DE19757516A1 - New oligo-nucleotide analogs with negatively charged non-nucleoside units - Google Patents

Abstract

A molecule that hybridises with nucleic acids and has a backbone of linearly linked monomer units, where at least one of the monomer units is a non-nucleoside unit containing an acid function with a pKa of less than 3.0, is new. Independent claims are also included for the following: (1) a molecule of formula (IV): where L = H, OH, 1-4C alkanoyl, an optionally protected nucleobase-binding group, 6-14C aryl, N-, O- and/or S-containing heterocyclyl, or an intercalator or reporter group; A = a spacer of 1-3 atoms; x = 0-3; E and F = COOX, CSOX, SO2X, SO3X or NR<1>Y; R<1> = H or 1-3C alkyl; X = H or a protecting/activating group; Y = H or a protecting group; N = amine nitrogen; C and D = (CR<2>R<3>)n or CR<2>R<3>CR<4>R<5>; R<2>-R<5> = H, optionally substituted 1-6C alkyl, OH, COOH or an optionally protected group containing an acid function with a pKa of less than 3.0; n = 1-4; (2) a method for detecting the presence or absence of a nucleic acid in a sample suspected of containing one or more other nucleic acids, whose base sequence differs from that of the target nucleic acid in one or more positions, comprising contacting the sample with a probe whose base sequence is complementary to the target sequence but not to the base sequence of the other nucleic acids and determining if the probe has bound to its complementary base sequence and the probe is a molecule in which fewer than 80% but at least one of its bases are bonded to negatively charged backbone units; (3) use of negative charges in probes containing at least one non-nucleoside backbone unit to avoid nonspecific binding of the probes to (a) base sequences that are less than 50% complementary to the probes or (b) solid supports; (4) use of acid functions to increase the selectivity of probes in binding reactions; (5) use of molecules that hybridize with nucleic acids and have at least one base bonded to a negatively charged non-nucleoside backbone unit as primers for polymerase-catalysed extension with the aid of mononucleoside triphosphates; and (6) use of molecules that bind to nucleic acids and have at least one base bonded to a negatively charged non-nucleoside backbone unit for transfection into cells with the aid of transfection reagents.

Description

Gegenstand der Erfindung sind ein Verfahren zum Nachweis eines basensequenzhaltigen Targets in einer Probe unter Verwendung einer oder mehrerer spezieller Hybridisierungs­ sonden, ein fester Träger, an den diese Hybridisierungssonde gebunden ist sowie die Ver­ wendung negativer Ladungen in partiell geladenen Hybridisierungssonden zur Vermeidung unspezifischer Bindungen und zur Erhöhung der Selektivität bei Bindereaktionen.The invention relates to a method for the detection of a base sequence containing Targets in a sample using one or more special hybridizations probes, a solid support to which this hybridization probe is bound and Ver avoid negative charges in partially charged hybridization probes non-specific bindings and to increase the selectivity in binding reactions.

Nachweise von Nukleinsäuren in Proben haben in den letzten Jahren in der Analytik be­ trächtlich an Bedeutung gewonnen. Insbesondere im Gesundheitswesen, wo der Nachweis von Krankheitserregern, wie Viren und Bakterien, in und außerhalb des Körper, sowie von körperlichen Zuständen, wie genetischen Veranlagungen für Krankheiten erforderlich ist, hat sich die Aussagekraft solcher Tests als nützlich erwiesen. Dies gilt umso mehr, seit es möglich ist, Basensequenzen aus den nachzuweisenden Nukleinsäuren spezifisch zu ampli­ fizieren, beispielsweise mit der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, US-A-4,683,202). Im Allgemeinen werden die Proben, in denen die Anwesenheit der nachzuweisenden Nuklein­ säure vermutet wird, mit einer Hybridisierungssonde in Kontakt gebracht, wobei die Sonde so gewählt wird, daß sie eine Basensequenz aufweist, die im wesentlichen komplementär zu einer Basensequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure ist. Die Tatsache der Hybridisierung der Sonde mit der Nukleinsäure wird als Hinweis für die Anwesenheit der Nukleinsäure gewertet.Evidence of nucleic acids in samples has been used in analysis in recent years gained in importance. Especially in healthcare, where proof of pathogens, such as viruses and bacteria, in and outside the body, as well as of physical conditions, such as genetic predisposition to disease, the validity of such tests has proven useful. This has been all the more true since it it is possible to specifically amplify base sequences from the nucleic acids to be detected fect, for example with the polymerase chain reaction (PCR, US-A-4,683,202). in the Generally, the samples in which the presence of the nucleus to be detected acid is suspected, contacted with a hybridization probe, the probe is chosen to have a base sequence that is substantially complementary to a base sequence of the nucleic acid to be detected. The fact of hybridization The probe with the nucleic acid is used as an indication of the presence of the nucleic acid rated.

Als Hybridisierungssonden wurden zunächst fragmentierte, radioaktiv markierte Nuklein­ säuren verwendet. Diese hatten jedoch den Nachteil, daß sie umständlich herzustellen und recht unrein waren. Durch Einführung automatisierter Nukleotidsynthesen wurde die Her­ stellung sehr kleiner Nukleinsäuren (Oligonukleotide) in hoher Reinheit und mit definierter, frei wählbarer Basensequenz möglich. Die Einführung chemisch markierter Mononukleo­ sidphosphoramidite ermöglichte die einfache Einführung von Labeln zum ungefährlichen, nicht-radioaktiven Nachweis. In jüngerer Zeit wurden auch Hybridisierungssonden gefun­ den, die überraschenderweise sehr fest an Nukleinsäuren binden, obwohl sie das für Nukleinsäuren typische Zucker-Phosphat-Grundgerüst nicht oder gemischt zusammen mit anderen Grundgerüsteinheiten enthalten (z. B. WO 92/20703, EP-0 672 677 und EP-0 700 928). Diese Sonden sind einerseits hochaffin zu natürlichen Nukleinsäuren mit komplementärer Sequenz, sind andererseits aber auch hochselektiv. Aus Angew. Chem. 1996, 108, 17, 2068-2070), sind PNA bekannt, in deren Rückgrat eine Glycin-Einheit durch eine Glutaminsäure-Einheit ersetzt ist. Dadurch wird die Löslichkeit der Sonde erhöht. Es wurde auch festgestellt, daß ein Ersatz von Glutaminsäure durch Lysin keine wesentliche Änderung der Schmelzpunkterniedrigung (ΔTm) des vollständig komplementären PNA/DNA-Hybrids verglichen mit einem PNA/DNA-Hybrid mit einem mismatch mit sich bringt. Nachteile der bekannten PNA-Sonden sind die starke Tendenz zu unspezifischen Bindungen, zu hohen Leerwertsignalen und mangelnder Löslichkeit. DNA-Sonden haben den Nachteil, daß die Renaturierung eines Amplicon-Doppelstranges mit der Hybridisierung der (D)NA-Sonde in Konkurrenz tritt.Initially, fragmented, radioactively labeled nucleotides were used as hybridization probes acids used. However, these had the disadvantage that they were difficult to manufacture and were quite impure. By introducing automated nucleotide synthesis, Her provision of very small nucleic acids (oligonucleotides) in high purity and with defined, freely selectable base sequence possible. The introduction of chemically labeled mononucleos sidphosphoramidite made it easy to introduce labels for non-hazardous, non-radioactive detection. Hybridization probes have also recently been found to those who surprisingly bind very tightly to nucleic acids, even though they are for Nucleic acids typical sugar-phosphate framework or not mixed together with  other basic units (e.g. WO 92/20703, EP-0 672 677 and EP-0 700 928). On the one hand, these probes have a high affinity for natural nucleic acids complementary sequence, but are also highly selective. From Angew. Chem. 1996, 108, 17, 2068-2070), PNA are known, in the backbone of which a glycine unit a glutamic acid unit is replaced. This increases the solubility of the probe. It it was also found that replacing glutamic acid with lysine was not essential Change in melting point depression (ΔTm) of the completely complementary PNA / DNA hybrids compared to a PNA / DNA hybrid with a mismatch with it brings. Disadvantages of the known PNA probes are the strong tendency towards non-specific ones Bonds, too high blank signals and lack of solubility. Have DNA probes the disadvantage that the renaturation of an amplicon duplex with the hybridization the (D) NA probe competes.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik teilweise oder vollständig zu vermeiden, insbesondere die Ausnutzung der höheren Affinität von PNA-Sonden unter Vermeidung von unspezifischen Bindungen und hohen Leerwert­ signalen. Auch die zusätzliche Unterdrückung der Rehybridisierung des Amplicons ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung (Verwendung von Niedrigsalzbedingungen).The object of the present invention is to partially overcome the disadvantages of the prior art or to avoid completely, in particular the exploitation of the higher affinity of PNA probes avoiding unspecific binding and high blank values signals. The additional suppression of the rehybridization of the amplicon is also a Advantage of the present invention (use of low salt conditions).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein mit Nukleinsäuren hybridisierbares Molekül mit einem Grundgerüst aus linear miteinander verknüpften Monomereinheiten, wobei mindestens eine der Monomereinheiten eine nicht-nukleosidische Einheit ist, die eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 enthält. Ebenfalls Gegenstand der Erfin­ dung sind Monomere für die Herstellung dieser Moleküle, Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mit Hilfe dieser Moleküle sowie die Verwendung von Säurefunktionen, be­ vorzugt mit einem pK_a von weniger 3.0, in Sonden zur Vermeidung unspezifischer Bindun­ gen der Sonden an nicht-komplementäre Basensequenzen sowie an feste Träger, zur Er­ höhung der Selektivität in Bindereaktionen, in Primern sowie in Molekülen zur Trans­ fektion.The present invention therefore relates to a molecule which can be hybridized with nucleic acids and has a backbone of linearly linked monomer units, at least one of the monomer units being a non-nucleoside unit which contains an acid function with a pK _a of less than 3.0. The invention also relates to monomers for the production of these molecules, methods for the detection of nucleic acids with the aid of these molecules and the use of acid functions, preferably with a pK _a of less than 3.0, in probes to avoid non-specific binding of the probes to non- complementary base sequences and on solid supports, to increase the selectivity in binding reactions, in primers and in molecules for trans fection.

Mit Nukleinsäuren hybridisierende Moleküle, die nicht-nukleosidische Einheiten enthalten, sind prinzipiell bekannt. Sie lassen sich prinzipiell einteilen in Moleküle, die nur (nicht­ natürliche) nicht-nukleosidische Einheiten enthalten, und Moleküle, die sowohl nicht­ nukleosidische als auch (natürlich vorkommende) nukleosidische Einheiten enthalten. Ge­ meinsam ist all diesen Molekülen, daß sie aus Monomereinheiten aufgebaut sind. Diese sind so miteinander linear verknüpft, daß sich ein Oligomer mit einem fortlaufenden Grundgerüst (Backbone) ergibt, an welchem in im wesentlichen gleichmäßigen Abständen Liganden ge­ bunden sind. Damit das Oligomer die Fähigkeit zur Hybridisierung mit Nukleinsäuren erhält, müssen einige dieser Liganden (im allgemeinen mehr als 6 Liganden) Nukleobasen der Nukleinsäure über Wasserstoffbrückenbindung erkennen und binden können. Solche Ligan­ den sind beispielsweise die natürlich vorkommenden Nukleobasen, wie A, G, C, T und U, aber auch künstliche Heterozyklen, wie 7-Deazapurine oder Pseudopyrimidine. Darüber hinaus können diese Moleküle noch weitere Liganden enthalten, die nicht unbedingt zur Bindung mit der Nukleinsäure beitragen. Solche Liganden sind beispielsweise Gruppen die dem Nachweis oder der Abtrennung der Moleküle in Verfahren zum Nachweis der Nuklein­ säure dienen können. Solche Liganden können an die Nukleobasen, aber auch anstelle der Nukleobasen oder zusätzlich zu den Nukleobasen an das Grundgerüst, gebunden sein. Bei­ spiele für solche Liganden sind beispielsweise in WO 92/20703, WO 95/14708 (Metallkomplexe), DE 197 12 530.1 und WO 95/16202 (Peptide) beschrieben.Molecules hybridizing with nucleic acids that contain non-nucleoside units are known in principle. In principle, they can be divided into molecules that only (not natural) contain non-nucleoside units, and molecules that both do not contain nucleosidic as well as (naturally occurring) nucleosidic units. Ge  All these molecules have in common that they are composed of monomer units. These are so linearly linked that an oligomer with a continuous backbone (Backbone) results in ligands at substantially uniform intervals are bound. In order for the oligomer to have the ability to hybridize with nucleic acids, some of these ligands (generally more than 6 ligands) need nucleobases of the Recognize and bind nucleic acid via hydrogen bonding. Such ligan these are, for example, the naturally occurring nucleobases, such as A, G, C, T and U, but also artificial heterocycles, such as 7-deazapurine or pseudopyrimidine. About that In addition, these molecules can also contain other ligands that are not necessarily Binding with the nucleic acid contribute. Such ligands are, for example, groups the detection or separation of the molecules in methods for the detection of nucleic acids acid can serve. Such ligands can be attached to the nucleobases, but also instead of Nucleobases or in addition to the nucleobases to the basic structure. At Games for such ligands are, for example, in WO 92/20703, WO 95/14708 (Metal complexes), DE 197 12 530.1 and WO 95/16202 (peptides).

Die Herstellung von mit Nukleinsäure hybridisierenden Molekülen, bei denen das Grund­ gerüst aus einer Sequenz von über Peptidbindungen verknüpften Monomereinheiten aufge­ baut sind, ist beispielsweise in WO 92/20702 beschrieben. In einem ersten Aspekt unter­ scheidet sich der Gegenstand der vorliegenden Erfindung von der dort beschriebenen da­ durch, daß mindestens eine der dort eingesetzten Monomereinheiten eine Funktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 enthält.The production of molecules hybridizing with nucleic acid, in which the basic structure is built up from a sequence of monomer units linked via peptide bonds, is described, for example, in WO 92/20702. In a first aspect, the subject matter of the present invention differs from that described there in that at least one of the monomer units used there contains a function with a pK _a of less than 3.0.

In EP-A-0 672 677 ist eine Synthese von Nukleinsäureanalogen beschrieben, bei der nukleosidische und nicht-nukleosidische Monomereinheiten miteinander gemischt sind. In einer weiteren Ausführungsform unterscheidet sich der Gegenstand der vorliegenden Erfin­ dung von den dort beschriebenen Molekülen dadurch, daß eine der nicht-nukleosidischen Monomereinheiten eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 enthält.EP-A-0 672 677 describes a synthesis of nucleic acid analogs in which nucleosidic and non-nucleosidic monomer units are mixed with one another. In a further embodiment, the subject matter of the present invention differs from the molecules described therein in that one of the non-nucleoside monomer units contains an acid function with a pK _a of less than 3.0.

Wenn im Folgenden von einer modifizierten Monomereinheit gesprochen wird, so ist hiermit die nicht-nukleosidische Monomereinheit gemeint, welche die Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 bzw. die negative Ladung enthält. Als Monomereinheit wird bevorzugt eine Einheit verstanden, welche ein Teil des oben genannten Oligomers ist und welche höchstens eine Nukleobase enthält. Diese Einheiten enthalten bevorzugt nur solche Molekülteile, die bereits in den zur Synthese der Oligomeren verwendeten Monomeren ent­ halten waren. In der Regel ist das Oligomer zwischen 6 und 100, bevorzugt 8 und 30 Monomereinheiten lang. Bei der Berechnung der Länge der Grundgerüsteinheit jedes Monomers wird im Folgenden zugrundegelegt, daß die geometrische Länge zwischen den Verknüpfungspunkten der einzelnen Monomere im wesentlichen gleich ist und bevorzugt mit den Verknüpfungsstellen der Monomeren, aus denen das Oligomer hergestellt ist, zu­ sammenfällt. Für den bevorzugten Fall von Peptidnukleinsäuren beispielsweise reicht die Länge einer Grundgerüsteinheit von der Carbonylgruppe des einen Endes der Monomer­ einheit bis zum Aminoende derselben Monomereinheit, welche an die darauffolgende Carbonylgruppe der nächsten Monomereinheit gebunden ist. Bevorzugt liegt die Länge einer so definierten Grundgerüsteinheit zwischen 4 und 8, besonders bevorzugt bei 6 Atomen.When we speak of a modified monomer unit in the following, we are referring to the non-nucleoside monomer unit which contains the acid function with a pK _a of less than 3.0 or the negative charge. A monomer unit is preferably understood to mean a unit which is part of the above-mentioned oligomer and which contains at most one nucleobase. These units preferably contain only those parts of the molecule which were already present in the monomers used to synthesize the oligomers. As a rule, the oligomer is between 6 and 100, preferably 8 and 30, monomer units long. When calculating the length of the basic unit of each monomer, the following is based on the fact that the geometric length between the connecting points of the individual monomers is essentially the same and preferably coincides with the connecting points of the monomers from which the oligomer is produced. For example, in the preferred case of peptide nucleic acids, the length of a backbone unit extends from the carbonyl group of one end of the monomer unit to the amino end of the same monomer unit which is bonded to the subsequent carbonyl group of the next monomer unit. The length of a basic framework unit defined in this way is preferably between 4 and 8, particularly preferably 6, atoms.

Die modifizierte Monomereinheit kann prinzipiell jede beliebige, also auch die letzte nukleobasenhaltige Monomereinheit des Moleküls darstellen. Besonders bevorzugt jedoch ist die modifizierte Monomereinheit nicht die letzte basenhaltige Monomereinheit des Oli­ gomers. Besonders bevorzugt liegt die modifizierte Monomereinheit innerhalb des inneren Drittels der Gesamtlänge des Moleküls.The modified monomer unit can in principle be any one, including the last one represent nucleobase-containing monomer unit of the molecule. However, particularly preferred the modified monomer unit is not the last base-containing monomer unit of the oli gomers. The modified monomer unit is particularly preferably located within the inner one Third of the total length of the molecule.

Das mit Nukleinsäuren hybridisierende Molekül kann prinzipiell so viele modifizierte Monomereinheiten enthalten, wie Monomereinheiten vorhanden sind. Bevorzugt ist es je­ doch der Fall, daß weniger als die Hälfte der Monomereinheiten eine modifizierte Mono­ mereinheit darstellen. Die übrigen Monomereinheiten sind bevorzugt nicht negativ geladen, bevorzugt sind sie neutral. Die Diskriminierung zwischen Nukleinsäuren mit einer in einer oder mehreren Positionen unterschiedlichen Basensequenz wird dadurch begünstigt, daß das Molekül so gewählt wird, daß die modifizierte Monomereinheit ungefähr in der Mitte des Moleküls eingebaut ist und zwar zu der nachzuweisenden, nicht aber mit einer davon zu diskriminierenden Nukleinsäure gerade in dieser Position komplementär ist (mismatch).In principle, the molecule hybridizing with nucleic acids can have so many modified ones Monomer units contain how monomer units are present. It is preferred but the case that less than half of the monomer units are a modified mono represent unit. The remaining monomer units are preferably not negatively charged, they are preferably neutral. The discrimination between nucleic acids with one in one or more positions of different base sequence is favored in that the Molecule is chosen so that the modified monomer unit approximately in the middle of the Molecule is built in and to be detected, but not with one of them discriminating nucleic acid is complementary in this position (mismatch).

Unter einer nukleosidischen Einheit wird eine Einheit verstanden, die sowohl einen Zucker­ anteil, als auch einen Phosphatanteil enthält. Eine nicht-nukleosidische Einheit ist somit eine Monomereinheit, in welcher die Base nicht an einen Zuckeranteil, oder/und der Zuckeranteil nicht über einen Phosphatrest an eine benachbarte Monomereinheit gebunden ist. A nucleoside unit is understood to mean a unit that is both a sugar portion, as well as a phosphate portion. A non-nucleoside unit is therefore one Monomer unit in which the base does not have a sugar content, and / or the sugar content is not bound to an adjacent monomer unit via a phosphate residue.  

Unter einer Säurefunktion wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine chemische Gruppe verstanden, die kovalent an die nicht-nukleosidische Einheit gebunden ist. Diese Gruppe hat in an die nicht-nukleosidische Einheit gebundener Form bevorzugt einen pK_a von weniger als 3.0. Bevorzugt sind 2- oder mehrbasige Säuren. Bevorzugte Säurefunktionen sind ausgewählt aus der Gruppe der anorganischen Säuren, insbesondere den Gruppen der Sulfonsäuren, der Phosphonsäuren oder der Phosphorsäuren bzw. deren Salze. Ein Sulfonsäurerest ist bevorzugt eine Gruppe der Formel -SO₃H. Unter einem Phosphonsäurerest wird bevorzugt ein Rest der Formel -PO₃H₂ verstanden. Phosphorsäuren enthalten die Gruppe -OP(OH)₂O. Die Säurefunktion ist bevorzugt nicht an der kovalenten Bindung zweier Monomereinheiten miteinander beteiligt. Insbesondere ist die Säurefunktion bevorzugt an ein Kohlenstoffatom des Grundgerüsts (Backbone) gebunden, welches nicht das erste neben einem für die Verknüpfung mit dem nächsten Monomeren verwendeten Heteroatom (O, P, S oder N) ist. Die Säurefunktion kann entweder direkt oder über einen Abstandshalter A' mit der Grundgerüsteinheit der Monomereinheit, bevorzugt einem Atom der fortlaufenden Kette von Atomen im Backbone, z. B. einem C-Atom, verbunden sein. Die Säurefunktion zusammen mit dem Abstandshalter A' wird im Folgenden auch als eine Gruppe R enthaltend eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 bezeichnet.For the purposes of the present invention, an acid function is understood to mean a chemical group which is covalently bound to the non-nucleoside unit. In the form bound to the non-nucleoside unit, this group preferably has a pK _a of less than 3.0. 2- or polybasic acids are preferred. Preferred acid functions are selected from the group of inorganic acids, in particular the groups of sulfonic acids, phosphonic acids or phosphoric acids or their salts. A sulfonic acid residue is preferably a group of the formula -SO ₃ H. A phosphonic acid residue is preferably understood to mean a residue of the formula -PO ₃ H ₂ . Phosphoric acids contain the group -OP (OH) ₂ O. The acid function is preferably not involved in the covalent bond between two monomer units. In particular, the acid function is preferably bound to a carbon atom of the backbone, which is not the first in addition to a hetero atom (O, P, S or N) used for the linkage with the next monomer. The acid function can either directly or via a spacer A 'with the basic unit of the monomer unit, preferably one atom of the continuous chain of atoms in the backbone, e.g. B. a C atom. The acid function together with the spacer A 'is also referred to below as a group R containing an acid function with a pK _a of less than 3.0.

Der Abstandshalter A' verbindet ein Atom einer Reihe von linear aufeinanderfolgenden Atomen des Grundgerüsts mit einem Atom der Säurefunktion. Diese Abstandshalter können prinzipiell zwischen 1 und 20 Atomen lang sein. Besonders bevorzugt hat der Abstands­ halter A' die Formel III
The spacer A 'connects an atom of a series of linearly consecutive atoms of the basic structure with an atom of the acid function. In principle, these spacers can be between 1 and 20 atoms long. The spacer A 'particularly preferably has the formula III

-(-(-A¹-)_a-(-A²-)_b-(-A³-)_c-)_d- (III),
- (- (- A ¹ -) _a - (- A ² -) _b - (- A ³ -) _c -) _d - (III),

in der
A¹ Sauerstoff, NR⁶ oder Schwefel,
A² ein substituierter oder unsubstituierter Alkylen-, Alkinylen- oder Alkenylen- Rest,
A³ Sauerstoff, Schwefel oder NR⁶,
R⁶ unabhängig Wasserstoff, Acyl oder Alkyl,
a und c unabhängig voneinander eine Zahl von 0 bis 2,
b eine Zahl von 1 bis 10, und
d eine Zahl von 1 bis 4
bedeuten, wobei der Abstandshalter in jeder der beiden möglichen Orientierungen eingebaut sein kann.in the
A ¹ oxygen, NR ⁶ or sulfur,
A ^{2 is} a substituted or unsubstituted alkylene, alkynylene or alkenylene radical,
A ³ oxygen, sulfur or NR ⁶ ,
R ^{6 is} independently hydrogen, acyl or alkyl,
a and c independently of one another a number from 0 to 2,
b is a number from 1 to 10, and
d is a number from 1 to 4
mean, the spacer can be installed in either of the two possible orientations.

Alkyl, Acyl, Alkylen-, Alkinylen- und Alkenylen-Reste in der Definition von A² und R⁶ haben bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatome. Substituenten können beispielsweise gewählt werden aus der Gruppe Hydroxyl, Halogen (z. B. Cl, Br oder F) oder Amino.Alkyl, acyl, alkylene, alkynylene and alkenylene radicals in the definition of A ² and R ⁶ preferably have 1 to 3 carbon atoms. Substituents can be chosen, for example, from the group hydroxyl, halogen (e.g. Cl, Br or F) or amino.

Bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Molekül um ein mit Nukleinsäuren hybridisierendes Oligomer enthaltend mindestens eine nicht-nukleosidische Monomereinheit der Formel I
The molecule according to the invention is preferably an oligomer hybridizing with nucleic acids and containing at least one non-nucleoside monomer unit of the formula I.

worin
L ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, Hydroxyl, (C₁-C₄)- Alkanoyl, nukleo­ basenbindende Gruppe, (C₆-C₁₄)-Aromaten, Heterocyclen mit Stickstoff-, Sauer­ stoff- oder/und Schwefel-Atomen, Interkalatoren und Reportergruppen,
A ein Abstandshalter mit einer Länge von 1 bis 3 Atomen,
x eine Zahl zwischen 0 und 3,
B eine Grundgerüsteinheit mit einer Länge von zwischen 4 und 8 Atomen,
R eine Gruppe enthaltend eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 bedeuten. Ein bevorzugter Alkanoylrest (Acylrest) ist die Acetylgruppe. Unter Nukleobasen sollen die natürlich vorkommenden Basen A, C, G, T und U verstanden werden. Eine nukleobasenbindende Gruppe ist eine Gruppe, die mit einer solchen Nukleobase über wasserstoffbrückenspezifische Wechselwirkungen ausbilden kann. Hierzu gehören neben den (hierzu komplementären) natürlichen Nukleobasen auch unnatürliche Nukleobasen wie z. B. 7-Deazaguanosin oder Pseudopyrimidine. Aromaten können sowohl substituiert als auch unsubstituiert sein. Als Substituenten kommen insbesondere Hydroxyl, C₁-C₂-Alkoxy oder Amino in Frage. Bevorzugte Aromaten sind der Phenyl-, Pyrenyl- und der Naphthyl­ rest. Heterozyklen sind zyklische Verbindungen, welche ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus der Gruppe O, N und S enthalten, die nicht-aromatisch oder aromatisch sein können. Auch sie können durch die bei Aromaten genannten Reste substituiert sein. Bei­ spiele für Heterozyklen sind der Pyridylrest und der Piperidylrest. Interkalatoren sind Moleküle, die sich in die Basen-Basen-Wechselwirkung benachbarter Basen einschieben können, z. B. Acridin. Eine Reportergruppe kann zum Nachweis oder zur Immobilisierung des Moleküls verwendet werden. Insbesondere eignen sich immunologisch aktive Verbin­ dungen und biospezifische Wechselwirkungen aus bindenden Molekülen aus Reporter­ gruppen. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Reportergruppen sind die Markierungen oder Label. Hier besonders bevorzugt sind die elektrochemilumineszenten Rutheniumbis­ pyridylkomplexe.wherein
L is selected from the group hydrogen, hydroxyl, (C ₁ -C ₄ ) alkanoyl, nucleobase-binding group, (C ₆ -C ₁₄ ) aromatics, heterocycles with nitrogen, oxygen and / or sulfur atoms, intercalators and reporter groups,
A is a spacer with a length of 1 to 3 atoms,
x is a number between 0 and 3,
B is a basic unit with a length of between 4 and 8 atoms,
R is a group containing an acid function with a pK _a of less than 3.0. A preferred alkanoyl group (acyl group) is the acetyl group. Nucleobases are to be understood as the naturally occurring bases A, C, G, T and U. A nucleobase-binding group is a group which can form with such a nucleobase via interactions specific to hydrogen bonds. In addition to the (complementary) natural nucleobases, this also includes unnatural nucleobases such as B. 7-deazaguanosine or pseudopyrimidines. Aromatics can be both substituted and unsubstituted. Suitable substituents are in particular hydroxyl, C ₁ -C ₂ alkoxy or amino. Preferred aromatics are the phenyl, pyrenyl and naphthyl radical. Heterocycles are cyclic compounds which contain one or more heteroatoms selected from the group O, N and S, which can be non-aromatic or aromatic. They too can be substituted by the radicals mentioned for aromatics. Examples for heterocycles are the pyridyl radical and the piperidyl radical. Intercalators are molecules that can be inserted into the base-base interaction of neighboring bases, e.g. B. acridine. A reporter group can be used to detect or immobilize the molecule. Immunologically active compounds and biospecific interactions from binding molecules from reporter groups are particularly suitable. A particularly preferred group of reporter groups are the markings or labels. The electrochemiluminescent ruthenium bis pyridyl complexes are particularly preferred here.

Besonders bevorzugt ist L über den Abstandshalter A an ein Stickstoffatom, besonders be­ vorzugt an ein Aminstickstoffatom, in B gebunden. Ebenfalls bevorzugt ist die Gruppe R an die Grundgerüsteinheit, nicht jedoch direkt an das Stickstoffatom gebunden, an welches L gebunden ist.L is particularly preferably via the spacer A to a nitrogen atom, particularly be preferably bound to an amine nitrogen atom in B. The R group is also preferred the basic scaffold unit, but not directly bound to the nitrogen atom to which L is bound.

Besonders bevorzugte Moleküle weisen mindestens eine Monomereinheit der Formel II auf
Particularly preferred molecules have at least one monomer unit of the formula II

worin L, A und x die oben genannten Bedeutungen haben und
E' und F' unabhängig voneinander CO, CS, SO, SO₂ oder NR¹, wobei R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und (C₁-C₃)-Alkyl,
N ein Aminstickstoffatom, und
C und D unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe (CR²R³)n und
CR²R³CR⁴R⁵
wobei
R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, C₁-C₆-(substituiertes oder unsubstituiertes) Alkyl, Hydroxyl, Carboxyl und einer die Säurefunktion enthaltenden Gruppe R, und
n eine Zahl zwischen 1 und 4 ist.wherein L, A and x have the meanings given above and
E 'and F' independently of one another CO, CS, SO, SO ₂ or NR ¹ , where R _{1 is} selected from the group hydrogen and (C ₁ -C ₃ ) alkyl,
N is an amine nitrogen atom, and
C and D are independently selected from the group (CR ² R ³ ) n and
CR ² R ³ CR ⁴ R ⁵
in which
R ² , R ³ , R ⁴ and R ^{5 are} independently selected from the group hydrogen, C ₁ -C ₆ - (substituted or unsubstituted) alkyl, hydroxyl, carboxyl and a group R containing the acid function, and
n is a number between 1 and 4.

Mindestens eine der Reste R²-R³, bzw. R²-R⁵ ist eine Gruppe R.At least one of the radicals R ² -R ³ or R ² -R ⁵ is a group R.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Molekül der Formel IV
The invention also relates to a molecule of the formula IV

in der
L ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff- Hydroxyl, (C₁-C₄)-Alkanoyl, nukleobasenbindende Gruppe in geschützter oder ungeschützter Form, (C₆-C₁₄)-Aromaten, Heterocyclen mit Stickstoff-, Sauerstoff- oder/und Schwefel-Atomen, Interkalatoren und Reportergruppen,
A ein Abstandshalter mit einer Länge von zwischen 1 und 3 Atomen,
x eine Zahl zwischen 0 und 3,
E und F unabhängig voneinander COOX, CSOX, SO₂X, SO₃X oder NR¹Y,
wobei
R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und (C₁-C₃)-Alkyl,
X ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, der Schutzgruppen und der Akti­ vierungsgruppen,
Y ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und Schutzgruppe,
N ein Aminstickstoffatom und
C und D unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe (CR²R³)_n und CR²R³CR⁴R⁵
wobei
R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, C ₁-C₆-(substituiertes oder unsubstituiertes) Alkyl, Hydroxyl, Carboxyl und einer eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 enthaltenden Gruppe R in geschützter oder ungeschützter Form, und
n eine Zahl zwischen 1 und 4 ist.in the
L is selected from the group hydrogen-hydroxyl, (C ₁ -C ₄ ) alkanoyl, nucleobase-binding group in protected or unprotected form, (C ₆ -C ₁₄ ) aromatics, heterocycles with nitrogen, oxygen or / and sulfur Atoms, intercalators and reporter groups,
A is a spacer with a length of between 1 and 3 atoms,
x is a number between 0 and 3,
E and F independently of one another COOX, CSOX, SO ₂ X, SO ₃ X or NR ¹ Y,
in which
R ^{1 is} selected from the group consisting of hydrogen and (C ₁ -C ₃ ) alkyl,
X is selected from the group hydrogen, the protective groups and the activation groups,
Y is selected from the group hydrogen and protective group,
N is an amine nitrogen atom and
C and D are independently selected from the group (CR ² R ³ ) _n and CR ² R ³ CR ⁴ R ⁵
in which
R ² , R ³ , R ⁴ and R ^{5 are} independently selected from the group hydrogen, C ₁ -C ₆ - (substituted or unsubstituted) alkyl, hydroxyl, carboxyl and a group containing an acid function with a pK _a of less than 3.0 R in protected or unprotected form, and
n is a number between 1 and 4.

Diese Moleküle sind zur Synthese der erfindungsgemäßen Oligomeren einsetzbar. Be­ sonders bevorzugt sind dann solche Moleküle, bei denen einer der Reste E und F eine geschützte Amino- oder Carbonsäurefunktion ist und der andere entweder eine reaktive Gruppe, wie eine Carbonsäure- oder primäre Aminogruppe oder ein entsprechendes aktiviertes Derivat, z. B. ein Aktivester, bedeutet. Eine Aktivierungsgruppe ist beispielsweise 1-Oxybenzotriazol. Während der Oligomersynthese ist die Säurefunktion bevorzugt mit Hilfe einer Schutzgruppe geschützt, bevorzugt in Form eines Esters, der gespalten werden kann, ohne daß das Oligomer fragmentiert wird. Solche Schutzgruppen sind beispielsweise Benzyl und β-Cyanoethyl. Die z. B. aus der chemischen Oligonukleotidsynthese oder der Synthese von Peptidnukleinsäuren (WO 92/20702) bekannten Syntheseverfahren können analog zur Synthese der erfindungsgemäßen bzw. der erfindungsgemäß verwendeten Oligomeren verwendet werden. These molecules can be used for the synthesis of the oligomers according to the invention. Be those molecules in which one of the radicals E and F is a are particularly preferred is protected amino or carboxylic acid function and the other is either reactive Group such as a carboxylic acid or primary amino group or the like activated derivative, e.g. B. an active ester. An activation group is for example 1-oxybenzotriazole. During the oligomer synthesis is the acid function preferably protected with the aid of a protective group, preferably in the form of an ester which can be cleaved without the oligomer being fragmented. Such protecting groups are, for example, benzyl and β-cyanoethyl. The z. B. from the chemical Oligonucleotide synthesis or the synthesis of peptide nucleic acids (WO 92/20702) known synthetic methods can be analogous to the synthesis of the invention or Oligomers used according to the invention can be used.  

Ein besonders geeignetes Monomer ist in Fig. 1 angegeben (Verbindung 3). Es handelt sich hierbei um ein Derivat der Aminosäure Homoserin. Diese Verbindung ist am Amino-Ende der Grundgerüstmonomereinheit mit einer t-Butyloxycarbonyl(Boc)-Schutzgruppe an gegebenenfalls vorhandenen exozyklischen Aminogruppen der Base mit einer Benzyloxycarbonyl (Z)gruppe und an der Hydroxylgruppe des Homoserins durch Ersatz des Wasserstoff durch eine als Di-Benzylester geschützte Phosphatgruppe gekennzeichnet.A particularly suitable monomer is shown in Fig. 1 (compound 3 ). It is a derivative of the amino acid homoserine. This compound is at the amino end of the backbone monomer unit with a t-butyloxycarbonyl (Boc) protective group on the optionally present exocyclic amino groups of the base with a benzyloxycarbonyl (Z) group and at the hydroxyl group of the homoserine by replacing the hydrogen with a protected as di-benzyl ester Phosphate group marked.

In Fig. 1 ist weiterhin eine Verbindung (4) gezeigt, bei der die Aminogruppe der Grundge­ rüsteinheit mit einer Monomethoxytrityl-Schutzgruppe und die exocyclischen Aminofunk­ tionen der Base mit einer Acyl-Schutzgruppe (Benzoyl, Isobutyryl) geschützt ist. Die Homoserinhydroxyl-Gruppe ist mit einem di-βn-Cyanoethyl-geschützten Phosphatrest ver­ estert. Als Verbindung 5 ist die entsprechende in das Oligomere eingebaute entschützte Monomereinheit gezeigt. Weiterhin sind in Fig. 1 das entsprechende auf Serin als Aminosäure beruhende Monomer 1 und die entschützte Monomereinheit 2 gezeigt. Als Verbindungen 6, 7, 8 und 9 sind die auf Homoserin beruhenden Phosphonate und Sulfonate gezeigt. Die Abstandshalter zwischen der Säurefunktion (PO₄ ^2-, PO₃ ^2- und SO₃⁻) und dem Kohlenstoffatom der linearen Backbonekette folgen bevorzugt der Formel (CH₂)_n, wobei n Werte von 1 bis 6, bevorzugt 2 bis 4 annimmt.In Fig. 1, a compound ( 4 ) is also shown, in which the amino group of the basic unit is protected with a monomethoxytrityl protective group and the exocyclic amino functions of the base are protected with an acyl protective group (benzoyl, isobutyryl). The homoserine hydroxyl group is esterified with a di-βn-cyanoethyl-protected phosphate residue. Compound 5 shows the corresponding deprotected monomer unit built into the oligomer. Furthermore, the corresponding monomer 1 based on serine as amino acid and the deprotected monomer unit 2 are shown in FIG. 1. As compounds 6 , 7 , 8 and 9 , the phosphonates and sulfonates based on homoserine are shown. The spacers between the acid function (PO ₄ ^2- , PO ₃ ^2- and SO ₃ ⁻) and the carbon atom of the linear backbone chain preferably follow the formula (CH ₂ ) _n , where n assumes values from 1 to 6, preferably 2 to 4.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nukleinsäure in einer Probe, bei der zu vermuten ist, daß sie eine oder mehrere nicht-nachzuweisende Nukleinsäuren (zu diskriminierende Nukleinsäure(n)) enthält, deren Basensequenz sich von der Basensequenz der Nukleinsäure in einer oder mehreren Positionen unterscheidet, enthaltend die Schritte Inkontaktbringen einer Sonde, welche eine Basensequenz enthält, die zu der nachzuweisenden, nicht jedoch zu der anderen Nukleinsäuren komplementär ist, und Feststellung, ob eine Bindung der Sonde an eine zu der Basensequenz komplementäre Basensequenz stattgefunden hat, dadurch gekennzeichnet, daß als Sonde ein mit Nukleinsäuren hybridisierbares Molekül mit einem Grundgerüst aus linear miteinander verknüpften Monomereinheiten, wobei mindestens eine der Monomereinheiten eine nicht-nukleosidische Einheit ist, die eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 enthält, verwendet wird.The invention also relates to a method for detecting the presence or absence of a nucleic acid in a sample, in which it can be assumed that it contains one or more non-detectable nucleic acids (nucleic acid (s) to be discriminated), the base sequence of which differs from the base sequence distinguishes the nucleic acid in one or more positions, comprising the steps of contacting a probe which contains a base sequence which is complementary to the nucleic acid to be detected but not to the other nucleic acid and determining whether binding of the probe to a base sequence complementary to the base sequence has taken place, characterized in that the probe is a nucleic acid hybridizable molecule with a backbone of linearly linked monomer units, at least one of the monomer units being a non-nucleoside unit which contains an acid function with a pK _a of less than 3.0, ve is used.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine spezielle Ausführungsform der sogenannten Hybridisierungstests, die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im Folgen­ den nicht ausgeführt sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation", Heraus­ geber B.D. Hames und S.J. Higgins, IRL Press, 1986, z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridisation) und 4 (Quantitative Filter Hybridisation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, und Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, Bezug ge­ nommen.The method according to the invention is a special embodiment the so-called hybridization tests, the basic features of which are known to those skilled in the art  Are known in the field of nucleic acid diagnostics. So far experimental details in the following which are not set out, the full content is "Nucleic acid hybridization", out B.D. Hames and S.J. Higgins, IRL Press, 1986, e.g. B. in Chapter 1 (Hybridization Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridization) and 4 (Quantitative Filter Hybridization), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, and Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, reference ge taken.

Unter einer Sonde wird allgemein ein nukleinsäurebindendes Molekül verstanden, welches von natürlichen Nukleinsäuren durch Anbringen einer chemischen Gruppe unterscheidbar gemacht wurde. Bei der chemischen Gruppe kann es sich einerseits um eine immobilisier­ bare Gruppe, andererseits um eine Markierung handeln. Diese Sonde enthält eine Basen­ sequenz, die zu einer Sequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure, nicht jedoch einer Sequenz der anderen, nicht-nachzuweisenden Nukleinsäuren komplementäre Basensequenz enthält. Diese Sequenz ist bevorzugt länger als 10 Basen. Bevorzugt ist die Sequenz fortlaufend und ununterbrochen. Die Länge der Sequenz beträgt bevorzugt 10 oder mehr Basen, besonders bevorzugt 15 oder mehr Basen. Die Sonde kann darüber hinaus noch weitere Basen enthalten, die die diskriminierenden Eigenschaften der Sonde nicht beeinflussen, da sie nicht zu einer stärkeren Bindung der Sonde an eine nicht-nachzu­ weisende Nukleinsäure führen als zu der nachzuweisenden. Im Allgemeinen ist dies sicher­ gestellt, wenn diese Basen nicht zu einer Basensequenz komplementär sind, die direkt neben einer potentiellen Bindesequenz für die Sonde auf einer nicht-nachzuweisenden Nuklein­ säure liegt. Solche zusätzlichen Basen können beispielsweise dazu verwendet werden, die Sonde selbst spezifisch über eine Nukleotidsequenz zu erkennen, z. B. zur Verwendung als universelle Nachweissonde.A probe is generally understood to mean a nucleic acid-binding molecule which distinguishable from natural nucleic acids by attaching a chemical group have been done. The chemical group can be immobilized on the one hand bare group, on the other hand act as a marker. This probe contains a base sequence that results in a sequence of the nucleic acid to be detected, but not one Sequence of the other, undetectable nucleic acids complementary base sequence contains. This sequence is preferably longer than 10 bases. The sequence is preferred continuously and continuously. The length of the sequence is preferably 10 or more Bases, particularly preferably 15 or more bases. The probe can also contain other bases that do not discriminate the probe's properties affect, since they do not lead to stronger binding of the probe to a non-post pointing nucleic acid lead to the one to be detected. In general, this is safe if these bases are not complementary to a base sequence that is right next to it a potential binding sequence for the probe on an undetectable nucleotide acid lies. Such additional bases can be used, for example, to: To recognize the probe itself specifically via a nucleotide sequence, e.g. B. for use as universal detection probe.

Eine Markierung im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht aus einer direkt oder indirekt nachweisbaren Gruppe L. Direkt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise radioaktive (³²P), farbige, oder fluoreszierende Gruppen, Metalle oder Metallkomplexe. Indirekt nach­ weisbare Gruppen sind beispielsweise immunologisch oder enzymatisch wirksame Verbin­ dungen, wie Antikörper, Antigene, Haptene oder Enzyme oder enzymatisch aktive Teil­ enzyme. Diese werden in einer nachfolgenden Reaktion oder Reaktionssequenz detektiert. Besonders bevorzugt sind Haptene, da an mit ihnen markierte Oligomere über eine an­ schließende Reaktion mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten leicht vorge­ nommen werden kann. Besonders gute Wirkung zeigt die Erfindung für lipophile Label, wie Biotin, Fluorescein, Pyrenyl oder Ruthenium-organische Komplexe.A label in the sense of the present invention consists of a directly or indirectly detectable group L. Directly detectable groups are, for example, radioactive ( ³² P), colored or fluorescent groups, metals or metal complexes. Indirectly detectable groups are, for example, immunologically or enzymatically active compounds, such as antibodies, antigens, haptens or enzymes or enzymatically active partial enzymes. These are detected in a subsequent reaction or reaction sequence. Haptens are particularly preferred because oligomers labeled with them can easily be made via a subsequent reaction with a labeled antibody against the hapten. The invention has particularly good effects for lipophilic labels such as biotin, fluorescein, pyrenyl or ruthenium-organic complexes.

Unter einer immobilisierbaren Gruppe wird ein chemischer Rest verstanden, welcher zur Bindung der Sonde an eine Festphase benutzt werden kann. Hierfür eignen sich daher so­ wohl aktivierbare Reste (z. B. photoaktivierbare) aber auch Partner eines spezifischen Bindepaares, wie Rezeptoren und zugehörige Liganden, Partner einer immunologischen Reaktion, wie z. B. Haptene, Antigene oder Antikörper, oder Vitamine bzw. Rezeptoren für diese Vitamine. Besonders bevorzugt als immobilisierbare Gruppe sind Haptene oder Biotin sowie dessen Derivate. Besonders bevorzugt ist Biotin. Die feste Phase, an welche die Sonde mittels der immobilisierbaren Gruppe gebunden werden kann, weist einen ent­ sprechenden Bindungspartner oder eine entsprechende Reaktivität auf. Im Falle von Biotin kann daher die Festphase einen Überzug aus Streptavidin aufweisen.An immobilizable group is understood to mean a chemical residue which is used for Binding of the probe to a solid phase can be used. So are suitable for this residues that can be activated (e.g. photoactivatable) but also partners of a specific one Binding pair, such as receptors and associated ligands, partners in an immunological Response, such as B. haptens, antigens or antibodies, or vitamins or receptors for these vitamins. Haptens or biotin are particularly preferred as the immobilizable group and its derivatives. Biotin is particularly preferred. The fixed phase to which the Probe can be bound by means of the immobilizable group, has one ent speaking binding partner or a corresponding reactivity. In the case of biotin the solid phase can therefore have a coating of streptavidin.

Unter einer Analytnukleinsäure wird die Nukleinsäure verstanden, die Ziel des Nachweises ist. Darunter sind Nukleinsäuren jeglichen Ursprungs zu verstehen, beispielsweise Nuklein­ säuren viroiden, viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs. Sie können in Lösung, Suspension, aber auch an Festkörpern fixiert oder in zellhaltigen Medien, Zellabstrichen, fixierten Zellen, Gewebsschnitten oder fixierten Organismen vorliegen. Bevorzugt liegen die Nukleinsäuren in Lösung (in-vitro) vor.An analyte nucleic acid is understood to mean the nucleic acid, the aim of the detection is. This includes nucleic acids of any origin, for example nuclein acids of viroid, viral, bacterial or cellular origin. You can in solution, Suspension, but also fixed to solids or in cell-containing media, cell swabs, fixed cells, tissue sections or fixed organisms are present. The are preferably Nucleic acids in solution (in vitro).

Die Reaktionssequenz wird meist gestartet durch Verfügbarmachung der Analytnuklein­ säure mit entsprechenden Reagenzien. Hierbei können sowohl Veränderungen des pHs (alkalisch), Hitze, Wiederholung extremer Temperaturveränderungen (Einfrieren/Auftauen), Veränderung der physiologischen Wachstumsbedingungen (Osmotischer Druck), Einwir­ kung von Detergenzien, chaotropen Salzen oder Enzymen (z. B. Proteasen, Lipasen), alleine oder in Kombination zur Freisetzung der Nukleinsäuren beitragen.The reaction sequence is usually started by making the analyte nucleus available acid with appropriate reagents. Both changes in pH (alkaline), heat, repetition of extreme temperature changes (freezing / thawing), Change in the physiological growth conditions (osmotic pressure) detergents, chaotropic salts or enzymes (e.g. proteases, lipases), contribute alone or in combination to the release of the nucleic acids.

Denaturierung von Nukleinsäuren bedeutet Auftrennung von Nukleinsäuredoppelsträngen in Einzelstränge. Dem Fachmann stehen prinzipiell eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Ver­ fügung, z. B. Behandlung durch Alkalihydroxide, durch Hitze, oder durch Chemikalien.Denaturation of nucleic acids means separation of nucleic acid double strands in Single strands. In principle, a multitude of possibilities are available to the person skilled in the art addition, e.g. B. Treatment by alkali hydroxides, by heat, or by chemicals.

Unter einem spezifischen Nachweis wird ein Verfahren verstanden, durch welches ge­ wünschtenfalls selektiv bestimmte Nukleinsäuren auch in Gegenwart anderer, hiervon zu diskriminierender, Nukleinsäuren nachgewiesen werden können. Es ist jedoch auch möglich, eine Gruppe von Nukleinsäuren mit teilweise übereinstimmender oder ähnlicher Nukleotid­ sequenz nachzuweisen. Zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuren kann jeder der beiden komplementären Stränge einbezogen werden. Bevorzugt ist daher die spezifische Sequenz der Sonde auf eine Länge von mehr als 10, bevorzugt mehr als 15 Basen zu mehr als 90, bevorzugt mehr als 95 und besonders bevorzugt zu 100% komplementär zu einer Sequenz von gleichvielen ununterbrochen aufeinanderfolgenden Basen der nachzuweisenden Nukleinsäure. Besonders gute Wirkung zeigt die vorliegende Erfindung für Sequenzen, die besonders purinreich sind, d. h. mehr als 50% Purine enthalten. Besonders bevorzugt ist sie für Sequenzen, die in einer ununterbrochenen Reihe 4 oder mehr Purine, z. B. G, enthalten. In diesem Falle liegt die erfindungsgemäß modifizierte Monomereinheit bevorzugt innerhalb dieses Homopurinbereiches.A specific detection is understood to be a method by which ge if desired, certain nucleic acids can also be selectively present in the presence of others discriminatory, nucleic acids can be detected. However, it is also possible  a group of nucleic acids with partially matching or similar nucleotide demonstrate sequence. Any of the following can be used to detect double-stranded nucleic acids two complementary strands are included. The specific one is therefore preferred Sequence of the probe to a length of more than 10, preferably more than 15 bases more than 90, preferably more than 95 and particularly preferably 100% complementary to one Sequence of equal number of consecutive bases of the to be detected Nucleic acid. The present invention is particularly effective for sequences which are particularly rich in purine, d. H. contain more than 50% purines. It is particularly preferred for sequences that consist of 4 or more purines, e.g. B. G included. In this case, the monomer unit modified according to the invention is preferably within this homopurine range.

Unter einer zu einer Nukleinsäure im wesentlichen komplementären Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz werden Nukleinsäuren oder Sequenzen verstanden, die mit der ent­ sprechenden Nukleinsäure hybridisieren können, deren Nukleotidsequenz im hybridisieren­ den Bereich entweder genau komplementär zu der anderen Nukleinsäure ist oder sich in wenigen Basen von der genau komplementären Nukleinsäure unterscheidet. Die Spezifität richtet sich dabei sowohl nach dem Grad der Komplementarität als auch nach den Hybridi­ sierungsbedingungen.Under a nucleic acid which is essentially complementary to a nucleic acid or Nucleic acid sequence is understood to mean nucleic acids or sequences which start with the ent can hybridize speaking nucleic acid, the nucleotide sequence of which hybridize the region is either exactly complementary to the other nucleic acid or in a few bases from the exactly complementary nucleic acid. The specificity depends on both the degree of complementarity and the hybridi conditions.

Zwei Basen sind üblicherweise dann komplementär, wenn sie miteinander Basenpaarungen ausbilden können, die bevorzugt der Watson-Crick-Regel oder der Hoogsteen-Basen­ paarung folgen. Die Komplementaritätsbedingung bezieht sich auf zwei oder mehr Basen­ sequenzen mit direkt zueinander benachbarten Basen mit einer Länge von 10 oder mehr Basen. Genau komplementär heißt zu 100% komplementär; bei Unterschieden sollten diese bei weniger als 10%, bevorzugt weniger als 5% der Basen innerhalb des hybridisierenden Bereiches liegen. Die Unterschiede müssen natürlich so gewählt werden, daß sie die Spezifi­ tät des Tests für die nachzuweisende Nukleinsäure nicht entscheidend verschlechtern.Two bases are usually complementary when they base pair together can train, preferably the Watson-Crick rule or the Hoogsteen bases mating follow. The complementarity condition refers to two or more bases sequences with bases directly adjacent to one another with a length of 10 or more Bases. Completely complementary means 100% complementary; if there are any differences, less than 10%, preferably less than 5% of the bases within the hybridizing Range. The differences must of course be chosen so that they are the spec test does not deteriorate significantly for the nucleic acid to be detected.

Die nachzuweisende Nukleinsäure kann die Analytnukleinsäure selbst sein. Sie kann aber auch eine Nukleinsäure sein, die aus der Analytnukleinsäure durch Vorbehandlung in der Probenflüssigkeit hergestellt wurde. Zu den bekannten Vorbehandlungen gehört insbe­ sondere die Fragmentierung, beispielsweise mittels Restriktionsenzymen, oder die cDNS-Synthese aus RNS. Damit das erfindungsgemäße Verfahren seine Vorteile voll entfalten kann, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure eine Größe von mindestens 40 bp aufweist. Bevorzugt ist die nachzuweisende Nukleinsäure das Produkt einer vorgeschalteten spezifischen oder unspezifischen Nukleinsäurevermehrung. Solche Nukleinsäureamplifikationsverfahren sind beispielsweise aus EP-A-0 201 184, EP-A-0 237 362, EP-A-0 329 822, EP-A-0 320 308 oder WO 88/10315 bekannt. In diesen Verfahren dient die Analytnukleinsäure als Templatnukleinsäure für die Herstellung der letztendlich nachzuweisenden Nukleinsäure. Die Nukleinsäure kann jedoch auch eine durch Klonierung und in-vivo-Vermehrung hergestellte Nukleinsäure sein.The nucleic acid to be detected can be the analyte nucleic acid itself. But it can also be a nucleic acid which is obtained from the analyte nucleic acid by pretreatment in the Sample liquid was prepared. Known pretreatments include in particular the fragmentation, for example by means of restriction enzymes, or the cDNA synthesis from RNA. So that the method according to the invention fully unfolds its advantages  can, it has proven to be useful if the nucleic acid to be detected a Has a size of at least 40 bp. The nucleic acid to be detected is preferably the Product of an upstream specific or non-specific nucleic acid amplification. Such nucleic acid amplification methods are described, for example, in EP-A-0 201 184, EP-A-0 237 362, EP-A-0 329 822, EP-A-0 320 308 or WO 88/10315 are known. In these The method uses the analyte nucleic acid as a template nucleic acid for the production of ultimately nucleic acid to be detected. However, the nucleic acid can also be a Cloning and nucleic acid produced in vivo.

Beispielsweise kann ein Verfahren zum Nachweis eines speziellen Virus, z. B. HGV, in einer Körperflüssigkeit (z. B. Serum) als ersten Schritt die Lyse der Virushülle enthalten. Verfahren zur Lyse von Zellwänden sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise kann die Lyse durch Behandlung mit Alkalihydroxydlösungen vorgenommen werden. Auch der Zusatz von Hilfsstoffen, z. B. Detergenzien, ist möglich. Daran kann sich insbesondere bei Viren, welche nur in geringen Konzentrationen in Körperflüssigkeiten vorliegen (z. B. Hepatitis C-Virus), eine in-vitro Nukleinsäurevermehrung anschließen (z. B. über die Poly­ merase Chain Reaction oder die anderen oben genannten Amplifikationsverfahren). Dabei wird mit der Analytnukleinsäure als Templatnukleinsäure eine Vielzahl von Nukleinsäuren gebildet, welche dann in dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden.For example, a method for detecting a specific virus, e.g. B. HGV, in a body fluid (e.g. serum) as a first step containing the lysis of the virus envelope. Methods for the lysis of cell walls are known to the person skilled in the art. For example, the Lysis can be done by treatment with alkali hydroxide solutions. Also the Addition of auxiliary substances, e.g. B. detergents is possible. This can particularly be the case with Viruses that are only present in low concentrations in body fluids (e.g. Hepatitis C virus), connect an in vitro nucleic acid amplification (e.g. via the poly merase chain reaction or the other amplification methods mentioned above). Here is a multitude of nucleic acids with the analyte nucleic acid as template nucleic acid formed, which are then detected in the method according to the invention.

Bei einem Nachweis von Bakterien, beispielsweise in Lebensmitteln, könnten dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren ebenfalls mehrere Schritte vorgeschaltet werden. Im allgemeinen werden Bakterienproben ggf. nach in vivo Vermehrung der Bakterien unter Bedingungen, welche die Lyse der Bakterienzellwand bewirken (z. B. Proteinasen, Alkali), aufge­ schlossen. Bei sehr niedrig konzentrierten Proben kann sich auch hier eine in vitro Amplifi­ kation der Analytnukleinsäuren des Bakteriums anschließen.If bacteria, for example in food, are detected, this could be the result Process according to the invention can also be preceded by several steps. In general if necessary, bacterial samples are grown after in vivo multiplication of the bacteria under conditions which cause the lysis of the bacterial cell wall (e.g. proteinases, alkali) closed. In the case of very low-concentration samples, an in vitro amplifi can also occur connect cation of the bacterial analyte nucleic acids.

Resultat der diversen Vorbehandlungen ist eine Probenflüssigkeit, welche Nukleinsäuren gelöst enthält und in der ggf. die in den vorbereitenden Schritten eingesetzten Reagenzien sowie gegebenenfalls zerstörte Zellbestandteile enthalten sind.The result of the various pretreatments is a sample liquid, which is nucleic acids contains dissolved and in which, if necessary, the reagents used in the preparatory steps as well as possibly destroyed cell components are contained.

Für die Durchführung des spezifischen Nachweises mit Hilfe der Sonde gemäß der vor­ liegenden Erfindung stehen dem Fachmann bekannte Verfahren zur Verfügung. Diese be­ ruhen im wesentlichen darauf, daß die nukleinsäurehaltige Probe mit der Sonde unter Be­ dingungen inkubiert wird, bei denen die Sonde spezifisch an die nachzuweisende Nuklein­ säure bindet, jedoch nicht oder in untergeordnetem Ausmaß an die nicht nachzuweisenden Nukleinsäuren in der Probe. Wenngleich in den meisten Fällen die für die nicht-modifizierten Sonden geeigneten Reaktionsbedingungen für die Hybridisierung auch bei den erfindungs­ gemäßen Molekülen angewandt werden können (z. B. für PNA die in WO 92/20703 ge­ nannten Bedingungen), so hat es sich doch erwiesen, daß die Sensitivität und Dynamik mit abnehmender Salzkonzentration im Hybridisierungspuffer zunehmen. Dies ist vorteilhaft, da bei niedriger Salzkonzentration DNA-DNA-Hybridisierungen ungünstiger werden. Dies gilt insbesondere für den Fall der Renaturierung ursprünglich doppelsträngiger Analytnuklein­ säuren gegenüber der Hybridisierung relativ kurzer erfindungsgemäßer Oligomere. Die er­ findungsgemäßen Sonden zeigen ein gegenüber DNA-Sonden umgekehrtes Bild. Bei DNA-Sonden steigt mit zunehmender Salzkonzentration die Signaldynamik und Sensitivität. Für den bevorzugten Fall von erfindungsgemäß modifizierten PNA-Sonden hat sich gezeigt, daß die bevorzugte Konzentration von Salz (NaCl) bei zwischen 0 und 150 mM liegt. Ein Ver­ gleich erfindungsgemäßer Sonden gegenüber DNA-Sonden ist in Fig. 2 gezeigt. Im ersten Schaubild ist der Einfluß der Natriumchloridkonzentration auf die Sensitivität eines HGV-Tests unter Verwendung einer Rutheniumkomplex markierten DNA-Sonde bei verschiede­ nen Salzkonzentrationen gezeigt. Im zweiten Schaubild ist derselbe Versuch mit einer er­ findungsgemäßen PNA-Sonde mit derselben Sequenz gezeigt, wobei der Ruthenium­ komplex über zwei Glutaminreste an das PNA-Grundgerüst gebunden ist, und das Grundge­ rüst darüber hinaus zwei Glutaminreste enthält. Es ist erkennbar, daß die Salzabhängigkeit für die DNA-Sonde verglichen mit der PNA-Sonde unterschiedlich verläuft, obwohl die Sonde negative Ladungen enthält. Gerade bei niedriger Salzkonzentration, bei der die Re­ naturierung des Amplicon-Doppelstranges unterdrückt ist, ist die Signaldynamik und Sensi­ tivität bei Verwendung partiell negativ geladener PNA-Sonden im Gegensatz zu DNA-Sonden optimal.Methods known to the person skilled in the art are available for carrying out the specific detection with the aid of the probe according to the present invention. These are essentially based on the fact that the nucleic acid-containing sample is incubated with the probe under conditions in which the probe specifically binds to the nucleic acid to be detected, but not or to a lesser extent to the nucleic acids not to be detected in the sample. Although in most cases the reaction conditions for the hybridization which are suitable for the unmodified probes can also be applied to the molecules according to the invention (for PNA, for example, the conditions mentioned in WO 92/20703), it has nevertheless been found that the sensitivity and dynamics increase with decreasing salt concentration in the hybridization buffer. This is advantageous because at low salt concentrations, DNA-DNA hybridizations become less favorable. This applies in particular to the case of the renaturation of originally double-stranded analyte nucleic acids compared to the hybridization of relatively short oligomers according to the invention. The probes according to the invention show a reverse image compared to DNA probes. With DNA probes, the signal dynamics and sensitivity increase with increasing salt concentration. For the preferred case of PNA probes modified according to the invention, it has been shown that the preferred concentration of salt (NaCl) is between 0 and 150 mM. A comparison of probes according to the invention to DNA probes is shown in FIG. 2. The first diagram shows the influence of sodium chloride concentration on the sensitivity of an HGV test using a DNA probe labeled with a ruthenium complex at various salt concentrations. The second diagram shows the same experiment with a PNA probe according to the invention with the same sequence, the ruthenium complex being bound to the PNA backbone via two glutamine residues, and the backbone also containing two glutamine residues. It can be seen that the salt dependency for the DNA probe is different compared to the PNA probe, even though the probe contains negative charges. Especially when the salt concentration is low and the amplification of the amplicon duplex is suppressed, the signal dynamics and sensitivity are optimal when using partially negatively charged PNA probes in contrast to DNA probes.

Im dritten Schaubild ist die Salzabhängigkeit einer Sonde gezeigt, welche zwei Lysinreste (positive Ladungen) im Backbone enthält. Es ist erkennbar, daß die Signaldynamik sowie Sensitivität kaum salzabhängig sind, die Leerwertsignale aber gerade bei niedrigen Salzkonzentrationen stark erhöht sind. Im vierten Schaubild ist die Salzabhängigkeit einer unmodifizierten, im Backbone neutralen PNA-Sonde mit zwei Glutaminsäureresten als Linker zum Rutheniumkomplex gezeigt. Auch hier steigt wie bei den partiell negativ geladenen PNA-Sonden Signaldynamik und Sensitivität zu niedrigen Salzkonzentrationen hin an, die optimale NaCl-Konzentration liegt bei 50 mM. Allerdings ist das Leerwertsignal deutlich erhöht.The third diagram shows the salt dependency of a probe, which has two lysine residues (positive charges) in the backbone. It can be seen that the signal dynamics as well Sensitivity are hardly salt-dependent, but the blank value signals are especially low Salt concentrations are greatly increased. In the fourth graph, salt dependence is one unmodified, backbone neutral PNA probe with two glutamic acid residues as Linker shown to the ruthenium complex. Here too, as in the case of the partially negative  loaded PNA probes signal dynamics and sensitivity to low salt concentrations towards, the optimal NaCl concentration is 50 mM. However, the blank signal clearly increased.

Nach der Inkubation wird festgestellt, ob bzw. in welchem Ausmaß sich Hybride aus der nachzuweisenden Nukleinsäure und der Sonde gebildet haben. Zum Nachweis verwendet man die an der Sonde befindliche Markierung, deren Anwesenheit im Komplex aus nachzu­ weisender Nukleinsäure und Sonde zum Zeichen der Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure verwendet wird. Dies geschieht bevorzugt, nachdem man einen eventuellen Überschuß an Sonde von dem Hybrid abgetrennt hat. Dies kann beispielsweise durch Ab­ fangen des Hybrides mit Hilfe einer festphasengebundenen Fangsonde geschehen. Nach einer Inkubationszeit, während der die Immobilisierungsreaktion stattfindet, wird die flüssige Phase von der festen Phase (z. B. aus dem Gefäß, dem porösen Material oder den pelletierten beads) entfernt. Die Festphase kann anschließend mit einem geeigneten Puffer gewaschen werden.After the incubation, it is determined whether or to what extent hybrids emerge from the nucleic acid to be detected and the probe. Used for proof to trace the label on the probe, its presence in the complex pointing nucleic acid and probe to indicate the presence of those to be detected Nucleic acid is used. This is preferably done after seeing a possible one Excess probe has separated from the hybrid. This can be done, for example, from Ab catch of the hybrid with the help of a solid-phase capture probe. After an incubation period during which the immobilization reaction takes place, the liquid phase from the solid phase (e.g. from the vessel, the porous material or the pelleted beads) removed. The solid phase can then be used with a suitable buffer getting washed.

Die Menge des an die Festphase gebundenen Hybrides aus nachzuweisender Nukleinsäure, Nachweissonde und Fangsonde kann auf im Prinzip bekannte Weise bestimmt werden, z. B. nach Art eines Sandwich-Hybridisierungsverfahrens. Bei diesem Verfahren wird das Hybrid mit der erfindungsgemäßen Nachweissonde umgesetzt, welche zu einer anderen Nukleotid­ sequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure als die Fangsonde komplementär ist, und mit dieser hybridisiert. Dadurch bildet sich ein Hybrid aus Nachweissonde, nachzuweisender Nukleinsäure und Fangsonde an der Festphase. Ein solches Verfahren ist beispielsweise beschrieben in der EP-A-0 079 139. Bevorzugt wird die Nachweissonde der Probe zu­ sammen mit der Fangsonde mit der Hybridisierungslösung zugegeben.The amount of the hybrid of the nucleic acid to be detected, bound to the solid phase, Detection probe and capture probe can be determined in a manner known in principle, e.g. B. in the manner of a sandwich hybridization process. In this process, the hybrid implemented with the detection probe according to the invention, which leads to another nucleotide sequence of the nucleic acid to be detected as the capture probe is complementary, and with this hybridizes. This forms a hybrid of the detection probe, which is to be verified Nucleic acid and capture probe on the solid phase. One such method is for example described in EP-A-0 079 139. The detection probe is preferably added to the sample added together with the capture probe with the hybridization solution.

Bei direkt nachweisbaren Gruppen, beispielsweise Fluoreszenzlabeln, wird die Menge an Markierung fluorometrisch bestimmt. Ist die nachweisbare Gruppe indirekt nachweisbar z. B. ein Hapten, so wird das Hybrid bevorzugt mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten umgesetzt, wie analog in der EP-A-0 324 474 beschrieben. Die Markierung am Antikörper kann beispielsweise eine Farb- oder Fluoreszenzmarkierung oder bevorzugt eine Enzymmarkierung, wie β-Galactosidase, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, sein. Im Falle der Enzymmarkierung wird die Menge an Nukleinsäure über die meist photometrische chemoluminometrische oder fluorometrische Verfolgung einer Reaktion des Enzyms mit einem chromogenen, chemoluminogenen oder fluorogenen Substrat gemessen. Das Meß­ signal ist ein Maß für die Menge ursprünglich vorhandener nachzuweisender Nukleinsäure und somit ggf. an nachzuweisenden Organismen.In the case of directly detectable groups, for example fluorescence labels, the amount becomes Marking determined fluorometrically. The detectable group is indirectly detectable e.g. B. a hapten, the hybrid is preferably with a labeled antibody against Hapten implemented, as described analogously in EP-A-0 324 474. The marking on Antibody can be, for example, a color or fluorescent label or preferably one Enzyme label such as β-galactosidase, alkaline phosphatase or peroxidase. in the In the case of enzyme labeling, the amount of nucleic acid is mostly photometric chemiluminometric or fluorometric tracking of a reaction of the enzyme with  a chromogenic, chemiluminogenic or fluorogenic substrate. The meas signal is a measure of the amount of nucleic acid originally to be detected and thus possibly on organisms to be detected.

Besonders bevorzugt unterscheidet sich die nicht-nukleosidische, modifizierte Grund­ gerüsteinheit an einer Position, in welche sich die nachzuweisende Nukleinsäure von einer der in der Probe vorhandenen nicht-nachzuweisenden Nukleinsäure unterscheidet, von mindestens einer der beiden benachbarten Grundgerüsteinheiten, womit nicht die Base gemeint sein soll. Dies kann beispielsweise dadurch realisiert werden, daß die benachbarte Grundgerüsteinheit nicht eine negative Ladung bzw. nicht die Säurefunktion aufweist, oder daß sie auf einer anderen Monomereinheit, z. B. einer anderen Aminosäure, im linearen Teil des Grundgerüsts basiert.The non-nucleoside, modified reason differs particularly preferably scaffold unit at a position in which the nucleic acid to be detected is from a differs from the undetectable nucleic acid present in the sample from at least one of the two neighboring basic scaffolding units, with which not the base should be meant. This can be achieved, for example, in that the neighboring one Basic unit does not have a negative charge or does not have the acid function, or that they are on another monomer unit, e.g. B. another amino acid, in the linear part of the basic structure.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Probe, die die nachzuweisende Nukleinsäure neben anderer Nukleinsäuren enthält, so behandelt, daß die nachzuweisende Nukleinsäure aus eventuell vorhandenen Zellen freigesetzt und eventuell daran haftende Proteine denaturiert werden. Daran kann sich eine Isolierung der Nukleinsäuren aus diesem Gemisch anschließen. Die von eventuellen Inhibitoren der Amplifikation befreiten Nuklein­ säuren können dann einer Amplifikation, z. B. einer PCR, unterzogen werden. Hierbei ist es bevorzugt, einen der Primer mit einer immobilisierbaren Gruppe markiert einzusetzen. Nach Durchlaufen der Amplifikation werden die Amplifikate durch Hybridisierung mit einer er­ findungsgemäßen Sonde nachgewiesen. Die Sonde wird bevorzugt so gewählt, daß sie in einen Bereich zwischen den Hybridisierungspositionen der Primer mit den Amplifikaten hybridisiert. Die Detektion findet nach Immobilisierung der Amplifikate und Hybridisierung mit der Sonde statt. Hierzu können bevorzugt magnetische Partikel eingesetzt werden, welche die immobilisierbare Gruppe der Amplifikate erkennen. Die Reagenzlösung mit den überschüssigen Sonden wird vor der Detektion bevorzugt entfernt.In a particularly preferred embodiment, the sample that is to be detected Contains nucleic acid in addition to other nucleic acids, treated so that the one to be detected Nucleic acid released from cells that may be present and possibly adhering to them Proteins are denatured. This can isolate the nucleic acids from it Connect the mixture. The nucleic acids freed from any inhibitors of amplification Acids can then be amplified, e.g. B. be subjected to a PCR. Here it is preferred to use one of the primers marked with an immobilizable group. After The amplificates are run through the amplification by hybridization with an er Proven according to the invention. The probe is preferably chosen so that it is in an area between the hybridization positions of the primers with the amplificates hybridizes. Detection takes place after immobilization of the amplificates and hybridization with the probe instead. Magnetic particles can preferably be used for this purpose, which recognize the immobilizable group of the amplificates. The reagent solution with the Excess probes are preferably removed before detection.

Die erfindungsgemäßen Oligomere, insbesondere diejenigen mit einer Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 eignen sich hervorragend zum Nachweis von Mutationen, Allelen oder Polymorphismen sowie zur Typisierung oder Subtypisierung von Mikro­ organismen. Bevorzugt enthalten die Oligomere sowohl eine solche Säurefunktion innerhalb des Bindebereiches des Oligomeren mit der nachzuweisenden Nukleinsäure als auch eine negative Ladung außerhalb des Bindebereiches, z. B. an dessen Ende(n) oder im Linker zwischen dem Bindebereich und der Markierung.The oligomers according to the invention, in particular those with an acid function with a pK _a of less than 3.0, are outstandingly suitable for detecting mutations, alleles or polymorphisms and for typing or subtyping microorganisms. The oligomers preferably contain both such an acid function within the binding region of the oligomer with the nucleic acid to be detected and also a negative charge outside the binding region, e.g. B. at the end (s) or in the linker between the binding area and the marker.

Darüber hinaus hat es sich erwiesen, daß Oligomere, bei denen weniger als 80, bevorzugt weniger als 50 und besonders bevorzugt weniger als 40%, mindestens jedoch eine der Basen an eine negativ geladene Grundgerüsteinheit, z. B. eine durch eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 5.0, bevorzugt weniger als 3.0, modifizierte, gebunden sind, deutlich weniger unspezifisch an in ihrer Sequenz relativ unverwandte Nukleinsäuren (z. B. Längenmarker) binden. Sie vermeiden daher unspezifische Bindungen in Reaktionen zur Bindung der Sonde an komplementäre Basensequenzen (Tabelle 1). Unter relativ unverwandten Nukleinsäuren werden Nukleinsäuren verstanden, die keine fortlaufende und ununterbrochene Sequenz von mehr als 10, bevorzugt mehr als 15 Basen enthalten, die zu mehr als 50% zu einer gleichlangen ununterbrochenen und fortlaufenden Sequenz von Basen der Sonde komplementär sind. Leerwerte, insbesondere bei Elektro­ chemilumineszenzmessungen, werden reduziert. Gegenüber nicht-modifizierten Peptid­ nukleinsäuren zeichnen sich die erfindungsgemäßen Oligomere durch eine erhöhte Selek­ tivität in Bindereaktionen aus. In Abgrenzung zu Oligomeren, bei denen eine positive Ladung am Backbone befestigt war (Z; B. T-Lys-haltige PNAs) und zu neutralen PNAs wurden deutlich niedrigere Leerwertsignale erhalten, insbesondere bei abnehmender Salz­ konzentration (Tabelle 1). Die erfindungsgemäßen Oligomere neigen auch weniger zu un­ spezifischen Bindungen an Festphasen, z. B. hydrophile Oberflächen, wie mit Streptavidin beschichtete Partikel oder Gefäße. In diesem Fall wird als unspezifische Bindung eine nicht aufBasen-Basen-Wechselwirkung beruhende Bindung verstanden. Für den Einsatz der erfindungsgemäßen Oligomere eignen sich insbesondere neutrale und ganz besonders negativ geladene Oberflächen.In addition, it has been found that oligomers in which less than 80, preferably less than 50 and particularly preferably less than 40%, but at least one of the bases are attached to a negatively charged basic unit, e.g. B. a modified by an acid function with a pK _a of less than 5.0, preferably less than 3.0, are bound to bind significantly less non-specifically to nucleic acids which are relatively unrelated in their sequence (e.g. length markers). You therefore avoid unspecific binding in reactions to bind the probe to complementary base sequences (Table 1). By relatively unrelated nucleic acids are meant nucleic acids which do not contain a continuous and uninterrupted sequence of more than 10, preferably more than 15 bases, which are more than 50% complementary to an equally long uninterrupted and continuous sequence of bases of the probe. Blank values, especially in electrochemiluminescence measurements, are reduced. Compared to unmodified peptide nucleic acids, the oligomers according to the invention are distinguished by an increased selectivity in binding reactions. In contrast to oligomers, in which a positive charge was attached to the backbone (e.g. T-Lys-containing PNAs) and neutral PNAs, significantly lower blank value signals were obtained, especially with decreasing salt concentration (Table 1). The oligomers of the invention are also less prone to unspecific binding to solid phases, e.g. B. hydrophilic surfaces, such as particles or vessels coated with streptavidin. In this case, non-specific binding is understood to mean a non-base-base interaction binding. Neutral and very particularly negatively charged surfaces are particularly suitable for the use of the oligomers according to the invention.

In Angew. Chem. 1996, 108, 17, 2068 sind PNAs mit Glutaminsäure-haltigem Backbone beschrieben. Auch solche Oligomere können zur Vermeidung unspezifischer Bindungen an nicht-komplementäre Nukleinsäuren oder Festphasen verwendet werden. Als Sonden in Vergleichsversuchen wurden jeweils 18mere bzw. 14mere eingesetzt. Die Sonden unterscheiden sich wie in Tabelle 2 angegeben. In Angew. Chem. 1996, 108, 17, 2068 are PNAs with a glutamic acid-containing backbone described. Such oligomers can also be used to avoid unspecific binding non-complementary nucleic acids or solid phases can be used. As probes in Comparative experiments were carried out in 18mers and 14mers, respectively. The probes differ as indicated in Table 2.  

Tabelle 1 Table 1

Tabelle 2 Table 2

In Tabelle 1 ist gezeigt, daß die partiell negativ geladenen PNA-Sonden ungeladenen PNAs bezüglich unspezifischer Bindung an nicht-komplementäre DNA-Fragmente deutlich über­ legen sind und ein ähnliches Verhalten wie eine vergleichbare DNA-Sonde gleicher Basensequenz zeigen. In der linken Spalte ist erläutert, welche Nukleinsäurekomponenten dem Nachweisverfahren zugrundegelegt wurden. Im ersten Fall wurden biotinmarkierte HGV-Primer in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt, die keine mit der Sonde komplementäre Sequenz enthalten. Im zweiten Fall wurden biotinmarkierte Längenmarker eingesetzt, die ebenfalls keine wesentliche Komplementarität zur Sonde aufweisen. Im dritten Fall wurden HGV-Amplifikate in unterschiedlichen Verdünnungen eingesetzt. Die Amplifikate enthalten einen Bereich, der zu 100% komplementär zu der Sondensequenz ist. Im vierten Fall wird das Amplifikat eines HBV-Tests eingesetzt. Dieses Amplifikat hat keine Komplementarität zur eingesetzten Sonde. Im fünften Fall werden keine Nukleinsäuren zugegeben, so daß nur die unspezifische Bindung der Sonde an die Oberfläche des Magnetpartikels gemessen wird.In Table 1 it is shown that the partially negatively charged PNA probes are uncharged PNAs with regard to non-specific binding to non-complementary DNA fragments and a similar behavior to a comparable DNA probe Show base sequence. The left column explains which nucleic acid components were used as the basis for the verification procedure. In the first case, biotin was labeled HGV primers used in different concentrations, none with the probe complementary sequence included. In the second case, biotin-labeled length markers were used used, which also show no significant complementarity to the probe. in the In the third case, HGV amplicons were used in different dilutions. The Amplificates contain a region that is 100% complementary to the probe sequence. In the fourth case the amplificate of an HBV test is used. This amplificate has none Complementarity to the probe used. In the fifth case there are no nucleic acids  added so that only the non-specific binding of the probe to the surface of the Magnetic particle is measured.

Die Ergebnisse aus Tabelle 1 zeigen, daß selbst bei Nichtanwesenheit von Nukleinsäuren in der Reaktionsmischung ein Leerwertsignal gemessen wird (Fall 5). Dieses ist bei DNA-Sonden und bei PNA, welche sowohl im Backbone als auch im Linker negative Ladungen enthalten, ähnlich klein. Demgegenüber steigt das Leerwertsignal bei Entfernen der negativen Ladung im Linker etwas an. Am größten ist das Leerwertsignal bei ungeladenen PNA. Dies zeigt, daß mit negativ geladenen PNA-Sonden eine Reduzierung des Leerwertes erreicht werden kann.The results from Table 1 show that even in the absence of nucleic acids in a blank signal is measured in the reaction mixture (case 5). This is at DNA probes and PNA, which have negative charges both in the backbone and in the linker included, similarly small. In contrast, the blank signal increases when the negative charge in the linker. The empty signal is greatest when the battery is uncharged PNA. This shows that with negatively charged PNA probes there is a reduction in the blank can be achieved.

Die Fälle 1 und 2 zeigen ferner, daß auch unspezifische Bindungen an Nukleinsäuren, die keine Ahnlichkeit mit der zu der Sondensequenz komplementären Sequenz haben, ein Bei­ trag zum Leerwertsignal liefern. Dies gilt sowohl für die zwangsläufig in der Reaktions­ mischung enthaltenen Primer, als auch Kontrollen, wie Standards. Auch hier wird durch Einsatz negativ geladener Sonden eine Reduktion des Leerwertes festgestellt. Dieser Bei­ trag konnte im vorliegenden Experiment sogar vollständig eliminiert werden.Cases 1 and 2 also show that non-specific binding to nucleic acids have no resemblance to the sequence complementary to the probe sequence, a case deliver the blank signal. This applies to both inevitably in the reaction mix contained primers, as well as controls, such as standards. Here too is through Use of negatively charged probes determined a reduction in the blank value. This case In this experiment, it was even possible to completely eliminate the impact.

Fall 4 zeigt, daß bei Anwesenheit von Amplifikaten, die beispielsweise auf eine simultane Amplifikation eines weiteren Analyten in der Reaktionsmischung zurückzuführen sind, ein beträchtliches Leerwertsignal gefunden wird, welches durch Einsatz negativ geladener Son­ den praktisch eleminiert werden kann.Case 4 shows that in the presence of amplificates, for example, a simultaneous Amplification of another analyte in the reaction mixture are due considerable blank value signal is found, which by using negatively charged Son that can be practically eliminated.

Bevorzugt findet die Reaktion in einem Kunststoffgefäß statt. Insbesondere sind dabei solche Gefäße einsetzbar, welche normalerweise in üblichen Analysenautomaten als Proben­ aufbewahrungsgefäße verwendet werden. Beispiele sind Gefäße aus Polystyrol, Polyethylen oder Luran. Während der Behandlung mit Alkali und Detergenz befindet sich das Gefäß, in dem die Behandlung stattfindet, bevorzugt schon in einem Analysenautomaten, besonders bevorzugt auf einem Probenrotor, welcher den Zugriff einer Probenentnahmevorrichtung auf einzelne auf dem Rotor befindliche Probengefäße zuläßt. Ein solcher Analysenautomat ist beispielsweise in EP-A- 0 361 830 beschrieben.The reaction preferably takes place in a plastic vessel. In particular are there such vessels can be used, which are normally used as samples in conventional automatic analyzers storage containers are used. Examples are vessels made of polystyrene, polyethylene or Luran. The vessel is in during treatment with alkali and detergent where the treatment takes place, especially in an automatic analyzer, especially preferably on a sample rotor, which gives access to a sampling device on individual sample vessels on the rotor. Such an automatic analyzer is described for example in EP-A-0 361 830.

Darüber hinaus eignen sich diese Oligomere, bei denen weniger als 80, bevorzugt weniger als 50%, jedoch mindestens eine der Basen an negativ geladene Grundgerüsteinheiten gebunden sind, besonders bevorzugt die erfindungsgemäßen Oligomere, hervorragend als Primer, sofern sie an einem Ende eine durch eine Polymerase verlängerbare Gruppe, vor­ zugsweise eine Hydroxylgruppe, aufweisen. Primer, die aus konventionellen Mononukleo­ tideinheiten und einem oder mehreren Nukleosideinheiten am C-Ende aufgebaut sind, sind in WO 95/08556 und EP-0 672 677 beschrieben. Überraschenderweise hat sich herausge­ stellt, daß bei Einbau einer oder mehrerer negativer Ladungen im Bereich des verlänger­ baren Endes die Wirkung als Primer verbessert wird. Besonders geeignet als Primer haben sich erfindungsgemäße Oligomere, die an einem ihrer Enden eine verlängerbare Hydroxyl­ gruppe, z. B. Nukleoside, und als nächste Monomereinheit eine nicht-nukleosidische Einheit, die eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 5.0, bevorzugt weniger als 3.0 enthält, erwiesen. Diese Chimären können mit den erfindungsgemäßen Monomeren analog zu WO 95/08566 hergestellt werden.In addition, these oligomers, in which less than 80%, preferably less than 50%, but at least one of the bases are bound to negatively charged basic framework units, particularly preferably the oligomers according to the invention, are outstandingly suitable as primers, provided that they have one end by a polymerase extendable group, preferably before a hydroxyl group. Primers which are composed of conventional mononucleotide units and one or more nucleoside units at the C end are described in WO 95/08556 and EP-0 672 677. Surprisingly, it has been found that the effect as a primer is improved when one or more negative charges are incorporated in the region of the extendable end. Oligomers according to the invention which have an extendable hydroxyl group, for. B. nucleosides, and the next monomer unit is a non-nucleoside unit which contains an acid function with a pK _a of less than 5.0, preferably less than 3.0. These chimeras can be produced with the monomers according to the invention analogously to WO 95/08566.

Erstaunlicherweise können Oligomere, bei denen weniger als 80%, bevorzugt weniger als 50%, jedoch mindestens eine der Basen an negativ geladene Grundgerüsteinheiten gebun­ den sind, besonders bevorzugt die erfindungsgemäßen Oligomere im Vergleich zu unmodi­ fizierten, neutralen PNAs, z. B. mit sogenannten Transfektionsreagenzien, z. B. DOSPER oder DOTAP, besser in Zellen eingeschleust werden. Solche Transfektionsreagenzien sind für Nukleinsäuren aus Bioforum 6/96, Seite 264, bekannt. Insbesondere in Form von Peptidnukleinsäuren, die außerdem den Vorteil der Stabilität gegenüber Enzymverdau und eine hohe Affinität der Nukleinsäuren aufweisen, können die erfindungsgemäßen Oligomere daher gut in der Antisense-Technologie oder als Gensonden verwendet werden.Surprisingly, oligomers in which less than 80%, preferably less than 50%, but at least one of the bases bound to negatively charged basic framework units these are, particularly preferably, the oligomers according to the invention compared to unmodi fected, neutral PNAs, e.g. B. with so-called transfection reagents, for. B. DOSPER or DOTAP, better to be introduced into cells. Such transfection reagents are for nucleic acids from Bioforum 6/96, page 264. Especially in the form of Peptide nucleic acids, which also have the advantage of stability over enzyme digestion and The oligomers according to the invention can have a high affinity for the nucleic acids therefore well used in antisense technology or as a gene probe.

Im Falle der Oligomeren, welche eine Reduzierung der unspezifischen Bindungen mit sich bringen, können die negativen Ladungen prinzipiell im Molekül verteilt sein. So ist es bei­ spielsweise möglich, die negativen Ladungen in Form einer oben beschriebenen Gruppe mit einem pK_a von weniger als 5.0 (3.0) an eine basetragende Grundgerüsteinheit zu binden, es ist jedoch auch möglich, diese außerhalb der Sequenz von basenhaltigen Grundgerüsteinheiten zu binden, z. B. an einem oder beiden Enden der Oligomeren oder an die Nukleobase selbst (z. B. DE- 1 97 12 530). Es hat sich herausgestellt, daß in diesem Fall die negativen Ladungen vorteilhafterweise über zusätzliche, nicht-basetragende Grundgerüsteinheiten, welche eine Gruppe mit einem pK_a von weniger als 5.0 (3.0) ent­ halten, an einem Ende der Basensequenz zu realisieren, wobei an einem oder mehreren dieser zusätzlichen Grundgerüsteinheiten auch die Markierung oder die immobilisierbare Gruppe lokalisiert ist. Für den Fall von Peptidnukleinsäuren hat es sich als äußerst zweck­ mäßig erwiesen, schon während der Synthese der PNAs weitere Grundgerüsteinheiten aus Aminosäuren mit einem pK_a von weniger als 5.0 (3.0) anzukondensieren und in einem an­ schließenden Schritt die Markierungsgruppe an die zusätzlichen Grundgerüsteinheiten zu binden. Dadurch wirken die zusätzlichen Grundgerüsteinheiten auch als Linker zwischen der Markierung und der für die nachzuweisende nukleinsäurespezifische Basensequenz. Be­ sonders vorteilhaft erscheinen solche Sonden, bei denen sowohl negative Ladungen inner­ halb der Basensequenz vorliegen, als auch im Linker.In the case of the oligomers, which bring about a reduction in the unspecific bonds, the negative charges can in principle be distributed in the molecule. For example, it is possible to bind the negative charges in the form of a group described above with a pK _a of less than 5.0 (3.0) to a base-bearing basic unit, but it is also possible to bind these outside the sequence of base-containing basic units, e.g. B. at one or both ends of the oligomers or to the nucleobase itself (z. B. DE-1 97 12 530). It has been found that in this case the negative charges are advantageously realized at one end of the base sequence, with one or more, via additional, non-base-bearing basic framework units which contain a group with a pK _a of less than 5.0 (3.0) the marker or the immobilizable group is localized to several of these additional basic unit units. In the case of peptide nucleic acids, it has proven to be extremely expedient to condense further basic framework units from amino acids with a pK _a of less than 5.0 (3.0) already during the synthesis of the PNAs and to bind the labeling group to the additional basic framework units in a subsequent step . As a result, the additional basic framework units also act as a linker between the label and the base sequence specific for the nucleic acid to be detected. Those probes in which both negative charges are present within the base sequence and in the linker appear to be particularly advantageous.

In Fig. 1 sind einige Formeln erfindungsgemäßer Monomere (1, 3, 4, 6 und 8) in ge­ schützter Form, wie sie zur Oligomersynthese eingesetzt werden können sowie die damit erzeugten Monomereinheiten innerhalb einer PNA (2, 5, 7 und 9), gezeigt (Z: Benzyloxycarbonyl, Bn: Benzyl).In FIG. 1, some formulas inventive monomers (1, 3, 4, 6 and 8) in ge schützter form as it can be used for oligomer synthesis, the monomer units within a PNA (2, 5, 7 and 9) and thus produced, shown (Z: benzyloxycarbonyl, Bn: benzyl).

In Fig. 2 ist der Einfluß des Salzgehaltes auf das Signal für eine markierte DNA-Sonde eine erfindungsgemäße markierte Sonde, eine positiv geladene PNA-Sonde und eine Sonde mit negativer Ladung nur im Linker (außerhalb des Backbones) gezeigt.In FIG. 2, the influence of the salt content of the signal for a labeled DNA probe is shown a labeled probe according to the invention, a positively charged PNA probe and a probe having a negative charge only in the linker (outside of the backbone).

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher:The following examples illustrate the invention:

Beispiel 1example 1 Synthese der MonomerenSynthesis of the monomers Synthese des Boc-T-D-Glu(Bn)-OH PNA-MonomersSynthesis of the Boc-T-D-Glu (Bn) -OH PNA monomer 1. Synthese von D-Glu(Bn)-O-Allyl1. Synthesis of D-Glu (Bn) -O-allyl

Man gibt unter Rühren zu einer Lösung von 10 g (29.6 mmol) Boc-D-Glu(Bn)-OH (erhältlich von der Fa. Novabiochem AG) in 100 ml absolutem DMF 9.64 g (29.6 mmol) Cäsiumcarbonat (Fluka) und nach einer 1/4 Stunde 7.16 g (59.2 mmol) Allylbromid (Pluka) und rührt eine % Stunde weiter. Danach filtriert man vom Feststoff ab und zieht das DMF im Vakuum ab. Der Rückstand wird in 400 ml Essigester aufgenommen und mit 400 ml gesättigter Natrium-hydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Danach wird die wäßrige Phase noch dreimal mit je 200 ml Essigester rückextrahiert. Anschließend werden die vereinigten organischen Phasen über Na₂SO₄ getrocknet. Man filtriert ab und rotiert ein. Jetzt wird der Rückstand in 100 ml Benzol gelöst und mit 5.80 g (30.5 mmol) p-Toluolsulfonsäure versetzt. Man kocht 1 Stunde lang am Rückfluß, engt danach die Lösung auf ein Volumen von ca. 20 ml ein und kristallisiert das Produkt durch langsame Zugabe von Diethylether aus. Der Feststoff wird abfiltriert und aus Methanol/Diethylether umkristallisiert. Man erhält nach Trocknen am Hochvakuum 11.1 g (77%) des Produkts als p-Toluolsulfonsäure-Salz in Form farbloser Kristalle.9.64 g (29.6 mmol) of cesium carbonate (Fluka) and then are added with stirring to a solution of 10 g (29.6 mmol) of Boc-D-Glu (Bn) -OH (available from Novabiochem AG) in 100 ml of absolute DMF a 1/4 hour 7.16 g (59.2 mmol) of allyl bromide (Pluka) and stirring continues for 1% hour. The solid is then filtered off and the DMF is removed in vacuo. The residue is taken up in 400 ml of ethyl acetate and washed with 400 ml of saturated sodium hydrogen carbonate solution. Then the aqueous phase is extracted three times with 200 ml of ethyl acetate. The combined organic phases are then dried over Na ₂ SO ₄ . It is filtered off and rotated in. Now the residue is dissolved in 100 ml of benzene and mixed with 5.80 g (30.5 mmol) of p-toluenesulfonic acid. The mixture is boiled under reflux for 1 hour, then the solution is concentrated to a volume of about 20 ml and the product is crystallized by slowly adding diethyl ether. The solid is filtered off and recrystallized from methanol / diethyl ether. After drying under high vacuum, 11.1 g (77%) of the product are obtained as p-toluenesulfonic acid salt in the form of colorless crystals.

2. Synthese von Boc-(2-Aminoethyl)-D-Glutaminsäure-γ-Benzylester-α-Allylester2. Synthesis of Boc- (2-aminoethyl) -D-glutamic acid-γ-benzyl ester-α-allyl ester

8 g (16.4 mmol) D-Glutaminsäure-γ-Benzylester-α-Allylester werden mit je 400 ml Dichlormethan und gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung in einem Scheidetrichter geschüttelt. Nach Abtrennen der organischen Phase wird die wäßrige Phase dreimal mit je 200 ml Dichlormethan rückextrahiert. Man trocknet die vereinigten organischen Phasen über Na₂SO₄, filtriert ab und rotiert ein. Der Rückstand wird in 60 ml Methanol gelöst und im Eisbad gekühlt. Danach gibt man unter Rühren 3.14 g (19.7 mmol) Boc-Aminoacetaldehyd (hergestellt nach K.L. Dueholm et al., Org. Prep. Proced. Int. 1993, 25, 457-461) zu und rührt eine 1/2 Stunde im Eisbad weiter. Danach wird mit 1.1 ml Essigsäure und 0.55 g (8.75 mmol) Natriumcyanoborhydrid versetzt. Nach 1/2 Stunde wird das Methanol im Vakuum abgezogen, und der Rückstand in 300 ml Essigester aufgenommen. Die Lösung wird mit 150 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 150 ml Kochsalz-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird anschließend über Na₂SO₄ getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Der Rückstand wird in 120 ml Diethylether aufgenommen, auf -20°C gekühlt und mit der äquivalenten Menge 1.5 M wasserfreier, etherischer HCl versetzt. Danach gibt man 120 ml absolutes Hexan zu. Das ausgefallene Hydrochlorid wird abfiltriert. Nach Umkristallisation aus Methanol/Diethylether/Hexan erhält man 7.15 g (88%) farblose Kristalle.8 g (16.4 mmol) of D-glutamic acid-γ-benzyl ester-α-allyl ester are shaken in a separating funnel with 400 ml of dichloromethane and saturated sodium bicarbonate solution. After the organic phase has been separated off, the aqueous phase is back-extracted three times with 200 ml of dichloromethane each time. The combined organic phases are dried over Na ₂ SO ₄ , filtered off and rotated in. The residue is dissolved in 60 ml of methanol and cooled in an ice bath. Then 3.14 g (19.7 mmol) of Boc-aminoacetaldehyde (produced according to KL Dueholm et al., Org. Prep. Proced. Int. 1993, 25, 457-461) are added with stirring and stirring is continued for 1/2 hour in an ice bath . Then 1.1 ml of acetic acid and 0.55 g (8.75 mmol) of sodium cyanoborohydride are added. After 1/2 hour the methanol is removed in vacuo and the residue is taken up in 300 ml of ethyl acetate. The solution is washed with 150 ml of a saturated sodium hydrogen carbonate solution and 150 ml of sodium chloride solution. The organic phase is then dried over Na ₂ SO ₄ , filtered off and concentrated using a rotary evaporator. The residue is taken up in 120 ml of diethyl ether, cooled to -20 ° C. and mixed with the equivalent amount of 1.5 M anhydrous, ethereal HCl. Then add 120 ml of absolute hexane. The precipitated hydrochloride is filtered off. After recrystallization from methanol / diethyl ether / hexane, 7.15 g (88%) of colorless crystals are obtained.

3. Synthese von Boc-T-D-Glu(Bn)-O-Allyl3. Synthesis of Boc-T-D-Glu (Bn) -O-allyl

Zu einer Lösung von 3.72 g (20.2 mmol) Thymin-1-ylessigsäure (hergestellt nach K.L. Dueholm et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 5767-5773) und 3.3 g (20.2 mmol) 3,4-Dihydro-3- hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin (Fluka) in 60 ml DMF gibt man unter Rühren 4.37 g (21.2 mmol) DCC (Fluka). Nach 1 Stunde gibt man dann 5 g (10.1 mmol) Boc-(2- Aminoethyl)-D-Glutaminsäure-γ-Benzylester-α-Allylester Hydrochlorid und 1.75 ml (10.2 mmol) Hünigs Base. Man rührt über Nacht bei 40°C (ca. 15 h). Danach wird das DMF im Vakuum abgezogen und der Rückstand in 180 ml Essigester aufgenommen. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Die organische Phase wird dann sukzessive mit je 150 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung, halbgesättigter Kaliumhydrogen­ sulfat-Lösung und und gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, danach über Na₂SO₄ getrocknet. Man filtriert ab und rotiert ein. Der Rückstand wird über eine Kieselgelsäule mit Essigester/Hexan 2 : 1 als Elutionssystem gereinigt. Das Produkt wird dann mit Essigester/Diethylether zur Kristallisation gebracht. Ausbeute: 3.6 g (57%).To a solution of 3.72 g (20.2 mmol) of thymin-1-ylacetic acid (prepared according to KL Dueholm et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 5767-5773) and 3.3 g (20.2 mmol) of 3,4-dihydro -337-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (Fluka) in 60 ml DMF are added 4.37 g (21.2 mmol) DCC (Fluka) with stirring. After 1 hour, 5 g (10.1 mmol) of Boc- (2-aminoethyl) -D-glutamic acid-γ-benzyl ester-α-allyl ester hydrochloride and 1.75 ml (10.2 mmol) of Hünig's base are then added. The mixture is stirred at 40 ° C. overnight (approx. 15 h). The DMF is then stripped off in vacuo and the residue is taken up in 180 ml of ethyl acetate. The dicyclohexylurea formed is filtered off. The organic phase is then washed successively with 150 ml of saturated sodium bicarbonate solution, semi-saturated potassium hydrogen sulfate solution and and saturated sodium chloride solution, and then dried over Na ₂ SO ₄ . It is filtered off and rotated in. The residue is purified on a silica gel column using ethyl acetate / hexane 2: 1 as the elution system. The product is then brought to crystallization with ethyl acetate / diethyl ether. Yield: 3.6 g (57%).

4. Synthese von Boc-T-D-Glu(Bn)-OH4. Synthesis of Boc-T-D-Glu (Bn) -OH

Zu einer Lösung von 2 g (3.2 mmol) Boc-T-D-Glu(Bn)-O-Allyl und 2.8 ml (32 mmol) Morpholin in 30 ml absolutem THF gibt man 37 mg (0.032 mmol) Tetrakistriphenylphosphin-Palladium. Nach ½ Stunde wird das THF abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Essigester aufgenommen und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung, die mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung auf pH 3 eingestellt wurde, gewaschen. Die wäßrige Phase wird danach 5× mit je 50 ml Essigester rückextrahiert. Danach werden die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter Koch­ salz-Lösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Man filtriert ab und rotiert ein. Nach Kristallisation aus Essigester/Hexan erhält man 1.46 g (78%) eines fast farblosen Feststoffs.
¹H-NMR (DMSO): COOH nicht sichtbar, 11.27 (sb, 1H, NH), 7.36-7.30 (m, 6H, Ph, H-C(6)), 6.99 (sb, 1H, NH), 5.10 (2s, 2H, CH₂Ph), 4.61-4.49 (m, 2H, CH₂Thy), 4.20-4.05 (m, 1H, CH), 3.68-2.91 (t, t, m, 6H, 2x CH₂N, CH₂COO), 2.39-2.31 (m, 2H, CH₂), 1.74 (s, 3H, CH₃), 1.38, 1.35 (2s, 9H, CH₃ (Boc)).37 mg (0.032 mmol) of tetrakistriphenylphosphine-palladium are added to a solution of 2 g (3.2 mmol) of Boc-TD-Glu (Bn) -O-allyl and 2.8 ml (32 mmol) of morpholine in 30 ml of absolute THF. The THF is withdrawn after ½ hour. The residue is taken up in 100 ml of ethyl acetate and washed with saturated sodium hydrogen carbonate solution, which was adjusted to pH 3 with potassium hydrogen sulfate solution. The aqueous phase is then back extracted 5 times with 50 ml of ethyl acetate. The combined organic phases are then washed with saturated sodium chloride solution and dried over Na ₂ SO ₄ . It is filtered off and rotated in. After crystallization from ethyl acetate / hexane, 1.46 g (78%) of an almost colorless solid is obtained.
¹ H-NMR (DMSO): COOH not visible, 11.27 (sb, 1H, NH), 7.36-7.30 (m, 6H, Ph, HC (6)), 6.99 (sb, 1H, NH), 5.10 (2s, 2H, CH ₂ Ph), 4.61-4.49 (m, 2H, CH ₂ Thy), 4.20-4.05 (m, 1H, CH), 3.68-2.91 (t, t, m, 6H, 2x CH ₂ N, CH ₂ COO), 2.39-2.31 (m, 2H, CH ₂ ), 1.74 (s, 3H, CH ₃ ), 1.38, 1.35 (2s, 9H, CH ₃ (Boc)).

Beispiel 2Example 2 Synthese der OligomerenSynthesis of the oligomers Synthese der PNA der SequenzSynthesis of the PNA of the sequence Ru(bpy)₃ (Glu)₂ CCA C(T-Glu)A TAG G(T-Glu)G GGT CTT GlyRu (bpy) ₃ (Glu) ₂ CCA C (T-Glu) A TAG G (T-Glu) G GGT CTT Gly

Die Synthese erfolgte auf einem ABI 433A Peptid-Synthesizer der Firma Applied Bio­ systems mit modifizierter Software (T. Koch et al., J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88). Die Synthesen wurden im 5 µmol Maßstab in einem 3 ml Reaktionsgefäß durchgeführt, ein kleineres Measuring Loop (150 ml) wurde verwendet. Die Monomerbausteine (PNA-Bau­ steine: Boc-T-OH, Boc-A(Z)-OH, Boc-C(Z)-OH und Boc-G(Z)-OH, erhältlich von der Fa. Perseptive Biosystems, Boc-T-Glu(Bzl)-OH hergestellt nach Beispiel 1; Aminosäurederivate: Boc-Glu(OBzl)-OH, erhältlich von der Fa. Novabiochem AG; Ru(Ruthenium)(bpy)₃-COOH von Boehringer Mannheim) wurden in NMP gelöst und in individuelle Kartuschen eingespritzt (140 µl, 0.26M). Das mit Boc-Gly (Novabiochem AG) derivatisierte MBHA-Trägermaterial (Novabiochem AG) wird in das 3 ml Reaktionsgefäß gefüllt und am Synthesizer angebracht. Trifluoressigsäure/m-Cresol 95 : 5 (2 × 180 sec); Flaschenposition 2) wird verwendet, um die Boc-Schutzgruppe abzuspalten. Je 2 Waschmodule (Dichlormethan- und NMP-Modul bestehend aus jeweils 5 aufeinanderfolgenden Waschschritten) befinden sich zwischen Boc-Abspaltung und dem Kupplungsmodul (Dichlormethan = Flaschenposition 9; NMP = Flaschenposition 10). 140 µl 0.26 M Monomer (36 µmol), 150 µl 0.21 M HATU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyluronium-hexaftuorophosphat) in NMP (32 µmol) und 150 µl 0.5 M Dilsopropylethylamin in NMP (75 µmol) werden in jedem Kupplungsschritt gefördert (Diisopropylethylamln-Lösung = Flaschenposition 7; HATU-Lösung = Flaschenposition 8). Die Monomere werden in der Synthesekartusche voraktiviert (1 min), dann in das Reaktionsgefäß überführt. Die Kupplungszeit beträgt 10 min, die Monomerenkonzentration während der Kupplung beträgt 0.08 M. Nach dem Kupplungsmodul erfolgt ein Capping-Modul mit Essigsäureanhydrid/NMP/Pyridin 1 : 25 : 25 (1 min; Flaschenposition 4). Jeder Synthesecyclus wird mit einem NMP Waschmodul abgeschlossen. Nach dem letzten Synthesecyclus folgt ein Dichlormethan-Waschmodul, um das Harz zu trocknen. Die Kupplungen wurden regelmäßig durch einen qualitativen Kaiser-Test kontrolliert.The synthesis was carried out on an ABI 433A peptide synthesizer from Applied Bio systems with modified software (T. Koch et al., J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88). The syntheses were carried out on a 5 μmol scale in a 3 ml reaction vessel, a smaller measuring loop (150 ml) was used. The monomer units (PNA building blocks: Boc-T-OH, Boc-A (Z) -OH, Boc-C (Z) -OH and Boc-G (Z) -OH, available from Perseptive Biosystems, Boc -T-Glu (Bzl) -OH prepared according to Example 1; amino acid derivatives: Boc-Glu (OBzl) -OH, available from Novabiochem AG; Ru (ruthenium) (bpy) ₃ -COOH from Boehringer Mannheim) were in NMP dissolved and injected into individual cartridges (140 µl, 0.26M). The MBHA carrier material (Novabiochem AG) derivatized with Boc-Gly (Novabiochem AG) is filled into the 3 ml reaction vessel and attached to the synthesizer. Trifluoroacetic acid / m-cresol 95: 5 (2 × 180 sec); Bottle position 2) is used to split off the Boc protecting group. Two washing modules (dichloromethane and NMP module, each consisting of 5 consecutive washing steps) are located between the Boc split-off and the coupling module (dichloromethane = bottle position 9; NMP = bottle position 10). 140 µl 0.26 M monomer (36 µmol), 150 µl 0.21 M HATU (O- (7-azabenzotriazol-1-yl) - 1,1,3,3-tetramethyluronium hexaftuorophosphate) in NMP (32 µmol) and 150 µl 0.5 M Dilsopropylethylamine in NMP (75 µmol) are conveyed in each coupling step (diisopropylethylamine solution = bottle position 7; HATU solution = bottle position 8). The monomers are preactivated in the synthesis cartridge (1 min), then transferred to the reaction vessel. The coupling time is 10 min, the monomer concentration during the coupling is 0.08 M. After the coupling module there is a capping module with acetic anhydride / NMP / pyridine 1:25:25 (1 min; bottle position 4). Each synthesis cycle is completed with an NMP wash module. After the final synthesis cycle, a dichloromethane wash module follows to dry the resin. The couplings were regularly checked by a qualitative Kaiser test.

Die Abspaltung der PNA vom Harz und der Schutzgruppen erfolgt in einem manuellen Schritt außerhalb des Gerätes in einer speziellen, verschließbaren Glasfritte. Das Harz wird zuerst mit Trifluoressigsäure gewaschen, dann schüttelt man 2 Stunden mit 2 ml Trifluor­ methansulfonsäure/Trifluoressigsäure/m-Cresol 2 : 8 : 1. Die Abspaltlösung wird in ein Zentrifugenglas gesaugt. Man wäscht mit 1 ml Trifluoressigsäure nach und präzipitiert die PNA mit Diethylether (ca. 10 ml). Das Präzipitat wird nach Zentrifugation von der über­ stehenden Lösung getrennt. Danach wäscht man zweimal mit Diethylether.The PNA is split off from the resin and the protective groups in a manual process Step outside the device in a special, lockable glass frit. The resin will first washed with trifluoroacetic acid, then shaken with 2 ml of trifluoro for 2 hours methanesulfonic acid / trifluoroacetic acid / m-cresol 2: 8: 1. The separation solution is in a Centrifuge glass sucked. It is washed with 1 ml of trifluoroacetic acid and the precipitated PNA with diethyl ether (approx. 10 ml). The precipitate is centrifuged from above standing solution separately. Then it is washed twice with diethyl ether.

Die PNA wurde über eine analytische RP18-HPLC (DeltaPak, Waters, 5 µ, 125×4 mm) mit einem Wasser/Acetonitril/0.1% Trifluoressigsäure-Gradienten bei 60°C analysiert.The PNA was determined using an analytical RP18-HPLC (DeltaPak, Waters, 5 μ, 125 × 4 mm) a water / acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid gradient at 60 ° C analyzed.

Die PNA wurde über eine präparative RP18-HPLC (Polygosil C-18/Macherey-Nagel, 5 µ, 250×20 mm) mit einem Wasser/Acetohitril/0,1% Trifluoressigsäure-Gradienten bei 60°C bis zur chromatographischen Einheitlichkeit gereinigt.The PNA was determined using a preparative RP18-HPLC (Polygosil C-18 / Macherey-Nagel, 5 μ, 250 × 20 mm) with a water / acetohitrile / 0.1% trifluoroacetic acid gradient at 60 ° C. cleaned to chromatographic uniformity.

Die Analyse der gereinigten PNA wird mit MALDITOF-MS durchgeführt.The analysis of the purified PNA is carried out with MALDITOF-MS.

Beispiel 3Example 3 HGV-Amplifikatnachweis mit verschieden modifizierten DetektionssondenHGV amplificate detection with differently modified detection probes

Ein Vergleich einer erfindungsgemäßen Detektionssonde zu unmodifizierten oder anders modifizierten PNA-Ru Sonden unter Verwendung einer identischen Sequenz verdeutlicht die Vorteile der Erfindung. Als Referenz wurde eine DNA-Sonde eingesetzt, das Experiment wurde am Beispiel HGV durchgeführt. A comparison of a detection probe according to the invention to unmodified or otherwise modified PNA-Ru probes using an identical sequence the advantages of the invention. A DNA probe, the Experiment was carried out using the example of HGV.  

a) Amplifikationa) amplification

Zur Herstellung der getesteten PCR-Produktes (HGV bzw. HBV), die als Proben in dem Beispiel dienten, wurden Plasmide verwendet, die mittels PCR amplifiziert wurden. Für die Herstellung der spezifischen Amplifikate wurden die folgenden Primer verwendet:
HGV Primer Sequenzen:
coding-strand:
To produce the tested PCR product (HGV or HBV), which served as samples in the example, plasmids were used which were amplified by means of PCR. The following primers were used to prepare the specific amplificates:
HGV primer sequences:
coding beach:

5'-CGG CCA AAA GGT GGT GGA TG-3' 20-mer (SEQ.ID.NO 1)
5'-CGG CCA AAA GGT GGT GGA TG-3 '20-mer (SEQ.ID.NO 1)

non-coding strand:
non-coding beach:

5'-Bi-CGA CGA GCC TGA CGT CGG G-3' 19-mer (SEQ.ID.NO. 2)
5'-Bi-CGA CGA GCC TGA CGT CGG G-3 '19-mer (SEQ.ID.NO. 2)

HBV Primer Sequenzen:
coding-strand:
HBV primer sequences:
coding beach:

5'-GGA GTG TGG ATT CGC ACT-3' 18-mer (SEQ.ID.NO. 3)
5'-GGA GTG TGG ATT CGC ACT-3 '18-mer (SEQ.ID.NO. 3)

non-coding strand:
non-coding beach:

5'-TGA GAT CTT CTG CGA CGC-3' 18-mer (SEQ.ID.NO.4).5'-TGA GAT CTT CTG CGA CGC-3 '18-mer (SEQ.ID.NO.4).

Für die PCR wurde für beide Parameter der folgende Reaktionsansatz gewählt:
2,5 U Taq polymerase
10 mM Tris/HCl, pH 8,3
50 mM KCl
1,5 mM MgCl₂
0, 1 mg/ml Gelatine
200 nM dCTP, dATP, dGTP, 600 mM dUTP
200 nM coding-strand primer
200 nM non-coding strand primer, Biotin-markiert
10 ng plasmid pJCP (HGV: Nukleotide 1-550 kloniert in pGEM3z; Stratagene; HBV: Nukleotide 50-2670 kloniert in pUC 18).The following reaction approach was chosen for the PCR for both parameters:
2.5 U Taq polymerase
10 mM Tris / HCl, pH 8.3
50 mM KCl
1.5 mM MgCl ₂
0.1 mg / ml gelatin
200 nM dCTP, dATP, dGTP, 600 mM dUTP
200 nM coding beach primer
200 nM non-coding strand primer, biotin labeled
10 ng plasmid pJCP (HGV: nucleotides 1-550 cloned in pGEM3z; Stratagene; HBV: nucleotides 50-2670 cloned in pUC 18).

Die Amplifikation wurde mit folgendem Temperaturprofil auf einem Perkin Elmer Cycler 9600 durchgeführt:
The amplification was carried out with the following temperature profile on a Perkin Elmer Cycler 9600:

35 Zyklen:
15 sec 94°C
30 sec 55°C
30 sec 72°C
hold 4°C.35 cycles:
15 sec 94 ° C
30 sec 55 ° C
30 sec 72 ° C
hold 4 ° C.

Um das Amplifikat zu stabilisieren, wurde das PCR-Produkt nach Beendigung der Reaktion mittels des High pure PCR template purification kits (BM Best. No. 1 796 828) gereinigt. Zur Bewertung der verschiedenen PNA-Ru Sonden wurde das PCR-Produkt in den bezeichneten Verdünnungen eingesetzt.In order to stabilize the amplificate, the PCR product was used after the reaction purified using the High pure PCR template purification kit (BM Order No. 1 796 828). To evaluate the various PNA-Ru probes, the PCR product was used in the designated dilutions used.

b) Detektionb) detection

Die Detektion erfolgte mit Hilfe von Elektrocheminumileszenz (ECL) auf einem Elecsys® 1010 (Boehringer Mannheim GmbH). Reaktionstemperatur für alle Schritte ist 37°C. 10 µl Probe werden zunächst mit 35 µl Denaturierungsreagenz versetzt und für 5 Minuten inkubiert. Anschließend werden 120 µl der Sondenlösung (50 ng/ml in Hybridisierungspuffer) zugegeben und 20 min inkubiert. Nach Beendigung der Hybridisierung werden dem Reaktionsansatz 35 µl Streptavidin-beschichtete magnetische Mikropartikel beigemischt und dieser erneut 10 Minuten inkubiert. Die Hybride (Bio­ markierter HGV Strang mit Ru-markierter Detektionssonde) werden dabei an die Festphase (Mikropartikel) gebunden. Nach Beendigung der Inkubation werden die Proben in die Meßzelle transferiert und dort die Mikropartikel über einen Magneten gebunden. Anschließend erfolgt in der Meßzelle die Chemilumineszenz. Unter Katalyse von TPA gibt der Ru-Komplex Lichtblitze ab, deren Anzahl in der Meßzelle bestimmt werden. Die Chemie zur Elektrocheminolumineszenz ist im J. Electrochem. Soc. 137: 3127-3131 beschrieben.The detection was carried out with the help of electrochemilinescence (ECL) on an Elecsys® 1010 (Boehringer Mannheim GmbH). The reaction temperature for all steps is 37 ° C. 10 µl Sample is first mixed with 35 µl denaturing reagent and for 5 minutes incubated. Then 120 µl of the probe solution (50 ng / ml in Hybridization buffer) added and incubated for 20 min. After completing the Hybridization are 35 µl streptavidin-coated magnetic reaction mixture Microparticles added and incubated again for 10 minutes. The hybrid (bio marked HGV strand with Ru-marked detection probe) are in the solid phase (Microparticles) bound. After the incubation has ended, the samples are transferred to the Measuring cell transferred and the microparticles bound there by a magnet. The chemiluminescence then takes place in the measuring cell. Under catalysis by TPA there the Ru complex flashes of light, the number of which are determined in the measuring cell. The Chemistry for electrocheminoluminescence is in J. Electrochem. Soc. 137: 3127-3131 described.

Detektionsreagenzien Detection reagents

1. Denaturierungsreagenz, pH < 12 1. Denaturing reagent, pH <12

Hybridisierungslösung, pH 6,5 Hybridization solution, pH 6.5

Als Detektionssonden wurden folgende Rutheniumbispyridkomplexe-markierten Sonden verwendet:The following ruthenium bispyride complex-labeled probes were used as detection probes used:

A. DNA-SondeA. DNA probe

Ru- CCA CTA TAG GTG GGT CTT  Id.Nr. 55 (SEQ.ID.NO. 5)Ru- CCA CTA TAG GTG GGT CTT Id.No. 55 (SEQ.ID.NO. 5)

B: PNA-SondenB: PNA probes

Ru Glu₂ Ru Glu ₂

CCA CT(TGlu)A TAG GT(TGlu)G GGT CTT Gly, Id. Nr. 506
Ru Gly₃ CCA CT (TGlu) A TAG GT (TGlu) G GGT CTT Gly, Id.No. 506
Ru Gly ₃

CCA CTA TAG GTG GGT CTT Gly, Id. Nr. 487
RuGlu₂ CCA CTA TAG GTG GGT CTT Gly, Id.No. 487
RuGlu ₂

CCACTATAGGTGGGTCTTGlu, Id. Nr. 493
Ru Gly₃ CCACTATAGGTGGGTCTTGlu, Id.No. 493
Ru Gly ₃

CCA CT(TLys)A TAG GT(TLys)G GGT CTT Gly, Id. Nr. 494CCA CT (TLys) A TAG GT (TLys) G GGT CTT Gly, Id.No. 494

Die Sonden wurden im oben beschriebenen Experiment getestet, das Ergebnis ist in Tabelle 4 wiedergegeben. Der erste Teil (4a) gibt den Mittelwert der Signale aus einer Doppelbestimmung wieder, der zweite (4b) zeigt das Verhältnis des Signals zum Hintergrundsignal.The probes were tested in the experiment described above, the result is in table 4 reproduced. The first part (4a) gives the mean value of the signals from a Double determination again, the second (4b) shows the ratio of the signal to Background signal.

Die wichtigsten Erkenntnisse sind:
The key findings are:

• - Die Integration von TGlu im Backbone führt zu einer deutlichen Reduktion des Hintergrundes und ist vergleichbar mit der Referenz (DNA-Sonde)- The integration of TGlu in the backbone leads to a significant reduction in the Background and is comparable to the reference (DNA probe)
• - Die Modifikation führt zu einer Verbesserung der Sensitivität der PNA-Sonde, die Sensitivität ist vergleichbar mit der Referenz. Dies ist insbesondere in Tab. 4b deutlich zu sehen.- The modification leads to an improvement in the sensitivity of the PNA probe Sensitivity is comparable to the reference. This is particularly evident in Tab. 4b see.
• - Im Gegensatz zur Referenz verschlechtert sich die Sensitivität nicht bei einer niedrigen Salzkonzentration im Hybridisierungspuffer. Die Konkurrenzreaktion zwischen unmarkiertem Strang aus der PCR-Reaktion mit der Detektionssonde wird bei niedriger Salzkonzentration zur Sonde hin verschoben, was einen großen dynamischen Meßbereich bei sehr guter Sensitivität ermöglicht. - In contrast to the reference, the sensitivity does not deteriorate at a low one Salt concentration in the hybridization buffer. The competitive reaction between unlabeled strand from the PCR reaction with the detection probe becomes lower Salt concentration shifted towards the probe, which is a large dynamic measuring range enabled with very good sensitivity.  
• - Die modifizierte Sonde gemäß der Erfindung erlaubt die Abdeckung eines besonders großen dynamischen Meßbereiches, was besonders für die quantitative Detektion wichtig ist- The modified probe according to the invention allows the coverage of a particularly large dynamic measuring range, which is particularly important for quantitative detection is
• - Bei den unmodifizierten PNA-Sonden bzw. bei der positiv geladenen PNA-Sonde erhöht sich der Hintergrund mit sinkender Salzkonzentration.- Increased for the unmodified PNA probes or for the positively charged PNA probe the background with decreasing salt concentration.

Beispiel 4Example 4 Reduktion des Leerwertes und der unspezifischen Kreuzreaktivität bei ECL-MessungenReduction of the blank value and the non-specific cross-reactivity in ECL measurements

Die Durchführung des Experimentes ist in Beispiel 3 beschrieben. Als Probenmaterial wurde ein mit Biotin-markierter Längenstandard (entspr. Cat. No. 1062590, nur 5' Biotin-markiert) verwendet. Die Konzentration der Stocklösung: 1 µl entspr. 250 ng DNA.The implementation of the experiment is described in Example 3. As a sample material a length standard marked with biotin (corresponds to Cat. No. 1062590, only 5 'marked with biotin) used. The concentration of the stock solution: 1 µl corresponds to 250 ng DNA.

Folgende Detektionssonden wurden verwendet:
The following detection probes were used:

A. DNA-Sonde:
Ru- CCA CTA TAG GTG GGT CTT (SEQ.ID.NO. 5), Id. Nr. 55
A. DNA probe:
Ru- CCA CTA TAG GTG GGT CTT (SEQ.ID.NO. 5), Id.No. 55

B: PNA-Sonden:
Ru Glu₂ CCA CT(TGlu)A TAG GT(TGlu)G GGT CTT Gly, Id. Nr. 506
Ru Gly₃ TAT AGG TGG GTC TT Gly, Id. Nr. 484
RuGly₃ ACT ATA GGT GGG TCT T Gly, Id. Nr. 486B: PNA probes:
Ru Glu ₂ CCA CT (TGlu) A TAG GT (TGlu) G GGT CTT Gly, Id.No. 506
Ru Gly ₃ TAT AGG TGG GTC TT Gly, Id.No. 484
RuGly ₃ ACT ATA GGT GGG TCT T Gly, Id.No. 486

Das Ergebnis ist in Tabelle 5 wiedergegeben. 5a gibt den Mittelwert der Signale aus einer Doppelbestimmung wieder, 5b zeigt das Verhältnis des Signals zum Hintergrundsignal. Die wichtigsten Erkenntnisse sind:
The result is shown in Table 5. 5a shows the mean value of the signals from a double determination, FIG. 5b shows the ratio of the signal to the background signal. The key findings are:

• - Unspezifische Hybridisierungsreaktionen sind nur mit den beiden unmodifizierten PNA-Sonden zu beobachten, nicht jedoch mit der erfindungsgemäß modifizierten Sonde oder mit der Referenz.- Nonspecific hybridization reactions are only with the two unmodified Observe PNA probes, but not with the probe or modified according to the invention with the reference.
• - Die Stärke der unspezifischen Reaktionen nimmt mit der Länge der unmodifizierten Sonden zu (484: 14-mer; 486: 16-mer).- The strength of the non-specific reactions increases with the length of the unmodified Probes to (484: 14-mer; 486: 16-mer).

Beispiel 5Example 5 Einfluß des Salzgehaltes auf die Sensitivität des NukleinsäurenachweisesInfluence of salinity on the sensitivity of nucleic acid detection

Analog zu Beispiel 3 wurde HGV mit Hilfe einer DNA-Sonde (Schaubild 1), einer positiv geladenen PNA-Sonde (Schaubild 3) und zweier negativ geladener Sonden (Schaubilder 2 und 4) bestimmt. Dabei wurde der Salzgehalt (0; 50; 150; 200; 300; 625 mM) variiert. Die Messergebnisse sind in Fig. 2 graphisch gezeigt. Die Ergebnisse sind in der Beschreibung diskutiert. Analogously to example 3, HGV was determined with the aid of a DNA probe (diagram 1), a positively charged PNA probe (diagram 3) and two negatively charged probes (diagrams 2 and 4). The salt content (0; 50; 150; 200; 300; 625 mM) was varied. The measurement results are shown graphically in FIG. 2. The results are discussed in the description.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims (21)

1. Mit Nukleinsäuren hybridisierendes Molekül mit einem Grundgerüst aus linear miteinander verknüpften Monomereinheiten, wobei mindestens eine der Monomer­ einheiten eine nichtnukleosidische Einheit ist, die eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 enthält.1. Molecule hybridizing with nucleic acids with a backbone of linearly linked monomer units, wherein at least one of the monomer units is a non-nucleoside unit which contains an acid function with a pK _a of less than 3.0. 2. Molekül gemäß Anspruch 1 enthaltend mindestens eine nicht-nukleosidische Monomereinheit der Formel I
worin
L ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, Hydroxyl, (C₁-C₄)-Alkanoyl, nukleobasenbindende Gruppe, (C₆-C₁₄)-Aromaten, Heterocyclen mit Stickstoff-, Sauerstoff- oder/und Schwefel-Atomen, Interkalatoren und Reportergruppen,
A ein Abstandshalter mit einer Länge von 1 bis 3 Atomen,
x eine Zahl zwischen 0 und 3,
B eine Grundgerüsteinheit mit einer Länge von zwischen 4 und 8 Atomen,
R eine Gruppe enthaltend eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 bedeuten.2. Molecule according to claim 1 containing at least one non-nucleoside monomer unit of the formula I.
wherein
L is selected from the group hydrogen, hydroxyl, (C ₁ -C ₄ ) alkanoyl, nucleobase-binding group, (C ₆ -C ₁₄ ) aromatics, heterocycles with nitrogen, oxygen or / and sulfur atoms, intercalators and reporter groups ,
A is a spacer with a length of 1 to 3 atoms,
x is a number between 0 and 3,
B is a basic unit with a length of between 4 and 8 atoms,
R is a group containing an acid function with a pK _a of less than 3.0. 3. Molekül gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß L über A an ein Stickstoffatom in B gebunden ist.3. Molecule according to one of the preceding claims, characterized in that L is linked via A to a nitrogen atom in B. 4. Molekül gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R nicht an das Stick­ stoffatom gebunden ist. 4. Molecule according to claim 3, characterized in that R is not on the stick atom is bound.   5. Molekül gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomereinheit die Formel II aufweist,
worin
E' und F' unabhängig voneinander CO, CS, SO, SO₂ oder NR¹, wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und (C₁-C₃)-Alkyl
N ein Aminstickstoffatom,
C (CR²R³)_n oder CR²R³CR⁴R⁵
wobei
R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, C₁-C₆-(substituiertes oder unsubstituiertes) Alkyl, Hydroxyl, Carboxyl und einer die Säurefunktion enthaltenden Gruppe, und
n eine Zahl zwischen 1 und 4 ist, und
D (CR²R³)_n oder CR²R³CR⁴R⁵
wobei
R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff- C₁-C₆-(substituiertes oder unsubstituiertes) Alkyl, Hydroxyl, Carboxyl und einer die Säurefunktion enthaltenden Gruppe, und
n eine Zahl zwischen 1 und 4 ist,
bedeuten.5. Molecule according to one of the preceding claims, characterized in that the monomer unit has the formula II,
wherein
E 'and F' independently of one another CO, CS, SO, SO ₂ or NR ¹ , where R1 is selected from the group hydrogen and (C ₁ -C ₃ ) alkyl
N is an amine nitrogen atom,
C (CR ² R ³ ) _n or CR ² R ³ CR ⁴ R ⁵
in which
R ² , R ³ , R ⁴ and R ⁵ are selected independently of one another from the group hydrogen, C ₁ -C ₆ - (substituted or unsubstituted) alkyl, hydroxyl, carboxyl and a group containing the acid function, and
n is a number between 1 and 4, and
D (CR ² R ³ ) _n or CR ² R ³ CR ⁴ R ⁵
in which
R ² , R ³ , R ⁴ and R ^{5 are} independently selected from the group hydrogen-C ₁ -C ₆ - (substituted or unsubstituted) alkyl, hydroxyl, carboxyl and a group containing the acid function, and
n is a number between 1 and 4,
mean. 6. Molekül gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß D abgeleitet ist von Serin oder einem Homologen von Serin.6. Molecule according to claim 5, characterized in that D is derived from serine or a homologue of serine. 7. Molekül gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Säurefunktion ausgewählt ist aus den Gruppen der Sulfonsäuren, der Phosphon­ säuren oder der Phosphorsäuren.7. Molecule according to one of the preceding claims, characterized in that the acid function is selected from the groups of the sulfonic acids, the phosphone acids or phosphoric acids. 8. Molekül gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Säurefunktion über einen Abstandshalter A' von zwischen 1 und 20 Atomen Länge an linear aufeinanderfolgende Atome des Grundgerüsts gebunden ist.8. Molecule according to one of the preceding claims, characterized in that the acid function via a spacer A 'of between 1 and 20 atoms Length is bound to linearly consecutive atoms of the basic structure. 9. Molekül gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstandhalter A' die Formel III
-(-(-A¹-)_a-(-A²-)_b-(-A³-)_c-)_d- (III)
hat, in der
A¹ Sauerstoff, NR⁶ oder Schwefel,
A² ein substituierter oder unsubstituierter Alkylen-, Alkinylen- oder Alkenylen­ rest,
A³ Sauerstoff, Schwefel oder NR⁶,
R⁶ unabhängig H oder Alkyl oder Acetyl,
a und c unabhängig voneinander eine Zahl von 0 bis 2,
b eine Zahl von 1 bis 10, und
d eine Zahl von 1 bis 4
bedeuten.9. Molecule according to claim 8, characterized in that the spacer A 'has the formula III
- (- (- A ¹ -) _a - (- A ² -) _b - (- A ³ -) _c -) _d - (III)
has in the
A ¹ oxygen, NR ⁶ or sulfur,
A ^{2 is} a substituted or unsubstituted alkylene, alkynylene or alkenylene radical,
A ³ oxygen, sulfur or NR ⁶ ,
R ^{6 is} independently H or alkyl or acetyl,
a and c independently of one another a number from 0 to 2,
b is a number from 1 to 10, and
d is a number from 1 to 4
mean. 10. Molekül der Formel IV
in der
L ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, Hydroxyl, (C₁-C₄)- Alkanoyl, nukleobasenbindende Gruppe in geschützter oder unge­ schützter Form, (C₆-C₁₄)-Aromaten, Heterocyclen mit Stickstoff-, Sauerstoff- oder/und Schwefel-Atomen, Interkalatoren und Reporter­ gruppen,
A ein Abstandshalter mit einer Länge von zwischen 1 und 3 Atomen,
x eine Zahl zwischen 0 und 3,
E und F unabhängig voneinander COOX, CSOX, SO₂X, SO₃X oder NR¹Y,
wobei
R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und (C₁-C₃)-Alkyl,
X ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff- der Schutzgruppen und der Aktivierungsgruppen,
Y ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und der Schutzgruppen,
N ein Aminstickstoffatom, und
C und D unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe (CR²R³)_n und CR²R³CR⁴R⁵
wobei
R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, C₁-C₆-(substituiertes oder unsubstituiertes) Alkyl, Hydroxyl, Carboxyl und einer eine Säurefunktion mit einem pK_a von weniger als 3.0 enthaltenden Gruppe in geschützter oder ungeschützter Form, und
n eine Zahl zwischen 1 und 4 ist.10. Molecule of formula IV
in the
L is selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl, (C ₁ -C ₄ ) alkanoyl, nucleobase-binding group in protected or unprotected form, (C ₆ -C ₁₄ ) aromatics, heterocycles with nitrogen, oxygen and / or sulfur -Atoms, intercalators and reporter groups,
A is a spacer with a length of between 1 and 3 atoms,
x is a number between 0 and 3,
E and F independently of one another COOX, CSOX, SO ₂ X, SO ₃ X or NR ¹ Y,
in which
R ^{1 is} selected from the group consisting of hydrogen and (C ₁ -C ₃ ) alkyl,
X is selected from the group consisting of hydrogen, the protective groups and the activation groups,
Y is selected from the group hydrogen and the protective groups,
N is an amine nitrogen atom, and
C and D are independently selected from the group (CR ² R ³ ) _n and CR ² R ³ CR ⁴ R ⁵
in which
R ² , R ³ , R ⁴ and R ^{5 are} independently selected from the group hydrogen, C ₁ -C ₆ - (substituted or unsubstituted) alkyl, hydroxyl, carboxyl and a group containing an acid function with a pK _a of less than 3.0 in protected or unprotected form, and
n is a number between 1 and 4. 11. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nukleinsäure in einer Probe, bei der zu vermuten ist, daß sie eine oder mehrere andere Nuklein­ säuren enthält, deren Basensequenz sich von der Basensequenz der nachzuweisen­ den Nukleinsäure in einer oder mehreren Positionen unterscheidet, enthaltend die Schritte

• - Inkontaktbringen einer Sonde, welche eine zu der nachzuweisenden Basen­ sequenz, nicht jedoch einer Basensequenz der anderen Nukleinsäuren komple­ mentäre Basensequenz enthält und
• - Feststellung, ob eine Bindung der Sonde an eine zu der Basensequenz komple­ mentäre Basensequenz stattgefunden hat,

dadurch gekennzeichnet, daß als Sonde ein Molekül verwendet wird, bei dem weniger als 80%, jedoch mindestens eine der Basen an negativ geladene Grund­ gerüsteinheiten gebunden sind.11. A method for detecting the presence or absence of a nucleic acid in a sample, which is suspected to contain one or more other nucleic acids, the base sequence of which differs from the base sequence of the nucleic acid to be detected in one or more positions, containing the steps

• Contacting a probe which contains a base sequence complementary to the base to be detected, but not a base sequence of the other nucleic acids, and
• Determining whether binding of the probe to a base sequence complementary to the base sequence has taken place,

characterized in that a molecule is used as the probe, in which less than 80%, but at least one of the bases are bound to negatively charged basic scaffold units. 12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sich die nicht-nukleo­ sidische Grundgerüsteinheit an der unterschiedlichen Position von mindestens einer der beiden benachbarten Grundgerüsteinheiten unterscheidet.12. The method according to claim 11, characterized in that the non-nucleo Sidic basic unit at the different position of at least one of the two neighboring basic scaffolding units. 13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich die unterschiedliche Position am Ende der Basensequenz befindet.13. The method according to any one of claims 11 and 12, characterized in that the different position is at the end of the base sequence. 14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde eine Markierung trägt.14. The method according to any one of claims 11 to 13, characterized in that the Probe carries a mark. 15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung ein Ruthenium-bispyridyl-Komplex ist. 15. The method according to claim 14, characterized in that the marking Is ruthenium bispyridyl complex.   16. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 zum Nachweis von Mutationen, Allelen oder Polymorphismen.16. Use of a method according to one of claims 11 to 13 for detection of mutations, alleles or polymorphisms. 17. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Typisie­ rung oder Subtypisierung von Mikroorganismen.17. Use of a method according to one of claims 11 to 13 for typing tion or subtyping of microorganisms. 18. Verwendung von negativen Ladungen in Sonden, die mindestens eine nicht­ nukleosidische Grundgerüsteinheit enthalten, zur Vermeidung unspezifischer Bindungen der Sonden an Basensequenzen, die zu weniger als 50% komplementär zu der Sonde sind oder an feste Träger.18. Using negative charges in probes that have at least one not contain nucleosidic basic scaffold unit to avoid unspecific Binding of the probes to base sequences that are less than 50% complementary to the probe or to solid supports. 19. Verwendung von Säurefunktionen zur Erhöhung der Selektivität von Sonden in Bindereaktionen.19. Use of acid functions to increase the selectivity of probes in Binding reactions. 20. Verwendung von mit Nukleinsäuren hybridisierenden Molekülen, bei denen mindestens eine der Basen an eine nicht-nukleosidische negativ geladene Grundgerüsteinheit gebunden ist, als Primer zur Polymerase katalysierten Verlängerung mit Hilfe von Mononukleosidtriphosphaten.20. Use of molecules hybridizing with nucleic acids in which at least one of the bases to a non-nucleoside negatively charged Basic unit is bound, catalyzed as a primer to polymerase Extension using mononucleoside triphosphates. 21. Verwendung von nukleinsäurebindenen Molekülen, bei denen mindestens eine der Basen an eine nicht-nukleosidische negativ geladene Grundgerüsteinheit gebunden ist zur Transfektion in Zellen mit Hilfe von Transfektionsreagenzien.21. Use of nucleic acid-binding molecules in which at least one of the Bases bound to a non-nucleoside negatively charged framework is for transfection in cells using transfection reagents.