DE19819476C1 - Polypeptide with immunogenic properties and modified biological functions of a protein - Google Patents
Polypeptide with immunogenic properties and modified biological functions of a proteinInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid mit immunogenen und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins, wobei das Polypeptid Abschnitte des Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist. Ferner betrifft die Erfindung eine ein solches Polypeptid kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Polypeptids. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Polypeptids zur aktiven Immunisierung sowie gegen das Polypeptid gerichtete Antikörper.The present invention relates to a polypeptide with immunogenic and modified biological functions of a protein, the polypeptide having sections of the protein of approximately 10-40 amino acids in an arrangement that is changed to the protein. The invention further relates to a DNA encoding such a polypeptide and to a method for producing such a polypeptide. The invention further relates to the use of the DNA and the polypeptide for active immunization and antibodies directed against the polypeptide.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, das immunogene Eigenschaften und veränderte biologische Funktionen eines Proteins aufweist, eine ein solches Polypeptid kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Polypeptids. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Polypeptids zur aktiven Immunisierung sowie gegen das Polypeptid gerichtete Antikörper.The present invention relates to a polypeptide which immunogenic properties and altered biological functions of a protein encoding such a polypeptide DNA and a method of making such a polypeptide. The invention further relates to the use of the DNA and the Polypeptide for active immunization as well as against the polypeptide targeted antibodies.
Bei aktiver Immunisierung eines Tieres bzw. Menschen wird vielfach ein Protein als Immunogen verabreicht, gegen das dann Antikörper bzw. zytotoxische T-Zellen induziert werden. Jüngste Versuche des Anmelders weisen darauf hin, daß ein solches Protein sehr lange im Körper des Tieres bzw. Menschen verweilen kann. Dies gilt insbesondere, wenn das Protein in Form eines es kodierenden Expressionsplasmids verabreicht wird. Somit ist das Tier bzw. der Mensch lange den biologischen Funktionen des Proteins, die z. B. toxisch oder transformierend sein können, ausgesetzt. Dies führt zu erheblichen Belastungen des Tieres bzw. Menschen, deren Folgen überhaupt nicht absehbar sind.With active immunization of an animal or human being often administered a protein as an immunogen against which Antibodies or cytotoxic T cells can be induced. Youngest Attempts by the applicant indicate that such Protein stays in the animal's or human body for a very long time can. This is especially true if the protein is in the form of an it coding expression plasmid is administered. So that's it Animal or man long the biological functions of Proteins, e.g. B. can be toxic or transforming, exposed. This leads to considerable stress on the animal or people whose consequences are not foreseeable at all.
Aus der EP 0 344 940 A2 ist ein Polyeptid mit etwa 5-50 Aminosäuren bekannt, das einen Abschnitt eines latenten Papillom-Virus-Proteins darstellt. Das Polypeptid kann sich in seiner Aminosäuresequenz von jener des entsprechenden Abschnitts des Proteins durch Insertionen, Deletionen und Substitutionen von Aminosäuren unterscheiden.From EP 0 344 940 A2 is a polyeptide with about 5-50 Amino acids known to be a section of a latent Represents papilloma virus protein. The polypeptide can be in its amino acid sequence from that of the corresponding section of the protein through insertions, deletions and substitutions differentiate from amino acids.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem eine aktive Immunisierung ohne die vorstehenden Nachteile durchgeführt werden kann.The present invention is based on the object Provide means with which an active immunization without the above disadvantages can be performed.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht. According to the invention this is the subject of the Claims achieved.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit ein Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins und eine für ein solches Polypeptid kodierende DNA. Diese Mittel erlauben eine aktive Immunisierung, ohne daß das Tier bzw. der Mensch zumindest in vollem Umfang den biologischen Funktionen des Proteins ausgesetzt ist. The present invention thus relates to a polypeptide with immunogenic properties and modified biological Functions of a protein and one for such a polypeptide coding DNA. These agents allow active immunization without the animal or human being at least in full biological functions of the protein is exposed.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß ein Polypeptid, das Abschnitte eines Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist, zwar eine mit dem Protein ver gleichbare Immunogenität besitzt, jedoch Veränderungen in den biologischen Funktionen des Proteins aufweist, wobei diese sogar gänzlich fehlen können. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß es für die Immunogenität eines solchen Polypeptids günstig ist, wenn es Teile von etwa 10-20 Aminosäuren enthält, die im Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen. Ein Polypeptid, das Abschnitte des HPV16-E7 Proteins in einer zum E7-Protein ver änderten Anordnung und weitere im E7-Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegende Teile enthält, ist in Fig. 1 angegeben.The present invention is based on the knowledge of the applicant that a polypeptide which has sections of a protein of about 10-40 amino acids in an arrangement changed to the protein has an immunogenicity comparable to that of the protein, but changes in the biological functions of the protein has, which may even be missing entirely. The applicant has further recognized that it is favorable for the immunogenicity of such a polypeptide if it contains parts of about 10-20 amino acids which are present in the protein as transitions between the individual sections. A polypeptide which contains sections of the HPV16-E7 protein in an arrangement changed to the E7 protein and further parts present in the E7 protein as transitions between the individual sections is indicated in FIG. 1.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein Polypep tid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins bereitzustellen, wobei das Polypeptid Abschnitte des Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist.According to the invention, the knowledge of the applicant is used, a polypep tid with immunogenic properties and modified biological functions of a protein, wherein the polypeptide comprises portions of the protein of has about 10-40 amino acids in an arrangement changed to the protein.
Der Ausdruck "Protein" umfaßt jegliches Protein, das immunogene Eigenschaf ten, z. B. die Fähigkeit zur Induktion von gegen das Protein gerichteten Antikör pern bzw. zytotoxischen T-Zellen, und biologische Funktionen aufweisen kann. Beispiele eines solchen Proteins sind toxische oder transformierende Proteine. Erstere können bakterielle Toxine oder virale Proteine sein, die bei persistieren den Infektionen exprimiert werden. Ein Beispiel solcher viraler Proteine ist HIV- Tat. Transformierende Proteine können zellulären Ursprungs sein, z. B. ein Mela nom-spezifisches Antigen (MAGE). Ferner können sie von Viren, z. B. humanpa thogenen Papillom-Viren (HPV), wie HPV 16 oder 18, stammen. Als Proteine solcher Viren sind insbesondere die Proteine E6 und E7 zu nennen.The term "protein" encompasses any protein, the immunogenic property ten, e.g. B. the ability to induce antibody directed against the protein pern or cytotoxic T cells, and can have biological functions. Examples of such a protein are toxic or transforming proteins. The former can be bacterial toxins or viral proteins that persist in the infections are expressed. An example of such viral proteins is HIV Did. Transforming proteins can be of cellular origin, e.g. B. a Mela nom-specific antigen (MAGE). They can also be infected by viruses, e.g. B. humanpa thogenic papilloma viruses (HPV), such as HPV 16 or 18. As proteins Such viruses include the proteins E6 and E7.
Der Ausdruck "Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins" umfaßt jegliches Polypeptid, das eine bis alle immunogenen Eigenschaften eines Proteins aufweisen kann, wobei eine bis alle biologischen Funktionen des Proteins verändert, insbesondere ausge schaltet, sein können. Ein solches Polypeptid weist Abschnitte des Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren, insbesondere 20-30 Aminosäuren, in einer zum Protein veränderten Anordnung auf. Günstig kann es sein, wenn sich die Ab schnitte von den entsprechenden Abschnitten im Protein durch eine oder mehre re Aminosäuren unterscheiden. Dies können z. B. Aminosäuren sein, die für die Herstellung des Polypeptids und/oder die Immunogenität der Abschnitte förder lich sind. Ferner kann es günstig sein, wenn das Polypeptid auch Teile von etwa 10-20 Aminosäuren, insbesondere 18-20 Aminosäuren, enthält, die im Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen. Solche Teile können an beliebiger Stelle des Polypeptids, insbesondere am N- und/oder C- Terminus, einzeln oder in einer Gesamtheit vorliegen.The expression "polypeptide with immunogenic properties and altered biological functions of a protein "includes any polypeptide that is a until can have all immunogenic properties of a protein, one until all biological functions of the protein are changed, especially out switches, can be. Such a polypeptide has portions of the protein from about 10-40 amino acids, especially 20-30 amino acids, in one to Protein changed arrangement. It can be favorable if the Ab cut from the corresponding sections in the protein through one or more re distinguish amino acids. This can e.g. B. be amino acids for the Production of the polypeptide and / or promote the immunogenicity of the sections are. Furthermore, it may be favorable if the polypeptide also contains parts of approximately Contains 10-20 amino acids, especially 18-20 amino acids, in the protein as transitions between the individual sections. Such parts can be anywhere on the polypeptide, especially on the N- and / or C- Terminus, individually or as a whole.
Ein bevorzugtes Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfaßt die in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz. Ein solches Polypeptid umfaßt Abschnitte des E7-Proteins von HPV 16 in einer zum Protein veränderten Anordnung und Teile des E7-Proteins, die in diesem als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen.A preferred polypeptide of the present invention comprises the amino acid sequence indicated in FIG. 1 or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids. Such a polypeptide comprises sections of the E7 protein from HPV 16 in an arrangement which has been changed to the protein and parts of the E7 protein which are present therein as transitions between the individual sections.
Der Ausdruck "eine durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz" weist darauf hin, daß die dieser Aminosäuresequenz zugrundeliegende DNA-Sequenz mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert. Die DNA- Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 1 durch Additionen, Substitutionen, Deletionen und/oder Inversionen von einem oder mehreren Basenpaaren unter scheiden. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist darauf hin, daß diese unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA-Sequenz erfolgt.The expression “an amino acid sequence different from one or more amino acids” indicates that the DNA sequence on which this amino acid sequence is based hybridizes with the DNA of FIG. 1. The DNA sequence can differ from the DNA of FIG. 1 by additions, substitutions, deletions and / or inversions of one or more base pairs. The term "hybridization" indicates that this takes place under usual conditions, in particular at 20 ° C. below the melting point of the DNA sequence.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine für ein vorstehendes
Polypeptid kodierende Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein.
Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
Another object of the present invention is a nucleic acid coding for a polypeptide above. This can be an RNA or a DNA. A DNA is preferred which comprises the following:
- a) Die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, odera) The DNA of FIG. 1 or a DNA different therefrom by one or more base pairs, or
- b) eine über den degenerierten Code mit der DNA von (a) verwandte DNA.b) a DNA related to the DNA of (a) via the degenerate code.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA" weist darauf hin, daß diese DNA mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert. Erstere DNA kann sich von der DNA von Fig. 1 durch Additionen, Substitutionen, Deletionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unter scheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung" wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen.The expression "a DNA different by one or more base pairs" indicates that this DNA hybridizes with the DNA of FIG. 1. The former DNA can differ from the DNA of FIG. 1 by additions, substitutions, deletions and / or inversions of one or more base pairs. With regard to the expression “hybridization”, reference is made to the above statements.
Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in einem Vektor, insbesondere einem Expressionsvektor, vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E.coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b, Bluscript und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tieri schen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressions vektor pAcSGHisNT-A.A DNA according to the invention can be used as such or in a vector, in particular an expression vector. Examples of these are known to the person skilled in the art known. In the case of an expression vector for E. coli, these are e.g. B. pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b, Bluscript and pQE-8. For expression in yeast are z. B. to call pY100 and Ycpad1, while for expression in tieri rule cells z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 are to be specified. For the Expression in insect cells is particularly suitable for baculovirus expressions vector pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG 13009, wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9 oder Hi5.The person skilled in the art knows suitable cells in order to make one according to the invention in one Expression vector to express existing DNA. Examples of such cells include the E. coli strains HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 and SG 13009, the latter being preferred, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa as well as the insect cells sf9 or Hi5.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Polypeptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusionspolypep tids exprimiert werden kann.The person skilled in the art knows how a DNA according to the invention is converted into a Expression vector must be inserted. He also knows that this DNA in conjunction with a DNA encoding another polypeptide can be, so that the DNA of the invention in the form of a fusion polypep tids can be expressed.
Ferner kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungs gemäße DNA exprimierte Polypeptid zu isolieren und zu reinigen.Furthermore, the person skilled in the art knows conditions, transformed or transfected cells to cultivate. Also known to him are the methods by the invention isolate and purify appropriate DNA expressed polypeptide.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen des Polypeptid bzw. Fusionspolypeptid gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklo nalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.Another object of the present invention is a protrude of the polypeptide or fusion polypeptide directed antibody. Such a Antibody can be produced by conventional methods. It can be polyclonal or be monoclonal. It is cheap to make it, especially animals Rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclonal len antibodies, with an above (fusion) protein or fragments thereof to immunize. Further "boosters" of the animals can be used with the same (Fu sions) protein or fragments thereof. The polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals. For the monoclo The animal's spleen cells are fused with myeloma cells.
Des weiteren kann eine erfindungsgemäße DNA direkt in Tieren bzw. dem Men schen exprimiert werden. Die erfindungsgemäße DNA kann hierzu in Expres sionsvektoren vorliegen, die von Plasmid- und/oder Virusvektoren abgeleitet sind. Beispiele von Virusvektoren umfassen AAV-, Adenovirus und Vacciniavi rus-Vektoren. Der Fachmann kennt Verfahren, eine erfindungsgemäße DNA in Tiere bzw. den Menschen einzuführen und zu exprimieren.Furthermore, a DNA according to the invention can be found directly in animals or in men be expressed. For this purpose, the DNA according to the invention can be found in Expres Sions vectors are present, which are derived from plasmid and / or virus vectors are. Examples of virus vectors include AAV, adenovirus and vacciniavi Rus vectors. Those skilled in the art are familiar with methods of DNA in the invention Introduce and express animals or humans.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vakzinierungsmittel,
umfassend:
Another object of the present invention is a vaccination agent comprising:
- a) Ein erfindungsgemäßes Polypeptid, und/odera) A polypeptide according to the invention, and / or
- b) eine erfindungsgemäße DNA, sowieb) a DNA according to the invention, and
- c) übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel und Träger.c) usual auxiliaries, such as buffers, solvents and carriers.
Ein solches Vakzinierungsmittel eignet sich zur aktiven Immunisierung, z. B. gegen HPV. Enthält das Vakzinierungsmittel anstelle von (a) und/oder (b) einen erfindungsgemäßen Antikörper (c), so eignet es sich zur passiven Immunisie rung, z. B. gegen HPV.Such a vaccine is suitable for active immunization, e.g. B. against HPV. Does the vaccine contain one instead of (a) and / or (b) Antibodies (c) according to the invention are suitable for passive immunization tion, e.g. B. against HPV.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, umfassend:
Another object of the present invention is a kit comprising:
- a) Ein erfindungsgemäßes Polypeptid,a) a polypeptide according to the invention,
- b) eine erfindungsgemäße DNA und/oderb) a DNA according to the invention and / or
- c) einen erfindungsgemäßen Antikörper, sowiec) an antibody according to the invention, and
- d) übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel, Träger und Kontrollen.d) usual auxiliaries, such as buffers, solvents, carriers and controls.
Von den einzelnen Komponenten des Vakzinierungsmittels bzw. des Kits können jeweils ein oder mehrere Vertreter vorliegen.Of the individual components of the vaccine or kit one or more representatives are present.
Die vorliegende Erfindung stellt Polypeptide bereit, die immunogene Eigenschaf ten und veränderte, insbesondere ausgeschaltete, biologische Funktionen eines Proteins aufweisen. Ferner stellt die vorliegende Erfindung DNAs bereit, die für solche Polypeptide kodieren. Mit diesen Mitteln können Tiere bzw. der Mensch aktiv immunisiert werden. Insbesondere kann durch die DNAs eine hohe Effizienz bei der Induktion von gegen das Protein gerichteten Antikörpern und vor allem von zytotoxischen T-Zellen erreicht werden. Ferner zeichnen sich die Mittel da durch aus, daß die immunisierten Tiere bzw. der Mensch nicht den Belastungen ausgesetzt sind, die bei herkömmlichen aktiven Immunisierungen auftreten. Des weiteren werden durch die erfindungsgemäßen Antikörper Mittel bereitgestellt, mit denen die aktive Immunisierung und deren Verlauf überwacht werden können. Gleichzeitig stellen die Antikörper auch Mittel dar, die für eine passive Immunisierung eingesetzt werden können. Somit stellt die vorliegende Erfindung einen großen Beitrag für die Entwicklung moderner Verfahren in der Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen dar.The present invention provides polypeptides that have immunogenic properties and changed, in particular deactivated, biological functions of a Have protein. The present invention further provides DNAs useful for encode such polypeptides. With these means animals or humans can be actively immunized. In particular, the DNAs can be highly efficient in the induction of antibodies directed against the protein and above all can be achieved by cytotoxic T cells. The funds are also there by the fact that the immunized animals or humans are not exposed to the loads exposed to conventional active immunizations. Of further means are provided by the antibodies according to the invention, with which the active immunization and its course are monitored can. At the same time, the antibodies also represent agents that are passive Immunization can be used. Thus, the present invention a major contribution to the development of modern prophylaxis procedures and therapy of diseases.
Fig. 1 zeigt die Basensequenz (b) und die davon abgeleitete Aminosäure sequenz (a) eines erfindungsgemäßen, HPV16-E7 Abschnitte auf weisenden Polypeptids. Die Abschnitte a, b, c und d des natürli chen HPV16-Proteins sind angegeben. Ebenso sind die Übergänge a/b, b/c und c/d angegeben. Unterstrichene Sequenzen stellen zusätzliche Aminosäuren aufgrund der eingeführten Spaltstellen für Restriktionsenzyme dar. Fig. 1 shows the base sequence (b) and the amino acid sequence (a) derived therefrom of a HPV16-E7 sections according to the invention pointing polypeptide. Sections a, b, c and d of the natural HPV16 protein are indicated. The transitions a / b, b / c and c / d are also given. Underlined sequences represent additional amino acids due to the introduced restriction enzyme cleavage sites.
Fig. 2 zeigt die Basensequenz (b) und die davon abgeleitete Aminosäure sequenz (a) des natürlichen HPV16-E7 Proteins. Die Abschnitte a, b, c und d sind angegeben. Diese werden durch abwärts gerichtete Pfeile voneinander getrennt. Ebenso sind die Übergänge a/b, b/c und c/d angegeben. Diese werden durch aufwärts gerichtete Pfeile verdeutlicht. Fig. 2 shows the base sequence (b) and the derived amino acid sequence (a) of the natural HPV16-E7 protein. Sections a, b, c and d are given. These are separated from each other by arrows pointing downwards. The transitions a / b, b / c and c / d are also given. These are illustrated by arrows pointing upwards.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.The present invention is illustrated by the following examples.
Eine für das E7-Protein (98 Aminosäuren) von HPV 16 kodierende DNA umfaßt die in Fig. 2 angegebenen 297 Basenpaare plus Stopcodon TAA. Diese DNA wurde in vier Teile (a-d) zerlegt: 1-30 (a), 31-120 (b), 121-210 (c) und 211-294 (d; ohne Stopcodon). Zusätzlich wurden die Übergänge a/b (10-60), b/c (100- 144) und c/d (190-231; plus Stopcodon) synthetisiert.A DNA coding for the E7 protein (98 amino acids) of HPV 16 comprises the 297 base pairs indicated in FIG. 2 plus the stop codon TAA. This DNA was broken down into four parts (ad): 1-30 (a), 31-120 (b), 121-210 (c) and 211-294 (d; without stop codon). In addition, the transitions a / b (10-60), b / c (100- 144) and c / d (190-231; plus stop codon) were synthesized.
-
1. Die Fragmente a und d wurden durch PCR zusammengesetzt; 5' zu a
wurde eine HindIII Spaltstelle und 3' von d eine EcoRI Spaltstelle (jeweils
mit 6 bp Spacer zur besseren Spaltbarkeit) eingesetzt. Im einzelnen wurde
wie folgt vorgegangen:
Aus der DNA von Fig. 2 wurde durch die Primer II und III folgende Se quenz hergestellt:
(II/III): 5'-21 → 30/211 → 294/EcoRI - Spacer-3' (106 bp)
Dieses Fragment wurde nach Gelektrophorese isoliert und mit Hilfe der Primer I und III verlängert, so daß die Sequenz (I/II/III)
5'-Spacer - HindIII/1 → 30/211 → 294/EcoRI - Spacer-3' (138 bp)
erhalten wurde.
Primer:
1. Fragments a and d were assembled by PCR; A HindIII cleavage site was inserted 5 'to a and an EcoRI cleavage site was inserted 3' to d (each with 6 bp spacer for better cleavage). The procedure was as follows:
The following sequence was prepared from the DNA of FIG. 2 by primers II and III:
(II / III): 5'-21 → 30/211 → 294 / EcoRI - Spacer-3 '(106 bp)
This fragment was isolated after gel electrophoresis and extended using primers I and III so that the sequence (I / II / III)
5'-spacer - HindIII / 1 → 30/211 → 294 / EcoRI - spacer-3 '(138 bp)
was obtained.
Primer:
-
2. Die Fragmente c und b wurden durch PCR zusammengesetzt; 5' zu c
wurde eine EcoRI Spaltstelle und 3' zu b wurde eine BamHI Spaltstelle
(jeweils mit 6 bp Spacer) eingesetzt. In einzelnen wurde wie folgt vor
gegangen:
Aus der DNA von Fig. 2 wurden durch die Primerpaare IV-V und VI-VII folgende Sequenzen hergestellt:
(IV/V): 5'-Spacer- EcoRI/121 → 210/31 → 40-3' (112 bp)
(VI/VII): 5'-201 → 210/31 → 120 - BamHI - Spacer-3' (112 bp)
Diese Fragmente wurden nach Gelektrophorese isoliert und mit Hilfe der Primer IV und VII verlängert, so daß die Sequenz (IV/V/VI/VII)
5'-Spacer - EcoRI/121 → 210/31 → 120 - BamHI - Spacer-3' (204 bp)
erhalten wurde.
Primer:
2. Fragments c and b were assembled by PCR; An EcoRI cleavage site was used 5 'to c and a BamHI cleavage site (each with 6 bp spacer) was used 3' to b. The individual procedure was as follows:
The following sequences were produced from the DNA of FIG. 2 by the primer pairs IV-V and VI-VII:
(IV / V): 5'-spacer EcoRI / 121 → 210/31 → 40-3 '(112 bp)
(VI / VII): 5'-201 → 210/31 → 120 - BamHI - Spacer-3 '(112 bp)
These fragments were isolated after gel electrophoresis and extended using primers IV and VII so that the sequence (IV / V / VI / VII)
5'-spacer - EcoRI / 121 → 210/31 → 120 - BamHI - spacer-3 '(204 bp)
was obtained.
Primer:
-
3. Die Fragmente ad und cb wurden mit EcoRI gespalten und durch Ligation
zusammengesetzt. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen:
Die unter 2. und 3. erhaltenen Sequenzen (I/II/III) und (IV/V/VI/VII) wurden durch Geleelektrophorese isoliert, durch EcoRI gespalten und ligiert. Dadurch wurde die Sequenz 5'-Spacer-HindIII/1 → 30/211 → 294/EcoRI/121 → 210/31 → 120 - BamHI - Spacer-3' (318 bp) erhalten, die nach Spaltung mit HindIII und BamHI in dem Vektor Bluescript kloniert wurde.3. The fragments ad and cb were digested with EcoRI and assembled by ligation. The procedure was as follows:
The sequences (I / II / III) and (IV / V / VI / VII) obtained under 2. and 3. were isolated by gel electrophoresis, cleaved by EcoRI and ligated. The sequence 5'-spacer HindIII / 1 → 30/211 → 294 / EcoRI / 121 → 210/31 → 120 - BamHI - spacer-3 '(318 bp) was obtained, which after cleavage with HindIII and BamHI in the Vector bluescript was cloned. -
4. Die Übergänge a/b, b/c und c/d wurden durch PCR zusammengesetzt,
wobei 5' von a/b eine BamHI Spaltstelle und 3' von c/d eine Xbal Spalt
stelle eingesetzt wurden. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen:
Aus der DNA von Fig. 2 wurden durch die Primerpaare VIII-IX, X-XI und XII-XIII folgende Sequenzen hergestellt:
Die entsprechenden Fragmente wurden nach Gelektrophorese isoliert.
Die Fragmente (VIII/IX) und X/XI wurden mit Hilfe der Primer VIII und XI verbunden, so daß die Sequenz 5'-Spacer - BamHI - 7 → 54/97 → 144/187 → 198-3' (117 bp) entstand. Dieses Fragment wurde zusam men mit dem Fragment (XII/XIII) mit Hilfe der Primer VIII und XIII ver bunden, so daß die Sequenz 5'-Spacer - BamHI - 7 → 54/97 → 144/187 234 → - Stop - Xbal - Spacer-3' (171 bp) entstand.
Diese Sequenz wurde nach Spaltung mit BamHI und Xbal in dem Vektor Bluescript kloniert.
Primer:
4. The transitions a / b, b / c and c / d were assembled by PCR, 5 'of a / b using a BamHI cleavage site and 3' of c / d an Xbal cleavage site. The procedure was as follows:
The following sequences were produced from the DNA of FIG. 2 by means of the primer pairs VIII-IX, X-XI and XII-XIII:
The corresponding fragments were isolated after gel electrophoresis.
The fragments (VIII / IX) and X / XI were linked using primers VIII and XI so that the sequence 5'-spacer - BamHI - 7 → 54/97 → 144/187 → 198-3 '(117 bp) originated. This fragment was joined together with the fragment (XII / XIII) using primers VIII and XIII, so that the sequence 5'-spacer - BamHI - 7 → 54/97 → 144/187 234 → - Stop - Xbal - Spacer-3 '(171 bp) was created.
This sequence was cloned in the vector Bluescript after cleavage with BamHI and Xbal.
Primer:
-
5. Die Fragmente HindIII - a - d - EcoRI - c - b - BamHI und BamHI - a/b - b/c
- c/d - Xbal wurden mit BamHI gespalten und durch Ligation zusammen
gesetzt. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen:
Die in 3. und 4. beschriebenen Sequenzen wurden mit BamHI gespalten und ligiert, so daß folgende Sequenz erhalten wurde:
5'-Spacer-HindIII/1 → 30/211 → 294/EcoRI/121 → 210/31 → 120 - BamHI - 7 → 54/97 → 144/187 → 234 - Stop - Xbal - Spacer-3' (477 bp) (vgl. Fig. 1). Diese Sequenz wurde mit HindIII und Xbal gespalten und in dem Vektor Bluescript kloniert.5. The fragments HindIII-a-d-EcoRI-c-b-BamHI and BamHI-a / b-b / c-c / d-Xbal were cleaved with BamHI and put together by ligation. The procedure was as follows:
The sequences described in 3rd and 4th were cleaved and ligated with BamHI so that the following sequence was obtained:
5'-Spacer-HindIII / 1 → 30/211 → 294 / EcoRI / 121 → 210/31 → 120 - BamHI - 7 → 54/97 → 144/187 → 234 - Stop - Xbal - Spacer-3 '(477 bp ) (see Fig. 1). This sequence was digested with HindIII and Xbal and cloned in the vector bluescript.
Die unter 5. von Beispiel 1 erhaltende DNA wurde in den mit HindIII und Xbal gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wurde das Expres sionsplasmid pQE-8/E7 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen (Protein) von Fig. 1 (C-Terminuspartner). pQE-8/E7 wurde zur Transformation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwen det. Die Bakterien wurden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyra nosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wurde eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromato graphie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wurde das Fusionsprotein einer 18% SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).The DNA obtained under 5 of Example 1 was inserted into the expression vector pQE-8 (Qiagen) which had been cleaved with HindIII and Xbal. The expression plasmid pQE-8 / E7 was obtained. Such a code for a fusion protein of 6 histidine residues (N-terminus partner) and the inventive (protein) of Fig. 1 (C-terminus partner). pQE-8 / E7 was used to transform E.coli SG 13009 (see. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273). The bacteria were cultivated in an LB medium with 100 μg / ml ampicillin and 25 μg / ml kanamycin and induced for 4 hours with 60 μM isopropyl-β-D-thiogalactopyra noside (IPTG). Lysis of the bacteria was achieved by adding 6 M guanidine hydrochloride, then chromatography (Ni-NTA resin) was carried out with the lysate in the presence of 8 M urea in accordance with the manufacturer's (Diagen) instructions for the chromatography material. The bound fusion protein was eluted in a pH 3.5 buffer. After its neutralization, the fusion protein was subjected to 18% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie blue (cf. Thomas, JO and Kornberg, RD, J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.It was found that a (fusion) protein according to the invention in highly pure form can be manufactured.
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 2 wurde einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wurde eine ca. 15 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke wurden sedimen tiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Poly acrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgte, bestimmt wurde. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein wurden Tiere wie folgt immuni siert:A fusion protein according to the invention from Example 2 was subjected to an 18% SDS Subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4 sts About 15 kD band was cut out of the gel and sodium acetate incubated in phosphate buffered saline. Gel pieces were sedimented tiert before the protein concentration of the supernatant by an SDS poly acrylamide gel electrophoresis, which was followed by a Coomassie blue stain has been. Animals were immunized with the gel-purified fusion protein as follows siert:
Pro Immunisierung wurden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS
und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten35 ug of gel-purified fusion protein in 0.7 ml of PBS and 0.7 ml of complete or incomplete Freund's adjuvant were used per immunization.
Day 0: 1st immunization (Freund's complete adjuvant)
Day 14: 2nd immunization (incomplete Freund's adjuvant; icFA)
Day 28: 3rd immunization (icFA)
Day 56: 4th immunization (icFA)
Day 80: bleeding
Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30- minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.The rabbit's serum was tested in the immunoblot. For this purpose, a fusion protein according to the invention from Example 1 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229. For this purpose, the nitrocellulose filter was incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody was rabbit serum (1: 10,000 in PBS). After several washes with PBS, the nitrocellulose filter was incubated with a second antibody. This antibody was a goat anti-rabbit IgG (Dianova) monoclonal monoclonal antibody coupled to alkaline phosphatase (1: 5000) in PBS. After 30 minutes of incubation at 37 ° C., there were several washing steps with PBS and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 μM 5 'bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, 400 μM nitroblue tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ) at room temperature until bands were visible.
Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.It was found that polyclonal antibodies according to the invention are produced can.
Pro Immunisierung wurden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS
und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
40 µg of gel-purified fusion protein in 0.8 ml of PBS and 0.8 ml of complete or incomplete Freund's adjuvant were used per immunization.
Day 0: 1st immunization (Freund's complete adjuvant)
Day 28: 2nd immunization (incomplete Freund's adjuvant; icFA)
Day 50: 3rd immunization (icFA)
Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.Antibodies were extracted from egg yolk and tested in a Western blot. It polyclonal antibodies according to the invention have been detected.
Pro Immunisierung wurden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS
und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei
der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: FusionFor each immunization, 12 µg gel-purified fusion protein in 0.25 ml PBS and 0.25 ml complete or incomplete Freund's adjuvant were used; at the 4th immunization the fusion protein was dissolved in 0.5 ml (without adjuvant).
Day 0: 1st immunization (Freund's complete adjuvant)
Day 28: 2nd immunization (incomplete Freund's adjuvant; icFA)
Day 56: 3rd immunization (icFA)
Day 84: 4th immunization (PBS)
Day 87: fusion
Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungs gemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.Supernatants from hybridomas were tested in a Western blot. Invention appropriate monoclonal antibodies have been detected.
Claims (18)
- a) eine DNA, die für Abschnitte des E7-Proteins von HPV16 in einer zum Protein veränderten Anordnung und für Teile des E7-Proteins kodiert, die in diesem als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen, und die in Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, angegebene DNA-Sequenz oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA-Sequenz umfaßt, wobei letztere DNA-Sequenz mit jener von Fig. 1 hybridisiert, oder
- b) eine über den degenerierten Code mit der DNA von (a) verwandte DNA.
- a) a DNA coding for portions of the E7 protein of HPV16 in a change to the protein assembly, and for parts of the E7 protein present in this as transitions between the individual sections, and in Fig. 1, wherein Fig. 1 part of this claim, specified DNA sequence or a DNA sequence different therefrom by one or more base pairs, the latter DNA sequence hybridizing with that of FIG. 1, or
- b) a DNA related to the DNA of (a) via the degenerate code.
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