DE19819735A1

DE19819735A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Herstellung einer Anordnung von Kettenmolekülen auf einem Trägermaterial

Info

Publication number: DE19819735A1
Application number: DE1998119735
Authority: DE
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1998-05-02
Filing date: 1998-05-02
Publication date: 1999-11-04
Also published as: AU3825899A; WO1999056865A1; JP2002513549A; EP1079920A1

Abstract

Bei einem Verfahren, einer Vorrichtung und einer Verwendung einer Vorrichtung zum Herstellen eines Trägermaterials mit in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen, insbesondere von zu Abschnitten von Erbinformationsträgern komplementären Oligonukleotiden, ist vorgesehen, nach einem Synthesedurchgang zum Synthetisieren von Kettenmolekülen (21) in einer Abfolge von Synthesefeldern (1 bis 16) wenigstens einen weiteren Synthesedurchgang durchzuführen, bei dem auf die bei dem oder jedem vorangehend durchgeführten Synthesedurchgang synthetisierten Kettenmoleküle (21) mit Kettenbausteinen (N1 bis N12; N9 bis N17) einer Grundtypreihe weitere Kettenbausteine (n4 bis n15) einer anderen Grundtypreihe verkettet werden, wobei die Zufuhr von Kettenbausteinen (N1 bis N17; n4 bis n15) zu den Synthesefeldern (1 bis 16) in den Synthesedurchgängen der vorgesehenen Abfolge der Kettenbausteine (N1 bis N17, n4 bis n15) in den zu synthetisierenden Kettenmolekülen (21) entspricht und die Gruppen von Synthesefeldern (1 bis 16) zugeordneten Synthesebereiche (27) bei jedem Synthesezyklus in jeweils gleicher Durchgangsrichtung um ein Synthesefeld (1 bis 16) versetzt werden. Dadurch sind beispielsweise wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern komplementäre Kettenmoleküle (21) mit Gruppen von Kettenbausteinen (N1 bis N17; n4 bis n15) zu verschiedenen Grundtypreihen effizient synthetesierbar.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Syn thesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten von Erbinforma tionsträgern komplementären Oligonukleotiden, bei dem in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen in einer Durchgangsrichtung wenigstens eine Reaktionszelle relativ zu dem Trägermateaal mit teilweise überlappenden Synthesebereichen positioniert und für eine Kettenverlängerung vorgesehene Kettenbausteine einer Grundtypreihe durch die Reaktionszelle geleitet werden, so daß bei mehreren Synthesezyklen in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Synthesefeldern Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen synthetisiert werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung insbesondere zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten von Erbinformationsträgern komplementären Oligonukleotiden, mit einem Träger materialhalter, auf den das Trägermaterial aufbringbar ist, mit einer Vorratseinheit, mit wenig stens einer an die Vorratseinheit angeschlossenen Reaktionszelle, durch die bei abdichtendem Auflegen der oder jeder Reaktionszelle auf das Trägermaterial für eine Kettenverlängerung vorgesehene Kettenbausteine unter Kontakt mit dem Trägermaterial in einem Synthesebereich durchleitbar sind, mit einer Positioniereinheit, mit der die oder jede Reaktionszelle in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen jeweils um einen Verschiebeweg relativ zu dem Trägermaterial mit teilweise in Synthesefeldern überlappenden Synthese bereichen positionierbar ist, und mit einer Steuereinheit zum Steuern der Vorratseinheit und der Positioniereinheit, so daß bei mehreren Synthesezyklen in wiederholt von Synthesebereichen einer Rektionszelle überdeckten Synthesefeldern Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen synthetisierbar sind.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Verwendung einer Vorrichtung zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten von Erbinformationsträgern komplementären Oligonukleotiden, insbesondere zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit einem Träger materialhalter, auf den das Trägermaterial aufgebracht wird, mit einer Vorratseinheit, mit wenig stens einer an die Vorratseinheit angeschlossenen Reaktionszelle, durch die bei abdichtendem Auflegen der oder jeder Reaktionszelle auf das Trägermaterial für eine Kettenverlängerung vorgesehene Kettenbausteine unter Kontakt mit dem Trägermaterial in einem Synthesebereich durchgeleitet werden, mit einer Positioniereinheit, mit der die oder jede Reaktionszelle in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen jeweils um einen Verschiebeweg relativ zu dem Trägermaterial mit teilweise in Synthesefeldern überlappenden Synthese bereichen positioniert wird, und mit einer Steuereinheit zum Steuern der Vortatseinheit und der Positioniereinheit, so daß bei mehreren Synthesezyklen in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Synthesefeldern Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen synthetisiert werden.

Ein derartiges Verfahren und eine derartige Vorrichtung sind aus dem Artikel "Arrays of complementary oligonucleotides for analysing the hybridisation behaviour of nucleic acids" von E.M. Southern, S.C. Case-Green, J.K. Elder et al., Seiten 1368 bis 1373, Nucleic Acid Research, 1994, Vol. 22, No. 8, bekannt. Bei dem vorbekannten Verfahren und der vorbekannten Vorrichtung ist eine Reaktionszelle mit einem rautenförmigen oder kreisförmigen Synthesebereich in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen in einer Durchgangsrichtung relativ zu einem Trägermaterial mit teilweise überlappenden Synthesebe reichen versetzt, wobei bei jedem Synthesezyklus eine Reaktionslösung mit einem für eine Ket tenverlängerung vorgesehenen Kettenbaustein unter Kontakt mit dem Trägermaterial durch die Reaktionszelle durchgeleitet wird. Kettenmoleküle mit einer vorbestimmten Abfolge von Ketten bausteinen, insbesondere von zu Abschnitten von Erbinformationsträgern komplementäre Oligo nukleotide, sind synthetisierbar, indem bei den Synthesezyklen jeweils eine Reaktionslösung mit einem vorbestimmten Kettenbaustein in dem Synthesebereich über das Trägermaterial geleitet wird, so daß in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Syn thesefeldern Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen synthetisiert werden.

Die Kettenmoleküle sind vorzugsweise als Oligonukleotide ausgebildet. In der vorliegenden Anordnung auf dem Trägermaterial (als sog. "scanning array") dienen die Oligonukleotide der Analyse des Hybridisierungsverhaltens von Nukleinsauren. Mit dem vorbekannten Verfahren und der vorbekannten Vorrichtung sind eine Vielzahl von sequenzhomologen komplementären Oligonukleotiden mit verschiedenen Kettenlängen synthetisierbar.

Bei der Inhibierung der Expression eines von einer Ziel-Nukleinsäure kodierten Proteins durch Interaktion (Hybridisierung) von relativ kurzen, zur Basensequenz der Ziel-Nukleinsäure komplementären Oligonukleotiden mit der Ziel-Nukleinsäure oder einem Ziel-Nukleinsäure- Protein-Komplex, wobei die Ziel-Nukleinsäure insbesondere eine einzelsträngige Ziel- Nukleinsäure mit sekundärer und tertiärer Struktur, insbesondere eine "messenger RNA" (mRNA) darstellt (sog. "Antisense-Technologie"), besteht aufgrund der komplizierten Sekundär- und Tertiärstruktur der mRNA das Problem, für eine Inhibierung der Translation einer spezi fischen mRNA verfügbare Bindungsplätze für ein Oligonukleotid zu identifizieren, über deren Lokalisierung nur schwer Voraussagen getroffen werden können. Ein Trägermaterial, auf dem sich die genannte Anordnung von Oligonukleotiden befindet, kann insbesondere in einem Assay eingesetzt werden, mit dem bestimmt wird, ob bzw. wie stark eine Ziel-Nukleinsäure, wie beispielsweise ein solches mRNA-Molekül, in der Lage ist, mit einem oder mehreren der auf dem Trägermaterial befindlichen Oligonukleotide zu hybridisieren. In einem solchen Assay werden die Hybridisierungsbedingungen möglichst so gewählt, dass dabei die Sekundär- bzw. Tertiärstruktur der Ziel-Nukleinsäure weitgehend erhalten bleibt und mit der entsprechenden in vivo-Struktur der RNA übereinstimmt. Dabei kann die Stärke der Hybridisierung als Mass für die Zugänglichkeit einer bestimmten Region der Ziel-Nukleinsäure durch die Oligonukleotide dienen. Ein einzelnes, solchermassen identifiziertes, zur Hybridisierung mit der Ziel-Nukleinsäure befähigtes Oligonukleotid kann dann nach bekannten Verfahren hergestellt und in der Antisense-Technologie zu medizinisch-therapeutischen oder diagnostischen Zwecken eingesetzt werden.

Aus der WO 95/21265 ist bekannt, zur Identifizierung von zur Inhibierung verwendbaren Bindungsplätzen als sogenannte "Antisense"moleküle an eine mRNA hybridisierbare Oligonukleotide auf einem festen Träger zu synthetisieren, wobei die Oligonukleotide jeweils vollständig aus einer einzigen definierten Art von Kettenbausteinen, beispielsweise vom Desoxyribonukleotid-Typ, vom Desoxyribophosphorothioatnukleotid-Typ oder vom 2'-O-Methyl- Ribonukleotid-Typ (d. h. jeweils aus Kettenbausteinen einer einzigen Grundtypreihe), aufgebaut sind.

Die bekannten Verfahren haben den Nachteil, dass sich mit ihrer Hilfe nur Oligonukleotide auf dem Träger synthetisieren und identifizieren lassen, die vollständig aus Kettenmolekülen einer einzigen bestimmten Grundtypreihe aufgebaut sind. Solche Oligonukleotide besitzen häufig nicht die in der Antisense-Technologie erwünschten multiplen Eigenschaften, wie beispielsweise eine hohe Bindungsaffinität zur Ziel-Nukleinsäure und/oder eine hohe Resistenz gegenüber endogenen Nukleasen verbunden mit dem Vermögen, die Expression des Zielproteins auf der Ebene der Zielnukleinsäure wirksam zu inhibieren.

Es ist weiterhin bekannt, dass pharmazeutisch besonders effiziente Oligonukleotide solche sind, die mehrere Eigenschaften in sich vereinen, beispielsweise eine hohe Bindungsaffinität zur Ziel- Nukleinsäure/oder Resistenz gegen Abbau durch Endonukleasen verbunden mit der Eigenschaft, eine effiziente Spaltung der Ziel-Nukleinsäure durch die endogene RNAse H zu bewirken. Es ist gelungen, bei Oligonukleotiden eine Vielzahl von solchen Eigenschaften in ein und demselben Molekül vereinen, indem ein solches Oligonukleotid abschnittsweise aus Kettenbausteinen einer bestimmten Grundtypreihe aufgebaut ist, wobei jeder Abschnitt für eine bestimmte Eigenschaft oder Funktion des Oligonukelotides verantwortlich ist. Solche Oligonukleotide werden oft als "chimäre" Oligonukleotide bezeichnet. Chimäre Oligonukleotide bestehen aus Kettenbausteinen wenigstens zweier verschiedener Grundtypreihen, die in wenigstens zwei aufeinanderfolgenden oder benachbarten Abschnitten, häufig auch in drei oder mehr solchen Abschnitten, synthetisiert sind (siehe beispielsweise S.T. Crooke et al., J. of Pharmacology and Experimental Therapeutics 277 (1996), S. 923-937).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, bei denen auf dem Trägermaterial eine effiziente Synthese einer Anordnung von Kettenmolekülen mit abschnittsweiser gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen, insbesondere Oligonukleotiden mit chimärer Struktur, jedoch ansonsten weitgehend gleichen charakteristischen Kenneigenschaften wie Basenerkennungscharakteristika bei Oligonukleotiden durchgeführt werden kann.

Der Erfindung liegt insbesondere die Aufgabe zugrunde, bei als zu Abschnitten von Erbinformationsträgern wenigstens teilweise komplementären Oligonukleotiden ausgebildeten Kettenmolekülen ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, wobei die Oligonukleotide eine chimäre Struktur aufweisen, wodurch beispielsweise eine hohe Bindungsaffinität und/oder eine hohe Widerstandsfähigkeit gegen auf solche Oligonukleotide einwirkenden natürlichen Abbauenzyme, verbunden mit der Fähigkeit zur effizienten Inhibition der Translation, oder allgemeiner der Expression, einer Ziel-Nukleinsäure erzielt wird.

Diese Aufgaben werden mit einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß nach einer Abfolge von Synthesezyklen in einem Synthesedurchgang wenigstens ein weiterer Synthesedurchgang mit Kettenbausteinen einer gegenüber dem vorangegangenen Synthese durchgang unterschiedlichen Grundtypreihe durchgeführt wird, daß bei dem oder jedem weiteren Synthesedurchgang bei Synthesezyklen eines Synthesedurchganges eine in diesem Synthesedurchgang verwendete Reaktionszelle in der gleichen Durchgangsrichtung wie bei dem vorangegangenen Synthesedurchgang so positioniert wird, daß der zugehörige Synthese bereich abschnittsweise mit einem in diesem Synthesedurchgang bislang unbedeckten Synthesefeld überlagert, in dem Kettenmoleküle mit einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge vorliegen, und daß an dieser Kettenposition vorgesehene Kettenbausteine des zu synthetisierenden Kettenmoleküles der in diesem Synthesedurchgang verwendeten Grundtypreihe durch die Reaktionszelle geleitet werden.

Diese Aufgaben werden bei einer Vorrichtung der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß in der Vorratseinheit Kettenbausteine wenigstens zweier verschiedener Grundtypreihen bevor ratet sind, daß mit der Steuereinheit die oder jede Reaktionszelle bei wenigstens zwei Synthesedurchgängen in jeweils gleichen Durchgangsrichtungen so positionierbar ist, daß bei Synthesezyklen eines Synthesedurchganges der zugehörige Synthesebereich abschnittsweise mit einem in diesem Synthesedurchgang bislang unbedeckten Synthesefeld überlagert, in dem Kettenmoleküle mit einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurchgang synthe tisierten maximalen Kettenlänge vorliegen, und daß von der Steuereinheit gesteuert bei zwei aufeinanderfolgenden Synthesedurchgängen Kettenbausteine verschiedener Grundtypreihen durch die oder jede Reaktionszelle durchleitbar sind.

Alternativ zu einer solchen Vorrichtung, deren Vorratseinheit Kettenbausteine wenigstens zweier verschiedener Grundtypreihen bevorratet, kann eine erfindungsgemässe Vorrichtung eine entsprechende Vorratseinheit umfassen, die jeweils Kettenbausteine einer einzigen Grundtypreihe enthält, und bei der die Vorratseinheit austauschbar ausgebildet ist, so dass nach jedem Synthesedurchgang die Vorratseinheit durch eine weitere Vorratseinheit mit Kettenbausteinen einer anderen Grundtypreihe ausgetauscht werden kann.

Diese Aufgaben werden bei einer Verwendung einer Vorrichtung der beschriebenen Art dadurch gelöst, daß in der Vorratseinheit Kettenbausteine wenigstens zweier verschiedener Grund typreihen bevorratet werden, daß mit der Steuereinheit die oder jede Reaktionszelle bei wenigstens zwei Synthesedurchgängen in jeweils gleichen Durchgangsrichtungen so posi tionierbar werden, daß bei Synthesezyklen eines Synthesedurchganges der zugehörige Synthesebereich abschnittsweise mit einem in diesem Synthesedurchgang bislang unbedeckten Synthesefeld überlagert, in dem Kettenmoleküle mit einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge vorliegen, und daß von der Steuer einheit gesteuert bei zwei aufeinanderfolgenden Synthesedurchgängen Kettenbausteine verschiedener Grundtypreihen durch die oder jede Reaktionszelle durchgeleitet werden.

Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer beschriebenen Vorrichtung zur Herstellung eines Trägermaterials umfassend eine Anordnung von in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erb informationsträgern komplementären Oligonukleotiden, wobei benachbarte Synthesefelder Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleicher Abfolge von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen umfassen. Eine solche Anordnung umfasst somit Kettenmoleküle, die wenigstens zwei Abschnitte mit jeweils unterschiedlichen Grundtypreihen von Kettenbausteinen umfassen.

Ein weiterer erfindungsgemässer Gegenstand ist ein Trägermaterial, aufweisend eine Anordnung von in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern komplementären Oligonukleotiden, wobei benachbarte Synthesefelder Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleicher Abfolge von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen umfassen. Eine solche Anordnung umfasst somit Kettenmoleküle, die wenigstens zwei Abschnitte mit jeweils unterschiedlichen Grundtypreihen von Kettenbausteinen umfassen.

In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein Trägermaterial, das nach einem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung herstellbar ist.

Durch das Durchführen von wenigstens zwei überlagerten Synthesedurchgängen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der erfindungsgemäßen Verwendung einer Vorrichtung lassen sich Kettenmoleküle mit Blöcken von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen, jedoch ansonsten gleicher Kenneigenschaften wie Basenerkennungscharakteristika synthetisieren, wobei sich beispiels weise durch unterschiedliche Abfolgen von Grundtypreihen und/oder verschieden groß ausgestaltete Synthesebereiche von in den verschiedenen Synthesedurchgängen verwendeten Reaktionszellen hohe Varietäten in den synthetisierten Kettenmolekülen mit hoher Effizienz erzielen lassen.

Zweckmäßigerweise sind die Synthesebereiche jeder Reaktionszelle rechteckförmig mit jeweils gleich großen Querseiten ausgebildet, wobei die Länge jeder Längsseite einer Reaktionszelle einem ganzzahligen Vielfachen eines Verschiebewegs in Längsrichtung entspricht. Die Reaktionszellen werden dabei von einem Synthesezyklus zum nächsten um den die Größe eines Synthesefeldes in Längsrichtung entsprechenden Verschiebeweg versetzt. Bei unterschiedlich langen Synthesebereichen sind die Reaktionszellen bei einem jeweils ersten Synthesezyklus jedes Synthesedurchganges so zu positionieren, daß die Synthesebereiche der Reaktionszellen in Durchgangsrichtung vorderseitig bündig miteinander überlagern.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Kettenmolekülen, wie bereits erwähnt, vorzugsweise um Oligonukleotide. Solche Oligonukleotide sind zur Paarung mit einem komplementären Nukleinsäurestrang, insbesondere einer mRNA, befähigt und bestehen aus einzelnen Kettenbausteinen, nämlich Nukleosiden oder Nukleosid-Analoga, die im Regelfall eine Nukleinsäure-Base oder ein -Basenanalog, die die Eigenschaften der Oligonukleotide zur Basenpaarung vermitteln, tragen. Ein Kettenbaustein umfasst auch eine internukleosidische Brückenbindung zum nächsten Baustein, bespielsweise vom Phosphodiester-, Phosphorothioat- oder Amid-Typ, wie beispielsweise beschrieben in A. de Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res. 28 (1995), S. 366-374.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei einer Grundtypreihe der Kettenmoleküle jeweils um Kettenbausteine derselben Grundstruktur, wobei sich Mitglieder einer ersten Grundtypreihe von Mitgliedern einer zweiten Grundtypreihe insbesondere durch die zu erzielenden Eigenschaften, beispielsweise die durch den betrachteten Teil des Kettenmoleküls hervorgerufenen oder vermittelten physiologischen oder pharmakologischen Eigenschaften, unterscheiden. Im Falle von Oligonukleotiden sind solche Eigenschaften der Kettenmoleküle beispielsweise die Affinität zu einer Ziel-Nukleinsäure, die Nukleaseresistenz, die Sensitivität gegenüber RNAse H oder die toxischen Eigenschaften. Ein vorteilhaftes Oligonukleotid, das als Medikament im Rahmen der Antisense-Technologie eingesetzt wird, vereinigt mehrere vorteilhafte Eigenschaften in sich.

Innerhalb eines Kettenmoleküls sind solche unterschiedlichen Eigenschaften häufig mit dem Vorhandensein von Bausteinen bestimmter Grundstrukturen oder Grundtypen verknüpft. Beispiele von verschiedenen Grundtypreihen von Kettenbausteinen von Oligonukleotiden sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise handelt es sich bei den Grundtypen von Bausteinen um natürliche Nukleoside, wie beispielsweise 2'-Desoxyribonukleoside oder Ribonukleoside; oder um 2'-O-Alkyl-modifizierte Ribonukleoside, wobei die 2'-O-Alkylgruppe, die vorzugsweise 2'-O-C₁-C₅-Alkyl darstellt, insbesondere 2'-O-Methyl oder 2'-O-Ethyl, unsubstituiert oder, im Falle von 2'-O-Ethyl an der β-Position mit -OH, -F oder Alkoxy, vorzugsweise mit C₁-C₅-Alkoxy, insbesondere Methoxy, substituiert sein kann, wobei 2'-O-(2-Methoxyethyl)-modifizierte Ribonukleoside ganz besonders bevorzugt sind; um Bausteine von Nukleotiden oder Nukleotid- Analoga, die zu Oligonukleotiden mit einer internukleosidischen Brückenbindung vom Phosphodiester- oder Phosphorothioat-Typ, oder zu Oligonukleotiden einem modifizierten Rückgrat (internukleosidische Brückenbindung) führen, wie PNA-Bausteine, Amid-Bausteine oder 3'-Methylenphosphonat-Bausteine; oder um basenmodifizierte Nukleosidbausteine, wie beispielsweise 5-Propinyl-Nukleosid-Bausteine, wobei die einzelnen Grundtypen in Abhängigkeit von der Basensequenz der Zielnukleinsäure entsprechende Nukleinsäure-Basen oder -Basenanaloga aufweisen (siehe auch A. De Mesmaeker et al., wie oben erwähnt E. Uhlmann et al., Chem. Rev. 90 (1990), S. 543-584). Auch Kombinationen von chemischen Modifikationen zu Bausteinen führen, die zu unterschiedlichen Grundtypreihen zählen. Beispielsweise werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Ribonukleotide mit einer Phosphodiestergruppe als Bausteine einer Grundtypreihe, und 2'-O-(2-Methoxyethyl)- Ribonukleotide mit einer Phosphorothioatgruppe als Bausteine einer anderen Grundtypreihe betrachtet. Erfindungsgemäss sind in einem Oligonukleotid Bausteine jeweils einer Grundtypreihe in einem Abschnitt synthetsiert, wobei ein Oligonukleotid aus wenigstens 2, beispielsweise 2 oder 3 Abschnitten besteht.

Bevorzugt sind als Kettenmoleküle chimäre Oligonukleotide, die aus zwei Abschnitten bestehen, wobei der eine Abschnitt aus 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Ribonukleosiden besteht, die über Phosphodiester-Brücken oder Phosphorothloat-Brücken miteinander verknüpft sind, und der andere Abschnitt aus 2'-Desoxyribonukleosiden besteht, die über Phosphorothioat-Brücken miteinander verknüpft sind.

Weiter bevorzugt sind als Kettenmoleküle chimäre Oligonukleotide, die aus drei Abschnitten bestehen, wobei, von 5'- in 3'-Richtung betrachtet, der erste Abschnitt aus 2'-O-(2- Methoxyethyl)-Ribonukleosiden besteht, die über Phosphodiester-Brücken oder Phosphorothioat-Brücken miteinander verknüpft sind, der daran anschliessende zweite Abschnitt aus 2'-Desoxyribonukleosiden besteht, die über Phosphorothioat-Brücken miteinander verknüpft sind, und der daran anschliessende dritte Abschnitt wiederum aus 2'-O-(2- Methoxyethyl)-Ribonukleosiden besteht, die über Phosphodiester-Brücken oder Phosphorothioat-Brücken miteinander verknüpft sind.

Bei solchen chimären Oligonukleotiden, die Abschnitte mit 2'-O-(2-Methoxyethyl- Ribonukleosiden enthalten, sind zwei einzelne Abschnitte bevorzugt über eine Rhosphorothioat- Brücke miteinander verknüpft, wenn es sich bei dem Nukleosid am 3'-Ende eines Abschnittes um ein 2'-Desoxyribonukleosid handelt; oder zwei einzelne Abschnitte sind alternativ über eine Phosphodiester-Brücke oder über eine Phosphorothioat-Brücke miteinander verknüpft, wenn es sich bei dem Nukleosid am 3'-Ende eines Abschnittes um ein 2'-O-(2-Methoxyethyl)- Ribonukleosid handelt.

Geeignete, bevorzugte chimäre Oligonukleotide haben eine Gesamtlänge von etwa 15 bis etwa 25, beispielsweise 20, Nukleosidbausteinen, wobei der aus 2'-Desoxyribonukleosidbausteinen bestehende Abschnitt wenigstens etwa 5 solcher Bausteine umfasst.

Weitere zweckmäßige Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen unter Bezug auf die Figuren der Zeichnung. Es zeigen:

Fig. 1 in einer schematischen Darstellung in einem Ausführungsbeispiel einen Träger materialstreifen mit einer aufgesetzten, einen vier Synthesefelder überdecken den Synthesebereich aufweisenden Reaktionszelle nach einem ersten Syn thesezyklus eines ersten Synthesedurchganges mit grafischer Darstellung der synthetisierten Kettenbausteine einer Grundtypreihe,

Fig. 2 die Anordnung gemäß Fig. 1 nach Durchführen des letzten Synthesezyklus des ersten Synthesedurchganges,

Fig. 3 die Anordnung gemäß Fig. 2 nach Durchführen eines ersten Synthesezyklus eines weiteren zweiten Synthesedurchganges mit Verkettung eines Kettenbau steines einer gegenüber oder bei dem ersten Synthesedurchgang verwendeten verschiedenen Grundtypreihe,

Fig. 4 die Anordnung gemäß Fig. 3 nach Durchführen des letzten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges,

Fig. 5 in einer schematischen Darstellung in einem weiteren Ausführungsbeispiel einen Trägermaterialstreifen mit einer einen drei Synthesefelder bedeckenden Syn thesebereich aufweisenden Reaktionszelle nach Durchführen eines zehnten Synthesezyklus eines ersten Synthesedurchganges mit Darstellung der bis dahin verketteten Kettenbausteine einer Grundtypreihe,

Fig. 6 die Anordnung gemäß Fig. 5 mit einer aufgesetzten, einen fünf Synthesefelder überdeckenden Synthesebereich aufweisenden Reaktionszelle nach einem zweiten Synthesezyklus eines weiteren zweiten Synthesedurchganges,

Fig. 7 die Anordnung gemäß Fig. 6 nach Durchführen des letzten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges und

Fig. 8 die Anordnung gemäß Fig. 7 mit einer einen zwei Synthesefelder überdeckenden Synthesebereich aufweisenden Reaktionszelle nach Durchführen des letzten Synthesezyklus eines weiteren dritten Synthesedurchganges.

Fig. 9 eine Vorrichtung zur Herstellung eines Trägermateriales mit in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen gemäss der Erfindung in einer schematischen perspektivischen Ansicht.

Fig. 10 die Hubeinheit der Vorrichtung schematisch in einer perspektivischen vergrösseren Ansicht.

Fig. 11 die Hubeinheit gemäss Fig. 10 in einer Draufsicht

Fig. 12 einen Querschnitt durch den Trägerbalken der Hubeinheit mit einer am Trägerbalken befestigten Reaktionszelle in einer Seitenansicht, teilweise aufgeschnitten:

Fig. 13 eine Draufsicht auf eine Reaktionszelle

Fig. 1 zeigt in einer schematischen Darstellung in einem Ausführungsbeispiel zu einem Verfahren und einer Vorrichtung gemäß der Erfindung einen mit insgesamt 16 Synthesefeldern 1 bis 16 belegbaren Trägermaterialstreifen 17 aus beispielsweise chemisch zur Synthese von Oligonukleotiden behandelten Polypropylen (PP) als Trägermaterial. Der Trägermaterialtreifen 17 ist auf einem in Fig. 1 nicht dargestellten, beispielsweise als mit einer elastischen Schicht versehene Metallplatte ausgestalteten Trägermaterialhalter aufgelegt. Auf den Träger materialstreifen 17 ist in der Darstellung gemäß Fig. 1 eine in ihren Umrissen dargestellte verschiebbare Reaktionszelle 18 aufgesetzt die an eine in Fig. 1 nicht dargestellte Vorratseinheit angeschlossen ist. In Weiterbildungen sind mehrere Reaktionszellen 18 vorgesehen, die beispielsweise zum Durchführen einer Parallelsynthese nebeneinander angeordnet an einem Reaktionszellenträger angebracht und gemeinsam verschiebbar sind. In der an eine in Fig. 1 ebenfalls nicht dargestellten Steuereinheit angeschlossenen Vorratseinheit sind für eine Synthese von Kettenmolekülen unter Kettenverlängerung mit einer vorbestimmten, spezifischen Abfolge von Kettenbausteinen vorgesehene Reaktionsfluide, beispielsweise Reaktionslösungen, bevorratet oder beziehungsweise werden aufeinanderfolgend bevorratet, die von der Steuereinheit gesteuert der oder jeder Reaktionszelle 18 zuführbar sind.

Die Reaktionszelle 18 ist unter Abdichtung auf den Trägermaterialstreifen 17 auflegbar. Bei dem Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 weist die Reaktionszelle 18 eine Vertiefung mit einer zu einer Seite offenen, rechteckförmigen, einen Synthesebereich 19 begrenzenden Umrandung auf, deren Abmessungen in dem dargestellten Ausführungsbeispiel der Größe von vier benach barten Synthesefeldern 1 bis 16 entspricht in der Darstellung gemäß Fig. 1 ist die mittels einer in Fig. 1 nicht dargestellten Positioniereinheit von der Steuereinheit gesteuert in Richtung der Synthesefelder 1 bis 16 unter Abheben verschiebbare Reaktionszelle 18 die von links gezählten ersten vier Synthesefelder 1 bis 4 überdeckend positioniert dargestellt.

Im nachfolgenden wird erläutert, wie mit der vorangehend erläuterten Vorrichtung in einem Verfahren eine Anzahl von wenigstens zu einem Teil eines Abschnittes 20 eines Erbin formationsträgers komplementären Oligonukleotiden synthetisiert werden. Die einzelnen, die Erbinformation tragenden Basen des Abschnittes 20 sind in Fig. 1 symbolisch mit B1 bis B17 gekennzeichnet und stehen jeweils für eine der Basen A, C, G und U beziehungsweise T nach dem Watson-Crick-Modell.

Weiterhin ist in der Darstellung gemäß Fig. 1 der Aufbau von jeweils einem Synthesefeld 1 bis 16 zugeordneten Oligonukleotiden 21 als Kettenmoleküle dargestellt. Jedes Oligonukleotid 21 wird an eine zur Bindung vorpräparierte Restgruppe R des Trägermaterialstreifens 17 angefügt.

In der Darstellung gemäß Fig. 1 ist die Reaktionszelle 18 in der Position eines ersten Synthesezyklus eines ersten Synthesedurchganges angeordnet, bei dem ein für eine Kettenverlängerung vorgesehenes Reaktionsfluid mit einem natürlichen, zu der Base B1 des Abschnittes 20 komplementären Nukleotid N1 durch die Reaktionszelle 18 geleitet worden ist. Das Reaktionsfluid hat den Synthesebereich 19 überspült, so daß an die Restgruppen R der in der Darstellung gemäß Fig. 1 links gelegenen ersten vier Synthesefelder 1 bis 4 das Nukleotid N1 angefügt worden ist.

In sich an den ersten Synthesezyklus gemäß Fig. 1 anschließenden weiteren Synthesezyklen des ersten Synthesedurchganges werden nunmehr unter schrittweisem Versetzen der Reaktionszelle 18 mittels der Positioniereinheit in einer Durchgangsrichtung jeweils um einen der Größe eines nächstbenachbarten Synthesefeldes 5 bis 16 entsprechenden Verschiebeweg die von dem Synthesebereich 19 überdeckten Synthesefelder 2 bis 16 in der Darstellung gemäß Fig. 1 von links nach rechts mit natürliche, zu den Basen B1 bis B13 des Abschnittes 20 komplementäre Nukleotide N2 bis N13 einer Grundtypreihe enthaltenden Reaktionsfluiden überspült.

Fig. 2 zeigt die Anordnung gemäß Fig. 1 mit der Reaktionszelle 18 in einer die in der gewählten Darstellung links gelegenen, in Durchgangsrichtung letzten vier Synthesefelder 13 bis 16 über deckenden Anordnung nach Durchführen des letzten Synthesezyklus des ersten Synthesedurchganges mit einem das zu der Base B13 komplementäre natürliche Nukleotid N13 aufeisenden Reaktionsfluid. Aus Fig. 2 ist ersichtlich, daß bis auf die in der Darstellung gemäß Fig. 2 von links gezählten ersten drei Synthesefelder 1 bis 3 und die letzten drei Synthesefelder 14 bis 16 in den mittigen Synthesefeldern 4 bis 13 sequenzhomologe, jeweils vier natürliche Nukleotide N1 bis N13 aufweisende Oligonukleotide 21 synthetisiert worden sind, wobei jedes in einem der Synthesefelder 4 bis 13 synthetisierte Oligonukleotid 21, wie durch die jeweils gleiche Abfolge von Ordnungszahlen repräsentiert, zu einem zusammenhängenden Teil des Abschnittes 20 der Basen B1 bis B13 des Erbinformationsträgers komplementär ist.

Fig. 3 zeigt die Anordnung gemäß Fig. 2 mit der den vier Synthesefelder 1 bis 16 überdeckenden Synthesebereich 19 aufweisenden Reaktionszelle 18 in der Positionierung eines ersten Synthesezyklus eines weiteren zweiten Synthesedurchganges. Bei dem ersten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges wird die Reaktionszelle 18 in die gleiche Positionierung wie bei dem ersten Synthesezyklus des ersten Synthesedurchganges unter Überdeckung der in der Darstellung gemäß Fig. 3 links gelegenen ersten vier Synthesefelder 1 bis 4 gebracht. Dann wird ein Reaktionsfluid mit einem nunmehr modifizierten Nukleotid n5 als Kettenbaustein einer gegenüber der bei dem ersten Synthesedurchgang verwendeten verschiedenen Grundtypreihe durchgespült, wobei die Base des modifizierten Nukleotides n5 zu der Base B5 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementär ist. Bei dem ersten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges wird somit in dem von links gezählten vierten Synthesefeld 4 ein aus fünf Kettenbausteinen in der Abfolge N1-N2-N3-N4-n5 zusam mengesetztes Oligonukleotid 21 synthetisiert, das zu den ersten fünf Basen B1 bis B5 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementär ist und natürliche Nukleotide N1 bis N4 der bei dem ersten Synthesedurchgang verwendeten Grundtypreihe und das modifizierte Nukleotid n5 der bei dem zweiten Synthesedurchgang verwendeten weiteren Grundtypreihe aufweist. In den randseitigen Synthesefeldern 1 bis 3 sind gegenüber dem Anfang des Ab schnittes 20 des Erbinformationsträgers nicht oder nicht vollständig komplementäre Oligonu kleotide 21 synthetisiert worden.

In den auf den ersten Synthesezyklus folgenden weiteren Synthesezyklen des zweiten Synthesedurchganges werden nunmehr nach Versetzen der Reaktionszelle 18 jeweils um einen der Größe eines benachbarten Synthesefeldes 5 bis 16 entsprechenden Verschiebeweges Reaktionsfluide mit modifizierten Nukleotiden n6 bis n17 durchgeleitet, wo bei durch die Abfolge der Basen B6 bis B17 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers die Abfolge der zu den Basen B6 bis B17 komplementären modifizierten Nukleotide n6 bis n17 vorgegeben ist.

Fig. 4 zeigt in der Anordnung gemäß Fig. 3 die Reaktionszelle 18 in der Position bei dem letzten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges nach Durchspülen mit einem das zu der letzten Base B17 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementäre modifizierte Nukleotid n17 enthaltenden Reaktionsfluid. Aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß nunmehr bis auf die jeweils drei randseitigen Synthesefelder 1, 2, 3, 14, 15, 16 in den mittleren Synthesefeldern 4 bis 13 sequenzhomologe, jeweils zu einem Teil des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementäre Oligonukleotide 21 mit einer Länge von acht Nukleotiden synthetisiert worden sind. Jedes Oligonukleotid 21 weist blockweise vier natürliche Nukleotide N1 bis N13 sowie sich daran anschließend vier modifizierte Nukleotide n5 bis n17 jeweils im Anschluß an die bei dem ersten Synthesedurchgang zuletzt angefügten natürlichen Nukleotide N4 bis N13 in einer der Abfolge der Basen B1 bis B17 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers entsprechenden Reihenfolge auf.

Der Trägermaterialstreifen steht nun, insbesondere hinsichtlich der in den mittleren Synthesefeldern 4 bis 13 synthetisierten Oligonukleotide 21 als Kettenmoleküle mit acht, in zwei Blöcken oder Abschnitten mit unterschiedlichen Grundtypreihen angeordneten Kettenbau steinen, zur Verwendung in einem Assay zur Untersuchung von Teilen des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers hinsichtlich zugänglicher Bindungsplätze für sogenannte "Antisense"oligonukleotide zur Verfügung, wie oben erwähnt.

Fig. 5 zeigt schematisch ähnlich Fig. 1 bis Fig. 4 in einem weiteren Ausführungsbeispiel zu einem Verfahrens und einer Vorrichtung gemäß der Erfindung den Trägermaterialstreifen 17 gemäß dem vorgenannten Ausführungsbeispiel. Bei dem nachfolgend erläuterten Ausführungsbeispiel sollen wiederum zu zusammenhängenden Teilen des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementäre Oligonukleotide 21 mit einer gegenüber dem anhand Fig. 1 bis Fig. 4 erläuterten Ausführungsbeispiel größeren Kettenlänge unter Verwendung von natürlichen und modifizierten Nukleotiden in drei unterschiedlich langen Blöcken von paarweise verschiedenen Grundtypreihen synthetisiert werden.

Hierzu wird gemäß Fig. 5 eine Reaktionszelle 22 mit einem drei Synthesefelder 1 bis 16 über deckenden Synthesebereich 23 in der Anordnung bei einem zehnten Synthesezyklus eines ersten Synthesedurchganges gezeigt. Bei dem ersten Synthesezyklus des ersten Synthesedurchganges wurde die Reaktionszelle 22 so angeordnet, daß von dem Synthese bereich 23 das in der Darstellung gemäß Fig. 5 von links gezählte dritte bis fünfte Synthesefeld 3, 4, 5 überdeckt worden ist. Dann wurden in den nachfolgenden Synthesezyklen des ersten Synthesedurchganges die Reaktionszelle 22 jeweils auf das nächstbenachbarte Synthesefeld 5 bis 14 versetzt und mit einem ein der Abfolge von Basen B2 bis B10 entsprechenden komplementären natürlichen Nukleotid N2 bis N10 enthaltenden Reaktionsfluid durchspült, so daß sich bis zu dem in Fig. 5 dargestellten zehnten Synthesezyklus die dargestellten komple mentären Oligonukleotide 21 aufgebaut haben.

Fig. 6 zeigt die Anordnung gemäß Fig. 5 nach einem zweiten Synthesezyklus eines weiteren zweiten Synthesedurchganges. Bei dem zweiten Synthesedurchgang wird eine Reaktionszelle 24 verwendet, mit deren Synthesebereich 25 fünf Synthesefelder 1 bis 16 überdeckbar sind. Bei einem ersten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges wird die Reaktionszelle 24 so angeordnet, daß als einziges der Synthesefelder 5 bis 12 mit einer Kette von drei natürlichen Nukleotiden N1 bis N12 das in der Darstellung gemäß Fig. 6 von links gezählte fünfte Synthesefeld 5 zusammen mit den linksseitig äußeren vier Synthesefeldern 1 bis 4 erstmalig von dem Synthesebereich 25 überdeckt worden ist. Bei dem ersten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges wurden die in der Darstellung gemäß Fig. 6 ersten beiden links außen gelegenen Synthesefelder 1, 2 erstmalig mit einem Reaktionsfluid überspült.

Bei dem ersten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges wurde ein Reaktionsfluid verwendet, die das zu der vierten Base B4 des Abschnittes 20 komplementäre modifizierte Nukleotid n4 enthält, während bei dem in Fig. 6 dargestellten zweiten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges das zu der fünften Base B5 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementäre, modifizierte Nukleotid n5 in dem Reaktionsfluid enthalten war.

In den weiteren Synthesezyklen des zweiten Synthesedurchganges wird die Reaktionszelle 24 jeweils um einen der Größe eines Synthesefeldes 1 bis 16 entsprechenden Verschiebeweg versetzt, und Reaktionsfluide mit komplementären modifizierten Nukleotiden n6 bis n15 in der entsprechenden Abfolge der Basen B6 bis B15 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers werden durchgeleitet.

Fig. 7 zeigt in der Darstellung Fig. 6 die Positionierung der in dem zweiten Synthesedurchgang verwendeten Reaktionszelle 24 nach Durchführen des letzten Synthesezyklus des zweiten Syn thesedurchganges. Aus Fig. 7 ist ersichtlich, daß bis auf die vier am rechten und linken Rand gelegenen Synthesefelder 1 bis 4, 13 bis 16 in den mittleren Synthesefeldern 5 bis 12 Oligonukleotide mit acht Kettenbausteinen N1 bis N10, n4 bis n15 synthetisiert worden sind, wobei die bei dem ersten Synthesedurchgang synthetisierten drei Nukleotide N1 bis N10 blockweise einer natürlichen Grundtypreihe und die bei dem zweiten Synthesedurchgang verketteten fünf Nukleotide n4 bis n15 blockweise einer modifizierten Grundtypreihe zugeordnet sind.

Fig. 8 zeigt die Anordnung gemäß Fig. 7 nach Durchführen des letzten Synthesezyklus eines weiteren dritten Synthesedurchganges, bei dem als Kettenbausteine einer von dem vorangegangenen Synthesedurchgang verschiedenen Grundtypreihe wiederum zu den Basen B9 bis B17 komplementäre natürliche Nukleotide N9 bis N17 an die in den ersten beiden Synthesedurchgängen synthetisierten Oligonukleotide 21 verkettet worden sind. Bei dem dritten Synthesedurchgang wird eine Reaktionszelle 26 verwendet, mit deren Synthesebereich 27 zwei benachbarte Synthesefelder 1 bis 16 überdeckbar sind.

Bei einem ersten Synthesezyklus des dritten Synthesedurchganges wurde die Reaktionszelle 26 so positioniert, daß das in der Darstellung gemäß Fig. 8 von links gezählte fünfte Synthesefeld 5 als einziges Synthesefeld mit einer bei den vorangegangenen beiden Synthese durchgängen synthetisierten vollen Anzahl von acht Kettenbausteinen erstmalig überdeckt worden ist. Bei diesem ersten Synthesezyklus wurde ein Reaktionsfluid mit einem zu der neunten Base B9 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementären natürlichen Nukleotid N9 durch die Reaktionszelle 26 durchgeleitet.

Bei den weiteren Synthesezyklen des dritten Synthesedurchganges wurden nach Versetzen der Reaktionszelle 26 zum erstmaligen Überdecken des jeweils nächstbenachbarten Synthese feldes 6 bis 16 durch die Abfolge der Basen B10 bis B17 vorgegebene komplementäre natürliche Nukleotide N10 bis N17 enthaltende Reaktionsfluide durch die Reaktionszelle 26 durchgespült.

Wie aus Fig. 8 ersichtlich, sind nunmehr nach Abschluß des dritten Synthesedurchganges in den mittleren Synthesefeldern 5 bis 12 sequenzhomologe Oligonukleotide 21 mit einer Länge von zehn Kettenbausteinen synthetisiert, die jeweils zu einem Teil des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementär sind und aus einem Block von drei natürlichen Nukleotiden N1 bis N10, einem Block von fünf modifizierten Nukleotiden n4 bis n15 und einem weiteren Block von zwei natürlichen Nukleotiden N9 bis N17 aufgebaut sind. Jeder Block von natürlichen Nukleotiden N1 bis N10 beziehungsweise N9 bis N17 und von modifizierten Nukleotiden n4 bis n15 weist eine Länge auf, die der Anzahl von von den Synthesebereichen 23, 25, 27 der in den entsprechenden Synthesedurchgängen verwendeten Reaktionszellen 22, 24, 26 überdeckten Synthesefeldern 1 bis 16 entspricht.

Es versteht sich, daß in weiteren, nicht dargestellten Ausführungen längerkettige Kettenmoleküle durch Verwendung von größere Synthesebereiche aufweisenden Reaktionszellen unter Ausführung von eine größere Anzahl von Synthesezyklen aufweisenden mehreren Synthesedurchgängen als bei den voranstehend ausführlich erläuterten Ausführungsbeispielen synthetisierbar sind. Durch Vorsehen von Reaktionszellen mit unterschiedlich großen Synthesebereichen sind dabei vielfältige Variationen in der blockweisen Abfolge von Grundtypreihen erzielbar, wobei es zweckmäßig ist, daß bei rechteckig ausgebildeten Synthesebereichen die Querseiten der Reaktionszellen gleich groß und die Größe der Längsseiten einem ganzseitigen Vielfachen der durch einen Verschiebeweg in Durchgangsrichtung festgelegten Abmessung der Synthesefelder entsprechen und die Reak tionszellen in Längsrichtung um die entsprechende Abmessung der Synthesefelder versetzt werden.

Es versteht sich, daß auch mehr als zwei verschiedene Grundtypreihen in den verschiedenen Synthesedurchgängen vorgesehen werden können, so daß mit einer entsprechenden Anzahl von Synthesedurchgängen vielfältigste Variationen in der Abfolge von Grundtypreihen erreich bar sind.

Beispiele 1. Herstellung eines aktivierten Polypropylen-Trägermaterials

Eine zurechtgeschnittene Polypropylen-Folie (PP: Mobil 40MB400, 400 mm × 300 mm) wird in einer zylinderförmigen Glastrommel (Durchmesser: 170 mm, Länge: 400 mm) in eine Lösung (180 ml) von 0,9 g Chrom(VI)oxid (Fluka), gelöst in einer 1 : 1 Mischung von Essigsäureanhydrid: Essigsäure (Fluka), getaucht. Die Reaktionstrommel wird mit Hilfe einer mechanischen Rollvorrichtung 1 Std. schnell rotiert. Danach wird die Folie entnommen, für 30 Min. in ein Bad aus 1 M wässriger Essigsäure getaucht und anschliessend 30 Min. mit Methanol (Fluka) gespült. Die Folie wird im Hochvakuum getrocknet, wobei sie sich zum Schutz zwischen 2 Glasplatten befindet. Sodann wird die Folie in einem entsprechenden Glasbehälter in eine 1 M Lösung von BH₃ (Aldrich Chemical Co.) in Tetrahydrofuran (180 ml), die mit zusätzlichem Tetrahydrofuran auf 0.2 M verdünnt wird, getaucht. Das Glasgefäss wird 1 Std. schnell rotiert. Die Folie wird entfernt, in 1 M wässrige Essigsäure getaucht, in Methanol gespült und unter Vakuum getrocknet. Die so behandelte Folie wird ohne weitere Behandlung als Trägermaterial in einem erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt.

2. Automatisierte Vorrichtung zur erfindungsgemässen Herstellung eines Trägermaterials mit in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen

In Fig. 9 ist eine automatisierte Vorrichtung (sog. "Array-Maker") dargestellt, die zur Synthese eines erfindungsgemässen Trägermaterials mit in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen verwendet wird. Die Vorrichtung umfasst einen Zellen-Positionierautomaten oder Zellen-Positioniereinheit 36 und einen DNA-Synthetisierer (ABI 394/4) 31. Der DNA- Synthetisierer 31 ist mit dem Zellen-Positionierautomaten 36 über in der Zeichnung nicht dargestellte Schlauchverbindungen für die Reagenzien (insbesondere Reaktionslösungen, Spülflüssigkeiten und Spülgase) verbunden. Die Einlass-Schlauchverbindungen, die normalerweise verwendet werden, um die Reagenzien vom DNA-Synthetisierer den 4 Reaktionssäulen zuzuführen, die einen festen Träger umfassen und standardmässig zur Synthese von Oligonukleotiden vorgesehen sind, sind statt dessen mit den Einlassöffnungen von 4 Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 verbunden. Die Auslass-Schlauchverbindungen, die normalerweise den DNA-Synthetisierer mit den jeweiligen Auslassöffnungen der genannten 4 Reaktionssäulen verbinden, sind statt dessen mit den Auslassöffnungen der 4 Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 verbunden. Der Zellen-Positionierautomat 36 ist über eine nicht in der Zeichnung dargestellte Triggerleitung mit einer elektronischen Steuereinheit 37 verbunden, mit deren Hilfe ein Triggersignal ("advance fraction collector signal") für die jeweils nächste Zellenposition des Zellen-Positionierautomaten 36 vom DNA-Synthetisierer 31 auf den Zellen-Positionierautomaten 36 übertragen wird. Der Zellen-Positionierautomat 36 und der DNA-Synthetisierer 31 stehen auf einem stabilen Untergrund 38 unterhalb einer Abzugshaube 39 mit einer Rückwand 40. Der Zellen-Positionierautomaten 36 besitzt eine eigene Schutzhaube 41, die in der Zeichnung nur stückweise dargestellt ist, und die mit einer vertikalen Schiebetür versehen ist, die mit Hilfe eines Griffes 42 und über in der Zeichnung nicht dargestellte Zugseile, die mit einem in der Zeichnung nicht dargestellten Gegengewicht verbunden sind und über Rollen 43 umgelenkt werden, in eine angedeutete obere und eine ebenfalls angedeutete untere Lage bewegt werden kann. Die Rollen 43 sind über Bügel und Streben mit dem aus mehreren Profilrohren 44 bestehenden und auf dem Untergrund 38 abgestützten Profilgestell 45 verbunden. Der Zellen-Positionierautomat (36) wird über eine elektrisch betriebene Einheit 46, die, gesteuert über die Steuereinheit 37, eine Andruckplatte 47 vertikal stufenweise zwischen einer dargestellten oberen Position und einer angedeuteten unteren Position bewegt.

Die PP-Folie 49 ist auf der Andruckplatte 47 mit Hilfe von 5 vertikalen Metall-Haltestegen 48 mittels von am oberen und am unteren Ende der Haltestege befindlichen Schrauben befestigt. Ein dünnes Stück Gummi 90 (siehe Fig. 11) befindet sich zwischen der PP-Folie 49 und der Andruckplatte 47. Die Andruckplatte 47 wird vertikal zu vorprogrammierten Positionen bewegt. Die Reaktionszellen 32, 33, 34 und 35 sind horizontal nebeneinander auf einem Trägerbalken 50 einer Hubeinheit 51 montiert.

Die Hubeinheit 51 ist in Fig. 10 gesondert und vergössert dargestellt. Fig. 11 zeigt die Hubeinheit 51 in Draufsicht zusammen mit den Reaktionszellen 32, 33, 34 und 35 sowie mit der Andruckplatte 47. Die Hubeinheit 51 verfügt über eine linke Führung 52 sowie eine rechte Führung 53, die jeweils als Hohlzylinder ausgebildet sind. Durch die Führungen 52 und 53 erstreckt sich jeweils eine linke Druckstange 54 und eine rechte Druckstange 55. Beide Druckstangen 54, 55 sind mit Hilfe von in der Zeichnung nicht dargestellten, in den Führungen 52, 53 angeordneten Druckfedern so vorgespannt, dass die Reaktionszellen 32, 33, 34, 36 auf die Andruckplatte 47 aufgedrückt werden. Zum Abheben der Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 weg von der Andruckplatte 47 sind in der Zeichnung nicht dargestellte Exzenterscheiben vorge sehen, die mit den Stirnflächen 56 und 57 der Druckstangen 54, 55 zusammenwirken, um den Trägerbalken 50 und damit die Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 von der Andruckplatte 47 wegzubewegen. Die Exzenterscheiben werden mit Hilfe eines elektrischen Antriebs verstellt, der ebenfalls mit der Steuerelektronik 37 verbunden ist.

Die Druckstangen 53, 54 sind mit Hilfe von Rändelmuttern 58 lösbar mit dem Trägerbalken 50 verbunden. Auf diese Weise können die Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 zusammen mit dem Trägerbalken 50 abmontiert werden. Nach der Demontage des Trägerbalkens 50 ist es möglich, jede einzelne Reaktionszelle 32, 33, 34, 35 vom Trägerbalken 50 zu lösen und gegebenenfalls durch eine andere Reaktionszelle 32, 33, 34, 35 zu ersetzen.

Die Verbindung der Reaktionszelle 32 ist in Fig. 12 beispielsweise dargestellt. Die Reaktionszelle 32 ist an einem Zapfen 59 befestigt, der sich durch eine Bohrung 60 im Trägerbalken 50 erstreckt. Auf der von der Reaktionszelle 32 wegweisenden Seite des Trägerbalkens 50 ist der Zapfen 59 mit einem Gewinde versehen, auf das eine Rändelmutter 61 aufgeschraubt ist. Der Zapfen 59 mit der aufgeschraubten Rändelmutter 61 ist mit Hilfe einer Druckfeder 62 vorgespannt, so dass die Rändelmutter 61 gegen die Rückseite des Trägerbalkens 50 angedrückt ist. Die Druckfeder 62 ist wesentlich schwächer ausgelegt als die in den Führungen 52, 53 vorgesehenen Druckfedern, so dass bei einem Aufsetzen der Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 auf die Kunststoffolie 49 und die Andruckplatte 47 die Druckfeder 52 komprimiert wird und die Andruckkraft der Reaktionszelle 32, 33, 34, 35 festlegt. Die optimale Andruckkraft kann dabei durch Auswechseln der Druckfeder 62 schnell und einfach eingestellt werden. Für die in diesem Beispiel als Trägermaterial verwendete PP-Folie 40MB400 wird eine Druckfeder 62 mit 42N verwendet. Ausserdem sorgt die Druckfeder 62 für einen gleichmässigen Andruck der Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 gegen die Kunststoffolie 49 (siehe Fig. 11), welche entweder unmittelbar auf der Andruckplatte 47 oder unter Zwischenlegen einer Zwischenträgerfolie 90 (siehe Fig. 11) aus einem elastischen Material mit Hilfe der Haltestege 48 an der Andruckplatte 47 befestigt ist. Die vorzugsweise bis 1 mm starke Zwischenträgerfolie 90 (siehe Fig. 11) besteht zum Beispiel aus einer Polymerfolie aus Neoprene 60° Shore A oder Naturgummi (zum Beispiel Paragummi 40° Shore A), die beide von der Firma Richterich + Zeller AG, Basel, Schweiz vertrieben werden.

Der Aufbau der einseitig offenen Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 wird nachfolgend unter Bezug auf die Fig. 12 und 13 näher erläutert.

Wie man den Fig. 12 und 13 entnehmen kann, bestehen die Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 aus einem im Querschnitt rechteckigen Klotz aus einem verformbaren Material oder einem Kunststoff. In diesem Fall wird PTFE verwendet. Die zum Trägerbalken 50 weisende Rückseite 63 sowie die Aussenseiten 64, 65, 66, 67 und 68 sind jeweils eben. Auf der vom Trägerbalken 50 wegweisenden Oberseite 69 ist eine umlaufende Randleiste 70 vorgesehen, die einen flachen Raum 71 (entsprechend 19, 23, 25, 27 in Fig. 1 bis 8) einschliesst. Die Höhe dieses flachen Raumes 71 und die Höhe der Randleiste 70 betragen einen Millimeter. Die vier ein Rechteck umschreibenden Randleistenabschnitte sind jeweils 40 mm × 10 mm gross. Im Bereich der Ecken 72, 73, 74 und 75 laufen die Randleistenabschnitte bogenförmig, wobei der innere Radius etwa 0,5 Millimeter beträgt.

Zwischen den Ecken 72 und 75 bzw. 73 und 74 befinden sich rechtwinklig zur Oberseite verlaufende Bohrungen 76 und 77, die bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel ebenfalls einen Radius von 0,5 Millimeter aufweisen. Die Bohrung 76 mündet in einen Auslasskanal 78. Die untere Bohrung 77 mündet in einen Einlasskanal 79. Jeder Einlasskanal 79 und jeder Auslasskanal 78 der Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 ist über eine in der Zeichnung nicht dargestellte Schlauchverbindung mit dem Synthetisierer 1 verbunden.

3. Betrieb der Synthesevorrichtung

Im Betrieb der Vorrichtung wird der Trägerbalken 50 horizontal bewegt, um die Reaktionszellen 32-35 an die PP-Folie anzudrücken. Wenn ein elektrisches Signal vom Synthetisierer (advance fraction collector) empfangen wird, sendet die Steuereinheit 37 ein Signal an den Zellen- Positionierautomaten 36. Der Trägerbalken 50 wird daraufhin horizontal bewegt, um die Reaktionszellen 32-35 von der Oberfläche der PP-Folie zu entfernen. Die Andruckplatte 47 wird daraufhin vertikal in eine neue Position bewegt. Schliesslich wird der Trägerbalken 50 wiederum horizontal bewegt, und die Reaktionszellen 32-35 werden erneut an die Oberfläche der PP- Folie angedrückt.

Die Herstellung einer Anordnung von chimären Oligonukleotiden auf dem festen Trägermaterial umfasst folgende Schritte:

1. Eine wie in Beispiel 1 voraktivierte PP-Folie 49 wird im Zell-Positionierautomaten 36 unter Verwendung eines Gummistückes 90, um eine gute Abdichtung zu garantieren, befestigt.
2. Die vertikalen Haltestege 48 werden an vorgesehener Stelle befestigt, um sicherzustellen, dass die Folie 49 gut hält.
3. Die ausgewählten Reaktionszellen (zwischen 1 und 4) 32, 33, 34, 35, mit entsprechenden Druckfedern 62 werden am Trägerbalken 50, der am Zellen-Positionierautomaten installiert wird, befestigt.
4. Die ausgewählten Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 werden über Schlauchverbindungen mit den Einlässen und Auslässen des DNA-Synthetisierers verbunden.
5. Die Koordinaten der Startposition und die Länge des Verschiebungsweges werden in die Steuereinheit 37 einprogrammiert, die Andruckplatte 47 wird in die Startposition bewegt, und die Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 werden mit der PP-Folie 49 in Kontakt gebracht.
6. Der DNA-Synthetisierer wird so programmiert, dass die gewünschten Oligonukleotidsequenzen in der gewünschten Anordnung synthetisiert werden, und die Synthese beginnt.
7. Sobald gemäss dem Syntheseprotokoll (siehe unten) das sog. "advance fraction collector" Signal erzeugt wird, hebt die Hubeinheit 51 die Reaktionszellen von der Oberfläche der PP-Folie weg, bewegt sich die Andruckplatte vertikal um die gewählte Verschiebungslänge aufwärts, und bewegt die Hubeinheit 51 den Trägerbalken 50 vorwärts, wodurch der Kontakt zwischen den Reaktionszellen und der Folie hergestellt wird. Sodann wird mittels des DNA-Synthetisierers ein Reaktionszyklus durchgeführt, um einen ersten Baustein eines Oligonukleotides an der Oberfläche der Folie zu synthetisieren oder um eine Kettenverlängerungsreaktion eines Oligonukelotides durchzuführen.
8. Schritt 7 wird so oft wiederholt, wie für einen Synthesedurchgang notwendig ist.

4. Herstellung einer Anordnung von Oligonukleotiden auf einem Träger (sog. "scanning array"). die chimäre Olignukleotide mit einer Länge von 16 Nukleotidbausteinen umfasst

Die PP-Folie 49 wird, wie hierin beschrieben, vorbehandelt. Ein Bogen Naturgummi (Paragummi 40° Shore, Richterich & Zeller, Basel, Schweiz, 0,5 mm dick, 400 × 300 mm) 90 wird wie beschrieben verwendet. Wie oben beschrieben, werden 4 rechteckige Reaktionszellen 32, 33, 34, 35, aus Teflon verwendet, wobei jede Reaktionszelle von zwei Druckfedern 62 (42N) gehalten wird. Jede Reaktionszelle wird mit den Einlass- und Auslass-Schlauchverbindungen eines ABI 394/4 DNA-Synthetisierers (Perkin Elmer Corp., Foster City, CA, USA) verbunden. Die Startposition des Trägerbalkens wird auf 5 mm unterhalb der Oberkante der PP-Folie eingestellt. Als Länge des Verschiebungsweges der Reaktionszellen nach jedem Synthesezyklus werden 5 mm programmiert. Aufgrund der Länge der Reaktionszellen von 40 mm wird somit in einem Synthesedurchgang eine Anordnung von Oligonukleotiden erzeugt, die eine Maximallänge von 8 Bausteinen aufweisen.

Durch die im folgenden beschriebenen Reaktionsabläufe entsteht auf dem Trägermaterial eine Anordnung von chimären Oligonukleotiden (Gesamtlänge eines chimären Oligonukleotides: 16 Nukleotidbausteine, davon (i) Bausteine 1 bis 8: Desoxyribonukleoside, die über Phosphorothioatbrücken miteinander verknüpft sind, und (ii) Bausteine 9 bis 16:
2'-O-(2-Methoxyethyl)-Ribonukleoside, die über Phosphodiesterbrücken miteinander verknüpft sind). In Analogie zu dem oben in allgemeiner Form beschriebenen Vorgehen (Fig. 1 bis 3; chimäres Oligonukleotid mit einer Gesamtlänge von 8 Bausteinen, davon die ersten 4 als N1 bis N4 und die letzten 4 als n5 bis n8 bezeichnet), entsprechen die Nukleotide des in einem ersten Synthesedurchgang hergestellten, Bausteine 1 bis 8 umfassenden Teils der gewünschten Oligonukleotide den Nukleotiden N1 bis N8, während die Nukleotide des im zweiten Synthesedurchgang hergestellten, Bausteine 9 bis 16 umfassenden Teils der gewünschten Oligonukleotide analog als n10 bis n16 zu bezeichnen wären.

Die Vorratseinheit umfasst unter anderem 8 Flaschen mit Nukleosidbausteinen, wobei 4 Flaschen jeweils eines der vier Desoxyribonucleotide (entspricht Kettenbausteinen einer ersten Grundtypreihe) enthalten, und die 4 übrigen Flaschen jeweils eines der vier 2'-O-(2- Methoxyethyl)-Ribonukleoside (entspricht Kettenbausteinen einer zweiten Grundtypreihe) enthalten. Im folgenden werden bei der Synthese der jeweils 1. bis 8. Bausteine der Oligonukleotide die entsprechenden Flaschen mit den Bausteinen der ersten Grundtypreihe angesteuert, und zur Synthese der jeweils 9. bis 16. Bausteine werden die entsprechenden Flaschen mit den Bausteinen der zweiten Grundtypreihe angesteuert.

(i) Synthese der jeweils 1. bis 8. Bausteine einer Anordnung von Oligonukleotiden auf der PP- Folie (DNA-Bausteine verknüpft über Phosphorothioat-Brücken)
Die Synthese des DNA-Phosphorothioat-Teils der Oligonukleotide wird durchgeführt, indem der DNA-Synthetisierer so programmiert wird, dass eine der vier möglichen Reaktionszellen verwendet wird, beispielsweise Zelle 32, um die gewünschte Anordnung von Oligonukleotide zu erzeugen. Die drei übrigen Reaktionszellen, beispielsweise 33, 34 und 35 stehen zur freien Verfügung, um simultan auf derselben PP-Folie benachbarte Anordnungen von Oligonukleotiden zu synthetisieren, die anderen Zielsequenzen entsprechen. Als Nukleotidbausteine werden kommerziell erhältliche Phosphoramidite verwendet (Cruachem, A: 2081120-21; G: 208199-2; C: 208130-21; T: 208100-21). 2 g der Phosphoramidite werden von der Synthesemaschine mit 50 ml Acetonitril (MWG-Biotech) verdünnt. Bei der Synthese wird Tetrazol (Cruachem. 17112044) wie vom Hersteller bezogen verwendet; Trichloressigsäure in 1,1,1-Trichlorethan (2,5% Gew./Vol.) wird zur Detritylierung verwendet; Phenylacetyldisulfid (hergestellt gemäss S. 329 des Artikels von H.C.P.F. Roclen et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 110 (1991), S. 325-331) wird als 0,5 M Lösung in einem Gemisch von Acetonitril/3-Picolin (4 : 1) zur Oxidation verwendet. Die erste Base (vom 3'-Ende her) wird an der Startposition an die PP- Folie gekoppelt, und nachfolgende Basen werden zugefügt, indem sich die Reaktionszelle gemäss der entsprechend programmierten Steuereinheit vertikal abwärts bewegt.

Es wird eine Anordnung von Oligonukleotiden erzeugt, der die folgende Sequenz zugrundeliegt:
5'-GGC CTG AAG GTG CTG GAC AGT GTC TGA AAG TAG GGC ACT AGC CAA GTT GGA GCA GAA GGC-3' (SEQ ID NR 1).

In der dargestellten Form ist diese Sequenz komplementär zur Sequenz der Zielnukleinsäure. Diese Sequenz wird in den Synthetisierer einprogrammiert, wobei die Synthese von 3'- in 5'- Richtung erfolgt.

Bei dem im folgenden wiedergegebenen Syntheseprotokoll zur Kopplung eines Nukleotidbausteines an die Folie bzw. an eine Nukleotidkette (d. h. eines Synthesezyklus), handelt es sich um ein Protokoll der DNA-Synthetisiermaschine ABI 394/4, das an die spezifischen Gegebenheiten der Herstellung einer Anordnung von Oligonukleotiden auf einer PP-Folie angepasst worden ist. Das Protokoll wird in englischer Sprache wiedergegeben, da die Maschine in Englisch zu programmieren ist:

Dabei enthält in der Vorratseinheit Flasche 18 Acteonitril, Flasche 14 die Detritylierungslösung, Flasche 10 das Phenylacetyldisulfid-Reagenz und die Flasche B die jeweilige Phosphoramidit- Lösung.

Zur Kopplung der weiteren Bausteine wird das beschriebene Protokoll entsprechend oft wiederholt, bis die gewünschte Anordnung des ersten Teils von chimären Oligonukleotiden fertiggestellt ist, wobei der erste Teil, bezogen auf ein einzelnes Oligonukleotid, maximal jeweils die ersten 8 Bausteine umfasst, und wobei die Anordnung insgesamt die oben angegebene Sequenz umfasst.

(ii) Synthese der jeweils 9. bis 16. Bausteine einer Anordnung von Oligonukleotiden auf der PP- Folie (2'-O-(2-Methoxyethyl)-Ribonukleoside verknüpft über Phosphodiester-Brücken)
Die Reaktionszelle wird in die ursprüngliche Ausgangsposition zurückgesetzt. Der DNA- Synthetisierer wird so programmiert, dass für den 9. bis 16. Baustein 2'-O-(2-Methoxyethyl)- Ribonukleosid-Phosphoramidit-Bausteine (2 g) verwendet werden, die gemäss P. Martin, Helv. Chim. Acta 78 (1995), S. 486-504 hergestellt und in 50 ml Acetonitril gelöst werden. Das im weiteren Syntheseverlauf verwendete Tetrazole (Cruachem. No. 17112044) wird wie vom Hersteller bezogen verwendet. Zur Detrytilierung wird Trichloressigsäure in 1,1,1 Trichlorethan (2,5% w/v) verwendet. Zur Oxidation wird ein Gemisch von Jod/Lutidin/Wasser/Acetonitril verwendet (0.65 g (Fluka)/50 ml (Fluka)/2,5 ml/450 ml) verwendet. Das Syntheseprotokoll wird entsprechend der Verwendung der modifizierten Phosphoramidit-Bausteine abgeändert. Die erste Base (3'-Ende) in jeder Sequenz wird an der Ausgangsposition der Reaktionszelle an die PP-Folie gekoppelt. Dabei entspricht die Ausgangsposition der Startposition zu Beginn des ersten Synthesedurchganges (5 mm unterhalb der Oberkante der PP-Folie). Nachfolgende Basen werden zugefügt, während die Reaktionszelle vertikal auf der Trägerfolie entlang bewegt wird (Verschiebungslänge 5 mm). Der Syntheseabfolge liegt folgende Basenquenz zugrunde:
5'-ccc acc gag gcc tga agg tgc tgg aca gtg tct gaa agt agg gca cta gcc aag ttg cag-3' (SEQ ID NR 2).

Diese Sequenz wird in den Synthetisierer einprogrammiert; die Synthese erfolgt wiederum in 3'-5'-Richtung. Dabei entspricht die erste Base 'g' am 3'-Ende der SEQ ID No 2 der 9. Base "G" gezählt vom 3'-Ende der SEO ID NO 1, da die Maximallänge der im 1. Synthesedurchgang synthetisierten Oligonukleotide 8 Kettenbausteine beträgt.

Syntheseprotokoll der Synthesemaschine ABI 394/4 (modifiziert hinsichtlich der Herstellung der Oligonukleotid-Anordnung ("array"); das "advance fraction collector" - Signal wird verwendet zur Verschiebung der Reaktionszelle). Das Protokoll wird in englischer Sprache wiedergegeben, da die Maschine in Englisch zu programmieren ist:

Dabei enthält in der Vorratseinheit Flasche 18 Acteonitril, Flasche 14 die Detriylierungslösung, Flasche 15 das Oxidationsreagenz (I₂/Lutidin/H₂O) und Flasche B die jeweilige Phosphoramidit-Lösung.

Auf diese Weise erhält man schliesslich die gewünschte Anordnung ("scanning array") von chimären Oligonukleotiden auf dem Träger.

5. Entschützung der Oligonukleotide

Die PP-Folie wird wird aus der Vorrichtung genommen und in iso-Propanol gespült. Danach wird die Folie in 32% Ammoniak bei Raumtemperatur in einer Reaktionstrommel (siehe Beispiel 1) gewaschen. Man lässt die Kammer 16 Std. schnell rotieren, um ein gutes Vermischen der Reagenzien zu garantieren. Die Folie wird aus der Kammer genommen, mit Wasser und Methanol gespült und kurz unter Vakuum getrocknet. Die Folie mit der gewünschten Anordnung von chimären Oligonukleotiden kann nun in einem Standard- Hybridisierungsassay, wie oben erwähnt, eingesetzt werden.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern kom plementären Oligonukleotiden, bei dem in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen in einer Durchgangsrichtung wenigstens eine Reaktionszelle relativ zu dem Trägermaterial (17) mit teilweise überlappenden Synthesebereichen positioniert und für eine Kettenverlängerung vorgesehene Kettenbausteine einer Grundtypreihe durch die Reaktionszelle geleitet werden, so daß bei mehreren Synthesezyklen in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Synthesefeldern Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleicher Abfolge von Kettenbausteinen synthetisiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß nach einer Abfolge von Synthesezyklen in einem Synthesedurch gang wenigstens ein weiterer Synthesedurchgang mit Kettenbausteinen einer gegenüber dem vorangegangenen Synthesedurchgang unterschiedlichen Grundtypreihe durchgeführt wird, daß bei dem oder jedem weiteren Synthesedurchgang bei Synthese zyklen eines Synthesedurchganges eine in diesem Synthesedurchgang verwendete Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) in der gleichen Durchgangsrichtung wie bei dem voran gegangenen Synthesedurchgang so positioniert wird, daß der zugehörige Synthese bereich (19, 23, 25, 27) abschnittsweise mit einem in diesem Synthesedurchgang bislang unbedeckten Synthesefeld (1 bis 16) überlagert, in dem Kettenmoleküle (21) mit einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge vorliegen, und daß an dieser Kettenposition vorgesehene Kettenbausteine des zu synthetisierenden Kettenmoleküles der in diesem Synthesedurchgang verwende ten Grundtypreihe durch die Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) geleitet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem ersten Synthesezyklus des oder jedes weiteren Synthesedurchganges die oder jede bei diesem Synthese durchgang verwendete Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) so positioniert wird, daß ein einziges Synthesefeld (1 bis 16) mit Kettenmolekülen (21) einer in dem oder jedem vor an gegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlange von deren Synthesebereich (19, 23, 25, 27) überlagert wird, und daß bei jedem weiteren Synthese zyklus ein weiteres benachbartes Synthesefeld (3 bis 16) mit einer in dem oder jedem vor angegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge erstmalig von dem Synthesebereich (19, 23, 25, 27) überlagert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei jedem Synthesedurchgang die oder jede Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) bei jedem Synthesezyklus um den gleichen Verschiebeweg versetzt wird, so daß die Synthesefelder (1 bis 16) gleich groß sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei wenigstens zwei Synthesedurchgängen die Synthesebereiche (23, 25, 27) der jeweils verwendeten Reaktionszellen (22, 24, 26) verschieden groß sind, wobei jeder Synthesebereich (23, 25, 27) in einer Richtung einem Vielfachen der Abmessungen der Synthesefelder (1 bis 16) in dieser Richtung entspricht.

5. Vorrichtung insbesondere zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern komplementären Oligonukleotiden, insbesondere zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit einem Trägermaterialhalter, auf den das Träger material (17) aufbringbar ist, mit einer Vorratseinheit, mit wenigstens einer an die Vorratseinheit angeschlossenen Reaktionszelle, durch die bei abdichtendem Auflegen der oder jeder Reaktionszelle auf das Trägermaterial (17) für eine Kettenverlängerung vorgesehene Kettenbausteine unter Kontakt mit dem Trägermaterial (17) in einem Synthesebereich durchleitbar sind, mit einer Positioniereinheit, mit der die oder jede Reak tionszelle in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen jeweils um einen Verschiebeweg relativ zu dem Trägermaterial (17) mit teilweise in Synthesefeldern überlappenden Synthesebereichen positionierbar ist, und mit einer Steuereinheit zum Steuern der Vorratseinheit und der Positioniereinheit, so daß bei mehreren Synthesezyklen in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Synthesefeldern Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleichen Abfolgen von Ketten bausteinen synthetisierbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß in der Vorratseinheit Kettenbausteine (N1 bis N17, n4 bis n15) wenigstens zweier verschiedener Grundtypreihen bevorratet sind, daß mit der Steuereinheit die oder jede Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) bei wenigstens zwei Synthesedurchgängen in jeweils gleichen Durchgangsrichtungen so positionierbar ist, daß bei Synthesezyklen eines Synthese durchganges der zugehörige Synthesebereich (19, 23, 25, 27) abschnittsweise mit einem in diesem Synthesedurchgang bislang unbedeckten Synthesefeld (1 bis 16) überlagert, in dem Kettenmoleküle (21) mit einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurch gang synthetisierten maximalen Kettenlänge vorliegen, und daß von der Steuereinheit ge steuert bei zwei aufeinanderfolgenden Synthesedurchgängen Kettenbausteine (N1 bis N17, n4 bis 15) verschiedener Grundtypreihen durch die oder jede Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) durchleitbar sind.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die oder jede Reaktionszeile (18, 22, 24, 26) einen rechteckigen Synthesebereich (19, 23, 25, 27) aufweist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Längsabmessungen jedes Synthesebereiches (19, 23, 25, 27) einer Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) einem ganzzahligen Vielfachen der durch jeweils gleiche Verschiebewege in allen Synthesedurchgängen festgelegten Größe der Synthesefelder (1 bis 16) in Längsrichtung der Synthesebereiche (19, 23, 25, 27) entspricht.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in ver schiedenen Synthesedurchgängen verwendete Reaktionszellen (22, 24, 26) verschieden große Synthesebereiche (23, 25, 27) aufweisen.

9. Verwendung einer in Anspruch 5 definierten Vorrichtung zur Herstellung eines Trägermaterials umfassend eine Anordnung von in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern komple mentären Oligonukleotiden, wobei benachbarte Synthesefelder Kettenmoleküle mit abschnittseise gleicher Abfolge von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen umfassen.

10. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die oder jede Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) einen rechteckigen Synthesebereich (19, 23, 25, 27) aufweist.

11. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Längsabmessungen jedes Synthesebereiches (19, 23, 25, 27) einer Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) einem ganzzahligen Vielfachen der durch jeweils gleiche Verschiebewege in allen Synthesedurchgängen festgelegten Größe der Synthesefelder (1 bis 16) in Längs richtung der Synthesebereiche (19, 23, 25, 27) entspricht.

12. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in verschiedenen Synthesedurchgängen verwendete Reaktionszellen (22, 24, 26) verschieden große Synthesebereiche (23, 25, 27) aufweisen.

13. Trägermaterial, aufweisend eine Anordnung von in Synthesefeldern synthetisierten Ketten molekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern komplementären Oligonukleotiden, wobei benachbarte Synthesefelder Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleicher Abfolge von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen umfassen.

14. Trägermaterial, aufweisend eine Anordnung von in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern kom plementären Oligonukleotiden, herstellbar nach einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4.