DE19755101A1 - Pflanzen mit erhöhter Phytochromexpression - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Pflanze, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie Phytochrom überexprimiert. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Pflanze, die Phytochrom-B dadurch überexprimiert, daß ein Phytochrom-B-Gen in die Pflanze eingeführt oder darin aktiviert wird. Ferner betrifft die Erfindung Pflan­ zenteile, Samen und/oder Pflanzenzellen, die wie die Pflanze durch eine Phyto­ chromüberexpression gekennzeichnet sind. Die Erfindung betrifft außerdem die Ver­ wendung eines und/oder mehrerer Phytochromgene für die Herstellung von Pflan­ zen, die Phytochrom überexprimieren. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze, die Phytochrom überexprimiert, oder von Pflanzenteilen, Samen und/oder Zellen, die Phytochrom überexprimieren. Schließlich betrifft die Er­ findung einen Vektor, der ein Phytochromgen enthält, das für eine Aminosäurese­ quenz kodiert, deren N-Terminus hydrophob ist.

Die Entwicklung von Pflanzen wird vom Keim bis zur Blütenbildung vielfältig durch Licht gesteuert. So wird Keimung und Ergrünung durch Licht ausgelöst. Pflanzen können in ihren grünen Geweben die Energie des Sonnenlichts nutzen, um Kohlen­ dioxid (CO₂) in energiereiche organische Verbindungen umzuwandeln. Dieser Prozeß bei dem zunächst Zuckermoleküle entstehen, wird als Photosynthese bezeichnet. Ein großer Teil der photosynthetisch gespeicherten Energie wird von der Pflanze für das Wachstum und andere Stoffwechselvorgänge genutzt, ein gewisser Teil kann jedoch auch in Speicherorganen konserviert werden.

Da Pflanzen auf Licht als Energiequelle unbedingt angewiesen sind, wird ihre Entwicklung vom Umweltfaktor Licht so gesteuert, daß sie das Licht optimal nut­ zen können. Beispielsweise bilden Keimlinge erst die für die Photosynthese wichtigen Strukturen aus, wenn sie ans Licht kommen. Bis zu diesem Zeitpunkt wachsen sie auf Kosten ihrer Reservestoffe bevorzugt in die Länge, um das Licht möglichst schnell zu erreichen. Auch adulte Pflanzen nutzen unter Schattenbe­ dingungen einen Großteil ihrer Energie für das Streckungswachstum des Sten­ gels, um dem Schatten zu entkommen.

Die Wahrnehmung des Lichts erfolgt durch Chromoproteine, die als Photorezep­ toren dienen. Pflanzen besitzen drei verschiedene Photorezeptorsysteme, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen absorbieren. Eines davon ist das Photore­ zeptorsystem Phytochrom, das im Rotlichtbereich des Spektrums absorbiert.

Phytochrome sind Chromoproteine, die aus einem 124 kDa großen Proteinanteil und einem langgestreckten Tetrapyrrolsystem als Chromophor bestehen (Ken­ drick und Kronenberg, 1986). Phytochrome werden im Dunkeln in der sogenann­ ten Pr-Form synthetisiert, die physiologisch inaktiv ist. Durch Absorption von Licht der Wellenlänge 660 nm gehen sie in die physiologisch aktive Pfr-Form über, die eine Vielzahl von Funktionen in der Pflanze kontrolliert. Charakteri­ stisch für die Phytochrome ist, daß sie durch Bestrahlung mit Dunkelrotlicht wie­ der in die Pr-Form konvertiert werden können. Zu den Phytochrom-abhängigen physiologischen Prozessen zählen:

• - Bildung von Proteinen, die an der Photosyntheseleistung der Pflanzen be­ teiligt sind.
• - Verkürzung der Internodien als Anpassung der Pflanzen an Schattenbedin­ gungen. (Unter Schattenbedingungen wird der Rotlichtanteil des Sonnen­ lichts vom Blätterdach absorbiert, das weniger stark absorbierte Dunkelrot­ licht bewirkt eine Konversion von Pfr zur inaktiven Pr-Form, was in einer Internodienstreckung resultiert.)
• - Bildung von Anthocyanen
• - Induktion von Blüten- oder Knollenbildung
• - Verzögerung der Seneszenz

Die Klonierung und Sequenzierung des ersten Phytochromgens gelang erstmals 1985 (Hershey et al., 1985). Es handelte sich um das in im Dunkeln gewachse­ nen Keimlingen besonders abundant vorliegende Phytochrom A aus Hafer. Auf­ grund einer Fülle von physiologischen Untersuchungen wurde die Existenz weite­ rer Phytochrome vermutet, deren Isolierung wegen ihrer geringen Menge jedoch sehr schwierig war. Erst durch molekulare Techniken gelang der eindeutige Nachweis weiterer Phytochrome. Die molekulare Identifikation distinkter Phyto­ chromgene (PhyA, PhyB, PhyC) erfolgte 1989 durch Sequenzierung verschiede­ ner cDNAs aus Arabidopsis thaliana (Sharrock und Quail, 1989), die durch die Publikation der Gene PhyD und PhyE 1993 ergänzt wurde (Clack et al., 1993). PhyA, PhyB, PhyC und PhyE sind in ca. 50% ihrer Aminosäurepositionen iden­ tisch, PhyD ist mit 70% Aminosäureidentität näher zu PhyB als zu den anderen Phytochromen verwandt. Das Vorkommen distinkter Phytochromgene konnte da­ nach auch in anderen Pflanzen nachgewiesen werden. So gibt es in der Kartoffel ein Phytochromgen, das zu 76% identisch zu PhyA aus Arabidopsis ist, und demnach als Typ A klassifiziert wurde (Heyer, 1992). Auch ein zu PhyB aus Ara­ bidopsis homologes Gens konnte aus der Kartoffel isoliert werden (Heyer, 1992). Dennoch kann man vom Vorkommen der fünf verschiedenen Phytochrome in Arabidopsis nicht auf die Zusammensetzung der Phytochromfamilie in anderen Pflanzen schließen. In der der Kartoffel nah verwandten Tomate wurde ein Phytochromgen gefunden, dessen Sequenz sich nicht in die Klassen A bis E ein­ gruppieren läßt (Pratt et al., 1997). Daher wird es als PhyF bezeichnet.

1989 wurde erstmals eine cDNA für das ein Phytochrom (Phytochrom A aus Ha­ fer) in Tabak eingeführt. Dies führte zu einer erhöhten Synthese dieses Phyto­ chroms in den transgenen Pflanzen. Dabei zeigte sich, daß Pflanzen sehr sensi­ bel auf die Erhöhung von Phytochrom reagieren. Bei starker Expression des Phytochromgens (fünffach erhöht, gemessen in etiolierten Keimlingen) zeigten sich folgende phänotypischen Veränderungen

• - Reduzierte Apikaldominanz
• - Zwergwuchs (semi-dwarfism)
• - Erhöhter Chlorophyllgehalt pro Blattfläche
• - Kleinere, jedoch dickere Blätter
• - Deformierte Chloroplasten
• - Verschlechterte Diffusion von CO₂ durch die Mesophyllzellen
• - Erniedrigte Photosyntheserate
• - Erhöhte enzymatische Aktivität von Enzymen, die an der Photosynthese betei­ ligt sind (bezogen auf Blattfläche)
• - Weniger Wurzelmasse
• - Verzögerte Seneszenz.

Von den allgemein erstrebenswerten Zielen bei einer Züchtung von Pflanzen zeigten diese Pflanzen Zwergwuchs, erhöhten Chlorophyllgehalt pro Blattfläche, dickere Blätter, erhöhte Aktivität von Enzymen, die an der Photosynthese beteiligt sind (bezogen auf Blattmasse). Allerdings waren sie in einigen Punkten den her­ kömmlichen Pflanzen unterlegen: sie hatten deformierte Chloroplasten, was zu einer verschlechterten Diffusion von CO₂ durch die Mesophylzellen und zu einer erniedrigten Photosyntheserate führte. Die deformierten Chloroplasten und die verminderte Photosyntheseleistung waren so gravierende Mängel, daß die weite­ ren Effekte nicht mehr zum Tragen kommen. Die Pflanzen waren insgesamt in ihrer Leistungsfähigkeit nicht besser als die Ausgangspflanzen. Weiterhin war die Wurzelmasse weniger stark ausgeprägt als bei den herkömmlichen Pflanzen. In bezug auf die stärkere Ausbildung unterirdischer Organe (hier Wurzeln) und die Photosyntheseleistung waren sie den herkömmlichen Pflanzen unterlegen. Bei geringerer Expression (2-3fach erhöht, gemessen in etiolierten Keimlingen) je­ doch zeigten sie eine Eigenschaft, die besonders bei dichter Bepflanzung zu ei­ ner Verbesserung des sogenannten Harvest Index führt (Harvest Index: Verhält­ nis der Menge der des gewünschten Produkts (z. B. Samen, Frucht, Blatt, Knolle) zur gesamten Biomasse). Bei vielen Kulturpflanzen bewirkt die gegenseitige Be­ schattung der Pflanzen bei dichter Bepflanzung, daß die Pflanzen in die Länge wachsen, um gegenüber den um Licht konkurrierenden Nachbarpflanzen einen Vorteil zu haben. Im Feld wachsen somit alle Pflanzen in die Länge, was auf Ko­ sten des Wachstums anderer Organe geht. Die erhöhten Mengen Phytochrom A jedoch bewirken dagegen eine Verkürzung der Internodien. Dadurch ist das Blattwachstum im Verhältnis zum Stengelwachstum stärker ausgeprägt und es kommt zu einer Ertragssteigerung (Blatt/ha) um 15-20%. Diese Daten wurden mit Tabakpflanzen erzielt, bei denen die Blätter den wertvollen Rohstoff darstellen. Eine erhöhte Photosyntheserate, verzögerte Seneszenz und Vergrößerung des Wurzelballens wurde wurde bei diesen niedrig exprimierenden Pflanzen nicht dokumentiert.

1991 wurden erstmals Phytochrom B-Proteine in erhöhter Menge (18-30fach, gemessen in grünem Gewebe) in transgenen Pflanzen überexprimiert (Wagner et al., 1991). Es handelte sich um Phytochrom B aus Arabidopsis, das in Arabidop­ sis überexprimiert wurde. Es wurde ein verkürztes Wachstum des Hypocotyls be­ schrieben, später wurde der Einfluß auf Phototropismus und Blühinduktion be­ schrieben. Eine Wirkung auf die Ziele erhöhte Photosyntheserate, verzögerte Seneszenz, Vergrößerung des Wurzelballens, erhöhter Ertrag wurde nicht beob­ achtet. Phytochrom B aus Arabidopsis wurde ebenfalls in Tabak überexprimiert. Es wurde Zwergwachstum und ein Einfluß auf die Induktion des Blühens beob­ achtet. Ein Einfluß auf Photosynthese, Wurzelmasse, Ertrag oder Seneszenz wurde nicht dokumentiert (Halliday et al.).

Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzen bzw. Pflanzenteile, Samen und/oder Pflanzenzellen bereitzustellen, a) deren Photo­ syntheseleistungen erhöht ist und/oder b) deren Alterung verzögert ist, wodurch die Sonnenenergie länger nutzbar wird, was sich in einer Ertragssteigerung wi­ derspiegelt und/oder c) bei denen der Wurzelballen vergrößert ist, was zu einer besseren Nährstoffaufnahme führt und/oder d) deren Ertrag gesteigert ist.

Insbesondere ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzen, Pflanzen­ teile, Samen und/oder Pflanzenzellen anzugeben, bei denen diese vier Ziele kombiniert gelöst werden können.

Diese Aufgaben werden durch die in den unabhängigen Ansprüchen genannten Gegenstände gelöst. In den Unteransprüchen sind bevorzugte Ausführungsfor­ men der Erfindung angegeben.

Gemäß Anspruch 1 wird eine Pflanze bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie Phytochrom überexprimiert.

Im folgenden werden einige der in der Anmeldung verwendeten Begriffe näher erläutert, um klarzustellen, wie sie hier verstanden werden sollen.

Unter "Phytochrome" sind all diejenigen Chromoproteine zu verstehen, die aus einem ca. 124 kDa großen Proteinanteil und einem langgestreckten Tetrapyrrol­ system als Chromophor bestehen und die in der Pflanze als Photorezeptoren dienen.

Unter "Überexpression" wird jede Erhöhung des Phytochromniveaus in der Pflan­ ze verstanden, sei es, daß sie auf Einführung eines starken Promotors gegebe­ nenfalls zusammen mit dem Phytochromgen zurückgeht oder auf eine Genampli­ fikation oder andere in der Biotechnologie bekannte Möglichkeiten, die Protein­ syntheseleistung einer Zelle zu steigern. Überexpression liegt dann vor, wenn die veränderte (überexprimierende) Pflanze mindestens die doppelte Menge an Phytochrom, insbesondere PhyB, erzeugt wie die Ausgangspflanzen. Hierunter fällt auch die doppelte Menge in nur einem Pflanzenteil, z. B. dem Blatt. Vorzugs­ weise erzeugt die veränderte Pflanze das 5fache, unter Umständen das 10fache, an dem jeweiligen Phytochrom im Vergleich zur Ausgangspflanze bzw. einem Teil der Ausgangspflanze.

Unter "Phytochrom-Gen" wird jedes Gen verstanden, das für ein Phytochrom, wie oben definiert, kodiert.

Unter "hydrophob" wird eine Aminosäuresequenz verstanden, die mehr hydro­ phobe als polare Aminosäuren aufweist, z. B. 10 Alanine pro 20 Aminosäuren.

Unter "glycinreich" wird eine Aminosäuresequenz verstanden, die mehr als ein Glycin pro vier Aminosäuren aufweist und vorzugsweise mindestens 20 AS lang ist, beispielsweise 12 Gly innerhalb von 30 AS.

Die Erfindung beschreibt, daß die genannten Ziele erreicht werden können, wenn in einer Pflanze Phytochrom, insbesondere Phytochrom B, überexprimiert wird. Überraschenderweise wurden die besten Ergebnisse erzielt, wenn das Phyto­ chrom in eine Pflanze eingebracht wurde, die zu einer anderen Art gehört als die Pflanze, aus der das Gen stammte. In den Beispielen wird dies insbesondere gezeigt, wenn das Phytochrom B-Protein aus Arabidopsis thaliana in erhöhten Mengen in Kulturpflanzen synthetisiert wird. Explizit gezeigt wurde dies am Bei­ spiel der Kartoffel. Die Pflanzen zeichnen sich durch eine um 30% erhöhte Pho­ tosyntheserate aus, die zudem wesentlich insensitiver gegen Lichtstreß ist, als die Photosyntheserate herkömmlicher Pflanzen mit normalen Phytochromspie­ geln. Die Seneszenz ist verzögert. Das unterirdische Sproß-Wurzelsystem ist mindestens verdreifacht. Weiterhin zeigen die Pflanzen bei einer Verdoppelung der Anzahl an Knollen eine Ertragssteigerung von 15-20%.

Dagegen zeigte die erhöhte Expression des Phytochroms B aus Solanum tubero­ sum weniger deutlich die gesteigerte Entwicklung des Wurzelballens, die erhöhte Photosyntheserate und die verzögerte Seneszenz. Ein offensichtlicher Unter­ schied zwischen den Phytochromen B aus A. thaliana und S. tuberosum (Amino­ säureidentität: 76%) besteht in dem unterschiedlichen N-Terminus. Wie unten gezeigt, ist der Bereich zwischen den Aminosäuren VSGV und QAQSS sehr un­ terschiedlich. Das Phytochrom B aus A. thaliana kodiert hier für einen glycinrei­ chen Bereich der im Phytochrom B aus Solanum tuberosum fehlt.

Ein Sequenzvergleich der N-Termini der B-Phytochrome von A. thaliana und S. tuberosum ist oben gezeigt.

Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung können mit Typen des Phytochroms B und anderen Phytochromen insbesondere dann erreicht werden, wenn die Phyto­ chrome einen hydrophoben N-Terminus aufweisen. Insbesondere ist ein glycin­ reicher N-Terminus vorteilhaft. Als besonders vorteilhaft hat sich der oben be­ schriebene N-Terminus erwiesen. Mit umfaßt sind jedoch Sequenzen, die sich von dem N-Termius von A. thaliana ableiten und die gleichen Effekte beim Ein­ bringen in Pflanzen zeigen, wie der N-Terminus von PhyB aus A. thaliana.

Besonders vorteilhaft sind monokotyledone, dikotyledone Nutzpflanzen oder Zierpflanzen als Ausgangspflanzen für die vorliegende Erfindung. Dies gilt insbe­ sondere für Mais, Weizen, Hirse, Hafer, Reis, Gerste, Sorghum, Amaranth, Zwiebel, Spargel, Zuckerrohr, Alfalfa, Sojabohne, Petunien, Baumwolle, Zuckerrübe, Sonnen­ blume, Karotte, Sellerie, Kohl, Gurke, Pfeffer, Canola, Tomate, Kartoffel, Linse, Flachs, Brokkoli, Tabak, Bohne, Salat, Raps, Blumenkohl, Spinat, Rosenkohl, Arti­ schocken, Erbse, Okra, Kürbis, Grünkohl, collard green, Tee und Kaffee, Geranien, Nelken, Orchideen, Rosen, impatiens, Petunien, Begonien, Fuchsien, Dotterblumen, Chrysanthemen, Gladiolen, Astromeria, Salbei, Veronica, Gänseblümchen und Iris.

Eine besonders vorteilhafte Wirkung ergibt sich bei der Verwendung von einem Phytochrom-B-Gen, mit dem oben angegebenen N-Termius für die Erzeugung einer transgenen Kartoffel.

Das oben für die Pflanzen, die Phytochrom überexprimieren, Ausgeführte gilt ebenso für die Pflanzenteile, Samen und/oder Pflanzenzellen, die Phytochrom überexprimieren. Insbesondere können z. B. bereits durch eine gewebespezifi­ sche Überexpression von Phytochrom im Blatt die gewünschten Ergebnisse er­ zielt werden. Es ist möglich, daß man in bestimmten Teilen der Pflanze das Phytochrom nicht überexprimiert haben möchte. So ist z. B. die vermehrte Knol­ lenanzahl eher unerwünscht; vorteilhaft wäre gleiche Anzahl an Knollen bei er­ höhtem Ertrag. Dies kann man z. B. dadurch erreichen, daß man das Phytochrom nicht in der ganzen Pflanze, sondern nur in den Blättern exprimiert. Mit einem konstitutiven Promotor findet man bisher auch eine Überexpression in der Sproß­ spitze, und dieser Teil der Pflanze kontrolliert die Knollenanzahl.

Eine Phytochromgenaktivierung kann ebenfalls zu dem gewünschten Ergebnis führen. Dabei werden pflanzeneigene Phytochromgene durch das Einbringen eines starken Promotors und/oder Enhancers aktiviert.

Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines und/oder mehrerer Phyto­ chrom-Gene für die Herstellung der oben beschriebenen Pflanzen und/oder Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen, ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, ein Konstrukt, das ein wie oben beschriebenes Phytochrom-Gen ent­ hält, sowie eine Pflanze enthaltend ein Konstrukt, umfassend ein Phytochrom- Gen und einen glycinreichen N-Terminus.

Im folgenden soll die Erfindung anhand der Beispiele und Zeichnungen im Detail erläutert werden, wobei aber beachtet werden sollte, daß es sich lediglich um spezielle Ausführungsformen handelt, die nur beispielhaft sind und den Umfang der Erfindung nicht begrenzen sollen.

In den Abbildungen wird folgendes dargestellt:

Abb. 1A und 1B

Sproßhabitus einer untransformierten Kontrollpflanze von Kartoffel (A) im Vergleich zu einer repräsentativen transgenen Kartoffelpflanze der Linie DARA12 (B). Die Pflanzen stammen aus Sterilkultur und waren 8 Wo­ chen im Gewächshaus kultiviert worden.

Abb. 2

Western-Analysen mit Antikörpern gegen Phytochrom B aus Arabi­ dopsis thaliana mit Proteinpräparationen aus Blättern untransformierter Kontroll- Kartoffelpflanzen (wt) im Vergleich zu denen der transgenen Linien DARA5 und DARA12.

Abb. 3A und 3B

• (A) Photosyntheserate (µmol CO₂/m²s, bei 1,2-1,8 mmol Photonen/m²s) von Blättern untransformierter Kontrollpflanzen von Kartoffel (WT) im Vergleich zu der von Blättern transgener Pflanzen der Linie DARA12.
• (B) Abnahme der Photosyntheserate der Blätter aus A nach 5,5-stündiger Expo­ sition unter 1,2-1,8 mmol Ph./m²s und 32-38°C. Die Daten stammen von je n = 6 Messungen 12 Wochen alter Gewächshauspflanzen.

Abb. 4

Unterirdisches Sproß-/Wurzelsystem von repräsentativen Kartof­ felpflanzen der untransformierten Kontrollinie (WT) und denen der transgenen Linien DARA5 und DARA12. Die Pflanzen wurden aus Sterilkultur ausgesetzt und von Oktober 1996 bis April 1997 im Gewächshaus kultiviert. Zum Zeitpunkt der Ernte waren sie 6 Monate alt.

Abb. 5A und 5B

Unterirdisches Sproß-/Wurzelsystem und Knollenausbeute von repräsentativen Kartoffelpflanzen der untransformierten Kontrollinie (WT) im Vergleich zu denen transgener Pflanzen der Linien DPOT1, DPOT9 (A) und DS13 und DS23 (B). Die Pflanzen wurden aus Sterilkultur ausgesetzt und von Oktober 1996 bis April 1997 im Gewächshaus kultiviert. Zum Zeitpunkt der Ernte waren sie 6 Monate alt.

Abb. 6

Western-Analysen mit Erstantikörpern gegen Phytochrom-B aus Arabidopsis thaliana mit Phytochrom-Präparationen aus Blättern untransformier­ ter Kontroll-Kartoffelpflanzen (Wt) im Vergleich zu denen der transgenen Linien DPOT1, DPOT9, DS13 und DS23.

METHODEN 1. Transformation von Kartoffeln (Rocha-Sosa et al. 1985)

30 µl einer in Selektionsmedium (YEB + Kanamycin (50 mg/l) und Rifampicin (50 mg/l)) angezogenen Übernachtkultur des T-DNA-Plasmid tragenden A. tume­ faciens Stammes GV2260 wurden mit 10 ml flüssigem MS-Medium gemischt (MS-Medium: Murashige and Skoog, 1962). Blättchen aus der sterilen Gewebekultur wurden an der Mittelrippe eingeschnitten und in das inokulierte MS-Medium überführt und zwei Tage dunkel bei 22°C inkubiert. Anschließend wurden die Blattscheiben zur Callusinduktion auf MS-Medium mit Glukose (16 g/l), Naphthyl­ essigsäure (5 mg/l), 16-Benzylaminopurin (0.1 mg/l), Cephotaxim (250 mg/l), Bi­ tec-Agar (6.3 g/l) und 1 mg/l Hygromycin oder 50 mg/l Kanamycin zur Selektrion sieben Tage unter Gewebekulturbedingungen inkubiert. Nachfolgend wurden die Blattscheiben zur Regeneration der Sprosse auf MS-Medium mit Glukose (16 g/l), Zeatinribose (1.4 mg/l), Naphthylessigsäure (20 µg/l), Gibberellinsäure (GA₃; 20 µg/l), Cephotaxim (250 mg/l), Bitec-Agar (6.3 g/l) und 3 mg/l Hygromycin oder 50 mg/l Kanamycin unter Gewebekulturbedingungen inkubiert. Die Blattscheiben wurden nach sieben Tagen auf neues Regenerationsmedium überführt. Die ent­ stehenden Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, selektiven An­ tibiotika (50 mg/l Kanamycin oder 3 mg/l Hygromycin B) und 250 mg/l Cephota­ xim in Gewebekultur kultiviert.
YEB-Medium:
2 g/l Hefeextrakt
5 g/l Beefextrakt
5 g/l Pepton
5 g/l Saccarose
2 mM MgSO₄
pH 7.0.

2. Kultur der Pflanzen

Die Pflanzen wurden im Versuchsgewächshaus des Botanischen Gartens der Universität Göttingen kultiviert. Ihre Anzucht erfolgte aus Knollen oder Sterilkultur (Medium nach Murashige & Skoog, 1962). Während der Kultur lag die Tempera­ tur im Gewächshaus im Winterhalbjahr (Oktober - April) bei 15-25°C, im Som­ merhalbjahr (Mai - September) bei 20-35°C. Zwischen Tag und Nacht schwank­ te sie um 5-15°C. Die relative Luftfeuchte betrug ganzjährig ca. 55%. Die Lichtintensität lag, je nach Alter und damit Höhe der Pflanzenkörper, tagsüber zwischen 200 und 450 µmol Photonen (m²s)^-1, an klaren Tagen bei max. 500 µmol Ph.(m²s)^-1. Die Tageslängen entsprachen der natürlichen jahreszeitlichen Periodik. Während der 4 bis 6 Monate dauernden Kultur wurden die Pflanzen in Intervallen von 2-6 Wochen in größere Töpfe umgesetzt (bis max. 20 cm Topf­ durchmesser nach 4 Monaten). Um Pflanzen vergleichbarer Stärke zu erhalten, wurden 3 Wochen nach Auflaufen der Knollen bzw. dem Aussetzen aus Sterilkul­ tur alle bis auf die beiden stärksten oberirdischen Sprosse zurückgeschnitten. Durch ihr Hochbinden und einen Topfabstand, der mindestens dem jeweiligen Topfdurchmesser entsprach, war eine weitgehend gleichmäßige Lichtexposition gewährleistet.

3. Präparation von Phytochromen aus Pflanzen (van Tuinen et al., 1995)

0.3 g frisches Blattmaterial wurde mit 0.03 g Polyvinylpyrrolidon unter flüssigem Stickstoff in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß im Homogenisator pulverisiert und in 300 µl Phytochrom-Extraktionspuffer aufgenommen. Nach 15 min Zentrifugati­ on bei 15 000 xg und 4°C wurden 300 µl des Überstandes abgenommen, mit 30 µl Polyethylenimine (10% w/v in H₂O) versetzt und 15 min bei 4°C im Eppen­ dorf-Schüttler bei maximaler Drehzahl inkubiert, um Nukleinsäuren und Chloro­ phyll auszufällen. Nach 10 min Zentrifugation bei 12 000 xg und 4°C wurde der Überstand mit 0.725 Vol. einer in Wasser gesättigten Ammoniumsulfatlösung versetzt und 15 min bei 4°C bei voller Leistung im Eppendorf-Schüttler inkubiert. Nach 15 min Zentrifugation bei 12 000 xg und 4°C wurde das Sediment in 30 µl "Laemmli"-Puffer aufgenommen und 2 min bei 100°C inkubiert. Zur Western- Blot-Analyse wurden 20 µl der Probe auf ein 7%-iges PAA-Gel geladen (Laemmli, 1970).

Phytochrom-Extraktionspuffer

Ethylenglycol	50%
EDTA	10 mM
Tris-HCl, pH 8.3	100 mM
frisch zusetzen:@	Na-Bisulfit	20 mM
(NH4)2SO4	140 mM
β-Mercaptoethanol	56 mM
Pefablock	4 mM
Jodacetamid (IAA)	4 mM
Pepstatin A	1 µg/ml
Aprotinin	2 µg/ml
Leupeptin	2 µg/ml

4. Immunulogischer Nachweis von Phytochrom B über Western-Analyse

Für den immunologischen Nachweis wurden die im PAA-Gel aufgetrennten Pro­ teine auf Nitrocellulose oder PVDF-Membranen übertragen. Dazu wurde das PAA-Trenngel 15 min in Elektroblot-Transferpuffer äquilibriert. Auf die Anoden­ platte der BioRad-Elektroblot-Apparatur wurden drei Lagen in Transferpuffer ge­ tränktes Whatman-Papier, die Membran, das Gel und drei weitere Lagen in Transferpuffer getränktes Whatman-Papier luftblasenfrei aufgelegt. Die Katho­ denplatte wurde unter leichtem Druck aufgelegt und der Elektroblot bei 15 V für 45-120 min durchgeführt. Nitrocellulose-Membranen wurden 10 min in Transfer­ puffer äquilibriert, PVDF-Membranen wurden zuerst in Methanol getränkt und anschließend 10 min in Transferpuffer äquilibriert. Der Transfer wurde mit Pon­ ceau-Rot - einem Farbstoff, der mit Wasser entfernt werden kann - überprüft.

Elektroblot-Transferpuffer:
PAGE-Laufpuffer mit
halbierter SDS-Konzentration
mit 20% Methanol
Ponceau-Färbelösung:@	Ponceau-Rot	10 Tropfen
Essigsäure	10 Tropfen
H2O	100 ml

Immunologische Detektion

Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln durchgeführt. Zum Absättigen unspezifischer Bindungsstellen wurden die Filter wie folgt blockiert:

TBSI	3 min
TBSII	10 min
TBSIII	5 min

Anschließend wurde der erste Antikörper in TBSIII mit 1% Magermilchpulver (w/v) 1 : 400 (polyklonaler Antikörper auf Kaninchen) oder 1 : 5000 (monoklonale Maus-Antikörper) verdünnt und 2 h inkubiert. Nach 3 × 10 min Waschen mit TBSIII wurde der Filter 90 min mit dem zweiten, biotinylierten Antikörper (1/1000 Amersham-Anti-Mouse bzw. -Anti-Rabbit) in TBSIII + 1% (w/v) Magermilch inku­ biert. Nach 3 × 10 min Waschen mit TBSIII wurde der Filter in TBSIII (ohne Tween) äquilibiriert. Der Filter wurde dann 30 min mit Streptavidin-gekoppelter Meer­ rettich-Peroxidase (1/500, Amersham) in TBSIII (ohne Tween) inkubiert. Nach 4 × 5 min Waschen in TBS können die von dem ersten Antikörper erkannten Pro­ teine auf dem Filter angefärbt oder auf Röntgenfilm über Chemolumineszenz entwickelt werden.

TBSI-Puffer:@	Tris-HCl, pH 8.3	20 mM
NaCl	500 mM
Tween20	0.05% (w/v)
TBSII-Puffer:@	Tris-HCl, pH 8.3	20 mM
NaCl	150 mM
Tween 20	0.05% (w/v)
TBSIII-Puffer:@	Tris-HCl, pH 8.3	20 mM
NaCl	150 mM
Tween 20	0.05% (w/v)

Anfärben

Der Filter wurde in folgender Farbreaktionslösung entwickelt:

Diaminobenzidin	10 mg
TBS	20 ml
CoCl2	0.01% (w/v)
20 min lösen@	frisch zugeben:@	H2O2 (30%)	30 µl

Die Farbreaktion wurde mit Wasser gestoppt.

Chemolumineszenz

Zum Chemolumineszenz-Nachweis wurde der Filter (PVDF-Membran) 1 min in Reaktionslösung (Amersham Peroxidase-Chemolumineszenzlösungen 1 und 2 im Verhältnis 1 : 1) inkubiert und 2 bis 10 min in einer Expositionskassette auf Rönt­ genfilm exponiert. Anschließend wurde der Röntgenfilm entwickelt

5. CO₂-Assimilation über Infrarotspektroskopie

Die Aktivität der photosynthetischen Dunkelreaktion wurde mittels Infrarotspek­ troskopie über die Rate der CO₂-Fixierung ermittelt. Hierzu diente ein tragbares Gaswechselporometer der Firma ADC (Hoddesdon, Großbritannien), bestehend aus der zentralen LCA-3-Analyseeinheit und einer PLC-3-Blattkammer (Durch­ messer 6,2 cm²) mit Thermofühler und Lichtsensor zur zeitgleichen Detektion von Küvetteninnentemperatur und Photonenfluxdichte. Ein integrierter PC diente der Datenspeicherung und Datenverarbeitung. Dieses System ermöglichte die Ermitt­ lung der unter verschiedenen Kulturbedingungen (siehe 1.1. und 1.2.) erzielten Assimilationsraten (in µmol (m²s)^-1).

5.1 CO₂-Assimilation ausgewählter Blattareale ungestreßter Kontrollpflanzen

Um Vergleichbarkeit der erhaltenen Daten zu gewährleisten, wurden nur Blätter annähernd gleichen Alters und ähnlicher Lichtexposition verwendet. So wurden alle Untersuchungen mit Endfiedern der 3. bis 5. ausgewachsenen Blätter (aus­ gehend vom Scheitel) durchgeführt. Die Blattfieder wurden, ohne sie von der Pflanze zu trennen und unter Beibehaltung ihrer Orientierung zum Licht, in die PLC-3-Kammer gespannt und unmittelbar vor jeder Messung zwecks Äquilibrie­ rung von Gas und Temperatur im Meßsystem für 10 min adaptiert. Im Verlauf der folgenden 10 min wurden alle 2 min die aktuelle Rate der CO₂-Fixierung, die Temperatur und Lichtintensität aufgenommen.

5.2. Lichtstreßanalyse

Zur Analyse ihrer Empfindlichkeit gegenüber Lichtstreß wurden die Pflanzen nach Ermittlung der Kontroll-Assimilationsraten (2.1) für 5,5 Stunden Photonen­ fluxdichten zwischen 1,2 und 1,8 mmol (m²s)^-1 ausgesetzt (Halogenlampe der Fa. Osram, Power Star HQI-T/N, 2000 W). Während dieser Zeit stieg die Temperatur in der Küvette bis auf 32-38°C. Im Verlauf der nachfolgenden 10 min wurden erneut alle 2 min die aktuelle Rate der CO₂-Fixierung, die Temperatur und Licht­ intensität registriert.

5.3. CO₂-Assimilation ganzer Pflanzen

Zur Abschätzung der Gesamt-Assimilationsleistung einzelner Pflanzen und damit ihres Potentials zur Stärkesynthese und letztlich Knollenproduktion wurde wie folgt vorgegangen. Über die Gesamtmasse der Blätter repräsentativer Einzel­ pflanzen (je n = 3) einer Linie und über ihre mittlere Masse pro Blattfläche (Messungen mit je n = 18 Blattscheiben) wurde für jede Linie die durchschnittliche Gesamtblattoberfläche pro Pflanze ermittelt. Mit Hilfe der gemäß 3.1. bestimmten CO₂-Assimilationsrate pro Fläche konnte damit auf die ungefähre Assimilationsra­ te (µmol s^-1) einer ganzen Pflanze geschlossen werden. Diese Bestimmungen wurden mit 3 Monate alten, nicht seneszenten Pflanzen durchgeführt.

6. Pigmentanalysen 6.1. Photometrische Bestimmung der Chlorophyllgehalte

Blattscheiben (1,33 cm²) wurden in flüssigem Stickstoff pulverisiert und die Chlo­ rophylle mit 80%igem Ethanol quantitativ extrahiert. Die Extrakte wurden bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert und die Extinktionen der Überstände mit Hilfe eines Uvikon 932-Spektralphotometers (Fa. Kontron, Neuzahrn) bei 645, 652 und 663 nm photometrisch ermittelt. Die Chlorophyllgehalte ergaben sich nach folgenden Formeln.

Gesamtchlorophyll (µg) = E₆₅₂ × Verdünnungsfaktor × (34,5)^-1
Chlorophyll a (mg/ml) = [E₆₆₃ × 45,6 - E₆₄₅ × 9,25 × (3858 × ml Aliquot)^-1] × 1,16 × ml Vol
Chlorophyll b (mg/ml) = [E₆₄₅ × 82,04 - E₆₆₃ × 16,75 × (3858 × ml Aliquot)^-1] × 1,07 × ml Vol.

6.2. HPLC-Analyse zur Quantifizierung der photosynthetischen Pigmente

Bis zur Aufarbeitung wurden die Blattscheiben (1,33 cm²) im Dunkeln in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Extraktion der Pigmente erfolgte gemäß Thiele et al. (1996). Zur Trennung und Detektion der Carotinoide und Chlorophylle wurde ein HPLC-Gerät der Firma Hitachi (Lichrograph; Merck, Darmstadt) benutzt, beste­ hend aus der Gradientenpumpe L-7100, dem Injektionsventil 7125 (Cotati, CA, USA), dem UV-Detektor L-7400, dem Lösungsmittelentgaser Gastorr 104 (Scham­ beck, Bad Honnef), dem Integrator L-7500 und einer Reversed Phase LiChroCART-Säule mit LiChroCART-Vorsäule (250-4 bzw. 4-4; beide Merck). Die Säulen­ füllung bildete LiChrospher 100RP-18 (5 µm; Merck). Als Lösungsmittel dienten (A) Acetonitril: Methanol: Tris/HCl (0,1 M, pH 8), 7 : 10 : 3, (B) Methanol: Hexan, 4 : 1. Zunächst wurde für 9 min mit Lösungsmittel A eluiert, danach über einen in 3,5 min aufgebauten linearen Gradienten (0-100%) mit B. Auf 5,5 min isokratische Elution mit B folgte ein linearer Gradient bis zurück auf 100% A, woraufhin die Säule bis zum nachfolgenden Trenngang für weitere 4 min in A reäquilibriert wur­ de. Die Flußrate betrug 2 ml (min)^-1. Diese Methode ermöglichte die saubere Tren­ nung von Neoxanthin, Violaxanthin, Antheraxanthin, Lutein, Zeaxanthin, α- und β-Carotin, sowie der Chlorophylle a und b. Die Quantifizierung dieser Pigmente erfolgte nach Färber et al. (1997).

6.3. Photometrische Bestimmung der UV-absorbierenden Substanzen (z. B. An­ thocyane)

Als grobes Maß für die Anthocyangehalte diente die relative Extinktion (% des Wildtyps) ethanolischer Gewebeextrakte bei 284 nm (siehe Garden, 1997), ge­ messen mit Hilfe eines Uvikon 932-Spektralphotometers (Fa. Kontron, Neu­ zahrn). Bei dieser Wellenlänge wiesen sowohl die Extrakte aus Blättern als auch die aus Stengelepidermen deutliche Absorptionsmaxima auf. Die Extraktion er­ folgte wie unter 4.1. beschrieben.

7. Nachweis von Trockensubstanz und Stärke

Die relativen Trockengewichte und Stärkegehalte der Knollen wurden wie folgt indirekt über die spezifischen Gewichte der Knollen in Luft (W_L) und in Wasser (W_W) ermittelt (Von Schéele et al., 1937).
Dichte δ = W_L (W_L - W_W)^-1
% Trockensubstanz = (δ - 1,0988) × (211,04 + 24,182)
% Stärke = (δ - 1,0988) × (199,07 + 17,546).

8. Herstellung und Färbung von Blattmikrotomschnitten für die Lichtmikroskopie

Wie für die Untersuchungen zur CO₂-Assimilation (siehe 3.1) wurden, der direk­ ten anatomischen Vergleichbarkeit wegen, nur Blätter ähnlichen Alters und ähnli­ cher Lichtexposition verwendet. Die Blätter stammten von 10 Wochen alten Pflanzen und zeigten äußerlich keine Anzeichen von Seneszenz. Pro Linie wur­ den der Spreite von je 4 Blattfiedern verschiedener Pflanzen zentrale Segmente (1 cm Abstand vom Hauptleitstrang) entnommen. Die Herstellung und Färbung der Schnitte folgte der Paraffinmethode (verändert nach Gerlach 1969, persönli­ che Mitteilung, G. Weis, Universität Göttingen), mit Histosec (Merck) als Einbett­ medium und unter Verwendung eines Schlittenmikrotoms (Fa. Leitz, Wetzlar). Safraninrot (Chroma) färbte primär Chloroplasten und Zellkerne, Astrablau (Merck) vornehmlich unverholzte Zellwände und Schleime.

BEISPIELE 1. Herstellung transgener Pflanzen

Die Kodierregion des Phytochrom B aus Arabidopsis thaliana (A. t. phyB) wurde durch die Polymerase Kettenreaktion amplifiziert, wobei der cDNA Klon in IEMBL3 (Somers et al., 1991) als Matrize diente. Die Primer enthielten KpnI Schnittstel­ len. Somit kann A.t. phyB als KpnI Fragment in geeignete Expressionsvektoren kloniert werden. In dem hier verwendeten Beispiel wurde es unter die Kontrolle des CaMV 35S Promotors (Benfey et al., 1990) gebracht, der zur Expression des Gens in allen Teilen der Pflanze führt. Zur Beendigung der Transkription diente die Polyadenylierungsregion des Nopalin Synthase Gens aus Agrobacterium tu­ mefaciens. Gene, bei denen der Promotor, die Kodierregion und das Polyadeny­ lierungssignal von verschiedenen Genen stammen, werden als chimäre Gene bezeichnet. Im folgenden wird daher das Konstrukt als chimäres A.t. phyB Gen bezeichnet. Die Techniken zur Herstellung solch rekombinanter DNA sind in Sambrook et al. (1989) beschrieben. Das chimäre A.t. phyB Gen wurde über Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfer in Kartoffelpflanzen trans­ formiert (Rocha-Sosa et al., 1985). Transgene Pflanzen, die Phytochrom B aus Arabidopsis thaliana exprimieren, sind an dem Zwergwuchs, der reduzierten Api­ kaldominanz, und den dunkelgrüneren Blättern leicht zu erkennen (Abb. 1, Zeichnung). Zwei unabhängige Transformanden, im folgenden mit DARA5 und DARA12 abgekürzt, wurden wie folgt charakterisiert.

Tabelle 1

Sproßanatomie der transgenen Kartoffellinien DARA5 und DARA12 im Vergleich zur untransformierten Kontrollinie (Wildtyp). Die Sproßhöhe gibt den Abstand zwischen Boden und Apikalmeristem an, die Stengeldurchmesser wurden nach Ernte der oberirdischen Sprosse an der Stengelbasis (1 cm über der Erde) ermit­ telt. Die Daten stammen von 3,5 Monaten alten aus Knollen gezogenen Ge­ wächshauspflanzen (Juli - Oktober). n = Zahl der Einzelmessungen.

TABELLE 1

2. Bestimmung des Gehaltes an Phytochrom B

Regulatorische Proteine werden in Pflanzen im Gegensatz zu Strukturproteinen nur in geringer Menge exprimiert. Der Nachweis von Phytochromen wird oft im­ munologisch unter Verwendung von Antikörpern geführt. Monoklonale Antikörper gegen Phytochrom B aus A. thaliana stehen zur Verfügung (Somers et al., 1991). Diese Antikörper erkennen auch das Phytochrom B aus S. tuberosum. Die ge­ naue Durchführung dieses Nachweises ist im Methodenteil beschrieben. Abb. 2 zeigt das Ergebnis der Western Blot Analyse. Im Vergleich zur untrans­ formierten Kontrolle (Wt) zeigen die Linien DARA5 und DARA12 ein deutlich stärkeres Signal. Die vergleichende Quantifizierung unter Verwendung von Ver­ dünnungsreihen ergab, daß DARA5 ca. fünffach mehr Phytochrom B syntheti­ siert, DARA12 etwa 12fach mehr, im Vergleich zur untransformierten Kontrolle (wt).

3. Erhöhung der Photosyntheserate

Anzuchtsbedingungen sowie die Technik der Messung der Phyotosyntheserate sind im Methodenteil beschrieben. Abb. 3A und 3B zeigen das Ergebnis der Messungen exemplarisch bei der Pflanze DARA12. Die Photosyntheseleistung von Gewächshauspflanzen (Transgene und Kontrollpflanzen), die 10 Wochen im Gewächshaus angezogen waren, wurde über die Messung der CO₂-Assi­ milationsrate bestimmt. Zunächst wurden die Pflanzen für ein paar Stunden bei einer Lichtstärke von 0.3 mmol Photonen/m²s belassen. Danach wurde Pho­ tosyntheseleistung unter 1.5 bis 1.8 mmol Photonen/m²s durch Messung der CO₂-Aufnahme analysiert. Bei dieser Messung zeigte die untransformierte Kon­ trollpflanze eine durchschnittliche CO₂-Assimilationsrate von 17,5 mmol/m²s, während die transgene Pflanze (DARA12) mit 22,5 mmol/m²s um 28,5% erhöht war. Rechnet man diese Werte auf die CO₂-Assmililationskapazität ganzer Pflan­ zen um, ergibt sich pro Pflanze eine um ca. 20% erhöhte Leistungsfähigkeit.

Das in Abb. 3B gezeigte Diagramm zeigt, daß die Leistungsfähigkeit der Photosynthese bei andauernd starker Lichtintensität, wie es im Sommer bei wol­ kenlosem Himmel vorkommt, bei den transgenen Pflanzen gegenüber den her­ kömmlichen Pflanzen um mehr als 30% erhöht ist. Die eben beschriebenen Pflanzen wurden für weitere 5 Stunden bei 1.2-1.8 mmol Photonen/m²s gehal­ ten, dann wurde die Photosyntheserate wieder gemessen. Diese war in den un­ transformierten Kontrollpflanzen von 17.5 µmol CO₂/m²s auf 3 µmol CO₂/m²s re­ duziert, während bei den transgenen Pflanzen die Rate von 22.5 µmol CO₂/m²s auf 15 µmol CO₂/m²s abfiel. Integriert man die Flächen unter beiden Kurven, so ergibt sich eine Verdoppelung der Photosyntheserate der DARA12 Pflanzen im Vergleich zu den nicht transformierten Kontrollpflanzen.

Die erhöhte Photosyntheseleistung ist mit folgenden phänotypischen Verände­ rungen korreliert, durch die sich die transgenen DARA-Pflanzen auszeichnen.

Anatomische Veränderungen

Die anatomischen Veränderungen der Blätter sind in Tabelle 2 zusammenge­ faßt. Die Blätter der transgenen Pflanzen sind kleiner und um ca. 15% dicker. Die erhöhte Blattdicke beruht auf einer Verlängerung der Zellen des Palisa­ denparenchyms um 50%. Weiterhin zeichnen sie sich durch ein um 60% er­ höhtes spezifisches Blattgewicht (g/cm²) aus. Bei annähernd gleicher Ge­ samtblattfläche aller Linien ist damit auch das Gesamtblattgewicht pro Pflanze um 50% erhöht. Bei Pflanzen, bei denen die Blätter geerntet werden (Luzerne, Salat, Kohl, Tabak) ermöglicht die Überexpression von PhyB eine Ertragsstei­ gerung von 50%.

Tabelle 2

Anatomische Charakterisierung der Blätter der transgenen Kartoffellinien DARA5 und DARA12 im Vergleich zur untransformierten Kontrollinie (Wildtyp). Die Länge der Palisadenparenchymzellen und die Gesamtblattdicke wurden lichtmikrosko­ pisch mit Skalenokular bestimmt. Je Parameter stammen die n Proben von drei verschiedenen, 6-12 Wochen alten Gewächshauspflanzen (April-Juli 1997) (mit Ausnahme der letzten Spalte: 2 verschiedene Pflanzen). k.M. = keine Messun­ gen.

TABELLE 2

Veränderungen der Pigmentmenge

Tabelle 3 gibt die absoluten und relativen Mengen der photosynthetischen Pigmente in den Blättern der transgenen Kartoffellinie DARA12 im Vergleich zur untransformierten Kontrollinie an. Alle gemessenen Pigmente sind um den gleichen Betrag (ca. 26%) erhöht. Es läßt sich folgern, daß sich die photosyn­ thetischen Zentren der transgenen Linien qualitativ nicht von denen der Kon­ trollen unterscheiden.

Tabelle 3

Absolute und relative Mengen photosynthetischer Pigmente in Blättern der trans­ genen Kartoffellinie DARA12 im Vergleich zur untransformierten Kontrollinie (Wildtyp). Die Daten stammen aus HPLC-Analysen von Blattsegmenten 9 Wo­ chen alter Gewächshauspflanzen. Pro Linie wurden 6 Segmente verschiedener Pflanzen entnommen und in 2 Trenngängen á 3 Segmenten analysiert. Unter Ca­ rotinoide (*) fällt die Summe der Mengen an Neoxanthin, Violaxanthin, An­ theraxanthin, Lutein, Zeaxanthin, α- und β-Carotin.

4. Verzögerung der Seneszenz

Seneszenz ist phänotypisch an der Vergilbung der Blätter zu erkennen. Diese Symptome treten bei untransformierten Kontrollpflanzen zu einem Zeitpunkt auf, an dem die Pflanzen der Linien DARA12 noch dunkelgrün sind. Somit haben die transgenen Pflanzen die Möglichkeit, über einen längeren Zeitraum die Energie des Sonnenlichts für die Assimilation von Kohlendioxid zu verwenden.

5. Vergrößerung des Wurzelballens

Ein ausgedehntes unterirdisches Sproß-Wurzelsystem ermöglicht eine gute Ver­ sorgung der Pflanze mit Wasser und Nährstoffen. Abb. 4 zeigt die Ver­ größerung des Wurzelballens der transgenen DARA-Pflanzen im Vergleich zu un­ transformierten Kontrollpflanzen.

6. Erhöhung des Ertrages

Bei Kartoffelpflanzen ist der Knollenertrag bei der Beurteilung der Leistungsfä­ higkeit einer Linie entscheidend. Abb. 4 und Tabelle 4 zeigen, daß DARA Pflanzen bis zu dreimal mehr Knollen bilden. Im Mittel liegt die Ertragssteigerung zwischen 10-40%, wenn die Pflanzen mindestens 5 Monate kultiviert werden. Der Stärkegehalt der Knollen ist mit 15% des Frischgewichts unverändert.

Tabelle 4

Knollenertrag und Anzahl der Einzelknollen pro Pflanze der transgenen Kartoffel­ linien DARA5 und DARA12 im Vergleich zur untransformierten Kontrollinie (Wildtyp). Die Pflanzen wurden auf Sterilkultur ausgesetzt und für 6 Monate (November 1996 - April 1997) im Gewächshaus kultiviert. Je Linie wurden die Knollen von 5 Einzelpflanzen ausgewertet. Im Fall der Knollenzahl sind nur Knollen über 1 g berücksichtigt.

TABELLE 4

7. Weitere Eigenschaften der DARA-Linien

Die Pflanzen zeichnen sich weiterhin durch einen bis zu 50% erhöhten An­ thocyangehalt aus, der ihnen verbesserten Schutz vor UV-Strahlung gibt.

Beschreibung der transgenen Kartoffelpflanzen, die das TypB Phytochrom von Solanum tuberosum in erhöhten Mengen exprimieren.

1. Herstellung transgener Pflanzen

Die Kodierregion des Phytochrom B aus Solanum tuberosum (S.t. phyB) wurde durch die Polymerase Kettenreaktion amplifiziert, wobei ein cDNA Klon in IZAP2 (Heyer und Gatz, 1992b) als Matrize diente. Die Primer enthielten EcoRV Schnitt­ stellen. Somit kann S.t. phyB als EcoRV Fragment in geeignete Expressionsvek­ toren kloniert werden. Solanum tuberosum kodiert für zwei phyB Allele (phyB(c) und phyB(g)), die sich in 4 Aminosäuren unterscheiden. Die Sequenzinformatio­ nen sind in der Datenbank unter der Hinterlegungsnummer Y14572 S51538 (EMBL, Hinxton Hall, Hinxton, Cambridge, CD10 1SD, U.K) abgelegt. In dem hier verwendeten Beispiel wurden die beiden phyB Allele unter die Kontrolle des CaMV 35S Promotors (Benfey et al., 1990) gebracht, der zur Expression der Ge­ ne in allen Teilen der Pflanze führt. Zur Beendigung der Transkription diente die Polyadenylierungsregion des Octopin Synthase Gens aus Agrobacterium tume­ faciens. Gene, bei denen der Promotor, die Kodierregion und das Polyadenylie­ rungssignal von verschiedenen Genen stammen, werden als chimäre Gene be­ zeichnet. Im folgenden wird daher die Konstrukte als chimäres S.t. phyB Gene bezeichnet. Die Techniken zur Herstellung solch rekombinanter DNA-Moleküle sind in Sambrook et al. (1989) beschrieben. Die beiden chimären S.t. phyB Gen wurde über Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfer in Kartoffel­ pflanzen transformiert (Rocha-Sosa et al., 1985). Transgene Pflanzen, die erhöh­ te Mengen Phytochrom B aus Solanum tuberosum exprimieren, sind phänoty­ pisch an der Vergrößerung des Wurzelballens und der Vergrößerten Knollenan­ zahl zu erkennen. (Abb. 5, Tabelle 5). Pflanzen, die das phyB(c) Allel in überexprimieren, werden als DS Pflanzen bezeichnet, Pflanzen, die das phyB(g) Allel überexprimieren, werden als DPOT Pflanzen bezeichnet. Von jeder Linie wurden jeweils zwei Pflanzen genauer charakterisiert (DS13 und DS23; DPOT1 und DPOT9).

2. Bestimmung des Gehaltes an Phytochrom B

Regulatorische Proteine werden in Pflanzen im Gegensatz zu Strukturproteinen nur in geringer Menge exprimiert. Der Nachweis von Phytochromen wird oft im­ munologisch unter Verwendung von Antikörpern geführt. Monoklonale Antikörper gegen Phytochrom B aus A. thaliana stehen zur Verfügung (Somers et al., 1991). Diese Antikörper erkennen auch das Phytochrom B aus S. tuberosum. Weiterhin steht ein polyklonales Serum zur Verfügung, das durch Immunisierung von Ka­ ninchen mit PhyB aus S. tuberosum gewonnen wurde. Die genaue Durchführung dieses Nachweises ist im Methodenteil beschrieben. Abb. 6 zeigt das Er­ gebnis der Western Blot Analyse. Die vergleichende Quantifizierung unter Ver­ wendung von Verdünnungsreihen ergab, daß die Linien DS15 im Vergleich zur untransformierten Kontrolle (Wt) eine 12fach erhöhte Phytochrommenge zeigt. Die drei anderen Linien waren in ihrem Phytochrom B Gehalt im Vergleich zur untransformierten Kontrollpflanze um den Faktor 5 erhöht.

3. Phänotypische Charakterisierung

Die oberirdischen Organe (Stengel, Blatt) der Pflanzen der DS und der DPOT Linien zeigen keine Veränderungen zu untransformierten Kontrollpflanzen. Blat­ tanatomie, Photosyntheserate und Seneszenzeigenschaften sind unverändert.

Allerdings sind die unterirdischen Organe (Sproß, Wurzel, Knollen) stärker aus­ gebildet (Abb. 5). Tabelle 5 dokumentiert, daß die Knollenanzahl um den Faktor 2 bis 3 erhöht ist, der Ertrag ist etwa um 10-40% gesteigert, wenn die Pflanzen mindestens 5 Monate kultiviert werden.

Tabelle 5

Knollenertrag und Anzahl der Einzelknollen pro Pflanze der transgenen Kartoffel­ linien DPOT1, DPOT9, DS13 und DS23 im Vergleich zur untransformierten Kon­ trollinie (Wildtyp). Die Pflanzen wurden aus Sterilkultur ausgesetzt und für 6 Mo­ nate (November 1996 - April 1997) im Gewächshaus kultiviert. Je Linie wurden die Knollen von 5 Einzelpflanzen (nur DPOT9: 4 Einzelpflanzen) ausgewertet. Im Fall der Knollenzahl sind nur Knollen über 1 g berücksichtigt.

TABELLE 5

Diese Versuche zeigen, daß das Gen aus Solanum tuberosum nach Einbringen in Kartoffel ebenfalls deren Eigenschaften verbessern kann, obwohl es eine ge­ ringere Anzahl an Merkmalen verbessert als das Gen aus Arabidopsis thaliana.

LITERATURVERZEICHNIS

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims (30)

1. Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß sie Phytochrom überexprimiert.

2. Pflanze gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Phytochrom-B überexprimiert.

3. Pflanze gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Über­ expression durch Einführung eines Phytochromgens in die Pflanze und/oder Phyto­ chromgenaktivierung ausgelöst wird.

4. Pflanze gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Überexpression durch Einführung des Phytochrom-B-Gens in die Pflanze und/oder dessen Aktivierung ausgelöst wird.

5. Pflanze gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Phytochrom-B- Gen aus der Familie der Solanaceen stammt.

6. Pflanze gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Phytochrom-B- Gen aus Arabidopsis thaliana stammt.

7. Pflanze gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß es eine monokotyledone Pflanze ist.

8. Pflanze gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Mais, Weizen, Hirse, Hafer, Reis, Gerste, Sorghum, Amaranth, Zwiebel, Spargel und Zuckerrohr.

9. Pflanze gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß es eine dikotyledone Pflanze ist.

10. Pflanze gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alfalfa, Sojabohne, Petunien, Baumwolle, Zuckerrü­ be, Sonnenblume, Karotte, Sellerie, Kohl, Gurke, Pfeffer, Canola, Tomate, Kartoffel, Linse, Flachs, Brokkoli, Tabak, Bohne, Salat, Raps, Blumenkohl, Spinat, Rosenkohl, Artischocken, Erbse, Okra, Kürbis, Grünkohl, collard green, Tee und Kaffee.

11. Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie eine Zierpflanze ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Geranien, Nelken, Orchideen, Rosen, impatiens, Petunien, Begonien, Fuchsien, Dotterblumen, Chrysanthemen, Gladiolen, Astromeria, Salbei, Veronica, Gänseblüm­ chen und Iris.

12. Pflanze gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze die Kartoffel ist.

13. Pflanze gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der N-Terminus der durch das Phytochrom-Gen kodierten Aminosäuresequenz hydrophob ist.

14. Pflanze gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der N-Terminus der durch das Phytochrom-Gen kodierten Aminosäuresequenz glycin- und/oder alanin­ reich ist.

15. Pflanze gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der N-Terminus der durch das Phytochrom-Gen kodierten Aminosäuresequenz die folgende Sequenz umfaßt:

16. Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen einer Pflanze nach einem der Ansprü­ che 1 bis 15.

17. Verwendung eines oder mehrerer Phytochrom-Gene für die Herstellung der Pflanzen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 und/oder der Pflan­ zenteile, Samen und/oder Zellen gemäß Anspruch 16.

18. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 und/oder der Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen gemäß Anspruch 16 für die Er­ zeugung von Pflanzen mit erhöhter Syntheserate.

19. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 und/oder der Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen gemäß Anspruch 16 für die Er­ zeugung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegen Sonnenbestrahlung.

20. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 und/oder der Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen gemäß Anspruch 16 für die Er­ zeugung von Pflanzen mit verzögerter Seneszenz.

21. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 und/oder der Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen gemäß Anspruch 16 für die Er­ zeugung von Pflanzen mit einem stärker ausgeprägten Wurzelballen.

22. Verwendung einer Pflanze für die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Knol­ lenertrag.

23. Verwendung einer Pflanze für die Erzeugung von Pflanzen mit verbessertem Harvest Index.

24. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der vorstehenden An­ sprüche 1 bis 15 oder eine Pflanzenteils, Samens und/oder einer Zelle gemäß An­ spruch 16 für die Bekämpfung der weißen Fliege.

25. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Pflanzenteils, Samens und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 16 für die Erzeugung gegen Sonnenbestrahlung resistenter Pflanzen.

26. Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der An­ sprüche 1 bis 15 oder von Pflanzenteilen, Samen und/oder Zellen gemäß An­ spruch 16, umfassend den Schritt:

• - Einbringen eines Phytochrom-Gens, wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 ange­ geben, in die Pflanze und/oder Aktivierung eines Phytochromgens in der Pflan­ ze.

27. Konstrukt, enthaltend ein Phytochrom-Gen, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, deren N-Terminus hydrophob ist.

28. Konstrukt, enthaltend ein Phytochrom-Gen, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, deren N-Terminus glycinreich ist.

29. Konstrukt nach Anspruch 28, enthaltend ein Phytochrom-Gen, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, deren N-Terminus die folgende Sequenz umfaßt:

30. Pflanze, enthaltend ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 27 bis 29.