DE19757144A1 - Detection of genomic mutations - Google Patents

Abstract

A method for detecting mutations in the genomes of organisms uses endonuclease VII (endo VII), which recognises all known base pair mismatches in heteroduplex DNA and cuts phosphodiester linkages in their immediate vicinity.

Description

Der Nachweis von Mutationen gewinnt im klinischen Bereich zunehmend an Bedeutung, seitdem man mehr und mehr Gene findet, deren sprunghafte Veränderungen vielfältige Erbkrankheiten und Tumoren auslösen können. In breit angelegten Suchaktionen wird nach individuellen Genvarianten beim Menschen gesucht, deren Produkte als Ziel für maßgeschneiderte Therapie (Drugdesign) infrage kommen. Im wissenschaftlichen Bereich gehören Auslösung, Isolation, Kartierung und Charkaterisierung von Mutationen zur Routine in allen Organismen.The detection of mutations is becoming increasingly important in the clinical field, ever since more and more genes have been found, the abrupt changes of which are diverse Can cause hereditary diseases and tumors. In broad-based searches, individual gene variants sought in humans, whose products as a target for tailor-made Therapy (drug design) come into question. In the scientific field, triggering includes Isolation, mapping and characterization of mutations to routine in all organisms.

Normalerweise lassen sich Veränderungen im Genom durch Vergleiche der Sequenz von Wildtyp und Mutante genau feststellen. Die Sequenziertechnik ist jedoch trotz enormer Vereinfachung in den letzten Jahren immer noch verhältnismäßig zeitaufwendig und teuer. Sie ist an wartungsintensive Maschinen gebunden und erfordert giftige Chemikalien. Man hat dehalb seit langem nach einfachen und schnellen Nachweismethoden gesucht und ist dabei auf die enzymatische Methode zum Nachweis von Mutationen (EMD) gekommen.Typically, changes in the genome can be seen by comparing the sequence of Identify wild type and mutant exactly. However, the sequencing technology is enormous Simplification in recent years has still been relatively time consuming and expensive. It is on maintenance-intensive machines bound and requires toxic chemicals. You've been there for has long been looking for simple and fast detection methods and is focused on the enzymatic Method for detecting mutations (EMD) has come.

Solche Methoden beruhen auf Enzymen, die normalerweise für die natürliche Reparatur von DNA-Schäden in den Zellen verantwortlich sind. Diese Enzyme erkennen u. a. Basenfehlpaarungen in der DNA, an die sie binden und dann selber oder mit Hilfsproteinen durch Schnitte in der Nachbarschaft zur Reparatur vorbereiten. Ein solches Enzym ist die Endonuklease VII des Phagen T4, das als bisher einziges bekanntes Enzym alle möglichen Basenfehlpaarungen erkennen, binden und schneiden kann.Such methods rely on enzymes that are normally used for the natural repair of DNA damage in the cells are responsible. These enzymes recognize u. a. Base mismatches in the DNA to which they bind and then by themselves or with auxiliary proteins through cuts in the Prepare neighborhood for repair. One such enzyme is phage endonuclease VII T4, which is the only enzyme known to date to recognize all possible base mismatches, bind and can cut.

Zum Zeitpunkt der Antragstellung steht die Auslieferung eines Kits zum vereinfachten Mutationsnachweis durch die Firma Pharmacia kurz bevor, der sich diese Fähigkeiten der Endo VII zunutze macht. Die neue, hier zur Patentierung vorgeschlagene Methode ist eine unabhängige Fortführung des alten, in dem Patent "Detection of Mutations by Resolvase Cleavage" (siehe Anlage) beschriebenen Verfahrens (siehe auch Stand der Technik).At the time of application, the delivery of a kit is simplified Proof of mutation by the company Pharmacia shortly before the endo VII takes advantage. The new method proposed here for patenting is an independent one Continuation of the old, in the patent "Detection of Mutations by Resolvase Cleavage" (see Plant) described method (see also prior art).

Die alte Methode besteht aus mehreren Schritten:
The old method consists of several steps:

• a) Gewinnung von Test-DNA aus Zellen, Viren und Bakteriophagen. a) Obtaining test DNA from cells, viruses and bacteriophages.  
• b) Maximal zwei PCR-Amplifikationen von DNA des Wildtyps und der vermutlichen Mutante. Bei DNA von Heterozygoten genügt eine PCR-Reaktion, weil sich die mutierte Sequenz und die Wildtyp-Sequenz gleichzeitig in derselben Zelle befinden.b) A maximum of two PCR amplifications of wild-type DNA and the putative mutant. At DNA from heterozygotes is sufficient for a PCR reaction because the mutated sequence and the Wild-type sequence are in the same cell at the same time.
• c) Isolation der PCR-Produkte.c) Isolation of the PCR products.
• d) Denaturierung und Reanturierung einer 1 : 1 Mischung von Mutanten-DNA^PCR und Wildtyp-DNA^PCR.d) Denaturation and reanturation of a 1: 1 mixture of mutant DNA ^PCR and wild-type DNA ^PCR .
• e) Verdau der Hybrid-DNA^PCR mit Endo VII.e) Digestion of the hybrid DNA ^PCR with Endo VII.
• f) Auftrennung und Vermessung der Fragmente auf einem Sequenziergel (s. Zeichnung).f) Separation and measurement of the fragments on a sequencing gel (see drawing).

Die Prozedur erfordert ab e) im günstigsten Fall 6 Stunden bei Verwendung normaler Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE). Bei Verwendung einer Sequenziermaschine ist der Aufwand der Maschinenvorbereitung und -betreuung hinzuzurechnen.From e) the procedure requires 6 hours in the best case when using normal ones Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). When using a sequencing machine, the Add the cost of machine preparation and support.

Eine Vereinfachung der zum Mutationsnachweis notwendigen PCR-Amplifikationsreaktionen und die nachfolgenden Schritte zur Reinigung der Fragmente und der Gewinnung von Heteroduplex-DNA^PCR ist derzeitig nicht möglich. Daher konzentrieren sich die Verbesserungsversuche auf die Sequenz der Ereignisse ab e) im obigen Schema. Die zur Patentierung vorgeschlagene neue Methode nutzt die Fähigkeit von Endo VII, vor jedem Schnitt an die den Schnitt auslösende Stelle in der Heteroduplex-DNA zu binden (duale Methode). Das hat eine erhebliche Vereinfachung der Prozedur bei gleichzeitigem Zeitgewinn zur Folge.Simplification of the PCR amplification reactions required for mutation detection and the subsequent steps for purifying the fragments and obtaining heteroduplex DNA ^PCR is currently not possible. Therefore, the attempts to improve focus on the sequence of events from e) in the above scheme. The new method proposed for patenting uses the ability of Endo VII to bind to the site that triggered the cut in the heteroduplex DNA before each cut (dual method). This results in a considerable simplification of the procedure while saving time.

Die duale Meßmethode beinhaltet 9 sehr einfache Schritte, wobei die Bindungsfähigkeit von Endo VII an Basenfehlpaarungen im Vortest verwendet wird. Die Fähigkeit von Endo VII an denselben Basenfehlpaarungen zu schneiden wird im Folgetest auf die ausselektionierten positiven Kandidaten zur Bestätigung und zur Kartierung der Mutationen verwendet (s. auch Zeichnung in der Zusammenfassung):The dual measurement method consists of 9 very simple steps, the binding ability of Endo VII is used on base mismatches in the pre-test. The ability from Endo VII The same base mismatches will be cut in the subsequent test for the selected positive ones Candidates used to confirm and map the mutations (see also drawing in the summary):

I. VortestI. Pretest

• 1. Endo VII wird unter EDTA (zur Inaktivierung der Schnittaktivität) an die Innenflächen von Vertiefungen in Mikrotiterplatten über 60 min gebunden.1. Endo VII is placed under EDTA (to inactivate the cutting activity) on the inner surfaces of Wells bound in microtiter plates over 60 min.
• 2. Die zuvor gewonnene Heteroduplex-DNA wird zu der Adsorptionsmischung gegeben und weitere 60 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. 2. The previously obtained heteroduplex DNA is added to the adsorption mixture and incubated for a further 60 min at room temperature (RT).  
• 3. Jede Vertiefung wird 5 mal mit dem Adsorptionspuffer nachgewaschen.3. Wash each well 5 times with the adsorption buffer.
• 4. Die an die Innenflächen gebundenen Protein-DNA Gemische werden durch hohe Salzgaben eluiert und in zwei Aliquots A und B geteilt.4. The protein-DNA mixtures bound to the inner surfaces are caused by high salt doses eluted and divided into two aliquots A and B.
• 5. Aliquot A wird innerhalb eines Rasters auf ein Filterpapier aufgetropft, getrocknet und die Radioaktivität im Phosphorimager quantifiziert.5. Aliquot A is dripped onto a filter paper within a grid, dried and the Radioactivity in the phosphor imager quantified.
• 6. Alle Proben mit einem mindestens 1,25 mal höherem Gehalt an DNA im Vergleich zu dem aus mindestens fünf Kontrollproben mit gleicher Menge Homoduplex-DNA ermittelten Durchschnittswert werden als "vorläufig-positiv" eingestuft.6. All samples with a DNA content at least 1.25 times higher than that from determined at least five control samples with the same amount of homoduplex DNA Average values are classified as "provisional positive".

II. FolgetestII. Follow-up test

• 7. Aliquots B aller unter #5 als "vorläufig-positiv" identifizierten Proben werden mit 10mM MgCl₂ versetzt, für 15 min bei 37°C inkubiert und nach Stoppen der Reaktion durch EDTA und M Stopmix auf ein Sequenziergel aufgetragen.7. Aliquots B of all samples identified as "provisionally positive" under # 5 are mixed with 10 mM MgCl ₂ , incubated for 15 min at 37 ° C. and applied to a sequencing gel after stopping the reaction by EDTA and M Stop mix.
• 8. Endgültige Identifikation der "endgültig-positiven" Proben.8. Final identification of the "final positive" samples.
• 9. Vermessen der entstandenen Fragmentlängen bzw. Kartierung der relativen Lage der Mutationen.9. Measure the resulting fragment lengths or map the relative location of the mutations.

Das Verfahren wurde mit kurzen Heteroduplex-DNAs und einer cruciformen DNA, als typische Substrate für Endo VII, etabliert (siehe "DNA-Substrate" im Anschluß an diesen Abschnitt und Abb. 1). Die Empfindlichkeit der Methode lag bei 12,5% Gehalt an Heteroduplex-DNA mit einer C/C-Basenfehlpaarung in 87,5% Homoduplex-DNA ohne Fehlpaarungen (Abb. 2). Das ist doppelt so empfindlich als es in einer heterozygoten Realsituation mit 50% Heteroduplex-DNA (Mutante) und 50% Homoduplex-DNA (Wildtyp) erforderlich sein würde. Durch den anschließenden Folgetest können die im Verlauf des Vortests als positiv eingestuften Kandidaten überprüft und die Lage der jeweiligen Mutationen kartiert werden (Abb. 3).The method was established with short heteroduplex DNAs and a cruciform DNA, as typical substrates for Endo VII (see "DNA substrates" following this section and Fig. 1). The sensitivity of the method was 12.5% content of heteroduplex DNA with a C / C base mismatch in 87.5% homoduplex DNA without mismatches ( Fig. 2). This is twice as sensitive as would be required in a heterozygous real situation with 50% heteroduplex DNA (mutant) and 50% homoduplex DNA (wild type). The subsequent follow-up test can be used to check the candidates classified as positive in the course of the pre-test and to map the location of the respective mutations ( Fig. 3).

Die Zuverläßigkeit des Verfahrens wurde in einem Blindtest geprüft (Abb. 4). Zwei positive Proben (A/4 und D/3) konnten unter 20 Kandidaten sicher erkannt werden. Bei unseren Vorversuchen wurden nur selten (<10% aller Kandidaten) Falsch-Positive im Vortest gefunden, niemals Falsch-Negative. Durch Weiterführung der Untersuchung aller im Vortest als "vorläufig-positiv" eingestuften Kandidaten lassen sich (theoretisch) alle Positiven mit hoher Sicherheit ermitteln. The reliability of the procedure was checked in a blind test ( Fig. 4). Two positive samples (A / 4 and D / 3) were reliably identified among 20 candidates. In our preliminary tests, false positives were rarely found in the pre-test (<10% of all candidates), never false negatives. By continuing the examination of all candidates classified as "preliminary positive" in the pre-test, (theoretically) all positives can be determined with a high degree of certainty.

SUBSTRATE SUBSTRATE

DNA-SUBSTRATE (Fortsetzung) DNA SUBSTRATES (continued)

Stand der TechnikState of the art (Kemper & Cotton, 1997; Übersetzung aus dem Englischen)(Kemper & Cotton, 1997; translation from English) Einleitungintroduction

Der Nachweis von Mutationen wird zunehmend wichtiger. Das hat verschiedene Gründe, insbesondere diese:
The detection of mutations is becoming increasingly important. There are several reasons for this, in particular:

• a) die Anzahl der beschriebenen Gene wächst ständig,a) the number of genes described is constantly growing,
• b) viele Tumore werden durch Mutationen in bestimmten Genen ausgelöst, undb) many tumors are triggered by mutations in certain genes, and
• c) mehr und mehr Gene werden auf eine Beziehung zu bestimmten Krankheiten der auf ihren wirtschaftlichen Nutzen hin untersucht.c) More and more genes are linked to certain diseases who examines their economic benefits.

Der Nachweis von Mutationen durch Sequenziertechniken ist zeitaufwendig und teuer, vor allem bei Genen mit langen codierenden Sequenzen oder solchen mit vielen Exons. Das hat zur Entwicklung von Methoden geführt, die ohne Sequenziertechniken auskommen und die gesamte Länge der DNA examinieren (für eine Übersicht, siehe Review 4). Die Tatsache daß es keine Methode gibt, die alle Ansprüche zufrieden stellt, wird dadurch unterstrichen, daß zur Zeit mindestens sechs verschiedene Methoden Verwendung finden, von denen jede ihre Vor- und Nachteile hat. Grundsätzlich gilt, je einfacher und billiger die Methode ist, umso geringer ist die Zahl der nachweisbaren Mutationen (Cotton, 1996) und umso mehr komplexere/teurere Methoden sind einzusetzen, um möglichst alle Mutationen erfassen zu können.The detection of mutations by sequencing techniques is time consuming and expensive especially for genes with long coding sequences or those with many exons. That has to Development of methods that do not require sequencing techniques and the whole Examine length of DNA (for an overview, see Review 4). The fact that there is none Method that satisfies all claims is underlined by the fact that at the moment at least six different methods are used, each with its first and last names Has disadvantages. Basically, the simpler and cheaper the method, the smaller the number of detectable mutations (Cotton, 1996) and the more complex / expensive methods are to be able to record all mutations if possible.

Es gibt zwei große Klassen von Methoden, die derzeit zum Nachweis unbekannter Mutationen eingesetzt werden:
There are two broad classes of methods currently used to detect unknown mutations:

• a) physikalische Methoden unda) physical methods and
• b) Basenfehlpaarungen spaltende Methoden ("mismatch cleavage method").b) mismatch cleavage method.

Die physikalischen Methoden basieren auf der Erkenntnis, daß Mutationen die physikalischen Eigenschaften eines DNA-Fragments so verändern, daß es von der Wildtyp-DNA mit Hilfe von Elektrophorese abgetrennt werden kann. Hierdurch kann nicht nur die Mutation entdeckt werden, sondern es kann das DNA-Fragment auch gleichzeitig für eine spätere Sequenzierung gewonnen werden. Die größte Schwäche dieser Techniken liegt darin, daß nur relativ kurze DNA-Fragmente untersucht werden können und daß die Lage der Mutation nicht direkt erkennbar wird. Das wäre jedoch eine große Hilfe für den in Sequenziertechniken ungeübten Anwender. The physical methods are based on the knowledge that mutations are change physical properties of a DNA fragment so that it is different from the wild-type DNA can be separated using electrophoresis. This can not only be the mutation can be discovered, but the DNA fragment can also be used simultaneously for later Sequencing can be obtained. The main weakness of these techniques is that they are only relative Short DNA fragments can be examined and that the location of the mutation is not direct becomes recognizable. However, that would be of great help to those who are inexperienced in sequencing techniques User.  

Die Spaltung von Basenfehlpaarungen ("mismatch cleavage") beruht auf der Gewinnung von Heteroduplex-Molekülen mit DNA von Mutante und Wildtyp und deren nachfolgende Spaltung direkt an oder in unmittelbarer Nähe der Basenfehlpaarung. Dadurch läßt sich die Mutation gleichzeitig nachweisen und kartieren. Der Hauptvorteil dieser Methoden beruht darauf, daß sie 1-2 kb lange DNA-Stücke absuchen und die Lage der Mutationen bestimmen können.The cleavage of base mismatches ("mismatch cleavage") is based on the extraction of Heteroduplex molecules with mutant and wild-type DNA and their subsequent cleavage directly on or in the immediate vicinity of the base mismatch. This allows the mutation prove and map at the same time. The main advantage of these methods is that they Scan 1-2 kb pieces of DNA and determine the location of the mutations.

Das ideale Enzym zur Spaltung von Basenfehlpaarungen würde eine Art "Restriktionsenzym für Basenfehlpaarungen" sein. Dieses Enzym würde an vielen Beispielen aller acht möglichen Basenfehlpaarungen ohne "star" Aktivität schneiden und keine falsch-positiven Signale in Homoduplex DNA hervorrufen. Viele Arbeitsgruppen haben in Richtung dieses Ideals gearbeitet und das Maß des erreichten Fortschritts hing weitgehend von der Art des gefundenen/studierten Enzyms ab.The ideal enzyme for cleaving base mismatches would be a kind of "restriction enzyme for Base mismatches ". This enzyme would use many examples of all eight possible Base mismatches with no "star" activity cut and no false positive signals in Cause homoduplex DNA. Many working groups have worked towards this ideal and the degree of progress achieved largely depended on the type of found / studied Enzyme.

Das ideale Enzym zur Spaltung von Basenfehlpaarungen würde eine Art "Restriktionsenzym für Basenfehlpaarungen" sein. Dieses Enzym würde an vielen Beispielen aller acht möglichen Basenfehlpaarungen ohne "star" Aktivität schneiden und keine falsch-positiven Signale in Homoduplex DNA hervorrufen. Viele Arbeitsgruppen haben in Richtung dieses Ideals gearbeitet und das Maß des erreichten Fortschritts hing weitgehend von der Art des gefundenen/studierten Enzyms ab.The ideal enzyme for cleaving base mismatches would be a kind of "restriction enzyme for base mismatches ". This enzyme would use many examples of all eight possible Base mismatches with no "star" activity cut and no false positive signals in Cause homoduplex DNA. Many working groups have worked towards this ideal and the degree of progress achieved largely depended on the type of found / studied Enzyme.

Das erste vielversprechende Enzym dieser Art war die Ribonuclease (Myers et al., 1985). Die Methode beruht auf einer RNA Probe, einem offensichtlichen Nachteil, aber auch darauf, daß verschiedene Basenfehlpaarungen dann nicht geschnitten werden, wenn DNA mit der RNA Probe hybridisiert ist. Es gibt jedoch einen käuflichen Kit neueren Datums, der den Einsatz von mutierter und wildtyp RNA erforderlich macht um Heteroduplexes herzustellen und dadurch die Zahl der Basenfehlpaarungen erhöht, die gespalten werden können. Viele Laboratorien benutzen zur Zeit die Methode, und es wurde kürzlich ein Beispiel von Nash and Inderlied (Nash and Inderlied, 1996) publiziert, in dem diese Methode angewendet wurde.The first promising enzyme of this kind was the ribonuclease (Myers et al., 1985). The method is based on an RNA sample, an obvious disadvantage, but also that Different base mismatches cannot be cut when DNA is used with the RNA sample is hybridized. However, there is a more recent kit available for purchase that uses mutant and requires wild type RNA to produce heteroduplexes and thereby the number of Base mismatches increased that can be split. Many laboratories currently use the Method, and recently an example of Nash and Inderlied (Nash and Inderlied, 1996) published in which this method was applied.

Chemikalien wurden ebenfalls als Nachweis von Mutationen durch Spaltung von Basenfehlpaarungen eingesetzt (Cotton et al., 1988). Diese Methode sollte im Prinzip alle Mutationen nachweisen, da sie mindestens zwei Chancen zum Nachweis aller Mutationen hat, mit Ausnahme von 1/3 an T/G Basenfehlpaarungen, den einzigen nicht spaltbaren Basenfehlpaarungen, die jedoch über C/A Basenfehlpaarungen nachweisbar sind (siehe Cotton, 1997). Obwohl weit verbreitet (siehe zum Beispiel Verpy et al., 1994), ist die Methode wegen der Giftigkeit der Chemikalien, der vielen erforderlichen Einzelschritte und der Nichtverfügbarkeit eines Kits, nicht weit verbreitet.Chemicals have also been used to detect mutations by cleavage of Base mismatches used (Cotton et al., 1988). In principle, this method should all Detect mutations as it has at least two chances to detect all mutations with Exception of 1/3 of T / G base mismatches, the only non-fissile base mismatches, which, however, can be detected via C / A base mismatches (see Cotton, 1997). Although far  widespread (see for example Verpy et al., 1994), the method is because of the toxicity of the Chemicals, the many individual steps required and the unavailability of a kit, not widespread.

Der offensichtlichste Platz, um nach Enzymen zu suchen, die zum Schneiden von Basenfehlpaarungen und damit zum Nachweis von Mutationen geeignet sind, liegt bei den Reparaturenzymen. Diese Quelle hat sich bisher jedoch als eher enttäuschend gezeigt. MUTY (Smith and Modrich, 1996) schneidet ausschließlich A/G und A/C Fehlpaarungen. Kürzlich wurde der komplette MUTS/MUTL Reparaturkomplex beschrieben und "scheint" ein ideales Restriktionsenzym für Basenfehlpaarungen darzustellen. Die Schnittstelle liegt jedoch bis zu mehreren Kilobasen von der Erkennungsstelle entfernt (Smith and Modrich, 1996).The most obvious place to look for enzymes to cut Base mismatches and thus suitable for the detection of mutations lies with the Repair enzymes. However, this source has so far been rather disappointing. MUTY (Smith and Modrich, 1996) only cuts A / G and A / C mismatches. Recently the complete MUTS / MUTL repair complex is described and "seems" an ideal one To represent restriction enzyme for base mismatches. However, the interface is up to several kilobases from the recognition site (Smith and Modrich, 1996).

Dieses enttäuschende Szenario hat zur Suche nach anderen potentiellen Enzymen geführt. Die durch T4 Endonuklease VII (T4 Endo VII) schneidbaren Substrate sind viel einfacher und schließlich können alle Basenfehlpaarungen geschnitten werden (siehe unten). Das hat zum Austesten dieses Enzyms als praktisches Werkzeug zur Mutationsnachweis über Basenfehlpaarungen geführt (Youil et al., 1995). Mashal et al (Mashal et al., 1995) haben das Potential diese Enzyms bestätigt.This disappointing scenario has led to the search for other potential enzymes. The substrates cut by T4 Endonuclease VII (T4 Endo VII) are much simpler and finally all base mismatches can be cut (see below). That has to Testing this enzyme as a practical tool for mutation detection Base mismatches were performed (Youil et al., 1995). Mashal et al (Mashal et al., 1995) did Potential of this enzyme is confirmed.

Funktionen der Endonuklease VII in vivoFunctions of endonuclease VII in vivo

Endo VII ist das Produkt des Gens 49 vom Bakteriophagen T4 (Phage T4). Mutationen in diesem Gen bewirken schwere Defekte in der spät im Entwicklungszyklus ablaufenden DNA-Verpackung. Als Konsequenz von Infektionen mit 49⁻-Mutatanten werden lediglich teilweise gefüllte Köpfe und nicht-verpackbare Vorläufer DNA in der Wirtszelle angehäuft. Auf Grund dieses Phänotyps wurde das Gen ursprünglich als morphopoietisches Gen klassifiziert (Epstein et al., 1963). Die Defizienz von Gen 49 Mutanten, DNA vollständig in reifende Köpfe zu verpacken, wurde erst später mit dem Fehlen einer endonukleolytischen Funktion zur Auflösung verzweigter DNA-Moleküle in Verbindung gebracht (Epstein et al., 1963). Das Genprodukt 49 (gp49) wird zur Auflösung der DNA-Verzweigungen vor dem eigentlichen Verpackungsvorgang benötigt. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen von aus 49⁻-Infektionen isolierten DNA-Vorläufer Molekülen ließen sich 3 bis 4 drei- bzw. vier-armig verzweigte, zufällig verteilte Strukturen pro Chromosom nachweisen. Diese Verzweigungen stammen offensichtlich aus früh im Entwicklungszyklus auftretenden Rekombinations- und Replikationsabläufen (Flemming et al., 1993). Zusammengefaßt beschrieben diese Beobachtungen das Produkt des Gens 49 als eine für die DNA-Verpackung essentielle Endonuklease, die später Endonuklease VII (Endo VII) genannt wurde (siehe unten).Endo VII is the product of gene 49 from bacteriophage T4 (phage T4). Mutations in This gene causes serious defects in the late development cycle DNA packaging. As a consequence of infections with 49⁻ mutants are only partial filled heads and non-packable precursors of DNA accumulated in the host cell. Because of this Phenotype, the gene was originally classified as a morphopoietic gene (Epstein et al., 1963). The deficiency of gene 49 mutants to completely pack DNA into maturing heads was later branched with the lack of an endonucleolytic function to dissolve DNA molecules linked (Epstein et al., 1963). The gene product 49 (gp49) becomes Disassembly of the DNA branches required before the actual packaging process. In electron microscopic investigations of DNA precursors isolated from 49⁻ infections Molecules could be 3 to 4 three- or four-arm branched, randomly distributed structures per Detect chromosome. These branches obviously come from early in the year Development cycle recombination and replication processes (Flemming et al.,  1993). In summary, these observations described the product of gene 49 as one for the DNA packaging essential endonuclease, later called endonuclease VII (Endo VII) was (see below).

Neben seiner Aufgabe als Auflöser von DNA-Verzweigungen während der DNA-Verpackung hat Endo VII auch noch austauschbare Hilfsfunktionen im frühen DNA-Metabolismus. Mutationen im Gen 49 wirken sich auf die homologe genetische Rekombination, die Reparatur von Basenfehlpaarungen und die Rekombinations abhängige DNA-Replikation aus (Mosig, 1994). Da diese Prozesse in Abwesenheit von gp49 nicht vollständig abgestellt sind, sondern mit reduizerter Effizienz weiterlaufen, muß der Phage Möglichkeiten haben, auf Backup-Mechanismen vom Wirt oder aus dem eigenen Gen-Repartoir zurückgreifen zu können.In addition to his role as a resolver of DNA branches during the Endo VII also has interchangeable auxiliary functions in early DNA packaging DNA metabolism. Mutations in gene 49 affect the homologous genetic Recombination, the repair of base mismatches and the recombination dependent DNA replication from (Mosig, 1994). Since these processes are not complete in the absence of gp49 are turned off, but continue to run with reduced efficiency, the phage must be able to to be able to use backup mechanisms from the host or from one's own gene repository.

Endo VII ist eine sehr potente Endonuklease, die bereits auf sehr niedrigem Expressionsniveau die intrazelluläre DNA mit hoher Wirksamkeit zerstört. Darum scheint es unabdingbar, daß die Aktivität des Enzyms in vivo einer ausbalancierten Kontrolle unterliegt. Gen 49 wird während des gesamten Infektionszyklus zunächst von einem frühen, dann von einem späten Promotor ausgehend transkribiert. Die Translation des frühen Transkripts ist jedoch dadurch herunter-reguliert, daß die Shine-Dalgarno Sequenz in der Faltung einer RNA-Sekundärstruktur schlecht für Ribosomen zugänglich ist. Die Transkripte der späten Promotoren bilden diese Sekundärstruktur in der mRNA nicht aus und Endo VII kann ungehindert translatiert werden (Barth et al., 1988).Endo VII is a very potent endonuclease that is already at a very low level Expression level destroys intracellular DNA with high effectiveness. That's why it seems indispensable that the activity of the enzyme is subject to a balanced control in vivo. gene During the entire infection cycle, 49 is initially from an early, then from a late Promoter transcribed outgoing. However, the translation of the early transcript is thereby down-regulated that the Shine-Dalgarno sequence in the folding of an RNA secondary structure is poorly accessible to ribosomes. The late promoter transcripts form these Secondary structure in the mRNA does not appear and Endo VII can be translated without hindrance (Barth et al., 1988).

Funktionen der Endonuklease VII in vitroFunctions of endonuclease VII in vitro

Endo VII wurde zunächst von Phagen-infizierten Zellen isoliert. Dazu wurde die aus 49⁻-infizierten Zellen isolierte hochverzweigte Vorläufer-DNA als Substrat für den Aktivitätstest eingesetzt. Ausbeuten und Reinheit des Proteins fielen jedoch unpraktisch niedrig aus. Heute wird das Protein in großen Mengen (mg-Mengen) bis zur Homogenität aus überexpremierenden E. coli isoliert. Die Aktivität von Endo VII wurde bis jetzt an einer großen Anzahl verschiedener DNA-Substrate überprüft. Die meisten dieser Substrate wurden in vitro synthetisch durch Hybridisierungen von Oligonukleotiden hergestellt. Eine Zusammenstellung aller bisher getesteten Substrate mit Literaturangaben ist im Anhang zu finden. Endo VII reagiert mit verzweigten Substraten wie vier- und drei-armigen Strukturen und Einzelstrang-überhängen. Weiterhin schneidet das Enzym an Basenfehlpaarungen von einzelnen Nukelotiden oder Heteroduplex-Schleifen, die durch Deletions- und Insertionsmutationen entstehen können. Endo VII schneidet an Einzestrangbrüchen, an Lücken, an chemisch veränderten Basen ("bulky adducts"), an Basenfehlstellen ("AP-sites") und an scharfen Knicken ("kinks"), immer 2-6 Basen entfernt, 3' von der Schadstelle in beiden Strängen. Die Spaltmuster und die Wirksamkeit der Spaltung hängt deutlich von den lokalen Sequenzgegebenheiten sowohl des Schadens wie auch der Nachbarschaft ab (Pottmeyer and Kemper, 1992).Endo VII was first isolated from phage-infected cells. For that the was 49⁻-infected cells isolated highly branched precursor DNA as a substrate for the activity test used. The yields and purity of the protein were, however, impractically low. Today will the protein in large amounts (mg amounts) to homogeneity from overexpressing E. coli isolated. Endo VII's activity has so far been varied on a large number Checked DNA substrates. Most of these substrates were synthesized in vitro Hybridizations of oligonucleotides produced. A compilation of all tested so far Substrates with references can be found in the appendix. Endo VII reacts with branched Substrates such as four- and three-arm structures and single-strand overhangs. Continues to cut  the enzyme at base mismatches of individual nucelotides or heteroduplex loops that can arise from deletion and insertion mutations. Endo VII is cutting Single strand breaks, at gaps, at chemically modified bases ("bulky adducts") Base defects ("AP sites") and at sharp kinks ("kinks"), always 2-6 bases away, 3 'from the damaged area in both strands. The cleavage pattern and the effectiveness of the cleavage depend clearly from the local sequence conditions of both the damage and the neighborhood ab (Pottmeyer and Kemper, 1992).

Eine zeitliche Verzögerung zwischen dem ersten Schnitt in einem Strang und dem folgenden Schnitt im zweiten Strang ist groß genug, um der DNA Polymerase gefolgt von der DNA Ligase die Reparatur des Schadens zu ermöglichen (Solaro et al., 1993). Die Enzyme führen ausgehend vom ersten Schnitt eine Excisions-Reparatursynthese durch, in deren Verlauf zunächst die Basenfehlpaarung exonukleolytisch entfernt wird und die entstandene Lücke dann durch Neusynthese wieder aufgefüllt wird. Die letzte offene Stelle wird durch die Funktion der DNA Ligase geschlossen. Die Reparatur kann in beiden Strängen erfolgen. Die Wahl der Stränge hängt von der Lage des ersten Schnittes ab. Eine häufig beobachtete Bevorzugung des einen Stranges über den anderen Strang hängt von den die Basenfehlpaarungen flankierenden Sequenzen ab.A time delay between the first cut in one strand and the following The second strand cut is large enough to follow the DNA polymerase followed by the DNA ligase To enable repair of the damage (Solaro et al., 1993). The enzymes start from first cut through an excision repair synthesis, in the course of which the Base mismatch is removed exonucleolytically and the resulting gap then Neosynthesis is replenished. The last vacancy is due to the function of the DNA Ligase closed. The repair can be done in both strands. The choice of strands depends on the location of the first cut. A frequently observed preference for one strand over the other strand depends on the sequences flanking the base mismatches.

Bei der Suche nach einem einheitlichen Motiv für die Erkennung der DNA-Schäden durch Endo VII, wurde ein durch die Schäden selbst ausgelöster scharfe Knick ("kink") in doppelsträngiger DNA als die wahrscheinlichste Möglichkeit ausfindig gemacht. Das Auftreten plötzlicher Änderungen in der DNA-Sekundärstruktur wurden z. B. für Basenfehlpaarungen, "bulky-addcucts" und Thymin-Dimere beschrieben. Auch die Arme von verzweigten DNAs können vom Verzweigungspunkt ausgehende Knick-artige Konformationen annehmen, indem sich die Enden entgegengesetzter Arme im Raum nähern und zwischen sich einen Winkel bilden (Bhattacharyya et al., 1991). Untersuchungen haben ergeben, daß Endo VII jeweils an ein Paar der den Verzweigungspunkt flankierenden Arme bindet. Sind nur zwei Enden eines an sich linearen Moleküls vorhanden, so bindet Endo VII an die beiden die Stelle des Knicks flankierenden Schenkel.When looking for a consistent motive for the detection of DNA damage by Endo VII, became a sharp kink in two strands caused by the damage itself Identified DNA as the most likely option. The appearance of sudden Changes in the secondary DNA structure were e.g. B. for base mismatches, "bulky addcucts" and thymine dimers. The arms of branched DNAs can also be from Branch point adopting outgoing kink-like conformations by the ends approach opposite arms in space and form an angle between them (Bhattacharyya et al., 1991). Research has shown that Endo VII each connect to a pair of the Branch point flanking arms binds. Are only two ends of a linear in itself Endo VII binds to the two legs flanking the point of the kink.

Optimale Reaktionsbedingungen für Endo VII wurden in 45 mM Phosphatpuffer (pH 6.5), 10mM MgCl₂ bei 37°C gefunden. Die Zugabe von 1mM 2-Merkaptoäthanol (2-ME) ist optional. Aus historischen Gründen wurden die meisten Experimente jedoch unter suboptimalen Bedingungen in 10mM Tris-HCl Puffer bei pH 8.0, 10mM MgCl₂ und 1mM 2-ME durchgeführt. Die Endo VII Reaktionen zeigen ein breites Temperaturprofil mit einem Maximum bei 37°C mit nach rechts und links zu höheren bzw. tieferen Temperaturen abfallenden Verläufen. Darum können Endo VII Reaktionen mit immer noch guter Ausbeute (50%) auf Eis durchgeführt werden, was für die Stabilität von heteroduplex DNA von Vorteil sein kann. Bei Temperaturen oberhalb von 45°C werden die meisten synthetischen Substrate jedoch so instabil, daß Messungen nicht mehr praktikabel sind.Optimal reaction conditions for Endo VII were found in 45 mM phosphate buffer (pH 6.5), 10mM MgCl ₂ at 37 ° C. The addition of 1mM 2-mercaptoethanol (2-ME) is optional. For historical reasons, most of the experiments were carried out under suboptimal conditions in 10mM Tris-HCl buffer at pH 8.0, 10mM MgCl ₂ and 1mM 2-ME. The Endo VII reactions show a broad temperature profile with a maximum at 37 ° C with courses falling to the right and left to higher or lower temperatures. Therefore Endo VII reactions can still be carried out on ice with a good yield (50%), which can be advantageous for the stability of heteroduplex DNA. At temperatures above 45 ° C, however, most synthetic substrates become so unstable that measurements are no longer practical.

Das Protein Endonuklease VIIThe protein endonuclease VII

Endo VII ist ein Zink bindendes Protein von 157 Aminosäuren (aa) Länge und einem Molekulargewicht von 18kDa. In Lösung bildet Endo VII Dimere und unter bestimmten Bedingungen auch Multimere. Das Zink bindende Motiv enthält vier Cystein-Reste (Cys). Mutationen in einem der beiden äußeren oder der inneren Cys-Reste führt zum Verlust der Zinkbindung und der Aktivität (Giraud-Panis et al., 1995). Ob sich tatsächlich im Protein ein Zinkfinger ausbildet, wie es die Sequenz suggeriert, ist im Moment noch unklar. Die Bindung von Endo VII an DNA erfordert auch die endständigen aa am Carboxyterminus. So haben Messungen mit Deletionen von endständigen aa gezeigt, daß die Aktivität zwischen der aa 155 (50% Wildtyp Aktivität), 154 (20% Wildtyp Aktivität) und 150 (keine meßbare Aktivität) fließend verloren geht. Der Verlust der nukleolytischen Aktivität dieser Mutanten wird jedoch von dem Verlust der Fähigkeit an DNA zu binden, begleitet. Daß die Befähigung zum Schnitt in diesen Mutanten prinzipiell erhalten bleibt und der beobachtete Aktivitätsverlust lediglich eine Folge der Unfähigkeit, an DNA zu binden, ist, konnte durch in vifro Komplementationsexperimente bewiesen werden. Hierzu wurden Heterodimere des Proteins zwischen einer eindeutig Schnitt-inaktiven Punktmutation (N62D) und der Binde-inaktiven Deletionsmutation EVII-del150 mit Schnitt-Aktivität hergestellt.Endo VII is a zinc binding protein of 157 amino acids (aa) in length and one Molecular weight of 18 kDa. In solution, Endo VII forms dimers and under certain Conditions also multimers. The zinc binding motif contains four cysteine residues (Cys). Mutations in one of the two outer or inner Cys residues leads to the loss of Zinc binding and activity (Giraud-Panis et al., 1995). Whether it is actually in the protein Zinkfinger, as the sequence suggests, is still unclear at the moment. The binding of Endo VII on DNA also requires the terminal aa at the carboxy terminus. So have measurements with deletions from terminal aa showed that the activity between the aa 155 (50% wild type Activity), 154 (20% wild-type activity) and 150 (no measurable activity) is lost fluently. However, the loss of the nucleolytic activity of these mutants is due to the loss of Ability to bind to DNA accompanied. That the ability to cut in these mutants is retained in principle and the observed loss of activity is merely a consequence of the inability to to bind to DNA has been demonstrated by in vifro complementation experiments. For this purpose, heterodimers of the protein were between a clearly cut-inactive point mutation (N62D) and the binding-inactive deletion mutation EVII-del150 with cutting activity.

Endo VII hat etwa 48% Sequenzähnlichkeiten zwischen aa 111 und 138 mit den Proteinen T4 Endonuklease V (Endo V), einem T4 kodierten DNA Reparaturenzym mit hoher Selektivität für Thymin-Dimere. Diese besondere Region wurde kürzlich in Endo VII durch die entsprechende Reglon von Endo V ausgetauscht, ohne daß die Spezifität für verzweigte DNAs verloren ging (Giraud-Panis et al., 1995).Endo VII has approximately 48% sequence similarities between aa 111 and 138 with the proteins T4 endonuclease V (Endo V), a T4 encoded DNA repair enzyme with high selectivity for Thymine dimers. This particular region was recently created in Endo VII by the corresponding Endo V Reglon exchanged without losing specificity for branched DNAs (Giraud-Panis et al., 1995).

Andere Cruciforme DNA auflösende EnzymeOther cruciform DNA-dissolving enzymes

Endo VII gehört zur Zeit zu den am besten untersuchten Endonukleasen seiner Art mit der Fähigkeit Basenfehlpaarungen zu schneiden. Andere Enzyme mit ahnlicher Funktion sind die Endonuklease I (Endo I) das Produkt des Gens 3 (gp3) des Phagen T7, ruvC und rus von E. coli und CCE1 von der Hefe S. cerevisiae. Eine Reihe weiterer, weniger gut untersuchter Aktivitäten wurden aus Bäckerhefe, menschlicher Placenta, Maus B-Zellen und Helazellen isoliert. Für keines dieser Enzyme sind heute jedoch detaillierte Studien zur Erkennung von Basenfehlpaarungen verfügbar.Endo VII is currently one of the best studied endonucleases of its kind with the Ability to cut base mismatches. Other enzymes with a similar function are those Endonuclease I (Endo I) the product of gene 3 (gp3) of phage T7, ruvC and rus from E. coli and CCE1 from the yeast S. cerevisiae. A number of other less well-studied activities were isolated from baker's yeast, human placenta, mouse B cells and hela cells. For none however, these enzymes are now detailed studies to detect base mismatches available.

Nachweis von Basenfehlpaarungen durch Endonuklease VIIDetection of base mismatches by endonuclease VII

Die Befähigung von Endo VII alle möglichen Basenfehlpaarungen in Heteroduplex-DNA zu erkennen und zu schneiden, hat das Enzym als ideal für den enzymatischen Nachweis von Mutationen (EMD) erscheinen lassen. Obwohl dieselbe Basenfehlpaarung in unterschiedlicher Umgebung mit unterschiedlicher Wirksamkeit erkannt wird (Abb. 1), ist ein Nichterkennen selten (unter 10%). Die Unterschiede in der Erkennbarkeit von Basenfehlpaarungen reflektieren minutiöse Unterschiede in der Sekundärstruktur der jeweiligen Heteroduplex-DNA wie sie sich in Analysen durch denaturierende Gelelektrophorese (DGGE) zu erkennen geben. Als Fausregel gilt, je geringer die Schmelztemperatur eines Heteroduplex ist, umso besser wird die Fehlpaarung durch Endo VII erkannt (Solaro et al., 1993).The ability of Endo VII to recognize and cut all possible base mismatches in heteroduplex DNA has made the enzyme ideal for the enzymatic detection of mutations (EMD). Although the same base mismatch is recognized with different effectiveness in different environments ( Fig. 1), non-recognition is rare (below 10%). The differences in the recognizability of base mismatches reflect minute differences in the secondary structure of the respective heteroduplex DNA, as can be seen in analyzes by denaturing gel electrophoresis (DGGE). As a rule of thumb, the lower the melting temperature of a heteroduplex, the better the mismatch is recognized by Endo VII (Solaro et al., 1993).

Häufig beobachtetes Schneiden im Hintergrund linearer DNA ohne Basenfehlpaarungen wird einer, jeder DNA eigenen, strukturellen Variabilität des Moleküls gesehen. Dieser für das Testverfahren unerwünschte Hintergrund (Falsch-Positive) wird teilweise unterdrückt sobald die DNA durch eine Fehlpaarung als Heteroduplex vorliegt.Frequently observed cutting in the background of linear DNA without base mismatches one, each DNA has its own structural variability of the molecule. This one for that Test procedure unwanted background (false positives) is partially suppressed as soon as the DNA is present as a heteroduplex due to a mismatch.

Weitere Untersuchungen und AnwendungenFurther investigations and applications

Die für die Entwicklung des Mutationsnachweisverfahrens notwendigen, ausführlichen Untersuchungen wurden bisher dadurch behindert, daß nicht genügend Enzym verfügbar war. Das liegt einerseits daran, daß das Enzym kommerziell noch nicht angeboten wurde und einem breiten Kreis von interessierten Labors nicht frei zugänglich war. Zum anderen lassen sich größere Mengen des Enzyms nur mit Schwierigkeiten erhalten, weil es durch verfrühtes Abtöten der expremierende Wirtszellen nur in begrenzten Mengen synthetisiert wird. Es gibt jedoch zwei Studien, die die potentielle Nützlichkeit von Endo VII deutlich belegen. The detailed, necessary for the development of the mutation detection procedure Studies have so far been hampered by the fact that insufficient enzyme was available. The is on the one hand because the enzyme has not yet been offered commercially and a broad one Circle of interested laboratories was not freely accessible. On the other hand, larger quantities can be of the enzyme is difficult to obtain because it kills the expressing premature Host cells are only synthesized in limited quantities. However, there are two studies that do the clearly demonstrate the potential usefulness of Endo VII.  

In einer Studie wurden 81 von 81 bekannten Maus β-Globin Promotormutanten durch Endo VII-Schnitte erkannt (Youil et al., 1995). Das Hauptergebnis war, daß die Schnitte in ihrer Intensität von stark bis schwach eingruppiert wurden. Außerdem waren Schnitte im Hintergrund des Homoduplex zu erkennen. Das heißt für den Moment, daß eine Wildtyp-Kontroll DNA bei der Mutationssuche mitgeführt werden muß.In one study, 81 of 81 known mouse β-globin promoter mutants were identified by Endo VII sections recognized (Youil et al., 1995). The main result was that the cuts in their intensity were classified from strong to weak. There were also cuts in the background of the Recognizing homoduplex. For the moment, this means that a wild-type control DNA in the Mutation search must be carried out.

Die Anwendung der Methode auf Mutationen im menchlichen Tumorsuppressorgen p53 führte zum Nachweis neuer Mutationen (Giuntal et al., 1997).The application of the method to mutations in the human tumor suppressor gene p53 led to Detection of new mutations (Giuntal et al., 1997).

Verbesserungen und ZukunftsaussichtenImprovements and future prospects

Die Bereitstellung eines Test-Kits im Laufe des Jahres 1997 durch die Firma Avitech Diagnostics (Malvern, USA) wird die Chancen für die Verbreitung und die Verwendung des Enzyms als Mutationssonde drastisch verbessern. Dieses auch deshalb, weil dann ein sehr einfaches Vier-Schritt-Ein-Reagenzgefäß Protokoll mitgeliefert wird. Verbesserungen einiger der oben erwähnten negativen Begleiterscheinungen von Endo VII werden voraussichtlich durch den Einsatz anderer, verwandter Enzyme und mögliches Engeneering der vorhandenen Enzyme sowie die Entwicklung alternativer Testverfahren bald behoben sein.Avitech provided a test kit in 1997 Diagnostics (Malvern, USA) will increase the chances of spreading and using the Enhance enzyme dramatically as a mutation probe. This is also because it is a very simple one Four-step one-tube protocol is included. Improvements to some of the above Negative side effects mentioned by Endo VII are expected to be caused by the use other, related enzymes and possible engineering of the existing enzymes as well as the Development of alternative test procedures will be fixed soon.

Referenzencredentials

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Neuheit der ErfindungNovelty of the invention Vorteile der Erfindung in technischer und wirtschaftlicher HinsichtAdvantages of the invention in technical and economic terms

Die Erfindung stellt eine wesentliche Vereinfachung bei gleichzeitiger Erweiterung der Möglichkeiten der patentierten Methode: "Detection of Mutations by Resolvase Cleavage", USSN 08/232,530 - Cotton et al. vom 16. September 1996, dar.The invention represents a significant simplification while expanding the Possibilities of the patented method: "Detection of mutations by resolvase cleavage", USSN 08 / 232,530 - Cotton et al. dated September 16, 1996.

Die derzeit sicherste Art, Mutationen nachzuweisen, ist die Sequenzierung von DNA-Proben. Die sehr zuverläßige Methode hat jedoch die Nachteile, daß sie teuer und zeitaufwendig ist und den Einsatz giftiger Chemikalien erfordert.The currently safest way to detect mutations is by sequencing DNA samples. However, the very reliable method has the disadvantages that it is expensive and is time consuming and requires the use of toxic chemicals.

Eine wesentlich einfachere Methode ist der Nachweis von Basenfehlpaarungen mit Hilfe des Enzyms Endonuklease VII (Endo VII). Der Nachweis erfolgt in Heteroduplex-DNA, die man zuvor mit Hilfe etablierter PCR-Techniken aus Wildty- und Mutanten-DNA gewinnt. Nach Behandlung der Heteroduplex-DNA mit Endo VII werden indikative Fragmente auf Sequenziermaschinen nachgewiesen und vermessen. Dadurch gelangt man zu einer raschen Ja/Nein-Antwort bei gleichzeitiger Abschätzung der Lage der Mutation in Relation zu den Enden des untersuchten Fragments. Im Vergleich zur Sequenzierung ist die Methode einfach, erfordert keine giftigen Chemikalien und kann in normalen Routinelabors durchgeführt werden. Nachteile liegen in dem immer noch relativ hohen Zeitaufwand und der Notwendigkeit, alle Proben ausnahmslos über Gele (Sequneziermaschinen) analysieren zu müssen. Im praktischen Fall, wenn nur wenige positiven Proben unter vielen negativen zu erwarten sind, bedeutet das einen entscheidenden Zeitverlust durch die vielen "Leerläufe".A much simpler method is the detection of base mismatches using the Enzyme endonuclease VII (Endo VII). The detection takes place in heteroduplex DNA, which one previously using wild-type and mutant DNA using established PCR techniques. After treatment the heteroduplex DNA with Endo VII are indicative fragments on sequencing machines proven and measured. This leads to a quick yes / no answer simultaneous estimation of the location of the mutation in relation to the ends of the examined Fragments. Compared to sequencing, the method is simple and does not require toxic ones Chemicals and can be done in normal routine laboratories. Disadvantages lie in that still relatively time consuming and the need to all samples without exception via gels (Sequneziermaschinen) to have to analyze. In practical cases, if only a few positive ones Samples are expected among many negative ones, which means a crucial loss of time the many "idle times".

Das bisherige Verfahren nutzt nur einen Teil der Eigenschaften von Endo VII zum Nachweis von Mutationen. Lediglich die nukleolytische Aktivität des Enzyms wird zur Indikation herangezogen, und man mißt die Spaltung von Heteroduplex-DNA im Bereich der Fehlpaarungen. Die Spaltungsreaktion wird ohne Einschränkung auf alle Proben (positiv wie negativ) angewendet.The previous method uses only part of the properties of Endo VII for detection of mutations. Only the nucleolytic activity of the enzyme becomes an indication and the cleavage of heteroduplex DNA in the mismatch area is measured. The cleavage reaction is applied to all samples (positive and negative) without restriction.

Die neue Methode nutzt die im Schneide-Test inhärent verborgene, weitere Eigenschaft von Endo VII, nämlich an Basenfehlpaarungen zu binden und differenziert in einem Bindetest in Ja/Nein-Entscheidung zwischen negativen und positiven Proben. (Jede Schneidereaktion setzt die Bindung des Enzyms and die potentielle Schnittstelle voraus). Der Nachweis der gebundenen DNA gelingt durch Phosphorimaging von auf Filter aufgetropften prozessierten Proben. Die Auswertung läuft über das dem Phosphorimager zugeordnete Computerprogramm. Der optional durchführbare Nachtest berücksichtigt dann nur noch die zuvor ausgewählten positiven Proben. Er kann einerseits zur Absicherung der im Vortest erhaltenen Daten und/oder zum Kartieren der Mutationen verwendet werden. Hierzu wird die Schneideaktivität von Endo VII in den vom Vortest abgezweigten Aliquots durch Zugabe von Mg²⁺ aktiviert und die Fraginente neben Größenmarkern auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt.The new method uses the additional property of Endo VII that is inherently hidden in the cutting test, namely binding to base mismatches and differentiates between negative and positive samples in a binding test in a yes / no decision. (Every cutting reaction requires the enzyme to bind to the potential interface). The detection of the bound DNA is achieved by phosphorimaging of processed samples dropped onto filters. The evaluation runs via the computer program assigned to the phosphor imager. The optional follow-up test then only takes into account the previously selected positive samples. On the one hand, it can be used to secure the data obtained in the pre-test and / or to map the mutations. For this purpose, the cutting activity of Endo VII in the aliquots branched off from the pre-test is activated by adding Mg ²⁺ and the fragments are separated on a polyacrylamide gel in addition to size markers.

Die Vorteile der neuen Methode liegen in:
The advantages of the new method are:

• a) Zeitgewinna) Save time
• b) Einfache Handhabungb) Easy handling
• c) Wählbarkeit von Optionen (Ja/Nein-Entscheidung oder Kartierung)c) Selectability of options (yes / no decision or Mapping)

bei gleichzeitiger unverminderter Zuverläßigkeit.with undiminished reliability at the same time.

Die weitere Entwicklung der Methode in Richtung von Fluorescenzmarkierung mit nachfolgender automatischer Auswertung im Fluorescenz-Lesegerät sind denkbar.The further development of the method in the direction of fluorescence labeling with subsequent automatic evaluation in the fluorescence reader are conceivable.

Anwendungsmöglichkeiten und Zielbranchen, potentielle LizenznehmerApplications and target industries, potential licensees

Der Nachweis von Mutationen ist weltweit Routinearbeit in genetischen Labors öffentlicher Einrichtungen akademisch und angewandt orientierter Bereiche. Privatwirtschaftliche Einrichtungen setzen derzeit verstärkt auf die gentechnologischen Möglichkeiten Naturprodukte durch Genisolation bzw. Mutantengewinnung zu nutzen und zu verändern. Die wachsende Erkenntnis, daß viele (Erb)kranidieiten durch Veränderungen (Mutationen) in bekannten Genen begleitet, oft auch ausgelöst werden, macht die medizinisch diagnostische Verwertbarkeit einfacher Mutationsnachweisverfahren sowohl wissenschaftlich wie kommerziell interessant. Hier liegt DER prospektive Markt der Zukunft für das bereits bestehende Verfahren, und in besonderem Maße wegen der Einfachheit für das neue Verfahren.The detection of mutations is more routine work in genetic laboratories worldwide Establish academic and applied areas. Private sector institutions are currently increasingly enforcing natural products on the genetic engineering possibilities Use and change gene isolation or mutant production. The growing realization that many (hereditary) diseases are accompanied, often also, by changes (mutations) in known genes triggered, makes the medical diagnostic usability easier Mutation detection methods are both scientifically and commercially interesting. Here is DER  prospective market of the future for the existing process, and in particular because of the simplicity for the new process.

Wir können uns vorstellen, daß Firmen mit medizinisch diagnostischen Produkten Interesse an der Neuentwicklung hätten und die Möglichkeit, das Mutationsnachweisverfahren durch Fluorescensmarkierung zu vereinfachen und z. B. zusammen mit entsprechender Hardware (Fluorescenz-Lesegeräte) anzubieten, eine interessante Bereicherung ihrer Produktpalette sehen. Firmen dieser Art gibt es in großer Zahl, z. B. Amershani/Pharmacia, Boehrihger, Perkin-Elmer, Applied Biosystem Incorporation (ABI) etc. Neben diesen "großen" Firmen sehen wir aber auch grundsätzlich eine gute Verwendbarkeit als Starterset für "kleine" Neugründungen im biotechnologischen Bereich, die in besonderem Maße jetzt auch in Deutschland gefördert werden und denen neue Geldquellen aus "Venture-Capital" und/oder Förderungsmaßnahmen des Bundesministeriums für Forschung und Technologie (BMFT) eröffnet werden. We can imagine that companies with medical diagnostic products are interested on the new development and the opportunity to go through the mutation detection procedure Simplify fluorescence labeling and z. B. together with appropriate hardware (Fluorescence readers), see an interesting addition to their product range. There are many companies of this type, e.g. B. Amershani / Pharmacia, Boehrihger, Perkin-Elmer, Applied Biosystem Incorporation (ABI) etc. Besides these "big" companies we also see basically a good usability as a starter set for "small" startups in the biotechnological sector, which are now also being promoted to a special degree in Germany and which new sources of money from "venture capital" and / or support measures of the Federal Ministry of Research and Technology (BMFT) will be opened.  

Angaben zur PatentsituationInformation about the patent situation

Wie im vorausgehenden Text bereits erwähnt, wurde die grundlegende Methode des Enzymatischen Nachweises von Mutationen durch Resolvasen in den USA unter dem Titel: "Detection Of Mutations By Reoslvase Cleavage" patentiert. Das Patent wurde durch die Firma Avitech Diagnostics in Malvern (Philadelphia, USA) im Zuge einer Abtretungsvereinbarung für Dr. R. Cotton (Melbourne, Australien) und Dr. B. Kemper (Köln, Deutschland) am 16. September 1996 angemeldet. Das Patent wurde kürzlich erteilt (Patent Number 5,698,400 vom 16. Dec. 1997).As already mentioned in the previous text, the basic method of the enzymatic Detection of mutations by resolvases in the USA under the title: "Detection Of Mutations By Reoslvase Cleavage ". The patent was granted by Avitech Diagnostics in Malvern (Philadelphia, USA) as part of an assignment agreement for Dr. R. Cotton (Melbourne, Australia) and Dr. B. Kemper (Cologne, Germany) on September 16, 1996 Registered. The patent was recently granted (Patent Number 5,698,400 dated Dec. 16, 1997).

Ein zweites Patent: "Overexpression of Recombinant Bacteriophage T4 Endonuclease VII and Uses Thereof" wurde später ebenfalls in Washington (USA) angemeldet und wurde kürzlich (Juni 1998) erteilt (U.S.S.N. 08/621,708).A second patent: "Overexpression of Recombinant Bacteriophage T4 Endonuclease VII and Uses Thereof "was later also filed in Washington (USA) and was recently (June 1998) (U.S.S.N. 08 / 621,708).

Ein drittes Patent: "Mismatch Detection Technique" wurde zeitlich nach dem hier beantragten Patent am 4. Februar 1998 in Washington (USA) beantragt (Provisional Application No. 60/073,716). Der Sachverhalt dieses für die USA angemeldeten Patents ist derselbe wie der des hier für Deutschland beantragten Patents.A third patent: "Mismatch Detection Technique" was filed after the one applied for here Patent applied for on February 4, 1998 in Washington (USA) (Provisional Application No. 60 / 073,716). The patent application for the United States is the same as the one here patent applied for in Germany.

Angaben über bereits kontaktierte UnternehmenInformation about companies already contacted

Zwischen Avitech-Diagnostics und einem der Erfinder (B. Kemper) bestehen Vereinbarungen, Neuentwicklungen zunächst der Firma vorzustellen, um ihre Patentwürdigkeit und ihre für die Firma voraussehbare Nützlichkeit abzuschätzen. Entsprechende Nachrichten bezüglich der hier beschriebenen Neuentwicklung gingen deshalb bereits an die Firma.Exist between Avitech Diagnostics and one of the inventors (B. Kemper) Agreements to present new developments to the company first to ensure their patentability and assess their usefulness foreseeable for the company. Corresponding news regarding The new development described here has therefore already gone to the company.

Angaben zur PersonPersonal Information

Name: Börries Kemper
Titel: Dr. rer. nat.
Beruf: Universitätsprofessor
Adresse: Institut für Genetik II, Zülpicher Straße 47, 50674 Köln
Tel.: 0221-470 5287
FAX: 0221-470 5172
e-mail: [email protected]
Erfahrungen auf dem Gebiet der Erfindung: Der Antragsteller arbeitet und lehrt seit 1972 ununterbrochen am Institut für Genetik in Köln auf dem Gebiet der molekularen Genetik von Prokaryonten und niederen Eukaryonten.
Spezialgebiet: Nachweis, Reinigung und Charakterisierung von DNA-Reparaturenzymen aus den benannten Organismen (siehe Jahrbuch des Instituts für Genetik).Name: Börries Kemper
Title: Dr. rer. nat.
Profession: University professor
Address: Institute for Genetics II, Zülpicher Straße 47, 50674 Cologne
Tel .: 0221-470 5287
FAX: 0221-470 5172
e-mail: [email protected]
Experience in the field of invention: The applicant has been working and teaching continuously since 1972 at the Institute of Genetics in Cologne in the field of molecular genetics of prokaryotes and lower eukaryotes.
Specialty: Detection, purification and characterization of DNA repair enzymes from the named organisms (see yearbook of the Institute of Genetics).

Claims (2)

1. Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Genomen von Organismen mit Hilfe von Endonuklease VII (Endo VII),
dadurch gekennzeichnet,
daß Endo VII alle bekannten Basenfehlpaarungen in einem Heteroduplex DNAs erkennt und in ihrer unmittelbaren Nachbarschaft Phosphodiesterbindungen spaltet.1. Method for the detection of mutations in genomes of organisms with the help of endonuclease VII (Endo VII),
characterized by
that Endo VII recognizes all known base mismatches in a heteroduplex DNA and cleaves phosphodiester bonds in their immediate vicinity. 2. Endo VII nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß in zwei Stufen a) die Bindungsaffinität von nicht-aktiviertem Endo VII an Heteroduplex DNAs mit Basenfehlpaarungen zur selektiven Anreicherung solcher DNAs an einer Trägermatrix genutzt wird und b) nach Aktivierung der Endonuklease in den positiven Proben ein optionaler Schnittest zur Kartierung der Mutationen herangezogen wird.2. Endo VII according to claim 1,
characterized,
that in two steps a) the binding affinity of non-activated Endo VII to heteroduplex DNAs with base mismatches is used for the selective enrichment of such DNAs on a carrier matrix and b) after activation of the endonuclease in the positive samples, an optional cut test is used to map the mutations.