DE19805298A1 - Hair restorer - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Haarwuchsmittel, das FGF-10 als Wirkstoff enthält, der zur Familie der Fibrobla stenwachstumsfaktoren (FGF) gehört.The present invention relates to a hair restorer that FGF-10 contains as an active ingredient that belongs to the Fibrobla family growth factors (FGF) belongs.
Bisher wurden Haarwuchsmittel hauptsächlich zur Förderung der Proliferation von Haarepithelzellen (wie Matrixzellen), einschließlich der Verbesserung des Stoffwechsels von peri follikulären Geweben und der Erhöhung des Blutstroms in den Kapillaren der Gewebe unter Verwendung der "zellulären Akti vierung" oder "Aktivierung" als Marker entwickelt. Als Er gebnis wurden Plazentaextrakte, Ginseng und Swertiakraut, Panthothensäure und ihre Derivate, Vitamin E und seine Deri vate, Capsicumtinktur, Nicotinsäurederivate, etc. in Haar wuchsmitteln als Wirkstoffe verwendet, wobei sie eine Zellaktivierungsaktivität und eine den Blutstrom fördernde Aktivität zeigen. So far, hair restoration products have mainly been used for promotion the proliferation of hair epithelial cells (such as matrix cells), including improving the metabolism of peri follicular tissues and increase in blood flow in the Capillaries of the tissues using the "cellular acti vation "or" activation "as a marker. As Er The results were placental extracts, ginseng and swertia herb, Pantothenic acid and its derivatives, vitamin E and its deri vate, capsicum tincture, nicotinic acid derivatives, etc. in hair growth agents used as active ingredients, being a Cell activation activity and a blood flow promoting Show activity.
Jedoch müssen zelluläre Aktivatoren oder Aktivatoren, etc. mit einer sehr breiten Anwendbarkeit, von denen erwartet wird, daß sie nur Haarepithelzellen, die zu haarbildenden Zellen werden, aktivieren, aufgrund von Begrenzungen in ihren anwendbaren Mengen häufig in hohen Dosen verabreicht werden, was zu vielen unvermeidlichen Schäden (Stechen, etc.) führen kann.However, cellular activators or activators, etc. with a very broad applicability that expected is that they are only hair epithelial cells that are hair-forming Cells will activate due to limitations in often administered in high doses to their applicable amounts resulting in many inevitable damages (stinging, etc.) can lead.
In am Haarwuchs beteiligten follikulären Geweben, insbeson dere ihren unteren Bereichen, sind undifferenzierte Matrix zellen des Epithels vorhanden, die den Rand der Haarhautpa pillenzellen des Mesenchyms und die Basalmembran umgeben. Man nimmt an, daß der normale Haarwuchs durch die Prolifera tion und Differenzierung von Matrixzellen aufgrund der Wech selwirkung zwischen diesen Geweben verursacht wird. Man nimmt mit anderen Worten an, daß die Proliferation und Dif ferenzierung von Matrixzellen, die von Haarhautpapillenzel len kontrolliert werden, zur Bildung des Haarschaftes ein schließlich Mark, Rinde des Haarschaftes, Cuticula pili, etc. und innerer Wurzelscheide führen, und die Aufwärtsbewe gung der Matrixzellen aufgrund ihrer aktiven Proliferation und Differenzierung zur Haarverlängerung führt.In follicular tissues involved in hair growth, in particular their lower ranges, are undifferentiated matrix cells of the epithelium are present that cover the edge of the hair skin pa pill cells surrounding the mesenchyme and the basement membrane. It is believed that normal hair growth is caused by prolifera tion and differentiation of matrix cells due to the change interaction between these tissues is caused. Man in other words, assumes that proliferation and dif differentiation of matrix cells by hair papilla len are controlled to form the hair shaft finally marrow, bark of the hair shaft, cuticle pili, etc. and internal root sheath, and the upward movement delivery of the matrix cells due to their active proliferation and differentiation leads to hair extension.
Es wurde beispielsweise berichtet, daß, wenn Haarhautpapil len oder gezüchtete Haarhautpapillenzellen zwischen die Epi dermis und Dermis der Fußsohlenhaut von Maus und Ratte, die keine Haarfollikel besitzt, eingebettet werden und in das Implantationsbett überführt werden, dann die Fußsohlenhaut, die ursprünglich Haarfollikel nicht induzierte, die Haarpa pille und gezüchtete Haarhautpapillenzellen umgibt und die Bildung von Haarfollikeln induziert [Kobayashi, K. et al., J. Invest. Dermatol. 92 (1989), 278-282, Reynolds, A. et al., Ann. NY Acad. Aci. 642 (1991), 226-242]. Es wurde auch berichtet, daß die induzierten Haarfollikel durch die Art und Größe der zuvor eingebetteten Haarhautpapillen beein flußt werden [Jahoda, C., Development 115 (1992), 1103-1109). For example, it has been reported that when hair skin papil len or cultured hair papilla cells between the epi dermis and dermis of the sole of the foot of mouse and rat, the has no hair follicles, are embedded and in the Implantation bed, then the sole of the foot, that originally did not induce hair follicles, the hair pair pill and cultured hair skin papilla cells and the Formation of hair follicles induced [Kobayashi, K. et al., J. Invest. Dermatol. 92: 278-282, 1989, Reynolds, A. et al., Ann. NY Acad. Aci. 642: 226-242 (1991)]. It was too reports that the induced hair follicles are affected by Art and size of the previously embedded hair papillae are flowed [Jahoda, C., Development 115 (1992), 1103-1109).
Andererseits wurde, was die Wechselwirkung zwischen den Haarfollikelgeweben betrifft, der androgenabhängige Haar wuchs beschrieben. Beispielsweise wird die Proliferation von Bartepithelzellen in Anwesenheit von androgenabhängigen Barthautpapillenzellen durch einen neutralisierenden Anti körper gegen den insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I (IGF-I) vollständig unterdrückt. Weiter wird IGF-I-mRNA in Barthaut papillenzellen exprimiert, und diese Expression wird durch Androgene gesteuert. Diese Fakten beweisen, daß mindestens IGF-I einer der parakrinen Wachstumsfaktoren ist, der direkt auf benachbarte Zellen wirkt, wobei er bei der Wechselwir kung zwischen androgenabhängigen Haarfollikelgeweben sezer niert wird und von Haarhautpapillenzellen stammt [Itami, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 212 (1995), 988-994, Itami, S. et al., Hair Research for the Next Millenium (1996), 297-302, Elsevier Science].On the other hand, what was the interaction between the Hair follicle tissue affects androgen-dependent hair grew described. For example, the proliferation of Beard epithelial cells in the presence of androgen-dependent Beard skin papilla cells through a neutralizing anti body against insulin-like growth factor-I (IGF-I) completely suppressed. IGF-I mRNA is also found in beard skin papillary cells, and this expression is expressed by Androgens controlled. These facts prove that at least IGF-I is one of the paracrine growth factors that is direct acts on neighboring cells, whereby it interacts with between androgen-dependent hair follicle tissues is renated and comes from hair skin papilla cells [Itami, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 212 (1995), 988-994, Itami, S. et al., Hair Research for the Next Millennium (1996), 297-302, Elsevier Science].
Zur Zeit bestehen noch, obwohl mesenchymale Haarhautpapil lenzellen zweifelsohne eine Schlüsselrolle beim Haarwuchs spielen, viele unklare aufzuklärende Punkte, die die Mecha nismen der Wechselwirkung zwischen den Haarfollikelgeweben betreffen.At present there are still mesenchymal hair papules Lenz cells undoubtedly play a key role in hair growth play, many unclear points to be clarified that the Mecha Interactions between the hair follicle tissues affect.
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines parakrinen Faktors, der zur Teilnahme an Wechselwirkungen zwischen Haarfollikelgeweben fähig ist, insbesondere eines parakrinen Faktors, der in Haarhautpapillenzellen exprimiert wird, die eine Schlüsselrolle beim Haarwuchs spielen. Auf der Grundlage dessen ist eine weitere erfindungsgemäße Auf gabe die Bereitstellung eines Haarwuchsmittels, das diesen Faktor als Wirkstoff umfaßt.An object of the invention is to provide a paracrine factor that contributes to interaction between hair follicle tissues, especially one paracrine factor that expresses in hair cuticle papilla cells that play a key role in hair growth. On the basis of which is another according to the invention gave the provision of a hair restorer that this Factor included as an active ingredient.
Es wird angenommen, daß Haarhautpapillenzellen eine wichtige Rolle nicht nur bei der Induktion der Differenzierung von Hautgeweben zu Follikelgeweben spielen, sondern auch bei der Aufrechterhaltung des Haarzyklus sowie bei der Differenzie rung und Proliferation von Matrixzellen in der Anagenphase. Des weiteren wird angenommen, daß von Haarhautpapillenzellen abgegebene Signale stark an den Wirkungen dieser Zellen be teiligt sind. Daher kann davon ausgegangen werden, daß die Bestimmung dieser Signale für die Aufklärung der Wechselwir kungsmechanismen zwischen Haarfollikelzellen sehr wichtig ist.Hair cuticle papilla cells are believed to be an important one Role not only in inducing the differentiation of Skin tissues play with follicular tissues, but also at Maintaining the hair cycle as well as in the difference Formation and proliferation of matrix cells in the anagen phase. Furthermore, it is believed that from hair cuticle papilla cells emitted signals strongly on the effects of these cells are divided. It can therefore be assumed that the Determination of these signals for the elucidation of the interaction Mechanisms between hair follicle cells are very important is.
Um die vorstehend beschriebenen Aufgaben zu erfüllen, haben die Erfinder intensive Studien betrieben und als Ergebnis aufgeklärt, daß ein als Fibroblastenwachstumsfaktor-10 (FGF-10) [Yamasaki, M. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 15918-15921, Emoto et al., Abstracts 163 (1996), Joint Annual Assembly of the 69th General Meeting of The Japanese Biochemical Society and the 19th General Meeting of The Molecular Biology Society of Japan] bekannter Faktor in menschlichen Haarhautpapillenzellen exprimiert wird und das Wachstum von Haarfollikeln fördert. Somit wurde gefunden, daß FGF-10 als Haarwuchsmittel nützlich ist.To accomplish the tasks described above the inventors conducted intensive studies and as a result clarified that a fibroblast growth factor-10 (FGF-10) [Yamasaki, M. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 15918-15921, Emoto et al., Abstracts 163 (1996), Joint Annual Assembly of the 69th General Meeting of The Japanese Biochemical Society and the 19th General Meeting of The Molecular Biology Society of Japan] known factor in human hair cuticle papilla cells is expressed and that Promotes growth of hair follicles. So it was found that FGF-10 is useful as a hair restorer.
FGF-10 ist der zehnte zur FGF-Familie gehörende Faktor, der aus einer Rattenembryonen-cDNA-Genbank durch PCR unter Ver wendung eines Teilbereichs der stark homologen Aminosäurese quenz als Primer isoliert wurde, die bei Mitgliedern der FGF-Familie konserviert ist [Yamasaki, M. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 15918-15921]. Von anderen zur FGF-Familie gehörenden Mitgliedern wurden bisher deren Anwendungen als Melaninsyntheseinhibitor (JP-A-Hei 7-304686), Mittel zur Verbesserung der Leberfunktion (JP-A-Hei 6-345666) und wei ter als Hautkosmetikum (JP-A-Hei 4-187613) berichtet. Wei terhin wurden Anwendungen zur Behandlung von und Vorbeugung vor Alopezie (JP-A-Hei 4-224522) und als haartonisierendes (wachstumsförderndes) Kosmetikum wie auch als Kosmetikum zur Verbesserung der Canities berichtet (JP-A-Hei 8-208440).FGF-10 is the tenth factor belonging to the FGF family, the from a rat embryo cDNA library by PCR with Ver application of a part of the strongly homologous amino acid quenz was isolated as a primer which was used by members of the FGF family is conserved [Yamasaki, M. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 15918-15921]. From others to the FGF family belonging members have so far been their applications as Melanin synthesis inhibitor (JP-A-Hei 7-304686), agent for Improvement of liver function (JP-A-Hei 6-345666) and white as a skin cosmetic (JP-A-Hei 4-187613). Wei There have also been applications for the treatment of and prevention before alopecia (JP-A-Hei 4-224522) and as a hair-toning (growth promoting) cosmetic as well as cosmetic for Improvement in canities reported (JP-A-Hei 8-208440).
Andererseits wurde von FGF-10 berichtet, daß es spezifisch im Hypophysenhinterlappen, dem ersten Halswirbel, dem Duo denum, in der Lunge, im Sakral- und Steißbeinabschnitt des Rückenmarks von Rattenembryonen und in der Lunge von erwach senen Ratten exprimiert wird [Yamasaki, M. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 15918-15921]. Es wurde auch berichtet, daß FGF-10 eine Aktivität zur Proliferation von Epithelzellen besitzt. Jedoch war überhaupt nichts über die Beziehung zwi schen menschlichem Haargewebe, insbesondere das Haarwachstum kontrollierende Haarhautpapillenzellen, und FGF-10 bekannt.On the other hand, FGF-10 has been reported to be specific in the posterior lobe of the pituitary, the first cervical vertebra, the duo denum, in the lungs, in the sacral and coccyx section of the Spinal cord from rat embryos and in the lungs from awakened its rats is expressed [Yamasaki, M. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 15918-15921]. It has also been reported that FGF-10 an activity for the proliferation of epithelial cells owns. However, nothing was at all about the relationship between human hair tissue, especially hair growth controlling hair cuticle papilla cells, and FGF-10.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung isolierten Haarhaut papillenzellen, epidermale Keratinocyten und Zellen der äußeren Wurzelscheide, führten RT-PCR mit Gesamt-RNA dieser Zellen aus und klärten als Ergebnis zum ersten Mal auf, daß FGF-10 in Haarhautpapillenzellen exprimiert wird, die eine zentrale Rolle beim Haarwuchs spielen. Die Erfinder der vor liegenden Erfindung untersuchten weiter die wachstumsför dernde Wirkung von FGF-10 auf Haarfollikelgewebe, die von isolierten Haarfollikeln hergestellt wurden, und fanden zum ersten Mal heraus, daß FGF-10 tatsächlich den Wuchs von Haarfollikeln fördert.The inventors of the present invention isolated hair skin papillary cells, epidermal keratinocytes and cells of the outer root sheath, RT-PCR performed with total RNA of this Cells and, as a result, clarified for the first time that FGF-10 is expressed in hair cuticle papilla cells, the one play a central role in hair growth. The inventor of the before lying invention further investigated the growth effect of FGF-10 on hair follicle tissue by isolated hair follicles were made, and found to first found out that FGF-10 actually grew from Promotes hair follicles.
Die vorliegende Erfindung betrifft den parakrinen Faktor "FGF-10", der zur Förderung des Wachstums von Haarfollikeln fähig ist, und insbesondere ein Haarwuchsmittel, das FGF-10 als Wirkstoff umfaßt.The present invention relates to the paracrine factor "FGF-10", which is used to promote the growth of hair follicles capable, and especially a hair restorer, the FGF-10 as an active ingredient.
Die Figuren zeigen:The figures show:
Fig. 1A stellt ein elektrophoretisches Muster dar, das die Expression von FGF-10 in Stirnhaarhautpapillenzel len, epidermalen Keratinocyten, Zellen der äußeren Wurzelscheide und Barthautpapillenzellen zeigt, die durch RT-PCR nachgewiesen wurde. Fig. 1A represents an electrophoretic pattern showing the expression of FGF-10 in forehead hair papilla cells, epidermal keratinocytes, cells of the outer root sheath and beard skin papilla cells, which was detected by RT-PCR.
Fig. 1B stellt ein elektrophoretisches Muster dar, das die Expression von FGF-10 in von verschiedenen Indivi duen stammenden Haarhautpapillenzellen zeigt, die durch RT-PCR nachgewiesen wurde. Fig. 1B represents an electrophoretic pattern showing the expression of FGF-10 in hair tissue papilla cells derived from different individuals, which was detected by RT-PCR.
Fig. 1C stellt ein elektrophoretisches Muster von FGF-10 dar, behandelt mit einem Restriktionsenzym. Figure 1C represents an electrophoretic pattern of FGF-10 treated with a restriction enzyme.
FGF-10, der als Wirkstoff des erfindungsgemäßen Haarwuchs mittels verwendet wird, kann aus Geweben oder Zellen von warmblütigen Tieren durch ein Standardproteinreinigungsver fahren und auch unter Verwendung von DNA-Rekombinationstech niken hergestellt werden. Der natürliche FGF-10 kann bei spielsweise isoliert und gereinigt werden durch geeignete Kombinationen von weit verbreiteten chromatographischen Techniken, Aussalzungsverfahren, Lösungsmittelextraktion, Konzentration durch Ultrafiltration, Umkristallisation, Zen trifugation, Destillation, etc. Im Falle der Herstellung von FGF-10 unter Verwendung von Rekombinationstechniken kann als Basensequenz für die Expression von FGF-10 zusätzlich zu der in SEQ ID No. 1 beschriebenen jede beliebige Basensequenz verwendet werden, die im wesentlichen die gleiche wie die in SEQ ID No. 2 beschriebene Aminosäuresequenz besitzt. Der re kombinante FGF-10 kann beispielsweise durch Transformation von Wirtszellen mit dem rekombinanten Expressionsvektor her gestellt werden, in den eine DNA cloniert wurde, welche die die gesamte oder partielle Aminosäuresequenz von FGF-10 co dierende Basensequenzen umfaßt, Züchtung der so erhaltenen Transformante in einem geeigneten Medium und unter geeigne ten Züchtungsbedingungen und Extraktion und Reinigung des Produkts aus der Transformante. Es gibt keine Begrenzung be treffend der Art der Expressionsvektoren, solange sie in Wirten replizieren, proliferieren, transkribieren und trans latieren können. Als mit dem Vektor zu transformierende Wirte können beispielsweise Escherichia coli, Hefe, Insek tenzellen, Säugerzellen, etc. verwendet werden.FGF-10, the active ingredient in hair growth according to the invention can be used from tissues or cells of warm-blooded animals using a standard protein purification process drive and also using recombinant DNA technology techniques are manufactured. The natural FGF-10 can for example isolated and cleaned by suitable Combinations of widely used chromatographic Techniques, salting-out processes, solvent extraction, Concentration through ultrafiltration, recrystallization, zen trifugation, distillation, etc. In the case of the production of FGF-10 using recombination techniques can be used as Base sequence for the expression of FGF-10 in addition to that in SEQ ID No. 1 described any base sequence are used, which are essentially the same as those in SEQ ID No. 2 amino acid sequence described. The right Combined FGF-10 can, for example, by transformation from host cells with the recombinant expression vector into which a DNA has been cloned which contains the the entire or partial amino acid sequence of FGF-10 co base sequences, cultivation of the thus obtained Transformants in a suitable medium and under suitable conditions breeding conditions and extraction and purification of the Product from the transformant. There is no limit matching the type of expression vectors as long as they are in Hosts replicate, proliferate, transcribe and trans can latate. As to be transformed with the vector Hosts can, for example, Escherichia coli, yeast, insect cells, mammalian cells, etc. can be used.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, modifizierte FGF-10-Pep tide zu verwenden. Modifizierte FGF-10-Peptide können na türlich oder durch posttranslationale Modifikation produ ziert werden. Sie können auch unter Verwendung von durch gentechnische Verfahren, beispielsweise ortsspezifische Mu tagenese [Methods in Enzymology 154 (1987), 350, 367-382, ibid. 100 (1983), 468, Nucleic Acids Research 12 (1984) 9441], etc., modifizierten DNAs und durch chemische Synthe severfahren wie das Phosphattriesterverfahren und das Phos phatamiditverfahren [J. Am. Chem. Soc. 89 (1967), 4801, ibid. 91 (1969), 3350, Science 150 (1968), 178, Tetrahedron Lett. 22 (1981), 1859; ibid. 24 (1983), 245] hergestellt werden. Es ist weiterhin möglich, sie durch geeignete Kombi nationen dieser Verfahren herzustellen.According to the invention, it is also possible to use modified FGF-10 pep tide to use. Modified FGF-10 peptides can be na naturally or by post-translational modification produ be decorated. You can also by using genetic engineering processes, for example site-specific mu tagenese [Methods in Enzymology 154 (1987), 350, 367-382, ibid. 100 (1983), 468, Nucleic Acids Research 12 (1984) 9441], etc., modified DNAs and by chemical synthesis Process like the phosphate triester process and the Phos phatamidite method [J. At the. Chem. Soc. 89 (1967), 4801, ibid. 91 (1969), 3350, Science 150 (1968), 178, tetrahedron Lett. 22: 1859 (1981); ibid. 24 (1983), 245] will. It is still possible to use suitable combinations to produce nations of these processes.
Der erfindungsgemäße FGF-10 kann allein oder in Kombination mit anderen Bestandteilen als Haarwuchsmittel verwendet wer den. Andere Bestandteile sind beispielsweise zelluläre Akti vatoren, Kreislauf-fördernde Mittel, Anti-Androgene, etc., insbesondere Pantothensäure und ihre Derivate, Plazentaex trakt, Photoelemente, Ginsengextrakt, Biotin, Mono nitroguajakol, Caproniumchlorid, Vitamin E und seine De rivate, Swertiakrautextrakt, Capsicumtinktur Cephalanthin, Nicotinsäure und ihre Derivate, Östradiol, Ethinylöstradiol, (1R)-2α-[2-[(1S,2S,3S)-2-(2-Carboxyethyl)-2-methyl-6-methy len-3-(1-methylethenyl)cyclohexyl]ethyl]-1,3-dimethyl-6α-(1-methy lethenyl)-3-cyclohexen-1-propionsäure, Minoxidil und seine Homologen und Derivate, 5α-Reduktaseinhibitor, 12-Tetra decanoylphorbol-13-acetat und Rohwirkstoffe wie Poly gonatum-Rhizome, Uncaria rhyncophylla, Henna, Süßholz, etc., sind jedoch nicht darauf beschränkt. Es ist möglich, diese Bestandteile in Kombination von mehr als zwei von ihnen zu verwenden. Diese Kombinationen können in jedem beliebigen Verhältnis gemacht werden, solange sie effektiv den Haar wuchs fördern oder einer Alopezie vorbeugen können.The FGF-10 according to the invention can be used alone or in combination with other ingredients used as hair restorer the. Other components are, for example, cellular stocks vators, circulatory agents, anti-androgens, etc., especially pantothenic acid and its derivatives, placentaex tract, photo elements, ginseng extract, biotin, mono nitroguajakol, capronium chloride, vitamin E and its De derivatives, swerty herb extract, capsicum tincture cephalanthin, Nicotinic acid and its derivatives, estradiol, ethynyl estradiol, (1R) -2α- [2 - [(1S, 2S, 3S) -2- (2-carboxyethyl) -2-methyl-6-methy len-3- (1-methylethenyl) cyclohexyl] ethyl] -1,3-dimethyl-6α- (1-methy lethenyl) -3-cyclohexen-1-propionic acid, minoxidil and its homologues and derivatives, 5α-reductase inhibitor, 12-tetra decanoylphorbol-13-acetate and raw ingredients such as poly gonatum rhizomes, Uncaria rhyncophylla, henna, licorice, etc., however, are not limited to this. It is possible to do this Ingredients in combination of more than two of them too use. These combinations can be in any Ratio can be made as long as they effectively hair promote growth or prevent alopecia.
Im Falle einer lokalen Anwendung kann der erfindungsgemäße FGF-10 zusammen mit pharmazeutisch und lokal verträglichen Trägern oder Medien verabreicht werden, die gewöhnlich für lokal eingesetzte Zusammensetzungen verwendet werden. Bei spielsweise kann der erfindungsgemäße FGF-10 in Kombination mit einem wäßrigen Bestandteil, Pulver, grenzflächenaktiven Mittel, medizinischen Öl, Benetzungsmittel, Alkohol, pH-Re gulator, Antiseptikum, Antioxidans, Verdickungsmittel, Vitaminen, Sebolytikum, Desinfektionsmittel, Keratolytikum, Parfüm, Pigment, etc. verwendet werden, die gewöhnlich in Kosmetika, Arzneimitteln und Arzneimitteln für die lokale Anwendung verwendet werden. Im Falle der lokalen Anwendung kann für eine effektivere Verwendung FGF-10 zusammen mit be kannten DDS-Trägern, wie Liposomen, verwendet werden.In the case of a local application, the invention FGF-10 together with pharmaceutically and locally acceptable Carriers or media are usually administered for locally used compositions can be used. At for example, the FGF-10 according to the invention can be used in combination with an aqueous ingredient, powder, surfactant Agent, medicinal oil, wetting agent, alcohol, pH re gulator, antiseptic, antioxidant, thickener, Vitamins, sebolytic, disinfectant, keratolytic, Perfume, pigment, etc. are commonly used in Cosmetics, medicines and medicines for the local Application. In the case of local application can be used with FGF-10 for more effective use known DDS carriers such as liposomes can be used.
Die Dosierung des erfindungsgemäßen Haarwuchsmittels ist ge wöhnlich zwischen etwa 0,001 und etwa 100 µg/Tag/cm2 und die anwendbare Konzentration ist zwischen 0,0001 bis 0,1 Gew./Vol.-%, vorzugsweise zwischen etwa 0,01 bis etwa 10 µg/Tag/cm2 und 0,0005 bis 0,05 Gew./Vol.-%. Die tägliche Dosierung wird geeignet ausgewählt entsprechend den Bedin gungen der Kopfhaut, etc., und die notwendige Dosierung kann in einer in einen bis mehrere Teile pro Tag unterteilten Do sierung verabreicht werden.The dosage of the hair restorer according to the invention is usually between about 0.001 and about 100 µg / day / cm 2 and the applicable concentration is between 0.0001 to 0.1 w / v%, preferably between about 0.01 to about 10 µg / day / cm 2 and 0.0005 to 0.05 w / v%. The daily dosage is appropriately selected according to the conditions of the scalp, etc., and the necessary dosage can be administered in a dosage divided into one to several parts per day.
Das erfindungsgemäße Haarwuchsmittel kann als Arzneimittel oder Kosmetikum wie Creme, Lotion, Salbe, Gel, Shampoo, Aerosol, etc. formuliert werden.The hair restorer according to the invention can be used as a medicament or cosmetic such as cream, lotion, ointment, gel, shampoo, Aerosol, etc. can be formulated.
Da angenommen wird, daß der erfindungsgemäße FGF-10 eine Alopezie-behandelnde und vorbeugende Wirkung wie auch eine haarwuchsfördernde Wirkung zeigt, kann das erfindungsgemäße Haarwuchsmittel als Alopezie-behandelndes Mittel und als Alopezie-vorbeugendes Mittel verwendet werden. Weiter kann es unter der Annahme, daß es biologischen Ursprungs und sehr sicher ist, als haarwuchsförderndes Haartonik-Kosmetikum und Alopezie-vorbeugendes Kosmetikum verwendet werden.Since it is assumed that the FGF-10 according to the invention is a Alopecia-treating and preventive effects as well hair growth promoting effect, the invention Hair restorer as an alopecia-treating agent and as Alopecia preventive can be used. Can continue it assuming that it is of biological origin and very is safe as a hair growth-promoting hair tonic cosmetic and Alopecia preventive cosmetic can be used.
Erfindungsgemäß wurde aufgeklärt, daß FGF-10 in Haarhautpa pillenzellen exprimiert wird und ein parakriner Faktor ist, der eine Schlüsselrolle beim Haarwuchs spielt. Auf Grundlage dieses Befundes stellt die vorliegende Erfindung ein FGF-10 als Wirkstoff umfassendes Haarwuchsmittel bereit. According to the invention it was clarified that FGF-10 in hair skin pa pill cells is expressed and is a paracrine factor, that plays a key role in hair growth. On the basis Based on this finding, the present invention provides an FGF-10 comprehensive hair restorer as an active ingredient.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.
Haarhautpapillenzellen wurden von Haut vollständiger Dicke, die bei einem Eingriff für plastische Chirurgie erhalten wurde, gemäß dem üblichen Verfahren (Messenger, A. G., Br. J. Dermatology 110, (1984), 685-689) isoliert. Die folgenden Tätigkeiten wurden unter einem stereoskopischen Mikroskop in einer Reinhaltebank ausgeführt.Hair cuticle papilla cells were of full thickness skin, received during a plastic surgery procedure was, according to the usual procedure (Messenger, A.G., Br. J. Dermatology 110, (1984), 685-689). The following Activities were carried out under a stereoscopic microscope a clean bench.
Haarfollikel mit peripheren Geweben wurden von Haut voll ständiger Dicke unter Verwendung einer G 21-Nadel selektiv entfernt. Von den herausgeschnittenen Haarfollikeln wurden anhaftende periphere Gewebe entfernt, und nur Haarfollikel zwiebeln wurden weggeschnitten. Haarfollikelzwiebel wurden zerlegt, und nur Haarhautpapillen wurden herausgeschnitten und für die Primärkultur verwendet.Hair follicles with peripheral tissues became full of skin constant thickness using a G 21 needle away. From the hair follicles cut out were adherent peripheral tissue removed, and only hair follicles onions were cut away. Hair follicle bulbs were disassembled and only hair skin papillae were cut out and used for the primary culture.
Auf diese Weise erhaltene Haarhautpapillen wurden in einer Zelldichte von 4 bis 5 Zellen pro 35 mm-Kulturschalen ausge bracht und bei 37°C in einer 5% CO2-Atmosphäre unter feuch ten Bedingungen in 199-Medium (Gibco BRL), das Penicillin (100 E/ml), Streptomycin (100 µg/ml), Glutamin (2 mMol/ml) und 20% fötales Kälberserum enthielt, gezüchtet. Das Medium wurde jeden dritten Tag nach der Adhäsion der Haarhautpapil len an die Bodenoberfläche der Schale ausgetauscht. "Epidercell NHEK(F)" (Kurabo) wurde als epidermale Keratino cyten verwendet und in "HuMedia-KG2-Medium" (Kurabo) gezüch tet. Zellen der äußeren Wurzelscheide wurden durch das übli che Verfahren isoliert und in "MCDB153-Medium" (Sigma) ge züchtet. Hair papillae obtained in this way were applied in a cell density of 4 to 5 cells per 35 mm culture dish and at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere under humid conditions in 199 medium (Gibco BRL), the penicillin ( 100 U / ml), streptomycin (100 µg / ml), glutamine (2 mmol / ml) and 20% fetal calf serum. The medium was exchanged every third day after the hair papilla had adhered to the bottom surface of the dish. "Epidercell NHEK (F)" (Kurabo) was used as the epidermal keratin cytogen and grown in "HuMedia KG2 medium" (Kurabo). Outer root sheath cells were isolated by the usual method and grown in "MCDB153 medium" (Sigma).
Die vorstehend beschriebenen Zellen wurden, nachdem sie einen subkonfluenten Zustand erreicht hatten, unter Verwen dung von PBS(-), das 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA ent hielt, gemäß dem üblichen Verfahren als Subkulturen gezüch tet. In diesen Experimenten wurden Zellen verwendet, die 3 bis 4 Generationen als Subkultur gezüchtet worden waren.The cells described above were after had reached a sub-confluent state using of PBS (-), which contains 0.05% trypsin and 0.02% EDTA cultivated as subcultures according to the usual procedure tet. In these experiments cells were used that 3 up to 4 generations had been bred as a subculture.
Die Reinigung von Gesamt-RNA von gezüchteten Haarhautpapil lenzellen kann nach dem üblichen Verfahren durchgeführt wer den. Insbesondere wurde sie unter Verwendung von ISOGEN (Nippon Gene) gemäß dem "Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chlo roformverfahren" (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162 (1987), 156-159) gereinigt. Zusätzlich wurde Gesamt-RNA aus epidermalen Keratinocyten und Zellen der äußeren Wurzel scheide auf ähnliche Weise hergestellt.Purification of total RNA from cultured hair tissue papil cells can be carried out using the usual procedure the. In particular, she was using ISOGEN (Nippon Gene) according to the "Guanidinium Thiocyanate Phenol Chlo roforming process "(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162 (1987), 156-159). In addition, total RNA was made epidermal keratinocytes and cells of the outer root made in a similar way.
Die Synthese von einzelsträngiger cDNA von gereinigter Ge samt-RNA kann nach dem üblichen Verfahren durchgeführt wer den. Es wurde ein Röhrchen, enthaltend ein Gemisch (100 µl) aus 2,5 M Zufallshexameren, 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), jeweils 1 mM Desoxynucleosidtriphosphat (dNTP), 1,0 E/µl Ribonucleaseinhibitor (die vorstehend be schriebenen Bestandteile waren von Takara Shuzo), 2,5 E/µl M-MLV reverse Transkriptase (Gibco BRL) und 2 µg Gesamt-RNA in einem Thermal-Cycler nach Denaturierung plaziert, und die Synthesereaktion wurde nach dem folgenden Programm durchge führt. Die Reaktion wurde bei "25°C 15 Minuten, 42°C 45 Mi nuten, 99°C 5 Minuten und 4°C 10 Minuten" für einen Zyklus durchgeführt. The synthesis of single-stranded cDNA from purified total RNA can be carried out by the usual method. A tube containing a mixture (100 μl) of 2.5 M random hexamers, 5 mM MgCl 2 , 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), each 1 mM deoxynucleoside triphosphate (dNTP), 1, 0 U / µl ribonuclease inhibitor (the components described above were from Takara Shuzo), 2.5 U / µl M-MLV reverse transcriptase (Gibco BRL) and 2 µg total RNA placed in a thermal cycler after denaturation, and the synthesis reaction was carried out according to the following program. The reaction was carried out at "25 ° C for 15 minutes, 42 ° C for 45 minutes, 99 ° C for 5 minutes and 4 ° C for 10 minutes" for one cycle.
Die PCR kann nach dem üblichen Verfahren durchgeführt wer den. Es wurde ein PCR-Gemisch durch die Zugabe von 5 µl einer Probenlösung, die von der vorstehend beschriebenen re versen Transkriptasereaktion erhalten wurde, zu einer sich in einem Röhrchen befindenden Lösung (insgesamt 20 µl), die 2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 0,025 E/µl rekombinante Tag DNA-Polymerase (Takara Shuzo), und jeweils 0,5 µM Primer enthielt, hergestellt. Als Primer wurden 5'-ACCAACTCTTCTTCCTCCTC-3' (SEQ ID No. 3) und 5'-CCTCTATCCTCTCCTTCAGC-3' (SEQ ID No. 4) verwendet. Zu die sem Gemisch wurde ein Tropfen Mineralöl (Perkin-Elmer) zuge fügt, und das resultierende Gemisch wurde in einem Thermal- Cycler plaziert. Die PCR wurde bei "94°C 1 Minute" für einen Zyklus, "94°C 1 Minute, 60°C 1 Minute und 72°C 1 Minute" für 35 Zyklen, "72°C 10 Minuten" für 1 Zyklus und "4°C 10 Minu ten" für 1 Zyklus durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurden die amplifizierten Produkte durch Gelelektrophorese auf einem Ethidiumbromid (0,5 µg/ml) enthaltenden 2% Agarosegel sichtbar gemacht.The PCR can be carried out according to the usual procedure. A PCR mixture was obtained by adding 5 µl of a sample solution obtained from the reverse transcriptase reaction described above to a solution in a tube (20 µl in total) containing 2 mM MgCl 2 , 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 0.025 U / µl recombinant Tag DNA polymerase (Takara Shuzo), and each containing 0.5 µM primer. 5'-ACCAACTCTTCTTCCTCCTC-3 '(SEQ ID No. 3) and 5'-CCTCTATCCTCTCCTTCAGC-3' (SEQ ID No. 4) were used as primers. A drop of mineral oil (Perkin-Elmer) was added to this mixture and the resulting mixture was placed in a thermal cycler. The PCR was run at "94 ° C 1 minute" for one cycle, "94 ° C 1 minute, 60 ° C 1 minute and 72 ° C 1 minute" for 35 cycles, "72 ° C 10 minutes" for 1 cycle and " 4 ° C for 10 minutes "for 1 cycle. After the PCR reaction, the amplified products were visualized by gel electrophoresis on a 2% agarose gel containing ethidium bromide (0.5 µg / ml).
Als Ergebnis wurde die Expression von FGF-10 in mesenchyma len Haarhautpapillenzellen (a, b, g und h in Fig. 1A) er kannt. In Fig. 1A stellt "M" einen 100 bp-Molekularge wichtsmarker dar, "a" und "b" zeigen die Ergebnisse, die mit den Stirnhaarhautpapillenzellen erhalten wurden, "c" und "d" die Ergebnisse, die mit den epidermalen Keratinocyten erhal ten wurden, "e" und "f" die Ergebnisse, die mit den Zellen der äußeren Wurzelscheide erhalten wurden und "g" und "h" die Ergebnisse, die mit den Barthautpapillenzellen erhalten wurden.As a result, expression of FGF-10 in mesenchymal hair cuticle papilla cells (a, b, g and h in Fig. 1A) was known. In Fig. 1A, "M" represents a 100 bp molecular weight marker, "a" and "b" show the results obtained with the forehead hair papilla cells, "c" and "d" show the results obtained with the epidermal keratinocytes "e" and "f" are the results obtained with the cells of the external root sheath and "g" and "h" are the results obtained with the whisker papilla cells.
Zusätzlich wurde auf ähnliche Weise eine RT-PCR unter Ver wendung von von verschiedenen Individuen stammenden Haar hautpapillenzellen (Fig. 1B) durchgeführt. In Fig. 1B stellt "M" einen 100 bp-Molekulargewichtsmarker dar und "a" bis "f" zeigen die experimentellen Ergebnisse mit von ver schiedenen Individuen stammenden Haarhautpapillenzellen. In von allen verschiedenen Individuen stammenden Haarhautpapil lenzellen, die in diesem Experiment verwendet wurden, wurde eine Bande an der Position, die 325 bp entspricht, nachge wiesen. Die Basensequenz des amplifizierten Fragments ist in SEQ ID No. 5 gezeigt.In addition, RT-PCR was carried out in a similar manner using hair papilla cells from different individuals ( FIG. 1B). In FIG. 1B, "M" represents a 100 bp molecular weight marker and "a" to "f" show the experimental results with hair tissue papilla cells from different individuals. A band at the position corresponding to 325 bp was detected in hair papillary cells from all different individuals used in this experiment. The base sequence of the amplified fragment is in SEQ ID No. 5 shown.
Zur Bestätigung, ob die so nachgewiesene Bande eine FGF-10-Bande ist, wurde eine Restriktionsenzym-Spaltungsanalyse durchgeführt. Genauer gesagt wurde eine einzelne Bande, die durch die Elektrophorese bestätigt wurde, aus dem Gel ausge schnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des "GENECLEAN II-Kits" (BIO 101) gewonnen. Das auf diese Weise gewonnene PCR-amplifizierte Produkt wurde mit dem Restriktionsenzym ScaI (Takara Shuzo) gespalten, und die Spaltungen wurden durch die vorstehend beschriebene Elektrophorese sichtbar gemacht. Als Ergebnis wurden aufgrund der Sequenz von FGF-10 zu erwartende Banden in der Größe von 210 bp und 115 bp nachgewiesen (Fig. 1C). In Fig. 1C zeigt die linke Spur das elektrophoretische Muster eines 100 bp-Molekularge wichtsmarkers (BRL Life Technology), die mittlere Spur zeigt die DNA der Probe ohne zugefügtes Sca I und die rechte Spur zeigt die DNA der Sca I-gespaltenen Probe.A restriction enzyme cleavage analysis was carried out to confirm whether the band detected in this way is an FGF-10 band. More specifically, a single band confirmed by electrophoresis was excised from the gel, and the DNA was obtained using the "GENECLEAN II kit" (BIO 101). The PCR-amplified product thus obtained was digested with the restriction enzyme ScaI (Takara Shuzo), and the cleavages were visualized by the electrophoresis described above. As a result, bands of 210 bp and 115 bp in size expected from the sequence of FGF-10 were detected ( FIG. 1C). In Fig. 1C the left lane shows the electrophoretic pattern of a 100 bp molecular weight marker (BRL Life Technology), the middle lane shows the DNA of the sample without added Sca I and the right lane shows the DNA of the Sca I-cleaved sample.
Zur Herstellung von rekombinantem FGF-10 wurde FGF-10-cDNA durch PCR hergestellt. Genauer gesagt wurde ein PCR-Gemisch (50 µl) durch das Mischen von 5 µl 10 × Pfu-Puffer (Strata gene), 0,4 mM dNTP (Takara Shuzo), 5 E Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene), jeweils 0,5 µM Primer und 5 µl Probenlösung, die von der in Beispiel 2 (2) hergestellten reversen Transkriptasereaktion erhalten wurde, hergestellt. Als Pri mer wurden 5'-AAGCTTATGTGGAAATGGATACTG-3' (SEQ ID No. 6) und 5'-AAGCTTCTATGAGTGTACCACCAT-3' (SEQ ID No. 7) verwendet. Die PCR wurde bei "94°C 1 Minute" für 1 Zyklus, "94°C 1 Mi nute, 56°C 1 Minute und 72°C 2 Minuten" für 35 Zyklen, "72°C 10 Minuten" für 1 Zyklus und "4°C 10 Minuten" für 1 Zyklus durchgeführt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel der Elektrophorese unterworfen. Dann wurde das Produkt einer Bande mit der Größe von 640 bp aus dem Gel gereinigt und mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten. Das den vollständigen codierenden Bereich von menschlichem FGF-10 enthaltende HindIII-Fragment wurde in die HindIII-Stel le des Plasmids pRc/CMW (Invitogen) subcloniert, wobei das Plasmid pRc/CMV-hFGF10 erhalten wurde. COS-1-Zellen (American Type Culture Collection) wurden in mit 10% fö talem Kälberserum angereichertem DMEM (Gibco BRL) 24 Stunden vor der Transfektion inokuliert, wobei sich eine Zelldichte von 2 × 105 Zellen pro 60 mm-Schale ergab. 5 µg rekombinan tes DNA-Molekül enthaltendes pRc/CMV-hFGF10 und pRc/CMV (Kontrolle), das kein darin eingeführtes rekombinantes DNA-Mole kül enthielt, wurden zur Transfektion durch das Calcium phosphat-Präzipitationsverfahren [Graham et al., Virology 52, (1973), 456] verwendet. Nach einer 24stündigen Züchtung wurde das Medium-durch mit 0,1% fötalem Kälberserum ange reichertem DMEM zur weiteren Züchtung von 40 Stunden er setzt. Anschließend wurden die transfizierten COS-1-Zellen und der Kulturüberstand geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gespült, in 20 mM Tris-HCL (pH 7,6), enthaltend 1 M NaCl, suspendiert und durch Beschallung aufgebrochen. Der Überstand wurde durch Zentrifugation bei 4°C und 15 000 g 15 Minuten gesammelt. Der resultierende Überstand und der Kul turüberstand wurden durch Ultrafiltration (molekularer Aus schluß bei 10 000) zum Erhalt von Filtrat A (stammt von COS-1-Zel len, die mit dem das rekombinante DNA-Molekül enthal tenden pRc/CMV-hFGF10 transfiziert waren, ab) und Filtrat B (stammt von COS-1-Zellen, die mit dem kein rekombinantes DNA-Molekül enthaltenden pRc/CMV als Kontrolle transfiziert waren, ab) gesammelt. FGF-10 cDNA was prepared by PCR to produce recombinant FGF-10. More specifically, a PCR mixture (50 µl) was made by mixing 5 µl 10 × Pfu buffer (Strata gene), 0.4 mM dNTP (Takara Shuzo), 5 U Pfu DNA polymerase (Stratagene), each 0 , 5 µM primer and 5 µl sample solution obtained from the reverse transcriptase reaction prepared in Example 2 (2). 5'-AAGCTTATGTGGAAATGGATACTG-3 '(SEQ ID No. 6) and 5'-AAGCTTCTATGAGTGTACCACCAT-3' (SEQ ID No. 7) were used as primers. The PCR was run at "94 ° C 1 minute" for 1 cycle, "94 ° C 1 minute, 56 ° C 1 minute and 72 ° C 2 minutes" for 35 cycles, "72 ° C 10 minutes" for 1 cycle and "4 ° C 10 minutes" performed for 1 cycle. The PCR products obtained were subjected to electrophoresis on an agarose gel. Then the product of a band with the size of 640 bp was purified from the gel and cleaved with the restriction enzyme HindIII. The HindIII fragment containing the complete coding region of human FGF-10 was subcloned into the HindIII site of the plasmid pRc / CMW (Invitogen), whereby the plasmid pRc / CMV-hFGF10 was obtained. COS-1 cells (American Type Culture Collection) were inoculated in DMEM (Gibco BRL) enriched with 10% fetal calf serum 24 hours before the transfection, resulting in a cell density of 2 × 10 5 cells per 60 mm dish. 5 µg of recombinant DNA molecule containing pRc / CMV-hFGF10 and pRc / CMV (control), which contained no recombinant DNA molecule introduced therein, were transfected by the calcium phosphate precipitation method [Graham et al., Virology 52, (1973), 456] was used. After 24 hours of breeding, the medium was replaced by DMEM enriched with 0.1% fetal calf serum for further breeding of 40 hours. The transfected COS-1 cells and the culture supernatant were then harvested. The cells were rinsed twice with PBS, suspended in 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 1 M NaCl and disrupted by sonication. The supernatant was collected by centrifugation at 4 ° C and 15,000 g for 15 minutes. The resulting supernatant and the culture supernatant were obtained by ultrafiltration (molecular exclusion at 10,000) to obtain filtrate A (derived from COS-1 cells which were transfected with the pRc / CMV-hFGF10 containing the recombinant DNA molecule) , ab) and filtrate B (derived from COS-1 cells which were transfected with the pRc / CMV containing no recombinant DNA molecule as a control).
Menschliche Haarfollikel wurden von Kopfhautbiopsien von normalen Individuen, die bei einem Eingriff für plastische Chirurgie erhalten wurden, gemäß dem üblichen Verfahren [Philpott, M.P. et al., J. Cell Sci. 97 (1990) 463-471] iso liert. Die folgenden Tätigkeiten wurden alle unter einem stereoskopischen Mikroskop in einer Reinhaltebank durchge führt.Human hair follicles were taken from scalp biopsies normal individuals undergoing plastic surgery Surgery was obtained according to the usual procedure [Philpott, M.P. et al., J. Cell Sci. 97 (1990) 463-471] iso liert. The following activities were all under one Stereoscopic microscope in a clean bench leads.
Die Streifen wurden in schmale Stücke von einer Breite von nicht mehr als 5 mm geschnitten. Die Epidermis und untere Dermis wurden von der darunterliegenden Fettschicht, die die Haarfollikelzwiebeln enthält, getrennt. Die Fettgewebe, die die Haarfollikelzwiebeln enthalten, wurden dann in ein Kul turmedium ausgebracht, und die Haarfollikel wurden unter einem Stereomikroskop (Leica WILD MZ8) durch vorsichtiges Herausziehen aus der Fettschicht unter Verwendung einer Pin zette isoliert.The strips were cut into narrow pieces of width not cut more than 5 mm. The epidermis and lower Dermis were from the underlying layer of fat that the Contains hair follicle bulbs, separately. The adipose tissue that the hair follicle bulbs were then placed in a kul The medium was applied and the hair follicles were removed a stereomicroscope (Leica WILD MZ8) through careful Pull out of the fat layer using a pin zette isolated.
Einzelne, frisch isolierte Haarfollikel, wie in Beispiel 4
beschrieben, wurden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5%
CO2/95% Luft in jeder Vertiefung einer Platte mit 12 Ver
tiefungen (CORNING Coster) 5 Tage aufrechterhalten. Die in
Beispiel 3 erhaltenen Filtrate A und B wurden 10 000fach
bzw. 100 000fach mit einem Kontrollmedium, das Williams' E-Medium
(Gibco BRL) enthielt, das mit 2 mM L-Glutamin
(Nacalai tesque), Insulin (10 µg/ml) (Sigma, die folgenden
Besandteile wurden ebenfalls von Sigma bezogen), Transferrin
(10 µg/ml), Hydrocortison (10 ng/ml), Natriumselenit (10 ng/ml),
Penicillin (50 µg/ml), und Streptomycin (50 IE/ml)
angereichert war, zur Herstellung von Testkulturmedien ver
dünnt. Die Haarfollikelorgankultur wurde in den so herge
stellten Meßtestmedien zur Beurteilung ihrer Größe durchge
führt. Das Wachstum wurde als die Zunahme der Länge des ge
samten Follikels, das für einen vorherbestimmten Zeitraum
gezüchtet wurde, durch Messung unter Beobachtung unter einem
Umkehr-Mikroskop (OLYMPUS IX70), das mit einem Meßstrich
gitter-Augenstück ausgestattet war, definiert. Als Ergebnis
zeigte das Haarfollikel, das in dem Medium gezüchtet worden
war, in das Filtrat A 100 000fach verdünnt war, eine Ver
längerung von etwa 1,3 mm. Das Haarfollikelwachstum in die
ser Kultur wurde um etwa 15% mehr gefördert als das in der
Kultur, die das Filtrat B mit der gleichen Verdünnung
enthielt. Weiter wurde eine etwa 1,4 mm-Verlängerung für das
Haarfollikel beobachtet, das in dem Medium gezüchtet worden
war, das eine 10 000fache Verdünnung des Filtrats A
enthielt, wobei dieses Haarfollikel um etwa 26% länger war
als das in dem Medium gezüchtete Haarfollikel, das das
Filtrat B in der gleichen Verdünnung enthielt.
Individual, freshly isolated hair follicles, as described in Example 4, were maintained at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 /95% air in each well of a plate with 12 wells (CORNING Coster) for 5 days. The filtrates A and B obtained in Example 3 were 10,000 times and 100,000 times, respectively, with a control medium containing Williams' E medium (Gibco BRL) containing 2 mM L-glutamine (Nacalai tesque), insulin (10 µg / ml ) (Sigma, the following ingredients were also obtained from Sigma), transferrin (10 µg / ml), hydrocortisone (10 ng / ml), sodium selenite (10 ng / ml), penicillin (50 µg / ml), and streptomycin (50 IE / ml) was enriched, diluted for the production of test culture media. The hair follicle organ culture was carried out in the measurement test media thus produced to assess their size. The growth was defined as the increase in the length of the entire follicle grown for a predetermined period of time by measurement under observation under an inverted microscope (OLYMPUS IX70) equipped with a measuring line grating eye piece. As a result, the hair follicle grown in the medium in which filtrate A was diluted 100,000 times showed an elongation of about 1.3 mm. Hair follicle growth in this culture was promoted about 15% more than that in the culture containing filtrate B at the same dilution. An approximately 1.4 mm extension was also observed for the hair follicle grown in the medium containing a 10,000-fold dilution of filtrate A, which hair follicle was approximately 26% longer than the hair follicle grown in the medium. that contained the filtrate B in the same dilution.
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