID No. l, SEQ ID No. 3rd or SEQ ID No. 5 or their functional equivalents and the natural promoter with its regulation was not away. Instead, the natural regulatory sequence became like this mutated that regulation no longer takes place and gene expression is increased. These modified promoters can also be used alone brought before the natural genes to increase activity become. The gene construct can also advantageously one or more so-called "enhancer sequences" functional  linked to the promoter containing increased expression enable the nucleic acid sequence. Also at the 3 'end of the DNA Sequences can insert additional advantageous sequences become like other regulatory elements or terminators. The rib genes can be in one or more copies in the gene construct be included.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver­ fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im X-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanol­ oxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Weitere vor­ teilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetra­ zyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO9321334) Promotor. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Purinen bzw. dessen Vorstufen statt­ findet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blatt­ spezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245). Auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder einen anderen Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden.Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacI ^q , T7, T5, Contain T3, gal, trc, ara, SP6, λ-P _R - or in the XP _L promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria. Further advantageous regulatory sequences are, for example, in the gram-positive promoters amy and SPO2, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH or in the plant promoters CaMV / 35S [Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos or in the ubiquitin or phaseolin promoter. In this context, the promoters of pyruvate decarboxylase and methanol oxidase from, for example, Hansenula are also advantageous. Further advantageous plant promoters are, for example, a benzene sulfonamide-inducible (EP 388186), a tetra cyclin-inducible (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), an abscisic acid-inducible (EP335528) and a by ethanol or cyclohexanone inducible (WO9321334) promoter. Plant promoters which ensure expression in tissues or parts of plants in which the biosynthesis of purines or its precursors takes place are particularly advantageous. Promoters that ensure leaf-specific expression should be mentioned in particular. The promoter of the cytosolic FBPase from potatoes or the ST-LSI promoter from potatoes should be mentioned (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245). The promoter of the phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase from Glycine max (see also Genbank Accession number U87999) or another node-specific promoter as in EP 249676 can also be used advantageously.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula­ tionssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthe­ tische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.In principle, all natural promoters can use their regulations tion sequences like those mentioned above for the invention Procedures are used. In addition, synthe table promoters can be used advantageously.

Im Nukleinsäurefragment (= Genkonstrukt) können wie oben be­ schrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die rib- Gene liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene, die eine gesteigerte Synthese ermög­ lichen.In the nucleic acid fragment (= gene construct) can be as above wrote other genes that were introduced into the organisms should be included. These genes can be separated Regulation or under the same regulatory region as the rib- Genes lie. These genes are, for example  other biosynthetic genes that enable increased synthesis lichen.

Das Nukleinsäurefragment wird zur Expression in den oben genann­ ten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie bei­ spielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermög­ licht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2 µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51 oder Derivate der vorstehend genannten Plasmide. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 beschrieben.The nucleic acid fragment is advantageously inserted into a vector such as a plasmid, a phage or other DNA for expression in the above-mentioned host organism, which enables optimal expression of the genes in the host. Suitable plasmids are, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III ¹¹³ -B1, λgt11 or pBdCI, J10104, p10C1, p108, in Streptomy , pIJ702 or pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 or pBD214, in Corynebacterium pSA77 or pAJ667, in mushrooms pALS1, pIL2 or pBB116, in yeasts 2 µM, pAG-1, YEp6, YEp13 or pEMBLYG19 ⁺ , pEMBLYL19 +23 , pAK2004 or pDH51 or derivatives of the plasmids mentioned above. The plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018 ) can be removed. Suitable plant vectors are described in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Chap. 6/7, pp. 71-119.

Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurefragment zur Expres­ sion der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.The nucleic acid fragment advantageously contains for expression sion of the other genes contained additionally 3 'and / or 5 'Terminal regulatory sequences to increase the Expression, which depends on the selected host organism and gene or genes can be selected for optimal expression.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei­ spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.These regulatory sequences are designed to target expression of genes and protein expression. This can happen with for example, depending on the host organism, mean that the gene is expressed and / or overexpressed after induction, or that it is immediately expressed and / or overexpressed.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs­ weise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beein­ flussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regu­ latorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptions­ ebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.The regulatory sequences or factors can be preferred have a positive effect on the gene expression of the introduced genes flow and thereby increase. This can strengthen the regu latory elements advantageously on the transcription level done by strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers" can be used. But there is also one The translation can be strengthened by, for example, the Stability of the mRNA is improved.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfin­ dungsgemäße Genkonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirts­ organismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurefragment als Vektor bestehen.In a further embodiment of the vector, this can be invented gene construct according to the invention also advantageously in the form of a linear DNA are introduced into the microorganisms and over  heterologous or homologous recombination in the genome of the host organism to be integrated. This linear DNA can be made from one linearized plasmid or just from the nucleic acid fragment as Vector consist.

Als Vektor kann auch ein beliebiges Plasmid (insbesondere aber ein Plasmid, das den Replikationsursprung des 2 µm Plasmids aus S. cerevisiae trägt) verwendet werden, das in der Zelle autonom repliziert, aber auch wie oben beschrieben ein lineares DNA- Fragment, das in das Genom des Wirtes integriert. Diese Inte­ gration kann über hetero- oder homologe Rekombination erfolgen. Bevorzugt wie erwähnt jedoch über homologe Rekombination (Steiner et al., Genetics, Vol. 140, 1995: 973-987). Dabei können die Gene rib3, rib4 und rib5 einzeln im Genom an verschiedenen Orten oder auf verschiedenen Vektoren vorliegen oder gemeinsam im Genom oder auf einem Vektor vorliegen.Any plasmid (but especially a plasmid indicating the origin of replication of the 2 µm plasmid S. cerevisiae) can be used, which is autonomous in the cell replicated, but also a linear DNA as described above Fragment that integrates into the host's genome. This inte Gration can be done via hetero- or homologous recombination. However, as mentioned above, preferred over homologous recombination (Steiner et al., Genetics, Vol. 140, 1995: 973-987). The Rib3, rib4 and rib5 genes individually in different locations in the genome or on different vectors or together in the genome or on a vector.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen, die die Kombination der rib-Gene 3, 4 und 5 oder deren funktionelle Äquivalente enthalten, zeigen eine erhöhte Riboflavin-Produktion.The organisms used in the process according to the invention, the the combination of the rib genes 3, 4 and 5 or their functional Equivalents included show increased riboflavin production.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die für die Herstellung von Riboflavin verwendeten Organismen in einem Medium, das das Wachs­ tum dieser Organismen ermöglicht, angezüchtet. Dieses Medium kann ein synthetisches oder ein natürliches Medium sein. Je nach Organismus werden dem Fachmann bekannte Medien verwendet. Für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten die verwendeten Medien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Vitamine und Spurenelemente.In the process according to the invention, those for the production of Riboflavin used organisms in a medium containing the wax enables these organisms to be grown. This medium can be a synthetic or a natural medium. Depending on Organisms are used media known to those skilled in the art. For the growth of the microorganisms contain the media used a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and possibly small amounts of vitamins and trace elements.

Vorteilhafte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose, komplexe Zucker­ quellen wie Melasse, Zuckerphosphate wie Fructose-1,6-bis­ phosphat, Zuckeralkohole wie Mannit, Polyole wie Glycerin, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Carbonsäuren wie Citronen­ säure, Milchsäure oder Essigsäure, Fette wie Sojaöl oder Rapsöl, Aminosäuren wie ein Aminosäurengemisch beispielsweise sog. Casamino acids (Difco) oder einzelne Aminosäuren wie Glycin oder Asparaginsäure oder Aminozucker, die letztgenannten können auch gleichzeitig als Stickstoffquelle verwendet werden.Examples of advantageous carbon sources are sugars such as Mono-, di- or polysaccharides such as glucose, fructose, mannose, Xylose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, Sucrose, raffinose, starch or cellulose, complex sugars swell like molasses, sugar phosphates like fructose-1,6-bis phosphate, sugar alcohols such as mannitol, polyols such as glycerol, Alcohols like methanol or ethanol, carboxylic acids like lemons acid, lactic acid or acetic acid, fats such as soybean oil or rapeseed oil, Amino acids such as a mixture of amino acids, for example so-called Casamino acids (Difco) or single amino acids such as glycine or aspartic acid or aminosugar, the latter can can also be used simultaneously as a nitrogen source.

Vorteilhafte Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele sind Ammoniumsalze wie NH₄Cl oder (NH₄)₂SO₄, Nitrate, Harnstoff, oder komplexe Stickstoffquellen wie Maisquell­ wasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Hefe oder Kartoffelprotein, die häufig auch gleichzeitig als Stickstoff­ quelle dienen können.Advantageous nitrogen sources are organic or inorganic nitrogen compounds or materials that contain these compounds. Examples are ammonium salts such as NH ₄ Cl or (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , nitrates, urea, or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, brewer's yeast autolysate, soybean meal, wheat gluten, yeast extract, meat extract, casein hydrolyzate, yeast or potato protein, which often also swell simultaneously as nitrogen can serve.

Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Natrium, Cobalt, Molybdän, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als Anion dieser Salze sind besonders das Chlor-, Sulfat- und Phosphation zu nennen. Ein wichtiger Faktor zur Steigerung der Produktivität im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kontrolle der Fe²⁺- oder Fe³⁺-Ionenkonzentration im Produktionsmedium.Examples of inorganic salts are the salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, manganese, potassium, zinc, copper and iron. The chlorine, sulfate and phosphate ions are particularly worth mentioning as the anion of these salts. An important factor for increasing productivity in the process according to the invention is the control of the Fe ²⁺ or Fe ³⁺ ion concentration in the production medium.

Gegebenenfalls werden dem Nährmedium weitere Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie beispielsweise Vitamine oder Wachstumsförderer wie Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nicotinsäure, Pantothenat oder Pyridoxin, Aminosäuren wie Alanin, Cystein, Prolin, Asparaginsäure, Glutamin, Serin, Phenylalanin, Ornithin oder Valin, Carbonsäuren wie Citronensäure, Ameisensäure, Pimelinsäure oder Milchsäure, oder Substanzen wie Dithiothreitol.If necessary, further growth factors become the nutrient medium added, such as vitamins or growth promoters such as Biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, pantothenate or pyridoxine, amino acids such as alanine, cysteine, proline, Aspartic acid, glutamine, serine, phenylalanine, ornithine or Valine, carboxylic acids such as citric acid, formic acid, pimelic acid or lactic acid, or substances like dithiothreitol.

Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Mediumkomponenten können alle zu Beginn der Fermentation vorge­ legt werden, nachdem sie falls erforderlich getrennt sterilisiert oder gemeinsam sterilisiert wurden, oder aber je nach Bedarf während der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgegeben werden.The mixing ratio of the nutrients mentioned depends on the Type of fermentation and is determined in individual cases. The Medium components can all be pre-selected at the start of the fermentation after being sterilized separately if necessary or have been sterilized together, or as needed continuously or discontinuously during fermentation be yielded.

Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die Organismen optimal wachsen und daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht wer­ den. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 37°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 fest­ gehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von wenigen Stunden bis zu einigen Tagen bevorzugt von 8 Stunden bis zu 21 Tagen, be­ sonders bevorzugt von 4 Stunden bis 14 Tagen ausreichend. Inner­ halb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge an Produkt im Medium an.The breeding conditions are determined so that the organisms grow optimally and that the best possible yields are achieved the. Preferred cultivation temperatures are 15 ° C to 40 ° C. Temperatures between 25 ° C and 37 ° C are particularly advantageous. The pH value is preferably fixed in a range from 3 to 9 held. PH values between 5 and 8 are particularly advantageous. In general, the incubation period is from a few hours to for a few days preferably from 8 hours to 21 days, be particularly preferably sufficient from 4 hours to 14 days. Inner The maximum amount of product in the Medium.

Wie Medien vorteilhaft optimiert werden können, kann der Fachmann beispielsweise dem Lehrbuch Applied Microbiol Physiology, "A Practical Approach (Eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL-Press, 1997, Seiten 53-73, ISBN 0 19 963577 3) entnehmen. Vorteilhafte Medien und Anzuchtsbedingungen sind für Bacillus und weitere Organismen beispielsweise der Schrift EP-A-0 405 370 speziell dem Beispiel 9, für Candida der Schrift WO 88/09822 speziell Tabelle 3 und für Ashbya der Schrift von Schmidt et al. (Micro­ biology, 142, 1996: 419-426) zu entnehmen.The person skilled in the art can know how media can be advantageously optimized for example the textbook Applied Microbiol Physiology, "A Practical Approach (Eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL-Press, 1997, pages 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Beneficial Media and growing conditions are for Bacillus and others Organisms, for example, the document EP-A-0 405 370 specifically  Example 9, for Candida of the document WO 88/09822 specifically Table 3 and for Ashbya the Schmidt et al. (Micro biology, 142, 1996: 419-426).

Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskonti­ nuierlich in batch- oder fed-batch-Weise durchgeführt werden.The method according to the invention can be continuous or discounted be carried out in batch or fed-batch manner.

Abhängig davon wie hoch die Ausgangsproduktivität des verwendeten Organismus ist, läßt sich die Riboflavin-Produktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren unterschiedlich stark steigern. In der Regel läßt sich die Produktivität vorteilhaft um mindestens 5%, bevorzugt um mindestens 10%, besonders bevorzugt um 20%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 100% jeweils gegenüber dem Ausgangsorganismus steigern.Depending on how high the output productivity of the used Is the organism, riboflavin productivity can be Increase the method according to the invention to different extents. In the As a rule, productivity can be advantageously reduced by at least 5%, preferably by at least 10%, particularly preferably by 20%, entirely particularly preferably by at least 100% in each case over the Increase starting organism.

Beispiele:Examples:

Die Isolierung der rib-Gene 1, 2, 3, 4, 5 und 7 aus Ashbya gossypii und Saccharomyces cerevisiae wird in den Patenten WO 95/26406 und WO 93/03183 und speziell in den Beispielen beschrieben und wurde entsprechend durchgeführt. Auf diese Schriften wird hier aus­ drücklich Bezug genommen.The isolation of the rib genes 1 , 2 , 3 , 4 , 5 and 7 from Ashbya gossypii and Saccharomyces cerevisiae is described in the patents WO 95/26406 and WO 93/03183 and specifically in the examples and was carried out accordingly. These writings are expressly referred to here.

Sequenz 1 zeigt das DNA-Konstrukt, das neben dem zur Trans­ formation notwendigen Selektionsmarker die Genfragmente von rib3, rib4 und rib5 trägt.Sequence 1 shows the DNA construct which, in addition to the trans formation necessary selection markers the gene fragments of rib3, rib4 and rib5 carries.

Allgemeine Nukleinsäureverfahren wie z. B. Klonierung, Restrik­ tionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Verknüpfen von DNA- Fragmenten, Transformation von Mikroorganismen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wenn nichts anderes beschrieben wurde wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.General nucleic acid methods such as e.g. B. cloning, restriction ion cleavage, agarose gel electrophoresis, linking of DNA Fragments, transformation of microorganisms, cultivation of Bacteria and sequence analysis of recombinant DNA were if nothing other was described as in Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) carried out.

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Ketten­ reaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft. Recombinant DNA molecules were sequenced using a Laser fluorescence DNA sequencer from ABI using the method by Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Fragments resulting from a polymerase chain reactions were avoided in order to avoid polymerase errors expressing constructs sequenced and checked.  

Beispiel 1example 1

Klonierung des DNA-Konstruktes, das die rib3, rib4 und rib5 Gen­ kopien enthält (Vektor Tef-G418 rib3,4,5)Cloning of the DNA construct that contains the rib3, rib4 and rib5 genes copies contains (vector Tef-G418 rib3,4,5)

Expressionskonstrukte der rib-Gene: rib3 (Vektor pJR874), rib4 (Vektor pJR762) und rib5 (Vektor pJR739) werden in WO95/26406 be­ schrieben. Der Vektor pAG-110 (Steiner und Philipsen (1994) Mol. Gen. Genet., 242; 263-271) wurde mit DraIII geschnitten, mit Klenowpolymerase und Desoxy-Nukleotiden inkubiert (Auffüllen der Enden), gefällt und anschließend mit SalI geschnitten. Das DNA- Fragment, das den Tef-Promotor und das Kanamycin-Resistenzgen enthält wurde mit dem HindIII und SalI geschnittenem Vektor Bluescript KS-(Stratagene), dessen HindIII Enden durch Klenow­ polymerase aufgefüllt waren ligiert. Es entstand der Vektor pBS Tef-G418.Expression constructs of the rib genes: rib3 (vector pJR874), rib4 (Vector pJR762) and rib5 (vector pJR739) are described in WO95 / 26406 wrote. The vector pAG-110 (Steiner and Philipsen (1994) Mol. Gene. Genet., 242; 263-271) was cut with DraIII, with Klenow polymerase and deoxy nucleotides incubated (filling the Ends), felled and then cut with SalI. The DNA Fragment containing the Tef promoter and the kanamycin resistance gene was included with the HindIII and SalI cut vector Bluescript KS- (Stratagene), the HindIII ends of which by Klenow polymerase filled were ligated. The vector was created pBS Tef-G418.

pJR874 wurde im zweiten Klonierungsschritt mit PvuII und SalI ge­ schnitten worden. Das rib3-Genfragment wurde daraufhin mit einem Sall geschnittenen und dephosphorilierten Vektor pBS Tef-G418 ligiert. Da nur die SalI Enden des Fragments und Vektors ligiert werden konnten, sind die nicht-kompatiblen PvuII und SalI Enden mit Klenowpolymerase aufgefüllt und anschließend ligiert worden. Der entstandene Vektor wird im folgenden Tef-G418-rib3 genannt.pJR874 was ge in the second cloning step with PvuII and SalI been cut. The rib3 gene fragment was then labeled with a Sall cut and dephosphorilated vector pBS Tef-G418 ligated. Since only the SalI ends of the fragment and vector ligated are the incompatible PvuII and SalI ends filled with Klenow polymerase and then ligated. The resulting vector is called Tef-G418-rib3 in the following.

Zur Subklonierung des rib5-Gens in den Vektor Tef-G418-rib3 wurde der Vektor pJR739 mit NcoI und NotI geschnitten. Die Enden wurden mit Klenowpolymerase aufgefüllt. Das rib5-Genfragment wurde dann in den mit SalI geschnittenen Vektor Tef-G418-rib3, dessen Enden ebenfalls aufgefüllt waren subkloniert. Es entstand Vektor Tef-G418-Rib3,5.For subcloning the rib5 gene into the vector Tef-G418-rib3 the vector pJR739 cut with NcoI and NotI. The ends were filled up with Klenow polymerase. The rib5 gene fragment was then in the SalI-cut vector Tef-G418-rib3, the ends of which were also filled in subcloned. The result was vector Tef-G418-Rib3.5.

Im letzten Klonierungsschritt wurde das rib4-Genfragment aus Vektor pJR762 durch PCR mit Hilfe der Primer
In the last cloning step, the rib4 gene fragment from vector pJR762 was PCR by means of the primer

5'GATCGATCGATCGCTAGCTGGGAGGATATGTTCTGGG 3'
5'TCCAAGCTTGCTAGCATCTCAAATAAGTGATTAGAAGGACAAGCTGCAAG 3'
5'GATCGATCGATCGCTAGCTGGGAGGATATGTTCTGGG 3 '
5'TCCAAGCTTGCTAGCATCTCAAATAAGTGATTAGAAGGACAAGCTGCAAG 3 '

gewonnen. Das PCR-Fragmente wurde mit NheI geschnitten und in einen NheI geschnittenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten Vektor Tef-G418rib3, 5 subkloniert.won. The PCR fragment was cut with NheI and cut into a NheI and with alkaline phosphatase treated vector Tef-G418rib3, 5 subcloned.

Das resultierende DNA-Konstrukt stellt den Vektor Tef-G418-rib3, 4, 5 dar. The resulting DNA construct represents the vector Tef-G418-rib3, 4, 5.  

Beispiel 2Example 2

Transformation des DNA-Konstruktes in den Pilz Ashbya gossypii Das in Beispiel 1 beschriebene DNA-Konstrukt (Vektor Tef- G418-rib3,4,5) wurde mit dem Restriktionsenzym SpeI vollständig geschnitten und das Insert, das die rib-Gen Sequenzen trägt durch Agarosegelauftrennung aufgereinigt. Das für die Transformation benutzte Insert wird in SEQ ID No. 7 wiedergegeben. Die abge­ leiteten Aminosäurensequenzen der im Insert vorhandenen rib-Gene 3, 4 und 5 sind den Sequenzen SEQ ID No. 8 (= rib3), SEQ ID No. 9 (= rib5) und SEQ ID No. 10 (= rib4) zu entnehmen.Transformation of the DNA construct into the Ashbya gossypii fungus The DNA construct described in Example 1 (vector Tef- G418-rib3,4,5) was completed with the restriction enzyme SpeI cut and the insert that carries the rib gene sequences through Agarose gel separation cleaned. That for the transformation insert used is in SEQ ID No. 7 reproduced. The abge derived amino acid sequences of the rib genes present in the insert 3, 4 and 5 are the sequences SEQ ID No. 8 (= rib3), SEQ ID No. 9 (= rib5) and SEQ ID No. 10 (= rib4).

MA2-Medium (10 g/l Bacto-Peptone, 1 g/l Hefeextrakt, 0,3 g/l myo- Inositol und 10 g/l D-Glucose) wurde mit Ashbya gossypii Sporen angeimpft. Die Kultur wurde 12 h bei 4 C und anschließend unter Schütteln für 13 h bei 28°C inkubiert. Die Zellsuspension wurde abzentrifugiert und das Zellpellet in 5 ml 50 mM Kaliumphosphat­ puffer pH 7,5, 25 mM DTT aufgenommen. Nach einer 30-minütigen Wärmebehandlung bei 28°C wurden die Zellen wiederum abzentri­ fugiert und in 25 ml STM-Puffer (270 mM Saccharose, 10 mM TRIS- HCl pH 7,5, 1 mM MgCl₂) aufgenommen. 0,5 ml dieser Suspension wurden dann mit ca. 3 µg des oben aufgereinigten Inserts und 40 U SpeI Enzym versetzt und in einem Biorad Gene Pulser (100 Ω, 20 µF, 1,5 kv) elektroporiert. Nach der Elektroporation sind die Zellen mit 1 ml MA2-Medium versetzt und auf MA2-Agarkulturplatten aus­ gestrichen worden. Zur Antibiotikaselektion überschichtet man die Platten nach 5 h Inkubation bei 28°C mit 5 ml "Low-Melting"-Agarose, die das Antibiotikum G418 (200 µg/ml) enthält. Die Transformanten wurden durch Mikromanipulation klonal aufgereinigt (Steiner und Philipsen (1995) Genetics, 140; 973-987). Die erfolgreiche Inte­ gration des Konstrukts wurde durch PCR-Analyse der genomischen DNA der Transformanten verifiziert. Die Isolation der genomischen DNA wurde wie von Carle und Olson(Proc.Natl.Acad.Sci, 1985, 82, 3756-3760) und Wright und Philipsen (Gene, 1991, 109,99-105) beschrieben durchgeführt. Die PCR mit für das Konstrukt spezi­ fischen Primern ist nach R. Saiki (PCR Protocols, 1990, Academic Press, 13-20) durchgeführt worden. Die Analyse der PCR-Fragmente geschieht durch Auftrennung über ein Agarosegel. Die erfolgreiche Integration der DNA in des Genom der Transformanten wurde mit Hilfe der folgenden Primer durchgeführt:
MA2 medium (10 g / l Bacto-Peptone, 1 g / l yeast extract, 0.3 g / l myo-inositol and 10 g / l D-glucose) was inoculated with Ashbya gossypii spores. The culture was incubated for 12 h at 4 C and then with shaking for 13 h at 28 ° C. The cell suspension was centrifuged off and the cell pellet was taken up in 5 ml of 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.5, 25 mM DTT. After a 30-minute heat treatment at 28 ° C., the cells were centrifuged again and taken up in 25 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM TRIS-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl ₂ ). 0.5 ml of this suspension was then mixed with about 3 µg of the above-purified insert and 40 U SpeI enzyme and electroporated in a Biorad Gene Pulser (100 Ω, 20 µF, 1.5 kv). After electroporation, the cells were mixed with 1 ml of MA2 medium and spread on MA2 agar culture plates. For antibiotic selection, the plates are overlaid after 5 h of incubation at 28 ° C. with 5 ml of “low-melting” agarose, which contains the antibiotic G418 (200 μg / ml). The transformants were clonally purified by micromanipulation (Steiner and Philipsen (1995) Genetics, 140; 973-987). The successful integration of the construct was verified by PCR analysis of the genomic DNA of the transformants. The isolation of the genomic DNA was carried out as described by Carle and Olson (Proc.Natl.Acad.Sci, 1985, 82, 3756-3760) and Wright and Philipsen (Gene, 1991, 109.99-105). The PCR with primers specific for the construct was carried out according to R. Saiki (PCR Protocols, 1990, Academic Press, 13-20). The PCR fragments are analyzed by separation using an agarose gel. The successful integration of the DNA into the genome of the transformants was carried out using the following primers:

Primer A: 5'-TCCCTTAATCATTGTCACTGC-3',
Primer B: 5'-CCAAGCTTGCTAGCATCTC-3',
Primer C: 5'-CTGCCTGAGAAGCTGGAAAGC-3',
Primer D: 5'-TGTGAATTAGTAAGCGAAAGG-3',
Primer E: 5'-TAAGGGATTAGGCGAAGTTGA-3',
Primer F: 5'-GCTGCCACCCCTCTGATTCAC-3',
Primer G: 5'-ATAAGCTTTTGCCATTCTCAC-3',
Primer H: 5'-CTTTTGCTTTGCCACGGAACG-3'.
Primer A: 5'-TCCCTTAATCATTGTCACTGC-3 ',
Primer B: 5'-CCAAGCTTGCTAGCATCTC-3 ',
Primer C: 5'-CTGCCTGAGAAGCTGGAAAGC-3 ',
Primer D: 5'-TGTGAATTAGTAAGCGAAAGG-3 ',
Primer E: 5'-TAAGGGATTAGGCGAAGTTGA-3 ',
Primer F: 5'-GCTGCCACCCCTCTGATTCAC-3 ',
Primer G: 5'-ATAAGCTTTTGCCATTCTCAC-3 ',
Primer H: 5'-CTTTTGCTTTGCCACGGAACG-3 '.

Bei allen Transformanten konnte eine erfolgreiche Integration ins Genom nachgewiesen werden.With all transformants a successful integration into Genome can be detected.

Beispiel 3Example 3

Riboflavinbestimmung im rekombinanten Ashbya gossypii Klon Ashbya gossypii Ita-GS-01 (Schmidt, G., Stahmann, K.-P., Kaesler, B., & Sahm, H. (1996) Microbiology 142,419-426) und die daraus durch Transformation mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Kon­ strukt hervorgegangenen Stamm Ita-GS-01#17.1 wurde auf Agarmedium bei 28°C 4 Tage lang angezogen. Von dieser Platte wurden drei 100 ml Erlenmeyerkolben mit 10 ml Medium (27,5 g/l Hefeextrakt, 0,5 g/l MgSO₄, 50 ml/l Sojaöl, pH 7,0) beimpft (17.1-1, 17.1-2, 17.1-3). Nach 40 h Stunden Inkubation bei 28°C, 180 rpm auf dem Schüttler wurde je 1 ml der Kulturbrühe in 250 ml Erlenmeyerkol­ ben mit 20 ml YPD-Medium überführt (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Bactopepton, 20 g/l Glucose). Inkubation 28°C, 300 rpm. Nach 190 h wurde aus jedem Kolben eine 1 ml Probe entnommen und mit 1 ml 1 M Perchlorsäure versetzt. Die Probe wurde filtriert und der Ribo­ flavingehalt mit HPLC-Analytik bestimmt. Dabei wurde eine Eichung mit Riboflavinstandards (10 mg/l, 20 mg/l, 30 mg/l, 40 mg/l, 50 mg/l) vorgenommen.Riboflavin determination in the recombinant Ashbya gossypii clone Ashbya gossypii Ita-GS-01 (Schmidt, G., Stahmann, K.-P., Kaesler, B., & Sahm, H. (1996) Microbiology 142, 419-426) and the result thereof by transformation with the construct Ita-GS-01 # 17.1 resulting from the construct described in Example 1 was grown on agar medium at 28 ° C. for 4 days. From this plate, three 100 ml Erlenmeyer flasks were inoculated with 10 ml medium (27.5 g / l yeast extract, 0.5 g / l MgSO ₄ , 50 ml / l soybean oil, pH 7.0) (17.1-1, 17.1-2 , 17.1-3). After 40 hours of incubation at 28 ° C., 180 rpm on the shaker, 1 ml of the culture broth was transferred to 250 ml of Erlenmeyer flask with 20 ml of YPD medium (10 g / l yeast extract, 20 g / l bactopeptone, 20 g / l Glucose). Incubation 28 ° C, 300 rpm. After 190 h, a 1 ml sample was taken from each flask and 1 ml of 1 M perchloric acid was added. The sample was filtered and the riboflavin content was determined using HPLC analysis. A calibration with riboflavin standards (10 mg / l, 20 mg / l, 30 mg / l, 40 mg / l, 50 mg / l) was carried out.

Parameter der HPLC-Methode zur Riboflavinbestimmung:
Parameters of the HPLC method for riboflavin determination:

Säule: ODS Hypersil 5 mm 200X 2,1 mm (HP)
Eluent A: Wasser mit 340 ml H₃PO₄ (89%) auf pH 2,3
Eluent B: 100% Acetonitril
Gradient
Stopzeit: 100-6 min.: 2% B auf 50% B
6-6,5 min.: 50% B auf 2% Bmin
Fluß: 0,5 ml/min
Detektion: 280 nm
Temperatur: 40°C
Injektion: 2-10 µl
Column: ODS Hypersil 5 mm 200X 2.1 mm (HP)
Eluent A: water with 340 ml H ₃ PO ₄ (89%) to pH 2.3
Eluent B: 100% acetonitrile
gradient
Stop time: 100-6 min .: 2% B to 50% B
6-6.5 min .: 50% B to 2% Bmin
Flow: 0.5 ml / min
Detection: 280 nm
Temperature: 40 ° C
Injection: 2-10 µl

Alle drei Ansätze des Klon 17, der eine zusätzliche Genkopie der rib-Gene 3, 4 und 5 enthalten, zeigen im Vergleich zum Ausgangs­ stamm eine deutlich erhöhte Riboflavinproduktivität (Fig. 4).All three approaches of clone 17, which contain an additional gene copy of rib genes 3, 4 and 5, show a significantly increased riboflavin productivity compared to the parent strain ( FIG. 4).

Fig. 4 zeigt die Riboflavinausbeuten der verschiedenen Klone. Durch Einbringen der rib3,4 und 5 Gene konnten Steigerungen der Riboflavinausbeuten von bis zu 150% im Vergleich zum unmodifi­ zierten Stamm erreicht werden. Figure 4 shows the riboflavin yields of the different clones. By introducing the rib3,4 and 5 genes, riboflavin yields could be increased by up to 150% compared to the unmodified strain.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims (17)

1. Verfahren zur gesteigerten Herstellung von Riboflavin mit einem Organismus, der in der Lage ist Riboflavin zu synthe­ tisieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivität der Enzyme 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase, Dimethyl-8-ribityllumazin-Synthase und Riboflavin-Synthase oder deren Funktionsanalogen im Organismus erhöht.1. A process for the increased production of riboflavin with an organism which is able to synthesize riboflavin, characterized in that the activity of the enzymes 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase, dimethyl-8 -ribityllumazine synthase and riboflavin synthase or their functional analogues in the organism increased. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kombination der Gene, die für die Enzyme 3,4-Di­ hydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase, Dimethyl-8-ribityl­ lumazin-Synthase und Riboflavin-Synthase oder deren Funktionsanalogen kodieren, zur Aktivitätssteigerung der Enzyme in den Organismus einbringt.2. The method according to claim 1, characterized in that the combination of the genes for the 3,4-Di enzymes hydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase, dimethyl-8-ribityl lumazine synthase and riboflavin synthase or their Code function analogs to increase activity which brings enzymes into the organism. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus ein Bakterium, eine Hefe, einen Pilz oder eine Pflanze verwendet.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that an organism is a bacterium, a yeast, a fungus or used a plant. 4. verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Bacillus, Clostridium, Escherichia, Pichia, Candida, Cyanobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Saccharomyces, Eremothecium oder Ashbya oder Pflanzen wie Arabidopsis, Tomate, Kartoffeln, Mais, Raps, Weizen, Gerste, Sonnenblumen, Hirse, Roggen, Hafer, Zuckerrübe, Bohnen­ gewächse oder Soja verwendet.4. The method according to claims 1 to 3, characterized shows that organisms selected from the group of Genera Bacillus, Clostridium, Escherichia, Pichia, Candida, Cyanobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Saccharomyces, Eremothecium or Ashbya or plants like Arabidopsis, tomato, potatoes, corn, rapeseed, wheat, barley, Sunflowers, millet, rye, oats, sugar beet, beans plants or soy. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Candida, Eremothecium oder Ashbya verwendet.5. The method according to claims 1 to 4, characterized records that organisms selected from the group of the genera Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Candida, Eremothecium or Ashbya are used. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeich­ net, daß Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 oder deren funktionellen Äquivalente ver­ wendet werden.6. The method according to claims 1 to 5, characterized in net that genes with the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3rd and SEQ ID No. 5 or their functional equivalents ver be applied. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Äquivalente eine Homologie auf der durch die Sequenzen kodierten und abgeleiteten Aminosäureebene von 35% haben. 7. The method according to claims 1 to 6, characterized characterizes that the equivalents have a homology on the the sequences encoded and derived amino acid level of 35%.   8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeich­ net, daß die Gene, die für die Enzyme 3,4-Dihydroxy-2- butanon-4-phosphat-Synthase, Dimethyl-8-ribityllumazin- Synthase und Riboflavin-Synthase oder deren Funktionsanaloge kodieren, aus eukaryontischen oder prokaryontischen Organis­ men stammen.8. The method according to claims 1 to 7, characterized in net that the genes responsible for the 3,4-dihydroxy-2- enzymes butanone-4-phosphate synthase, dimethyl-8-ribityllumazin- Synthase and riboflavin synthase or their functional analogs encode, from eukaryotic or prokaryotic organ men come. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Gene oder deren Äquivalente aus Organismen ausgewählt aus der Gruppe Bacillus, Escherichia, Clostridium, Saccharomyces, Candida, Eremothecium oder Ashbya stammen.9. The method according to claims 1 to 8, characterized records that the genes or their equivalents from organisms selected from the group Bacillus, Escherichia, Clostridium, Saccharomyces, Candida, Eremothecium or Ashbya. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Gene oder deren Äquivalente zusammen oder getrennt auf mindestens einem Vektor oder chromosomal lokalisiert sind.10. The method according to claims 1 to 9, characterized records that the genes or their equivalents together or separately on at least one vector or chromosomally are localized. 11. Nukleinsäurefragment enthaltend Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 oder deren funktionellen Äquivalente, wobei die Gene oder ihre Äquivalente funktionell mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft sind.11. Nucleic acid fragment containing genes with the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 or their functional Equivalents, where the genes or their equivalents are functional are linked to one or more regulation signals. 12. Expressionsvektor enthaltend das Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 11.12. Expression vector containing the nucleic acid fragment according to Claim 11. 13. Expressionsvektor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine lineare Nukleinsäure handelt.13. Expression vector according to claim 11, characterized in that that it is a linear nucleic acid. 14. Organismus enthaltend mindestens ein Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 11 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 12.14. Organism containing at least one nucleic acid fragment according to claim 11 or at least one vector according to Claim 12. 15. Verwendung einer Kombination der Gene, die für die Enzyme 3, 4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase, Dimethyl-8- ribityllumazin-Synthase und Riboflavin-Synthase oder deren Funktionsanalogen kodieren, in einen Organismus, der in der Lage ist Riboflavin zu synthetisieren, zur gesteigerten Herstellung von Riboflavin.15. Use a combination of the genes responsible for the enzymes 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase, dimethyl-8- ribityllumazine synthase and riboflavin synthase or their Encode functional analogues, in an organism that in the Able to synthesize riboflavin, the increased Production of riboflavin. 16. Verwendung nach Anspruch 15 in Ashbya gossypii.16. Use according to claim 15 in Ashbya gossypii. 17. verfahren zur Integration von Nukleinsäuren in das Genom von Organismen, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein Riboflavinsynthesegen über eine Restriktionsenzym vermittelte Integration ins Genom des Organismus einführt.17. Procedure for integrating nucleic acids into the genome of Organisms, characterized in that at least one Riboflavin synthesis gene mediated via a restriction enzyme Introduces integration into the genome of the organism.