DE19726012C1 - Cyclic peptide or cyclic depsipeptide production - Google Patents

Cyclic peptide or cyclic depsipeptide production

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Abstract

Production of cyclopeptides or cyclodepsipeptides in an enzyme reactor is effected in a system comprising an aqueous reaction mixture separated by a semipermeable membrane from an organic solvent serving as an extractant for the product. The reaction mixture comprises a peptide synthetase, aminoacids and optionally hydroxy acids, an energy source, divalent cations, a protective colloid and optionally a buffer. The reaction mixture is periodically regenerated in an aqueous buffer system (i.e. the membrane holding the reaction mixture is periodically removed and contacted with a dialysis buffer containing EDTA and a thiol) and the organic solvent is continuously replaced.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von Cyclopeptiden (Polypeptide, deren Aminosäuresequenzen zum Ring oder zu mehreren Ringen geschlossen sind) und Cyclodepsipeptiden (Verbindungen, die aus ester- und amidartig miteinander verknüpften α-Hydroxy- und α-Aminosäuren bestehen) mittels enzymatischer Synthese in einem Enzymreaktor.The invention relates to a new process for the continuous production of Cyclopeptides (polypeptides, their amino acid sequences to the ring or to several rings are closed) and cyclodepsipeptides (compounds that from ester and amide-like linked α-hydroxy and α-amino acids exist) by means of enzymatic synthesis in an enzyme reactor.

Cyclopeptide, wie z. B. die Enniatine (Struktur in Abb. 1), das Beauvericin (Struktur in Abb. 1), das Cyclosporin A (Struktur in Abb. 2) oder ähnliche Peptidstrukturen werden von spezifischen natürlichen oder künstlich verbesserten Mikroorganismen prokaryotischen oder eukaryotischen Ursprunges synthetisiert.Cyclopeptides, such as. B. Enniatins (structure in Fig. 1), beauvericin (structure in Fig. 1), cyclosporin A (structure in Fig. 2) or similar peptide structures are synthesized by specific natural or artificially improved microorganisms of prokaryotic or eukaryotic origin.

Ihre Synthese erfolgt enzymkatalysiert durch Peptidsynthetasen, deren Aufbau und katalytische Eigenschaften über Art und Reihenfolge der zu verknüpfenden Amino­ säuren entscheidet. Das Studium des Reaktionsmechanismus von aus entsprechen­ den Organismen isolierten Peptidsynthetasen (Übersicht z. B. in 1) hat ergeben:
Their synthesis is enzyme-catalyzed by peptide synthetases, the structure and catalytic properties of which determine the type and sequence of the amino acids to be linked. The study of the reaction mechanism of peptide synthetases isolated from corresponding organisms (overview, e.g. in FIG. 1) has shown:

  • 1. Die Gesamtsynthese der vorgenannten Cyclopeptide ist außerhalb des Organismus (in vitro) möglich.1. The overall synthesis of the aforementioned cyclopeptides is outside of Organism (in vitro) possible.
  • 2. Die Spezifität für einzelne Bausteine kann variabel sein, d. h., daß anstelle des natürlichen Bausteines andere natürliche oder synthetisch hergestellte Bausteine eingebaut werden können.2. The specificity for individual components can be variable, i. that is, instead of natural building block other natural or synthetically manufactured building blocks can be installed.

Solche Synthetasen wurden bereits zur in vitro-Herstellung von Cyclopeptiden be­ nutzt, z. B.:
Such synthetases have already been used for the in vitro production of cyclopeptides, e.g. B .:

  • - Enniatin mit im Reaktionsansatz gelöster Peptidsynthetase (2, 3),- Enniatin with peptide synthetase (2, 3) dissolved in the reaction mixture,
  • - Synthese von Enniatin mit immobilisiertem Enzym (4, 5),- synthesis of enniatin with immobilized enzyme (4, 5),
  • - Synthese von Cyclosporin A mit im Reaktionsansatz gelöstem Enzym (6-9).- Synthesis of cyclosporin A with enzyme (6-9) dissolved in the reaction mixture.

Milchsäure-haltige cyclische Depsipeptide mit 18 Ringatomen und Verfahren zu ihrer Herstellung sind im EP 0 669 343 A1 beschrieben.Lactic acid-containing cyclic depsipeptides with 18 ring atoms and process for their Production is described in EP 0 669 343 A1.

Es stehen aber einer rationellen technischen Anwendung der Nutzung von isolierten Peptidsynthetasen zur in vitro-Herstellung von Cyclopeptiden eine Reihe von Problemen im Wege:However, there is a rational technical application of the use of isolated A series of peptide synthetases for the in vitro production of cyclopeptides Problems in the way:

  • 1. Es sind labile Enzyme mit Halbwertszeiten im Stundenbereich, wodurch nur kurze Operationszeiten ermöglicht werden.1. They are labile enzymes with half-lives in the hour range, which means only short ones Operation times are made possible.
  • 2. Eine Immobilisierung zur Verbesserung der technischen Eigenschaften ist immer mit einem starken Aktivitätsverlust verbunden.2. Immobilization to improve the technical properties is always associated with a severe loss of activity.
  • 3. Bei einem Batch-Verfahren liegt die Grenze der Leistungsfähigkeit bei ng-µg- Mengen Produkt pro mg eingesetztes Enzym.3. In a batch process, the limit of performance is ng-µg- Amounts of product per mg of enzyme used.

Deshalb bestand die Aufgabe, ein technisch nutzbares Verfahren zur enzymati­ schen Herstellung von Cyclopeptiden und Cyclodepsipeptiden zu entwickeln, das diese Nachteile vermeidet.Therefore, there was the task of a technically usable method for enzymati development of cyclopeptides and cyclodepsipeptides, the avoids these disadvantages.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Peptidsynthetasen in Gegenwart organi­ scher Lösungsmittel stabil sind und daß sich die Operationsstabilität solcher Enzyme drastisch erhöht, wenn der sich in einer semipermeablen Membran befindliche wäßrige Reaktionsansatz von einem geeigneten organischen Lösungsmittel um­ geben und in definierten Zeiten durch Dialyse in einem geeigneten wäßrigen Puffer­ system regeneriert wird.According to the invention it was found that peptide synthetases in the presence of organi shear solvents are stable and that the operational stability of such enzymes drastically increased when the one in a semipermeable membrane aqueous reaction mixture of a suitable organic solvent give and at defined times by dialysis in a suitable aqueous buffer system is regenerated.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Cyclopeptiden und Cyclo­ depsipeptiden durch enzymatische Synthese in einem Enzymreaktor besteht darin, daß ein wäßriger Reaktionsansatz verwendet wird, der Peptidsynthetase und Aminosäuren, als Bausteine des End­ produkts sowie eine Energiequelle, insbesondere Adenosin-5'-triphosphat (ATP), in Verbindung mit zweiwertigen Kationen, ein Schutzkolloid und ggfs. eine Puffersubstanz gelöst enthält, und der über eine semipermeable Membran von einem organischen Lösungsmittel getrennt ist, das als Extraktionsmittel für die Cyclopeptide bzw. Cyclodepsipeptide dient, wobei sowohl der Reaktionsansatz regelmäßig in einem wäßrigen Puffersystem regeneriert als auch das Lösungsmittel kontinuierlich gewechselt werden.The process according to the invention for the preparation of cyclopeptides and cyclo depsipeptides by enzymatic synthesis in an enzyme reactor consists of that an aqueous reaction mixture is used, the peptide synthetase and Amino acids, as building blocks of the end product and an energy source, in particular adenosine 5'-triphosphate (ATP), in connection with divalent cations, a protective colloid and possibly a Contains dissolved buffer substance, and of a semipermeable membrane  an organic solvent is separated, which as an extractant for the Cyclopeptides or cyclodepsipeptides is used, both the reaction approach regularly regenerated in an aqueous buffer system as well as the solvent be changed continuously.

Die Verfahrensweise sieht
The procedure looks like

  • - die Extraktion der im wäßrigen Ansatz durch enzymatische Katalyse entstandenen hydrophoben Peptide durch ein geeignetes organisches Lösungsmittel,- The extraction of those created in the aqueous batch by enzymatic catalysis hydrophobic peptides with a suitable organic solvent,
  • - den kontinuierlichen Ersatz des mit Cyclopeptid bzw. Cyclodepsipeptid ange­ reicherten Lösungsmittels und damit eine kontinuierliche Produktabführung und- The continuous replacement of the cyclopeptide or cyclodepsipeptide enriched solvent and thus a continuous product removal and
  • - eine Regeneration des Reaktionsansatzes durch Dialyse in einem wäßrigen Puffersystem vor.- A regeneration of the reaction mixture by dialysis in an aqueous Buffer system before.

Das Verfahren eignet sich besonders zur In-vitro-Herstellung von Cyclopeptiden und Cyclodepsipeptiden. Die Herstellung kann kontinuierlich durchgeführt werden.The method is particularly suitable for the in vitro production of cyclopeptides and Cyclodepsipeptides. The production can be carried out continuously.

Die Wahl der geeigneten Synthesekomponenten ergibt sich aus dem gewünschten Endprodukt. Es sind vor allem die jeweiligen Aminosäuren, aber auch Hydroxy­ säuren, die als Bausteine dienen.The choice of suitable synthetic components results from the desired one End product. It is primarily the respective amino acids, but also hydroxy acids that serve as building blocks.

Als Energiequelle wird vorzugsweise Adenosin-5'-triphosphat (ATP) in Verbindung mit einem zweiwertigen Kation verwendet. Hierfür kommen insbesondere Mg++ und Mn++ in Frage.Adenosine 5'-triphosphate (ATP) in connection with a divalent cation is preferably used as the energy source. Mg ++ and Mn ++ are particularly suitable for this.

Die Regeneration des Reaktionssystems erfolgt in einem wäßrigen Puffersystem. Bei einem pH-Wert von 8,0 sind dafür
(50 mM) Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris),
1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA),
5 mM Thiolschutzreagenz wie Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT) und 20% Glycerin geeignet. The reaction system is regenerated in an aqueous buffer system. At pH 8.0 are in favor of it
(50 mM) tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris),
1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA),
5 mM thiol protection reagent such as mercaptoethanol or dithiothreitol (DTT) and 20% glycerin are suitable.

Die Konzentration der Synthesekomponenten wird wie bei solchen Reaktionen üblich - insbesondere im millimolaren Bereich - gewählt. Im Falle der Enniatin­ synthese können die Endkonzentrationen beispielsweise bei ca. 5-10 mM liegen.The concentration of the synthesis components becomes like in such reactions usual - especially in the millimolar range - selected. In the case of the Enniatin synthesis, the final concentrations can be around 5-10 mM, for example.

Zur Herstellung von Cyclodepsipeptiden mit 18 Ringatomen (Enniatine oder Beauvericin) wird als Peptidsynthetase ein Enzympräparat aus Fusarium oder ein gleichwirkendes Präparat verwendet. Unter gleichwirkendes Präparat wird ein Enzympräparat aus anderen Organismen oder gentechnisch hergestellten Enzymen verstanden. Als Synthesekomponenten dienen dafür D-Hydroxy-isovaleriansäure (Dhiv) und L-Valin in Gegenwart von Adenosin-5'-triphosphat (ATP) und einem Magnesiumsalz.For the production of cyclodepsipeptides with 18 ring atoms (Enniatine or Beauvericin) is used as a peptide synthetase, an enzyme preparation from Fusarium or a equivalent preparation used. Under equivalent drug is a Enzyme preparation from other organisms or genetically engineered enzymes Understood. D-hydroxy-isovaleric acid serves as synthesis components for this (Dhiv) and L-valine in the presence of adenosine 5'-triphosphate (ATP) and one Magnesium salt.

Zur Synthese von Cyclosporinen und verwandten Peptiden wird als Peptidsynthe­ tase ein Enzympräparat aus Beauveria oder ein gleichwirkendes Präparat einge­ setzt. Unter gleichwirkendes Präparat wird ein Enzympräparat aus anderen Organismen oder gentechnisch hergestellten Enzymen verstanden.The synthesis of cyclosporins and related peptides is called peptide synthesis tase an enzyme preparation from Beauveria or a preparation with the same effect puts. An enzyme preparation is made from others under the same effect preparation Understand organisms or genetically engineered enzymes.

Unter gleichwirksamen Präparaten sind insbesondere auch gentechnisch veränderte oder neu zusammengesetzte (recombinante) Proteine zu verstehen, die wie die natürlichen Enzympräparate selbst wirken.Genetically modified medicinal products are particularly effective or to understand newly composed (recombinant) proteins that like that natural enzyme preparations work themselves.

Die Dialyse- oder semipermeable Membran ist für die Reaktionsprodukte durch­ lässig, nicht jedoch für das Enzym. Vorzugsweise besteht sie aus Cellulose-Ester.The dialysis or semipermeable membrane is through for the reaction products casual, but not for the enzyme. It preferably consists of cellulose ester.

Die Dialysemembran ist von einem geeigneten organischen Lösungsmittel umgeben. In Frage kommen alle Lösungsmittel, in denen sich die Produkte lösen, beispiels­ weise The dialysis membrane is surrounded by a suitable organic solvent. All solvents in which the products dissolve, for example wise  

  • - Alkane oder Cycloalkane einer Kettenlänge von C5-C10,Alkanes or cycloalkanes with a chain length of C 5 -C 10 ,
  • - Alkan-Derivate wie Alkohole, Halogenalkane (z. B. Tetrachlormethan),- alkane derivatives such as alcohols, haloalkanes (e.g. carbon tetrachloride),
  • - Ketone, z. B. Diisobutylketon,
    Aromatische Kohlenwasserstoffe und deren Derivate, z. B. Benzol, Toluol, Mesitylen,    - ketones, e.g. B. diisobutyl ketone,
    Aromatic hydrocarbons and their derivatives, e.g. B. benzene, toluene, mesitylene,
  • - Ether, z. B. Diisopropylether,- ether, e.g. B. diisopropyl ether,
  • - Ester, z. B. Dibutylphthalat, Hexylacetat,
    vorzugsweise wird als organisches Lösungsmittel Heptan verwendet.    - esters, e.g. B. dibutyl phthalate, hexyl acetate,
    heptane is preferably used as the organic solvent.

Das vorliegende Verfahren erlaubt den halbkontinuierlichen oder kontinuierlichen Einsatz von Peptidsynthetasen zur Herstellung von Cyclopeptiden.The present method allows the semi-continuous or continuous Use of peptide synthetases for the production of cyclopeptides.

Vorteile sind eine wesentliche Erhöhung der Operationszeit (mindestens Wochen) und der erzielbaren Ausbeuten (mg-g Produkt pro mg eingesetztes Enzym).Advantages are a significant increase in the operating time (at least weeks) and the achievable yields (mg-g product per mg enzyme used).

Entsprechende Versuchsanordnungen sind leicht zu realisieren. Eine beispielhafte Anordnung ist in Abb. 3 dargestellt. Darin bedeuten:Appropriate test arrangements are easy to implement. An exemplary arrangement is shown in Fig. 3. Where:

  • 1. 1 Dialyse-Membran (mit Enzym und Substraten)1. 1 dialysis membrane (with enzyme and substrates)
  • 2. 2 Soxhlet-Aufsatz2. 2 Soxhlet attachment
  • 3. 3 Dimroth-Kühler3. 3 Dimroth coolers
  • 4. 4 zur Vakuum-Pumpe4. 4 to the vacuum pump
  • 5. 5 Thermometer5. 5 thermometers
  • 6. 6 Siedekapillare (zur Probenentnahme)6. 6 boiling capillaries (for sampling)
  • 7. 7 Dreihalsrundkolben mit Lösungsmittel7. 7 three-necked round bottom flask with solvent
  • 8. 8 Heizbad8. 8 heating bath

In der Abb. 1 bedeuten:
Enniatin A R1 = R2 = R3 = secButyl
Enniatin A1 R1 = iPropyl; R2 = R3 = secButyl
Enniatin B R1 = R2 = R3 = iPropyl
Enniatin B1 R1 = R2 = iPropyl; R3 = secButyl
Beauvericin R1 = R2 = R3 = BenzylIn Fig. 1 mean:
Enniatin AR 1 = R 2 = R 3 = sec butyl
Enniatin A 1 R 1 = i propyl; R 2 = R 3 = sec butyl
Enniatin BR 1 = R 2 = R 3 = i Propyl
Enniatin B 1 R 1 = R 2 = i propyl; R 3 = sec butyl
Beauvericin R 1 = R 2 = R 3 = benzyl

In der Abb. 2 bedeuten:
Bmt = 4-(E)-Butenyl-4-Methyl-L-Threonin
Abu = α-Aminobuttersäure In Fig. 2 mean:
Bmt = 4- (E) -butenyl-4-methyl-L-threonine
Abu = α-aminobutyric acid

Beispiel 1example 1 Herstellung von Enniatin B im EnzymreaktorProduction of Enniatin B in the enzyme reactor

Aus einer Submerskultur von Fusarium scirpi oder einem anderen Enniatin produzierenden Fusarium-Stamm wird Enniatinsynthetase (Esyn) nach den bereits beschriebenen Methoden isoliert und gereinigt (Zocher et. al. 1982).From a submerged culture of Fusarium scirpi or another Enniatin producing Fusarium strain is Enniatinsynthetase (Esyn) according to the already described methods isolated and cleaned (Zocher et. al. 1982).

In der in Abb. 3 gezeigten Apparatur werden 1000 µl ESyn-Lösung mit 200 µl Mix in wäßriger Lösung, hergestellt aus 60 µl D-Hydroxy-isovaleriansäure (D-Hiv) (0,1 M), 60 µl L-Valin (L-Val) (0,1 M), 60 µl Adenosin-5'-Triphosphat (ATP) (0,1 M) und 20 µl Mg2+ (1 M) und 50 µl S-Adenosyl-L-methionin (SAM) gemischt. Letztere Substanz dient als Methylgruppen-Donor in der enzymatischen Synthese. Als Schutzkolloid werden 60 µl Lösung von Rinderserum-Albumin (100 g/l) zugesetzt. Die Dauer der Inkubation beträgt 3 bis 6 Stunden.In the apparatus shown in Fig. 3, 1000 µl ESyn solution with 200 µl mix in aqueous solution, made from 60 µl D-hydroxy-isovaleric acid (D-Hiv) (0.1 M), 60 µl L-valine (L -Val) (0.1 M), 60 µl adenosine 5'-triphosphate (ATP) (0.1 M) and 20 µl Mg 2+ (1 M) and 50 µl S-adenosyl-L-methionine (SAM) mixed. The latter substance serves as a methyl group donor in enzymatic synthesis. 60 µl of bovine serum albumin solution (100 g / l) are added as a protective colloid. The incubation period is 3 to 6 hours.

Danach überführt man die Dialysemembran mit dem Enzym in ein Glasgefäß mit Dialysepuffer, worin sie 3 bis 6 Stunden verbleibt. Es wird wechselweise mit zwei Enzymportionen gearbeitet, damit die Reaktion ständig in Betrieb gehalten werden kann. Zur Regulation der Temperatur auf ca. 25°C (Temperaturoptimum des Enzyms), muß der Unterdruck in der Anlage entsprechend eingestellt werden. Es ergaben sich dadurch folgende Verhältnisse:
p = 120-150 mbar
ϑ = ca. 25°C (Heizbad ca. 60°C)The dialysis membrane with the enzyme is then transferred into a glass vessel with dialysis buffer, in which it remains for 3 to 6 hours. Two enzyme portions are used alternately so that the reaction can be kept in operation. To regulate the temperature to approx. 25 ° C (optimum temperature of the enzyme), the vacuum in the system must be set accordingly. This resulted in the following relationships:
p = 120-150 mbar
ϑ = approx. 25 ° C (heating bath approx. 60 ° C)

Die Ausbeute an Enniatin pro mg eingesetztem reinen Enzym beträgt unter den genannten Reaktionsbedingungen 50 bis 100 µm Enniatin B pro Stunde; sie ist abhängig von der spezifischen Aktivität der Enzympräparation. The yield of enniatin per mg of pure enzyme used is below that mentioned reaction conditions 50 to 100 µm Enniatin B per hour; she is depending on the specific activity of the enzyme preparation.  

Beispiel 2Example 2 Herstellung von radioaktiv (14C) markiertem Enniatin im EnzymreaktorProduction of radioactively ( 14 C) labeled eniatin in the enzyme reactor

In der in Beispiel 1 beschriebenen Weise wird Enniatinsynthetase im Dialysesack mit α-D-Hydroxy-isovaleriansäure (5 mM) und L-Valin (5 mM) unter Zusatz von Adenosin-5'-triphosphat (ATP) und S-Adenosylmethionin (5 mM) inkubiert. Dabei wird eine der Komponenten in radioaktiv markierter Form angeboten, z. B. 14C-Valin oder 14C-S-Adenosyl-L-Methionin (SAM).In the manner described in Example 1, Enniatinsynthetase in the dialysis bag with α-D-hydroxy-isovaleric acid (5 mM) and L-valine (5 mM) with the addition of adenosine-5'-triphosphate (ATP) and S-adenosylmethionine (5 mM ) incubated. One of the components is offered in a radioactive form, e.g. B. 14 C-valine or 14 CS-adenosyl-L-methionine (SAM).

Das so hergestellte 14C-markierte Enniatin wird durch Szintillation bzw. Dünnschicht­ chromatographie nachgewiesen. Die erzielbaren spezifischen Aktivitäten entspre­ chen der spezifischen Aktivität der eingesetzten Synthesebausteine.The 14 C-labeled enniatin thus produced is detected by scintillation or thin layer chromatography. The specific activities that can be achieved correspond to the specific activity of the synthetic building blocks used.

Beispiel 3Example 3 Herstellung von radioaktiv (14C-) markiertem Cyclosporin im EnzymreaktorProduction of radioactive ( 14 C-) labeled cyclosporin in the enzyme reactor

Die zur Cyclosporinsynthese benötigten Substrate werden gemischt und in den Dialysesack gegeben. Diese sind L-Aminobuttersäure, Glycin, L-Leucin, L-Valin, D- Alanin, L-Alanin, C9-Säure (MeBmt), Adenosin-5'-triphosphat (ATP), MgCl2 und 14C-Methyl-markiertes S-Adenosyl-L-methionin.The substrates required for cyclosporin synthesis are mixed and placed in the dialysis bag. These are L-aminobutyric acid, glycine, L-leucine, L-valine, D-alanine, L-alanine, C 9 acid (MeBmt), adenosine 5'-triphosphate (ATP), MgCl 2 and 14 C-methyl labeled S-adenosyl-L-methionine.

Das so hergestellte 14C-markierte Cyclosporin wird durch Szintillation bzw. Dünn­ schichtchromatographie nachgewiesen. Die erzielbaren spezifischen Aktivitäten entsprechen der spezifischen Aktivität der eingesetzten Synthesebausteine.The 14 C-labeled cyclosporin thus produced is detected by scintillation or thin layer chromatography. The specific activities that can be achieved correspond to the specific activity of the synthetic building blocks used.

LiteraturnachweisBibliography

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9. Lawen, A., Traber, R. (1993) Substrate specificities of cyclosporine synthetase and peptolide synthetase. J. Biol. Chem. 268, 20452-20465.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von Cyclopeptiden und Cyclodepsipeptiden durch enzymatische Synthese in einem Enzymreaktor, dadurch gekennzeichnet, daß ein wäßriger Reaktionsansatz verwendet wird, der Peptidsynthetase und Aminosäuren als Bausteine des Endprodukts sowie eine Energiequelle in Verbindung mit zweiwertigen Kationen, ein Schutzkolloid und gegebenenfalls eine Puffersubstanz gelöst enthält, und der über eine semipermeable Membran von einem organischen Lösungsmittel getrennt ist, das als Extraktionsmittel für die Cyclopeptide beziehungsweise Cyclodepsipeptide dient, wobei sowohl der Reaktionsansatz regelmäßig in einem wäßrigen Puffersystem regeneriert als auch das Lösungsmittel kontinuierlich gewechselt werden.1. A process for the preparation of cyclopeptides and cyclodepsipeptides by enzymatic synthesis in an enzyme reactor, characterized in that an aqueous reaction mixture is used, the peptide synthetase and amino acids as building blocks of the end product and an energy source in connection with divalent cations, a protective colloid and optionally a buffer substance contains and which is separated via a semipermeable membrane from an organic solvent which serves as an extractant for the cyclopeptides or cyclodepsipeptides, both the reaction mixture being regularly regenerated in an aqueous buffer system and the solvent being changed continuously. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptidsynthetase ein Enzympräparat aus Fusarium oder ein Enzympräparat aus anderen Organis­ men oder gentechnisch hergestellten Enzymen zur Herstellung von Cyclodepsipeptiden mit 18 Ringatomen (Enniatine oder Beauvericin) verwendet wird.2. The method according to claim 1, characterized in that as peptide synthetase an enzyme preparation from Fusarium or an enzyme preparation from another organ or genetically engineered enzymes for the production of Cyclodepsipeptides with 18 ring atoms (Enniatine or Beauvericin) is used. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Synthese­ komponenten D-Hydroxy-isovaleriansäure (DHiv) und L-Valin sowie Adenosin- 5'-triphosphat (ATP) und ein Magnesiumsalz verwendet werden.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that as a synthesis components D-hydroxy-isovaleric acid (DHiv) and L-valine and adenosine 5'-triphosphate (ATP) and a magnesium salt can be used. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptidsynthetase ein Enzympräparat aus Beauveria oder ein Enzympräparat aus anderen Organis­ men oder gentechnisch hergestellten Enzymen zur Synthese von Cyclosporinen und verwandten Peptiden verwendet wird.4. The method according to claim 1, characterized in that as peptide synthetase an enzyme preparation from Beauveria or an enzyme preparation from another organ or genetically engineered enzymes for the synthesis of cyclosporins and related peptides is used. 5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die semipermeable Membran aus Cellulose-Ester besteht.5. The method according to one or more of claims 1 to 4, characterized records that the semipermeable membrane consists of cellulose ester. 6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Heptan eingesetzt wird.6. The method according to one or more of claims 1 to 5, characterized records that heptane is used as the organic solvent.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Chemical Abstr. Vol. 123, Nr. 7948 *

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