DE19752961C1

DE19752961C1 - Method and device for disrupting biological cells for extracting and analyzing the cell contents

Info

Publication number: DE19752961C1
Application number: DE19752961A
Authority: DE
Inventors: Bentsian Elkine; Guenter Dr Tovar; Ruediger Koelblin; Andreas Schuele; Achim Gueth; Uwe Dr Vohrer; Juergen Dr Bernhagen; Frank Vitzthum
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1997-11-28
Filing date: 1997-11-28
Publication date: 1999-07-15
Anticipated expiration: 2017-11-29
Also published as: EP1034428A1; IL136194A0; WO1999028742A1; CA2311429A1; JP2001525185A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum Aufschluß von biologischen Zellen zur Extraktion und Analyse ihrer Zellinhalte, insbesondere der Nukleinsäuren.The invention relates to a method and an apparatus for digestion of biological cells for the extraction and analysis of their cell contents, in particular of nucleic acids.

Für die Untersuchung biologischer Zellen und insbesondere der Analyse der Zellin halte, insbesondere Proteine und Nukleinsäuren (DNA und RNA), beispielweise zu Zwecken medizinischer Diagnostik, müssen die Zellwände und Membranen aufge schlossen werden, um das Zellinnere in einer geeigneten Form aus den Zellen ex trahieren zu können.For the examination of biological cells and in particular the analysis of the cellin hold, in particular proteins and nucleic acids (DNA and RNA), for example For medical diagnostics, the cell walls and membranes need to be opened be closed to ex. the cell interior in a suitable form from the cells to be able to

Hierzu sind eine Reihe bekannter Verfahren geeignet, die in dem Beitrag von Carl A. Schnaitman, "Cell Fractionation" in Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Mikrobiology, Washington, DC 20006, 1981, Chapter 5, Seite 52-61, in einer Übersichtsdarstellung beschrieben sind. Die in diesem Beitrag be schriebenen Methoden lassen sich in unterschiedliche Gruppen einteilen, die sich nach ihrer Art der Zellwandzerstörung bzw. -auflösung unterscheiden:A number of known methods are suitable for this, which are described in the contribution by Carl A. Schnaitman, "Cell Fractionation" in Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC 20006, 1981, Chapter 5, page 52-61, are described in an overview. The be in this post Methods written can be divided into different groups, which are differentiate according to their type of cell wall destruction or dissolution:

Mechanische Verfahren beruhen auf der Erzeugung lokaler Druckschwankungen am Ort der aufzuschließenden Zellen, wodurch Zellwände und Membranen regelrecht aufgebrochen werden. Aufgrund der für die Zellwandzerstörung notwendigen starken Druckschwankungen bedarf es jedoch entsprechend stabil ausgebildeter Vorrichtun gen, wie sie beispielsweise in dem Artikel von J. R. Raper und E. A. Hyatt, "Modified Press For Disruption Of Microorganisms", J. of Bacteriology, V. 85, S. 712-713, be schrieben sind. Weitere Vorrichtungen zur Erzeugung derartig großer Druck- oder Scherkräfte sind sogenannte Kugelmühlen oder die sogenannte French press, die in "Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology", American Society for Micro biology, Washington, D. C. 1986 in Kapitel 9.3.6. auf Seiten 103-104 dargestellt sind.Mechanical processes are based on the generation of local pressure fluctuations on Location of the cells to be disrupted, making cell walls and membranes literally be broken up. Because of the strong necessary for cell wall destruction Pressure fluctuations, however, require appropriately stable devices as described, for example, in the article by J.R. Raper and E.A. Hyatt, "Modified Press For Disruption Of Microorganisms ", J. of Bacteriology, V. 85, pp. 712-713, be are written. Other devices for generating such large pressure or Shear forces are so-called ball mills or the so-called French press, which in "Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology", American Society for Micro biology, Washington, D.C. 1986 in Chapter 9.3.6. on pages 103-104.

Die vorstehend genannten Vorrichtungen bedürfen neben einem sehr großen techni schen und mechanischen Aufwand, der betrieben werden muß, um derartig große Druckkräfte zu erzeugen und sicher zu beherrschen, viel Platz und lassen sich über dies schwer automatisieren. Ein weiterer Nachteil der bekannten Druckbehandlung biologischer Zellen besteht überdies auch darin, daß die Zellinhalte, hierbei sind ins besondere die langkettigen DNA-Moleküle gemeint, stark fragmentiert werden, so daß eine vollständige DNA-Analyse erschwert ist.The devices mentioned above require a very large techni and mechanical effort that must be operated to such a large Generate pressure forces and master them safely, plenty of space and can be over difficult to automate this. Another disadvantage of the known pressure treatment biological cells also consists in the fact that the cell contents are ins especially the long-chain DNA molecules are meant to be highly fragmented, so that complete DNA analysis is difficult.

Auch sind Ultraschall-Aufschlußmethoden bekannt, bei denen die Zellwände und Membranen durch Kavitationseffekte regelrecht aufgerissen wird, so daß das Zellin nere nach außen gelangen kann. Beim Ultraschallaufschluß wird jedoch eine erheb liche Schall-Leistung in der zu untersuchenden Probe dissipiert, wodurch die Probe unnötigerweise erwärmt wird. Kühlvorkehrungen sind daher nötig. Durch die auftre tenden Temperaturschwankungen ist jedoch eine einigermaßen genaue Prozeßfüh rung erschwert. Überdies sind die bekannten Apparaturen zur Anwendung des Hochleistungsultraschalls schwierig zu reinigen, wodurch die Gefahr der Querkonta mination nicht ausgeschlossen werden kann.Ultrasonic digestion methods are also known in which the cell walls and Membranes are literally torn open by cavitation effects, so that the cellin nere can get outside. In the case of ultrasound digestion however a Liche sound power dissipated in the sample to be examined, causing the sample is heated unnecessarily. Cooling precautions are therefore necessary. Through the appearances However, temperature fluctuations are a reasonably accurate process control difficult. In addition, the known apparatus for using the High performance ultrasound difficult to clean, creating the risk of cross-contact mination cannot be excluded.

Der Aufschluß von biologischen Zellen auf ausschließlich chemischem Wege bedarf individuell auf die Zellen angepaßten Chemikalien, wodurch bei der Untersuchung unbekannter Zelltypen, wie es beispielsweise bei der Diagnose unbekannter Krank heitserreger der Fall ist, die Schwierigkeit der Wahl der jeweils richtigen Chemikalie besteht. Ein Beispiel für ein Zellaufschlußverfahren unter ausschließlicher Verwen dung rein chemisch ablaufender Aufschlußreaktionen ist in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 1.25-1.31 beschrieben. Die für den Aufschluß von Zellen erforderlichen Reak tionszeiten bei ausschließlicher Verwendung von Chemikalien betragen mehrere Stunden trotz hohen Konzentrationen der dabei verwendeten Chemikalien, die zu dem bei anschließenden Analyseschritten, wie beispielsweise PCR-Reaktionen, stö rende Einflüsse haben können. Auch ist die Aufschlußrate bei einigen Mikroorganis men nicht ausreichend; es ist beispielweise extrem schwierig bei Micrococcus luteus auf dem chemischen Wege eine Rate höher als 20% zu erreichen.The digestion of biological cells by chemical means only chemicals individually adapted to the cells, which means that during the examination unknown cell types, such as the diagnosis of unknown patients pathogen is the difficulty of choosing the right chemical consists. An example of a cell disruption method using only The use of purely chemical digestion reactions is described in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual, "Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Pages 1.25-1.31. The reak required for cell disruption times with the exclusive use of chemicals are several Hours despite the high concentrations of chemicals used that disrupt subsequent analysis steps, such as PCR reactions influencing factors. Also the digestion rate is with some microorganisms not sufficient; for example, it is extremely difficult with Micrococcus luteus to reach a rate higher than 20% by chemical means.

Schließlich sind Verfahren bekannt, bei denen in flüssigen Medien suspendierte bio logische Zellen, wie beispielsweise Bakterien oder Pilze, einem starken elektrischen Feld ausgesetzt werden. So werden mittels elektrischer Felder biologische Zellen im Wege der Pasteurisierung und Sterilisation abgetötet, wie es beispielsweise in der Druckschrift US 5 235 905 beschrieben ist. Hierbei wird, um einen zu großen Ener gieeintrag in die Probe und dessen Überhitzung zu vermeiden, die Probe mit gepul sten elektrischen Feldern beaufschlagt mit jeweils Impulsdauern von einigen Mikro sekunden. Da eine biologische Zelle elektrisch betrachtet aus einem elektrolytischen und deshalb elektrisch leitenden Inhalt besteht, der von einer elektrisch isolierenden Membran umschlossen ist, verschieben sich die elektrischen Ladungsträger im Inne ren beim Anlegen eines elektrischen Feldes von außen. Auf diese Weise entstehen lokale Potentialdifferenzen zwischen dem Zellinneren und Zelläußeren, die dazu füh ren, daß die Zellmembran einen elektrischen Durchbruch erfährt, wodurch sie ihre semipermeablen Eigenschaften verliert und an elektrischer Leitfähigkeit zunimmt. Bei geringen äußeren Feldstärken sowie kurzen Impulsdauern ist die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit der Zellmembran reversibel, eine Erscheinung, die bei der Elektroporation (siehe hierzu E. Neumann, A. E. Sowers, C. A. Jordan, "Electroporati on and Electrofusion in Cell Biology", Plenum Press, New York, 1989) eine zentrale Rolle spielt. Die wird beispielweise benutzt, um genetisches Material in die Zellen zu bringen. Nachteilig bei dieser Anwendung der Elektroporation ist, daß typischerweise die Effizienz im Bereich von 0,01% liegt, d. h. nur in eine Zelle aus 10000 das Materi al auch tatsächlich hineingebracht wird.Finally, methods are known in which bio. Suspended in liquid media logical cells, such as bacteria or fungi, a strong electrical Field are exposed. Biological cells in the Ways of pasteurization and sterilization, such as in the Document US 5 235 905 is described. In this case, in order to a too large energy To avoid gie entry in the sample and its overheating, the sample with pulsed Most electrical fields each have pulse durations of a few micro seconds. Because a biological cell is considered electrically from an electrolytic and therefore there is electrically conductive content, that of an electrically insulating When the membrane is enclosed, the electrical charge carriers move inside ren when applying an electrical field from the outside. This way arise local potential differences between the cell interior and cell exterior, which lead to ren that the cell membrane experiences an electrical breakthrough, causing it to loses semi-permeable properties and increases in electrical conductivity. At low external field strengths and short pulse durations is the change in electrical conductivity of the cell membrane reversible, a phenomenon that occurs in the Electroporation (see E. Neumann, A. E. Sowers, C. A. Jordan, "Electroporati on and Electrofusion in Cell Biology ", Plenum Press, New York, 1989) Role play. This is used, for example, to deliver genetic material into the cells bring. A disadvantage of this application of electroporation is that typically the efficiency is in the range of 0.01%, d. H. only in one cell out of 10,000 the matter al is actually brought in.

Bei stärkeren Feldern und ausreichender Impulsdauer, insbesondere bei einer wie derholten Behandlung der biologischen Zellen, sind diese Änderungen permanent und führen letztendlich zum Zelltod. Diese Vorgehensweise wird standardmäßig zur Abtötung von Mikroorganismen in Lebensmitteln eingesetzt.With stronger fields and sufficient pulse duration, especially with a like repeated treatment of biological cells, these changes are permanent and ultimately lead to cell death. By default, this procedure becomes Killing microorganisms used in food.

In der DE 35 37 261 A1 ist ein Verfahren zum feldinduzierten Einschleusen von Ma kromolekülen in lebenden Zellen beschrieben, das einen zum gezielten Ausschleu sen von Zellinhalte reziproken Vorgang darstellt und somit anderen Prozeßbedingen unterworfen ist. So können das Ein- und Ausschleusen von Teilchen in Zellen nicht als äquivalente Vorgänge angesehen werden, zumal die Natur des Transportes asymetrisch ist.DE 35 37 261 A1 describes a method for field-induced infiltration of Ma described cromolecules in living cells, one for targeted removal of cell contents represents a reciprocal process and thus other process conditions is subject. This means that particles cannot enter and exit cells are regarded as equivalent processes, especially since the nature of the transport is asymmetrical.

Der asymmetrische bzw. gerichtete Transport von verschiedenen Stoffen durch die Zellwand gehört vielmehr zu den wichtigsten Funktionen der Zellmembran. So weist zum einen die Zellmembran einen asymmetrischen Aufbau auf, zum anderen unter scheidet sich der Zellinhalt wesentlich von der äußeren Umgebung der Zelle. Die Größe der transportierten Molekülen ist oftmals mit der Zellgröße selbst ver gleichbar, wodurch nicht zuletzt auch dadurch die unterschiedlichen Transportme chanismen, die dem Ein- und Ausschleusen zugrunde liegen, nicht durch einfache Diffusionsmodelle beschrieben werden können - wobei auch die einfache Diffusion kein rein symmetrischer Prozeß ist. Die Transportmechanismen sind kompliziert, be inhalten mehrere Schritte und sind für die jeweilige Transportrichtung sehr spezifisch.The asymmetrical or directional transport of various substances through the Rather, cell wall is one of the most important functions of the cell membrane. So points on the one hand the cell membrane has an asymmetrical structure, on the other hand under the cell content differs significantly from the external environment of the cell. The size of the transported molecules is often ver with the cell size itself similar, which not least also means that the different transport dimensions mechanisms underlying the inward and outward transfer, not by simple ones Diffusion models can be described - including simple diffusion is not a purely symmetrical process. The transport mechanisms are complicated, be contain several steps and are very specific for the respective direction of transport.

Gleiches gilt auch für das aus der JP 04173093 A hervorgehende Transformations verfahren von Bacillus stearothermophilus mit einem Plasmid.The same applies to the transformation resulting from JP 04173093 A method of Bacillus stearothermophilus with a plasmid.

Allen bekannten Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen haftet neben dem zum Teil sehr großen apparativen und technischen Aufwand der Nachteil an, daß die Verfahren nicht vollautomatisch durchzuführen sind. Zudem kommt, daß die Zellauf schlußrate nicht immer ausreichend groß ist.All known methods for disrupting biological cells are liable in addition to that for Part of very large equipment and technical outlay the disadvantage that the Procedures are not to be carried out fully automatically. It also comes that the cell opening closing rate is not always sufficiently large.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte derart weiterzubilden, daß das Verfahren vollautomatisch und ohne großen apparativen und technischen Aufwand ablaufen kann. Insbesondere soll der extrahierte Anteil der zu analysierenden Zellin halte unabhängig vom Zelltyp hoch sein, wobei die Verfahrenszeitdauer zur Extrakti on und Isolation der Zellinhalte deutlich reduziert werden soll. Überdies soll eine Vor richtung angegeben werden, mit der eine kostengünstige, schnelle und sichere Durchführung des Verfahrens möglich ist.The invention has for its object a method for digesting biological To develop cells for extraction and analysis of the cell contents such that the Process fully automatically and without great equipment and technical effort can expire. In particular, the extracted portion of the cell to be analyzed consider to be high regardless of the cell type, the duration of the procedure for extracti on and isolation of the cell contents should be significantly reduced. Moreover, a pre direction to be specified, with a cost-effective, fast and safe Implementation of the procedure is possible.

Erfindungsgemäß ist erkannt worden, daß die Nachteile, die bei den bekannten Ver fahren des ausschließlichen chemischen Aufschlußes von biologischen Zellen auf treten, durch eine gezielte Abfolge bzw. Überlagerung von elektrischer und chemi scher Behandlung von biologischen Zellen vermieden werden können.According to the invention, it has been recognized that the disadvantages that exist in the known Ver drive up the exclusive chemical digestion of biological cells occur through a targeted sequence or overlay of electrical and chemical treatment of biological cells can be avoided.

Erfindungsgemäß zeichnet sich das Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte dadurch aus, daß die Zellen einem elektri schen Feld ausgesetzt werden und daß die Zellen vor oder nach dem Anlegen des elektrischen Feldes mit einer Substanz in Kontakt gebracht werden, die den Zellauf schluß unterstützt. According to the invention, the method for disrupting biological cells is characterized Extraction and analysis of the cell contents in that the cells an electri be exposed to the field and that the cells before or after the application of the electrical field can be brought into contact with a substance that finally supports.

Die für gewöhnlich in einem flüssigen Medium suspendierten biologischen Zellen werden einem gepulst betriebenen elektrischen Feld mit typischen Feldstärken zwi schen 5 und 100 kV/cm und einer Pulslänge von ca. 0,5 bis 50 Mikrosekunden aus gesetzt. Ebenso können die Zellen auch in Zellverbänden, wie etwa Gewebestücken vorliegen oder auf einem Träger immobilisiert aufgebracht sein, bspw. auf einem Fil ter.The biological cells usually suspended in a liquid medium are a pulsed electric field with typical field strengths between between 5 and 100 kV / cm and a pulse length of approx. 0.5 to 50 microseconds set. The cells can also be found in cell assemblies, such as pieces of tissue are present or applied immobilized on a carrier, for example on a fil ter.

Durch die Einwirkung des elektrischen Feldes und den elektrischen Durchbruch ent stehen in den Lypidschichten, aus den die Zellmembran besteht, Poren. Da sie aber sehr klein sind, und da bei bestimmten Zelltypen neben der Zellmembran auch die Zellwand die Diffusion von großen Molekülen wie beispielweise Nukleinsäure hindern kann, reicht die Behandlung der Zellen mit elektrischem Feld alleine für die Freisetzung der Zellinhalte in vielen Fällen nicht aus.Due to the action of the electrical field and the electrical breakthrough There are pores in the layers of lypid that make up the cell membrane. But since she are very small, and because of certain cell types in addition to the cell membrane the cell wall the diffusion of large molecules such as nucleic acid treatment of the cells with an electric field is sufficient for the Release of the cell contents in many cases does not stop.

Es wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, das Entstehen der Poren in der Zellmem bran auszunutzen, um die Wirkung von Chemikalien zum Zellaufschluß zu unterstüt zen und zu beschleunigen.It is proposed according to the invention the formation of the pores in the cell membrane exploit bran to support the effect of chemicals for cell disruption zen and accelerate.

In einer Variante werden Chemikalien verwendet, die auf den Zellinhalt und insbe sondere auf die zu analysierende Moleküle so einwirken, daß sie leichter und schnelle freigesetzt werden. Diese Chemikalien diffundieren durch die durch elektri sche Behandlung entstandene Poren in das Zellinnere, und bauen beispielweise Proteine ab und schneiden gezielt DNA-Moleküle in kleinere Fragmente, die aber für nachfolgende DNA-Analyse geeignet sind. Die entstandene DNA-Fragmente können dann ungehindert durch die Poren nach außen diffundieren. Diese Prozesse werden durch Zugabe einer oberflächenaktiven Substanz (Detergenz), wie beispielweise Natriumdodecylsulfat (SDS), unterstützt.In a variant, chemicals are used that affect the cell content and esp act in particular on the molecules to be analyzed so that they are lighter and to be released quickly. These chemicals diffuse through the electri treatment created pores in the cell interior, and build for example Proteins cut and cut DNA molecules into smaller fragments, but for subsequent DNA analysis are suitable. The resulting DNA fragments can then diffuse freely through the pores. These processes will by adding a surface-active substance (detergent), such as Sodium dodecyl sulfate (SDS).

In einer anderen Variante wird die Tatsache ausgenutzt, daß die durch elektrische Behandlung entstandene Poren schwache Stellen darstellen, die den Angriff der Chemikalien auf die Membran wesentlich erleichtern und beschleunigen. Chemikali en, die zum vollständigen Abbau der Zellwände eingesetzt werden können, sind bei spielweise chaotrope Reagenzien wie Harnstoff, Guanidiniumhydrochlorid oder - thiocyanat und andere. Es kann auch Dimethylsulfoxid eingesetzt werden.Another variant takes advantage of the fact that the electrical Treatment created pores represent weak spots that attack the Much easier and faster chemicals on the membrane. Chemical s that can be used to completely dismantle the cell walls are included in the for example chaotropic reagents such as urea, guanidinium hydrochloride or - thiocyanate and others. Dimethyl sulfoxide can also be used.

Da die in einem Medium suspendierten biologischen Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt sind, bedarf es bei der Beimengung der zusätzlich chemischen Substanz keiner allzu hohen Konzentration, wodurch negative Auswirkungen, bedingt durch die Gegenwart der chemischen Substanz, bei nachfolgenden Analyseschritten ausge schlossen werden können.Because the biological cells suspended in a medium have an electrical field are exposed, the addition of the additional chemical substance is required not too high a concentration, causing negative effects due to the Presence of the chemical substance, in subsequent analysis steps can be closed.

Um die angestrebte chemische Wirkung zu optimieren und zu beschleunigen, wer den die in Kontakt mit den Chemikalien gebrachte Zellen, beispielweise in Form einer Zellsuspension, auf ein Temperaturniveau zwischen 35 und 100°C gebracht.To optimize and accelerate the desired chemical effect, who which the cells brought into contact with the chemicals, for example in the form of a Cell suspension, brought to a temperature level between 35 and 100 ° C.

Zur Durchführung des Verfahrens ist erfindungsgemäß eine Vorrichtung dadurch ausgebildet, daß ein, die in einem Medium suspendierten Zellen oder Zellverbände aufnehmendes Probenvolumen mit zwei flächig ausgebildeten, sich gegenüberlie genden Elektroden vorgesehen ist, das durch ein Deckelelement, dessen dem Pro benvolumen zugewandte Seite konvex ausgebildet ist, an der Oberseite des Proben volumens abschließbar ist. Durch das konvex ausgebildete Deckelelement kann vorteilhafterweise vermieden werden, daß bei einem Einschluß des flüssigen Medi ums innerhalb des Probenvolumens keine Luftblasen eingeschlossen werden, die zur ungleichmäßigen Verteilung des elektrischen Feldes und daher möglicherweise zu unerwünschten elektrischen Durchbrüchen in der Behandlungsvorrichtung führen würden.According to the invention, a device for performing the method is thereby trained that one, the cells or cell aggregates suspended in a medium absorbing sample volume with two flat, opposing The electrodes provided is provided by a cover element, the Pro benvolum facing side is convex, on the top of the sample volume is lockable. Due to the convex cover element advantageously be avoided that with inclusion of the liquid medium to avoid trapping air bubbles within the sample volume to the uneven distribution of the electric field and therefore possibly lead to undesired electrical breakdowns in the treatment device would.

Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsge dankens anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen exemplarisch beschrieben. Es zeigen:The invention is hereinafter without limitation of the general inventions thanks based on exemplary embodiments with reference to the drawings described as an example. Show it:

Fig. 1 Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zum Aufschluß biologischer Zellen, Fig. 1 embodiment of an apparatus for performing the process of biological decomposition to cells

Fig. 2 alternative Vorrichtung mit metallischer Folie am Deckelelement, Fig. 2 alternative device with a metallic foil on the cover element,

Fig. 3 alternatives Ausführungsbeispiel mit metallischer Trennfolie innerhalb des Probenvolumens, sowie Fig. 3 alternative embodiment with metallic separating film within the sample volume, and

Fig. 4 alternatives Ausführungsbeispiel mit Reibelementen zur Gewebezerkleinerung. Fig. 4 alternative embodiment with friction elements for tissue reduction.

In Fig. 1 ist eine vorteilhafte Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zum Auf schluß biologischer Zellen dargestellt, die eine Behandlungszelle zeigt, die ein Kunststoffgehäuse 2 aufweist, in das eine untere Elektrode 3 eingegossen ist und eine obere Elektrode 4 vorsieht, die zugleich das Deckelelement darstellt. Zwischen den Elektroden befindet sich im Probenvolumen 1 die in einer Lösung suspendierten aufzuschließenden biologischen Zellen. Alternativ können sich die Zellen immobili siert auf einem Träger, beispielweise einem Filter, befinden, wobei das Restvolumen der Vorrichtung mit einer Elektrolytlösung aufgefüllt wird. Durch die konvex gewölbte Oberfläche des Deckelelementes 4 wird gewährleistet, daß beim Aufsetzen des Dec kelelementes keine Luftblasen im Probenvolumen 1 eingeschlossen werden. Der beim Aufsetzen des Deckelelementes auf das Probenvolumen 1 durch das Deckele lement 1 verdrängte Überschuß der Suspension 5 sammelt sich in einer zirkular um das Deckelelement 4 vorgesehenen Vertiefung 6 des Kunststoffgehäuses 2. Die dem Deckelelement 4 gegenüberliegende untere Elektrode 3 ist hingegen konkav ausge bildet, so daß der Abstand zwischen beiden Elektroden konstant gewählt ist. Zudem erleichtert die Ausgestaltung der Elektrodenform das Einfüllen einer Flüssigkeit in das Probenvolumen 1 ohne Luftblasen sowie eine weitgehend restlose Probenent nahme, nach Durchführung des Zellaufschlußverfahrens.In Fig. 1 an advantageous device for performing the method for closing biological cells is shown, which shows a treatment cell having a plastic housing 2 , in which a lower electrode 3 is cast and provides an upper electrode 4 , which also represents the cover element . The biological cells to be disrupted suspended in a solution are located in the sample volume 1 between the electrodes. Alternatively, the cells can be immobilized on a carrier, for example a filter, the remaining volume of the device being filled with an electrolyte solution. The convexly curved surface of the cover element 4 ensures that no air bubbles are trapped in the sample volume 1 when the Dec element is put on. The lement by the Deckele when placing the lid member on the sample volume 1 1 displaced excess of the suspension 5 collects in a circularly provided around the lid member 4 recess 6 of the plastic housing. 2 The lower electrode 3 opposite the cover element 4 , however, is formed concave, so that the distance between the two electrodes is chosen to be constant. In addition, the design of the electrode shape facilitates the filling of a liquid into the sample volume 1 without air bubbles and a largely complete sampling after the cell disruption process has been carried out.

Um die Elektroden 4 und 3 zu kontaktieren sowie die Behandlungszellenteile insbe sondere in einer automatisierten Vorrichtung zu transportieren und zu fixieren, weist die untere Elektrode 3 einen Stecker 7 sowie die obere Elektrode 4 eine Vertiefung 8 auf. In order to contact the electrodes 4 and 3 and to transport and fix the treatment cell parts in particular in an automated device, the lower electrode 3 has a plug 7 and the upper electrode 4 has a recess 8 .

Der in dem Ausführungsbeispiel vorzugsweise eingestellte Elektrodenabstand be trägt 2 bis 5 mm, der Elektrodendurchmesser ca. 1 cm. Bei diesen Abmessungen und bei einer noch relativ leicht handhabbaren Spannung von ca. 20 kV beträgt die Stärke des elektrischen Feldes zwischen 40 und 100 kV/cm, eine Feldstärke, die für einen Zellaufschluß durchaus geeignet ist.The electrode distance preferably set in the exemplary embodiment carries 2 to 5 mm, the electrode diameter approx. 1 cm. With these dimensions and with a still relatively easy to handle voltage of approx. 20 kV the Strength of the electric field between 40 and 100 kV / cm, a field strength that for cell disruption is quite suitable.

Die Elektrodenoberflächen können vorzugsweise aus Aluminium gefertigt sein, da dieses Material biologisch inert und chemisch ausreichend beständig ist. Außerdem ist es leicht zu verarbeiten und billig, und daher insbesondere für Einwegartikel geeignet.The electrode surfaces can preferably be made of aluminum, since this material is biologically inert and chemically stable. Furthermore it is easy to process and cheap, and therefore especially for disposable items suitable.

Nach der Behandlung mit elektrischem Feld kann die chemische Behandlung im gleichen Volumen durch hinzugabe der Chemikalien fortgesetzt werden, oder alter nativ kann die Zellsuspension in ein anderes Gefäß umpipettiert werden.After treatment with an electric field, chemical treatment in the same volume can be continued by adding chemicals, or older natively, the cell suspension can be pipetted into another vessel.

Die in Fig. 1 dargestellte Ausführungsform mag durch die konstruktive Auslegung des Deckelelementes für eine Probenentnahme umständlich sein, da das Deckele lement vor dem Entleeren des Probenvolumens 1 zu entfernen ist, an dem ein we sentlicher Teil der Lösung als Tropfen hängenbleiben kann. Dies wiederum könnte zu der Kontamination des Umfeldes und somit zur Querkontamination weiterer Pro ben führen, die es jedoch gilt, insbesondere bei der automatischen Handhabung der artiger Proben, zu vermeiden.The embodiment shown in Fig. 1 may be cumbersome due to the constructive design of the cover element for sampling, since the cover element is to be removed before emptying the sample volume 1 , to which a substantial part of the solution can get caught as drops. This in turn could lead to contamination of the environment and thus to cross-contamination of other samples, which must be avoided, however, especially when the samples are handled automatically.

Um die Probenentnahme insbesondere in einer automatisierten Vorrichtung zu er leichtern und sicher gegenüber Querkontamination zu machen, sieht die Vorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel der Fig. 2 eine zweiteilige Ausgestaltung des Deckele lementes 4 vor. Das Deckelelement 4 verfügt über eine mittige Bohrung 9 und ist mit einer das Deckelelement 4 umhüllenden elektrisch leitenden, vorzugsweise aus Alu minium gefertigten Folie 10 umhüllt. Nach der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch den Kanal 9 eine Pipette eingeführt, die die Folie 10 durch stößt, so daß die im Probenvolumen 1 enthaltene Suspension abgesaugt werden kann. Zwar muß in diesem Ausführungsbeispiel die Folie jedes Mal ausgetauscht werden, doch erscheint dies vorteilhaft, zumal zur Vermeidung von Querkontamina tionen die gesamte Behandlungszelle als Einwegartikel ausgebildet werden kann.In order to facilitate the taking of samples, in particular in an automated device, and to make them safe from cross-contamination, the device according to the exemplary embodiment in FIG. 2 provides a two-part design of the cover element 4 . The cover element 4 has a central bore 9 and is covered with an electrically conductive, preferably made of aluminum foil 10 enveloping the cover element 4 . After carrying out the method according to the invention, a pipette is inserted through the channel 9 , which pushes through the film 10 so that the suspension contained in the sample volume 1 can be sucked off. In this embodiment, the film must be replaced every time, but this appears to be advantageous, especially since the entire treatment cell can be designed as a disposable article to avoid cross-contamination.

In Fig. 3 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel dargestellt, das ein Deckelelement 4 vergleichbar zur Ausführungsform gemäß Fig. 1 aufweist. Jedoch sieht diese Ausge staltung eine das Probenvolumen 1 abtrennende Metallfolie 11 vor, die zugleich die untere Elektrode darstellt. Unter der Elektrode 11 befindet sich ein Hohlraum 12, der mit einem Kanal 7 verbunden ist. Wie im Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 wird die Behandlungszelle mit einer Suspension von biologischen Zellen aufgefüllt und eine Hochspannungsbehandlung mit chemischen Additiven zum Zellaufschluß durchge führt. FIG. 3 shows a further exemplary embodiment which has a cover element 4 comparable to the embodiment according to FIG. 1. However, this configuration provides a metal foil 11 which separates the sample volume 1 and which also represents the lower electrode. There is a cavity 12 below the electrode 11 , which is connected to a channel 7 . As in the exemplary embodiment according to FIG. 1, the treatment cell is filled with a suspension of biological cells and high-voltage treatment with chemical additives for cell disruption is carried out.

Nach Abschluß der elektrischen Feldapplikation wird durch den Kanal 7 der Hohl raum 12 evakuiert. Infolge der Druckdifferenz reißt die Folie 11 auf, so daß die be handelte Suspension zur weiteren Analyse durch den Kanal 7 abgesaugt werden kann.After completion of the electrical field application, the cavity 12 is evacuated through the channel 7 . As a result of the pressure difference, the film 11 tears open, so that the suspension being treated can be suctioned off through the channel 7 for further analysis.

Diese Ausführungsvariante eignet sich insbesondere für eine vollautomatische Ver fahrensdurchführung, bei der die Gefahr der Querkontaminationen vollständig aus geschlossen werden können.This variant is particularly suitable for a fully automated Ver driving, in which the risk of cross-contamination is completely eliminated can be closed.

In allen beschriebenen Fällen ist eine chemische Nachbehandlung notwendig, um effizient die Zellinhalte nach außen zu bringen. Die Chemikalien können der Lösung vor der elektrischen Feldapplikation zugesetzt werden; da sie aber in vielen Fällen Elektrolyten sind bzw. in elektrolytischen Puffern optimal wirken, sollen sie dann erst nach Abschluß der elektrischen Feldapplikation der Zellsuspension hinzugefügt wer den.In all cases described, chemical after-treatment is necessary in order to to efficiently bring the cell contents outside. The chemicals can be the solution be added before the electrical field application; but in many cases Electrolytes are or should work optimally in electrolytic buffers after completion of the electrical field application of the cell suspension who added the.

In einer Variante der chemischen Behandlung wird der Zellsuspension eine Mi schung aus 15 verschiedenen Restriktionsendonukleasen (je 3 U/ml) hinzugefügt, und bei 37°C ca. 10 bis 30 Minuten inkubiert. Die Reagenzien diffundieren durch die bei der elektrischen Feldapplikation entstandenen Membranporen in das Zellinnere und zerschneiden gezielt die DNA-Stränge auf Stücke mit einigen Tausend Basen paaren, die später für PCR-Reaktion verwendet werden können. Nach der Behand lung wird der Suspension Proteinase K in einer Konzentration von 1 µg/ml hinzuge fügt, und das Temperaturniveau wird auf 60°C eingestellt. Proteinase K diffundiert gleichfalls durch die Poren und bewirkt die Lyse sowohl von Zellproteinen als auch der im vorherigen Schritt hinzugefügten Enzymen, so daß störende Einflüsse auf die nachfolgenden PCR-Reaktionen ausgeschlossen werden. Nach Inkubation von 10 bis 30 Min. bei 60°C wird die Temperatur auf 95°C gebracht. Dabei denaturiert die Proteinase K, und die DNA diffundiert durch die Poren in der Membran nach außen. Durch derartige Behandlung werden die PCR-Inhibitoren, sowohl hinzugefügte als auch zelleigene, weitgehend abgebaut.In a variant of the chemical treatment, the cell suspension becomes a Mi added from 15 different restriction endonucleases (3 U / ml each), and incubated at 37 ° C for about 10 to 30 minutes. The reagents diffuse through the membrane pores formed in the cell interior during electrical field application and deliberately cut the DNA strands into pieces with a few thousand bases pairs that can later be used for PCR reaction. After the treatment The proteinase K suspension is added in a concentration of 1 µg / ml adds, and the temperature level is set to 60 ° C. Proteinase K diffuses likewise through the pores and causes the lysis of both cell proteins and of the enzymes added in the previous step, so that disruptive influences on the subsequent PCR reactions can be excluded. After incubation of 10 The temperature is brought to 95 ° C. for up to 30 minutes at 60 ° C. The denatures Proteinase K, and the DNA diffuses out through the pores in the membrane. By such treatment, the PCR inhibitors, both added and also cell's own, largely degraded.

In einer anderen Variante der chemischen Behandlung wird nach Abschluß der elek trischen Feldapplikation der Zellsuspension Guanidiniumhydrochlorid bzw. - thiocyanat (GdnHCl bzw. GdnSH) hinzugefügt, so daß eine 0,3 bis 3 M Konzentra tion eingestellt wird. Die Suspension wird auf eine Temperatur von 60 bis 100°C ge bracht und 10 bis 30 Min inkubiert. Dadurch werden die Zellwände und Membranen zerstört, wodurch die DNA freigesetzt wird. Diese Methode ist einfacher als die oben beschriebene, hat aber den Nachteil, daß Guanidiniumverbindungen, die zwar in ei ner geringeren Konzentration als sonst für rein chemischen Zellaufschluß verwendet werden, die nachfolgende PCR-Reaktion inhibieren können und deswegen aus der Lösung entfernt werden müssen.In another variant of the chemical treatment, the elec tric field application of the cell suspension guanidinium hydrochloride or - thiocyanate (GdnHCl or GdnSH) added, so that a 0.3 to 3 M concentration tion is set. The suspension is ge to a temperature of 60 to 100 ° C. brought and incubated for 10 to 30 minutes. This will make the cell walls and membranes destroyed, releasing the DNA. This method is easier than the one above described, but has the disadvantage that guanidinium compounds, although in egg ner lower concentration than otherwise used for purely chemical cell disruption be able to inhibit the subsequent PCR reaction and therefore from the Solution must be removed.

In der Ausführungsform gemäß Fig. 4 sind an den Oberseiten der Elektroden 13 und 3 Oberflächenrauhigkeiten vorgesehen, durch die in das Probenvolumen 1 einge brachte Gewebestücke 16 zerkleinert werden können.In the embodiment according to FIG. 4, surface roughness is provided on the upper sides of the electrodes 13 and 3 , through which tissue pieces 16 brought into the sample volume 1 can be comminuted.

Die obere Elektrode 13 und das Gehäuse 2 sind gemäß Ausführungsbeispiel der Fig. 4 derart ausgeführt, daß die Elektrode 13 axial und rotationsbeweglich geführt ist. Das Restvolumen des Probenvolumens 1 wird mit einer Flüssigkeit 17 aufgefüllt und die Gewebeprobe 16 durch einen Druck auf die obere Elektrode 13 zwischen den Elektroden zusammengepreßt. In diesem Fall ist die Flüssigkeit nur notwendig, um elektrische Entladungen zwischen den Elektroden auszuschließen, da die Probe selbst die Elektroden direkt kontaktiert. Die zwischen die Elektrode eingebrachte Flüssigkeit ist daher nicht unbedingt elektrisch leitend, so daß reines Wasser oder auch Öl verwendet werden kann.The upper electrode 13 and the housing 2 are designed according to the embodiment of FIG. 4 such that the electrode 13 is guided axially and rotatably. The remaining volume of the sample volume 1 is filled with a liquid 17 and the tissue sample 16 is pressed between the electrodes by pressure on the upper electrode 13 . In this case, the liquid is only necessary to rule out electrical discharges between the electrodes, since the sample itself contacts the electrodes directly. The liquid introduced between the electrodes is therefore not necessarily electrically conductive, so that pure water or oil can be used.

Nach der Hochspannungsbehandlung und der Zugabe entsprechender chemischer Additive wird die Gewebeprobe 16 durch Anlegen eines starken Druckes an die obe re Elektrode 13, eventuell kombiniert mit Rotationsbewegungen zerquetscht. Die obere Elektrode 13 und das Gehäuse 2 mit der unteren Elektrode 3 spielen also die Rolle eines Stempels und einer Matrize. Vorzugsweise weisen die Elektrodenober flächen ein rauhes Profil 17 auf, um die Desintegration des Gewebes effizienter zu machen.After the high-voltage treatment and the addition of appropriate chemical additives, the tissue sample 16 is crushed by applying a strong pressure to the upper electrode 13 , possibly combined with rotational movements. The upper electrode 13 and the housing 2 with the lower electrode 3 thus play the role of a stamp and a die. The electrode surfaces preferably have a rough profile 17 in order to make the disintegration of the tissue more efficient.

Die dabei freigesetzte Flüssigkeit bzw. der sich bildende Brei, der die Nukleinsäuren enthält, steigt in den Spalt 14 zwischen der oberen Elektrode 13 und dem Gehäuse 2 auf und kann durch den Kanal 15 zur weiteren Analyse abgesaugt werden.The liquid thereby released or the slurry that forms, which contains the nucleic acids, rises into the gap 14 between the upper electrode 13 and the housing 2 and can be sucked off through the channel 15 for further analysis.

BezugszeichenlisteReference list

11

Behandlungsraum (wird mit dem zu behandelnden biologischen Material im entsprechenden Medium (Elektrolytlösung) befüllt)
Treatment room (is filled with the biological material to be treated in the appropriate medium (electrolyte solution))

22nd

Gehäuse / Kapsel
Housing / capsule

33rd

Untere Elektrode
Lower electrode

44th

Deckel
cover

55

Mediumüberschuß
Medium surplus

66

Vertiefung / Rinne dafür
Well / groove for it

77

Stecker
plug

88th

Bohrung für Elektrodenanschluß
Hole for electrode connection

99

Kanal im Deckel
Channel in the lid

1010th

Metallfolie auf dem Deckel
Metal foil on the lid

1111

Untere Elektrode aus Metallfolie
Lower electrode made of metal foil

1212th

Hohlraum
cavity

1313

Obere Elektrode
Upper electrode

1414

Spalt
gap

1515

Kanal im Gehäuse
Channel in the housing

1616

Gewebeprobe
Tissue sample

1717th

Flüssigkeit
liquid

Claims

1. Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte,
dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt wer den und
daß vor oder nach dem Anlegen des elektrischen Feldes die Zellen mit Substanzen in Kontakt gebracht werden, die den Zellaufschluß unterstützen.1. Process for disrupting biological cells for the extraction and analysis of the cell contents,
characterized in that the cells are exposed to an electric field and the
that before or after the application of the electric field, the cells are brought into contact with substances that support cell disruption.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das elektrische Feld ein gepulstes Feld mit einer Feldstärke über 5 kV/cm, bevorzugt über 20 kV/cm und mit einer Pulsdauer etwa 0,5 bis 50 Mikrosekunde ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the electric field is a pulsed field with a Field strength above 5 kV / cm, preferably above 20 kV / cm and with a pulse duration approximately Is 0.5 to 50 microseconds.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß etwa 1 bis 100 Feldpulse an die Zellen angelegt wer den.3. The method according to claim 2, characterized in that about 1 to 100 field pulses are applied to the cells the.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen im Gewebeverband oder auf einem Träger, bevorzugt einem Filter, vorliegen.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the cells in the tissue or on a support, preferably a filter.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einem elektrisch leitenden Medium suspendiert werden.5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the cells in an electrically conductive medium be suspended.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium, in dem die Zellen suspendiert sind ei nen spezifischen elektrischen Widerstand von 20 bis 200 Ohm . m aufweist. 6. The method according to claim 5, characterized in that the medium in which the cells are suspended ei specific electrical resistance from 20 to 200 ohms. m has.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Detergenz, eine Nuklease oder eine Protease ist.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the substance is a detergent, a nuclease or a Is protease.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat) ist.8. The method according to claim 7, characterized in that the detergent is SDS (sodium dodecyl sulfate).

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease Proteinase K ist.9. The method according to claim 7, characterized in that the protease is Proteinase K.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Dimethylsulfoxid (DMSO) ist.10. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the substance is dimethyl sulfoxide (DMSO).

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Guanidiumthiocyanat oder -hydrochlorid (GdnSCN oder GdnHCl) ist.11. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the substance guanidium thiocyanate or hydrochloride (GdnSCN or GdnHCl).

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Guanidinium-Verbindung eine Konzentration von über 0,2 M aufweist.12. The method according to claim 11, characterized in that the guanidinium compound has a concentration of over 0.2 M.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium einer Temperatur zwischen 35 und 100°C ausgesetzt wird.13. The method according to any one of claims 5 to 12, characterized in that the medium has a temperature between 35 and Exposed to 100 ° C.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die aufzuschließenden Zellinhalte Nukleinsäuren sind.14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that the cell contents to be digested are nucleic acids are.

15. Vorrichtung zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte, zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein, die in einem Medium suspendierten Zellen, Zell verbände in Form eines Gewebeverbandes oder auf einem Träger aufgebrachte Zellen aufnehmendes Probenvolumen mit zwei flächig ausgebildeten, sich gegen überliegenden Elektroden vorgesehen ist, das durch ein Deckelelement, dessen dem Probenvolumen zugewandte Seite konvex ausgebildet ist, an der Oberseite des Probenvolumens abschließbar ist.15. Device for disrupting biological cells for the extraction and analysis of Cell contents for performing the method according to one of claims 1 to 14 characterized in that one, the cells suspended in a medium, cell dressings in the form of a fabric bandage or applied to a carrier Sample volume containing cells with two flat, opposed overlying electrodes is provided by a cover element whose the sample volume side is convex, on the top of the Sample volume is lockable.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Deckelelement als Elektrode ausgebildet ist.16. The apparatus of claim 15, characterized in that the cover element is designed as an electrode.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Deckelelement gegenüberliegende Elektrode eine dem Probenvolumen zugewandte konkav ausgebildete Seite aufweist.17. The apparatus of claim 16, characterized in that the electrode opposite the cover element has a concave side facing the sample volume.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Deckelement eine Durchgangsöffnung zum Pro benvolumen aufweist und an der dem Probenvolumen zugewandten Seite mit einer elektrisch leitenden Folie überzogen ist.18. The apparatus according to claim 16 or 17, characterized in that the cover element has a through opening to the Pro ben volume and on the side facing the sample volume with a electrically conductive film is coated.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Deckelelement gegenüberliegende untere Elektrode als Folie ausgebildet ist, die das Probenvolumen von einem unter der Folie befindlichen Abflußkanal trennt.19. Device according to one of claims 16 to 18, characterized in that the lower opposite the cover member Electrode is designed as a film that the sample volume from one under the film located drain channel separates.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Deckelelement als Stempel ausgebildet ist, der axial und rotatorisch beweglich innerhalb des Probenvolumens führbar ist.20. Device according to one of claims 15 to 19, characterized in that the cover element is designed as a stamp, the axially and rotatably movable within the sample volume.

21. Vorrichtung nach einem der Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Probenvolumen zugewandten Flächen der Elektroden aufgerauht sind. 21. The device according to claim 20, characterized in that the areas of the sample volume facing the Electrodes are roughened.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden etwa 1 bis 5 mm voneinander beab standet sind.22. The device according to one of claims 15 to 21, characterized in that the electrodes are spaced approximately 1 to 5 mm apart stands.