DE19725766B4 - Formulation for the preparation of test systems and preparation of the formulation - Google Patents

Abstract

Formulierung zur Herstellung von biologischen, insbesondere immunologischen, chemischen oder enzymatischen Testsystemen, bestehend aus
– einer Polymergrundmasse und
– einer reaktive funktionelle Gruppen tragenden Verbindung,
welche miteinander homogen vermischt und nicht chemisch vernetzt sind, wobei die Formulierung im festen Zustand an der Oberfläche die reaktiven fiunktionellen Gruppen der in die Polymergrundmasse eingemischten Verbindung trägt, und wobei die reaktiven Gruppen eine spezifische kovalente Anbindung von Molekülen ermöglichen.Formulation for the production of biological, in particular immunological, chemical or enzymatic test systems, consisting of
- a polymer matrix and
A reactive functional group-bearing compound,
which are homogeneously mixed and non-chemically crosslinked, wherein the solid state formulation bears on the surface the reactive fictitious groups of the compound blended into the polymer matrix, and wherein the reactive groups permit specific covalent attachment of molecules.

Description

Die Erfindung betrifft Formulierungen, μg bei denen in eine Polymergrundmasse reaktive funktionelle Gruppen tragende Verbindungen eingelagert sind, und deren Verwendung in biologischen, insbesondere immunologischen, enzymatischen und chemischen Testsystemen, sowie Verfahren zu deren Herstellung.The The invention relates to formulations, micrograms in which in a polymer matrix embedded reactive compounds bearing functional groups and their use in biological, in particular immunological, enzymatic and chemical test systems, and methods for their Production.

Immunologische Testsysteme sind aus der modernen Analytik und Forschung, sei es Medizin, Umweltanalytik, Biologie oder Gentechnik, nicht mehr wegzudenken. Die Tests werden in der Regel als Festphasenassays durchgeführt, wobei eine der am Test beteiligten Reaktanden (z. B. Antigen, Antikörper, deren Konjugate oder Substanzen, die mit ihnen reagieren) an eine feste Matrix gebunden werden. Die Festphasen sind Formkörper aus polymeren Verbindungen in Form von beispielsweise Beads (Kügelchen), Immunoröhrchen, Sticks oder Mikrotiterplatten. Polymere Verbindungen können dabei aus fossilen Rohstoffen wie das am häufigsten verwendete Plastikmaterial Polystyrol oder aus nachwachsenden Rohstoffen wie Polyhydroxybuttersäure, Polylaktid (Racemat bzw. L-Form), modifizierte Stärke, modifizierte Zellulose stammen.immunological Test systems are from modern analytics and research, be it Medicine, environmental analysis, biology or genetic engineering have become indispensable. The tests are usually performed as solid phase assays, wherein one of the reactants involved in the test (eg antigen, antibodies, their Conjugates or substances that react with them) to a solid Be bound matrix. The solid phases are shaped bodies polymeric compounds in the form of, for example, beads, Immunotubes, sticks or microtiter plates. Polymer compounds can be made from fossil raw materials like that most often used plastic material polystyrene or from renewable raw materials like polyhydroxybutyric acid, Polylactide (racemate or L-form), modified starch, modified Cellulose come.

Bei der Durchführung der immunologischen Testsysteme wird ein Reaktionspartner an die Oberfläche der Formkörper nach an sich bekannten Verfahren gebunden. Die Bindung ist in der Regel adhäsiv, wobei statistisch gesehen unterschiedliche Molekülteile des Reaktanden gebunden werden können, da die adhäsive Bindung nicht spezifisch ist. Für eine adhäsive Bindung eignen sich in der Regel nur Moleküle, die ein grösseres Molekulargewicht als 2000 besitzen. Kleinere Moleküle werden nicht oder nicht reproduzierbar fixiert. Gerade in der Umweltanalytik, Medizin oder Gentechnik ist es jedoch wichtig, Haptene oder Peptide (z. B. mit einer üblichen Sequenz von 10–15 Aminosäuren) an die Formkörper zu binden und spezifische, quantitative Testsysteme zu entwickeln.at the implementation the immunological test systems becomes a reaction partner to the Surface of the moldings bound according to known methods. The binding is in the Usually adhesive, where statistically different molecular moieties of the reactant bound can be because the adhesive bond is not specific. For an adhesive Binding are usually only molecules that have a larger molecular weight as 2000 own. Smaller molecules will not or will not fixed reproducibly. Especially in environmental analysis, medicine or However, genetic engineering it is important haptens or peptides (eg with a usual one Sequence of 10-15 Amino acids) to the moldings bind and develop specific, quantitative test systems.

Es gibt in neuerer Zeit in Handel auch Festkörper in Form von Mikrotiterplatten, deren Oberfläche so modifziert wurde, dass sie Aminogruppen enthält, die Carboxygruppen eines anderen Moleküls durch Ausbildung einer Säureamidbindung kovalent binden können. Diese Platten besitzen jedoch im Vergleich zu nicht modifizierten Mikrotiterplatten den Nachteil, dass ihre Haltbarkeit geringer ist und sie so für die Produktion von fertigen Test-kits, deren Haltbarkeit ein Jahr betragen soll, oft nicht geeignet sind. Zudem sind sie für Standardisierungen von Haptenen, die meist nur ein Molekulargewicht von 200–400 besitzen, wenig geeignet, da die Standardkurven zu flach sind und so eine quantitative Auswertung erschwert ist. Formkörper mit aktivierten Oberflächen, die mit anderen funktionellen Gruppen als Carboxyfunktionen reagieren können, gibt es derzeit mit ausreichender Qualität nicht.It in the recent past also trade in solids in the form of microtiter plates, their surface was modified so that it contains amino groups, the carboxy groups of a other molecule by forming an acid amide bond covalently bind. However, these plates have compared to unmodified Microtiter plates have the disadvantage that their durability is lower and her like that the production of finished test kits whose durability is one year should be, are often not suitable. In addition, they are for standardization of haptens, which usually have only a molecular weight of 200-400, Little suitable, because the standard curves are too shallow and so on quantitative evaluation is difficult. Moldings with activated surfaces, the react with functional groups other than carboxy functions can, There is currently not enough quality.

In Patent DE 195 29 250 C1 wird die Kopplung von niedermolekuaren Substanzen an Polyaminosäuren als Trägermaterial für die Herstellung von Antikörpern beschrieben. Patent EP 363 921 A2 betrifft synthetische Carrier-Partikel, wobei zwei Polymere miteinander chemisch guervernetzt werden.In patent DE 195 29 250 C1 the coupling of low molecular weight substances to polyamino acids as a carrier material for the production of antibodies is described. patent EP 363 921 A2 relates to synthetic carrier particles where two polymers are chemically crosslinked with each other.

In „Biomaterials Science", 1996, ISBN 0-12-582460-2 werden Methoden dargestellt, bei denen Makromoleküle durch aktivierte adhäsive Bindungskapazitäten Biomoleküle an die Oberfläche binden.In "Biomaterials Science ", 1996, ISBN 0-12-582460-2 presents methods in which macromolecules pass through activated adhesives binding capacities biomolecules to the surface tie.

Nachteilig ist bisher nicht bekannt, dass durch die Vermischung von reaktiven funktionellen Gruppen tragenden Verbindungen mit einer Polymergrundmasse sich die reaktiven Gruppen an der Oberfläche der festen Phase befinden und somit die Möglichkeit geben, Moleküle auch mit niedrigem Molekulargewicht spezifisch kovalent an die Oberfläche zu koppeln.adversely is not yet known that by the mixing of reactive functional group-bearing compounds with a polymer matrix the reactive groups are on the surface of the solid phase and thus the possibility give, molecules specifically with low molecular weight specifically to couple covalently to the surface.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Farmulierungen von Polymeren für die Formkörper, die für immunologische Tests eingesetzt werden, zu finden, die es ermöglichen, auch niedermolekulare Substanzen definiert kovalent an die Matrix zu binden, wobei eine für Test-kits ausreichende Haltbarkeit des Materials erreicht wird. Dabei soll es möglich sein, durch unterschiedliche Einlagerungen in die Polymerformulierungen verschiedene funktionelle Gruppen kovalent an die Matrix zu binden. Dabei soll vor allem für Test-kits eine erhöhte Haltbarkeit und Lagerbeständigkeit erreicht werden. Zusätzlich sollen erfindungsgemäß Matrix-Effekte minimiert und die Spezifität der Bindung erhöht werden.Of the The invention is therefore based on the object, Farmulierungen of polymers for the Shaped body, the for immunological Tests are used to find that allow even low molecular weight Substances defined covalently bind to the matrix, with a for test kits sufficient durability of the material is achieved. It should it possible be, by different inclusions in the polymer formulations covalently attach different functional groups to the matrix. It should especially for Test kits increased Durability and shelf life be achieved. additionally should be minimized according to the invention matrix effects and the specificity the bond increases become.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass in die Polymerstruktur der Formkörper, sei es auf Basis fossiler oder nachwachsender Rohstoffe, Moleküle eingelagert werden können, die definierte funktionelle Gruppen in Form von Oligo- oder Polylieferanten dieser Gruppen enthalten, an die verschiedene Moleküle gebunden werden können. Auch eine Einlagerung von langkettigen Fettsäuren mit geeigneten funktionellen Gruppen, über die ebenfalls kovalente Bindungen zu anderen Molekülen hergestellt werden können, ist möglich. Als funktionelle Gruppen dienen dabei insbesondere Amino-, Carboxy- oder SH-Gruppen. Durch die Einlagerung von Lieferanten dieser funktionellen Gruppen in die Matrix der für immunologische Testsysteme verwendeten Formkörper ist es möglich, definiert Substanzen kovalent zu binden. Das Molekulargewicht der Verbindungen kann zwischen 100 und 200 000 liegen.Surprisingly, it has now been found that molecules can be incorporated into the polymer structure of the molded articles, whether based on fossil or renewable raw materials, the defined funktionel contain groups in the form of oligo- or poly-suppliers of these groups, to which different molecules can be bound. It is also possible to store long-chain fatty acids with suitable functional groups, via which covalent bonds to other molecules can likewise be produced. In particular, amino, carboxy or SH groups serve as functional groups. By incorporating suppliers of these functional groups into the matrix of the moldings used for immunological test systems, it is possible to covalently bind substances. The molecular weight of the compounds may be between 100 and 200,000.

Die Träger der funktionellen Gruppen werden dabei nach Bedart so gewählt, dass nach Möglichkeit nur eine Art von funktionellen Gruppen für die Kopplung des Reaktanden zur Verfügung steht. Dies gewährleistet, dass ganz definiert über eins Stelle der am Testsystem beteiligten Substanz gebunden wird.The carrier The functional groups are chosen according to Bedart so that if possible only a type of functional group for the coupling of the reactant to disposal stands. This ensures that completely defined over one site of the substance involved in the test system is bound.

Bevorzugt eignen sich dafür Polyaminosäuren, bei denen eine freie funktionelle Gruppe für eine kovalente Bindung an einen Reaktanden zur Verfügung steht.Prefers are suitable for it polyaminoacids, where a free functional group for a covalent bond to a reactant available stands.

Soll ein Molekül über eine Carboxygruppe an die Formkörper gebunden werden, wird in dessen Matrix ein Polyaminogruppenlieferant eingelagert. Dies kann z. B. Oligo- bzw. Polylysin oder bei Einsatz eine Fettsäurederivats Laurylamin sein. Nach an sich bekannten Verfahren koppelt man mit Carbodiimid über eine Säureamidbindung die COOH-Gruppe des Reaktanden an die Aminogruppen des Polylysins. Analog dazu kann man durch Einlagerung von Garboxygruppenlieferanten Reaktanden mit ihrer Aminogruppe kovalent binden. Als Lieferant von Carboxygruppen kann beispielsweise das Oliga- bzw. Polymermolekül der Glutaminsäure oder Asparaginsäure dienen. Bei Einsatz von PHB oder PLA als Polmermatrix kann es dabei durch die Auswirkung eines Mesomerieeffekts zwischen den Carboxygruppen und den Esterbindungen der Polymere zu einer Beeinträchtigung der Reaktivität kommen, so dass die Ausbildung der Säureamidbindung mit dem Reaktanden erschwert ist. Durch Verwendung von Carboxygruppen liefernden Verbindungen mit einem aromatischen Grundgerüst kann dieser Effekt minimiert werden. Hierfür kann beispielsweise Benzoesäure verwendet werden.Should a molecule over one Carboxy group to the moldings become bound, in its matrix becomes a polyamine group supplier stored. This can be z. As oligo- or polylysine or when using a fatty acid derivative Be laurylamine. According to known methods coupled with Carbodiimide over an acid amide bond the COOH group of the reactant to the amino groups of polylysine. Analogously, one can by storage of Garboxygruppenlieferanten Covalently bind reactants with their amino group. As a supplier carboxy groups can serve, for example, the oligo- or polymer molecule of glutamic acid or aspartic acid. When using PHB or PLA as Polmermatrix it can by the effect of a mesomeric effect between the carboxy groups and the ester bonds of the polymers to an impairment the reactivity come so that the formation of acid amide binding with the reactant difficult is. By using carboxy group-providing compounds with an aromatic backbone This effect can be minimized. For example, benzoic acid can be used for this purpose become.

Zur Ausbildung von Disulfidbrücken können geeignete Oligo- oder Polymere von Cysteinderivaten eingesetzt werden. Es ist somit gewährleistet, dass eine geeignete funktionelle Gruppe der zu bindenden Substanz definiert an die Formkörper fixiert wird. Über andere funktionelle Gruppen, die sich noch im Molekül befinden können, ist keine Kopplung möglich. Dies führt zur verbesserten Standardisierungen der immunologischen Testsysteme. Denkbar für die Einlagerung in die Polymermatrix sind jedoch auch andere Oligo- oder Polymere oder Fettsäurederivate als Lieferanten freier funktioneller Gruppen, sofern es sich nur um eine Art funktioneller Gruppe handelt. Bei Molekülen mit SH-Funktionen ist das Vorhandensein anderer Gruppen wie Hydroxy-, Amino- oder Carboxyfunktionen weniger relevant, da bei der chemischen Reaktion die Ausbildung der Disulfidbrücke bevorzugt ist. Die Aminosäuren, die die funktionellen Gruppen für eine kovalente Bindung tragen (z. B. Lysin, Glutaminsäure, Asparaginsäure) können auch an verschiedene oligo- bzw. polymere Strukturen gebunden sein, sofern gewährleistet ist, dass im Gesamtmolekül nur die jeweilige gewünschte funktionelle Gruppe den Reaktanden binden kann. Die reaktive Gruppen liefernden Substanzen können dabei auch in Form ihrer Salze, z. B. als Hydrobromide eingesetzt werden. Bei Fettsäuren mit geeigneten funktionellen Gruppen sind Moleküle auch mit niedrigerem Molekulargewicht einsetzbar, da aufgrund der Polarität der Polymermatrix der Fettsäurerest im Inneren lagert, während der Teil mit der reaktiven Gruppen an der Oberfläche für eine chemische Reaktion zur Verfügung steht.to Training of disulfide bridges can suitable oligo- or polymers of cysteine derivatives are used. It is thus ensured that is a suitable functional group of the substance to be bound defined on the moldings is fixed. about other functional groups that are still in the molecule can, no coupling is possible. this leads to for improved standardization of immunological test systems. Possible for the incorporation into the polymer matrix, however, are also other oligo- or polymers or fatty acid derivatives as suppliers of free functional groups, if they only is a kind of functional group. For molecules with SH functions is the presence of other groups such as hydroxy, Amino or carboxy functions less relevant, as in the chemical Reaction the formation of the disulfide bridge is preferred. The amino acids that the functional groups for also carry a covalent bond (eg, lysine, glutamic acid, aspartic acid) be bound to various oligomeric or polymeric structures, provided guaranteed is that in the total molecule only the respective desired functional group can bind the reactant. The reactive groups supplying substances while also in the form of their salts, for. B. used as hydrobromides become. For fatty acids with suitable functional groups, molecules are also of lower molecular weight can be used because due to the polarity of the polymer matrix of the fatty acid radical stores inside while the part with the reactive groups on the surface for a chemical reaction to disposal stands.

Der Anteil an Einlagerungen in die Polymermatrix kann zwischen 0,05%–5% bezogen auf das Gewicht der Polymermatrix betragen. Man kann, sofern es technisch möglich ist, auch höhere Konzentrationen einsetzen, jedoch hat es sich gezeigt, dass der technische und finanzielle Aufwand hierfür in einem schlechten Verhältnis zu einer verbesserten Matrix steht. Niedrigere Konzentrationen an Einlagerungen sind vorstellbar, doch verschlechtert sich dadurch in den meisten Fällen die Testgualität. Der bevorzugte Bereich liegt zwischen 0,1% und 1% Anteil an Einlagerungen in der Polymerstruktur, der besonders bevorzugte Bereich zwischen 0,2% und 0,5%. Die Art der Polymermatrix hat auf die Konzentrationen der Einlagerungen wenig Einfluß, so dass Bereiche generell für jede Polymermatrix gelten können.Of the Proportion of incorporation into the polymer matrix can be between 0.05% -5% be based on the weight of the polymer matrix. You can, if it is technically possible is, even higher Concentrations, however, it has been shown that the technical and financial effort in a bad relationship with an improved matrix stands. Lower concentrations of inclusions are conceivable, but it worsens in most make the test quality. The preferred range is between 0.1% and 1% share of inclusions in the polymer structure, the most preferred range between 0.2% and 0.5%. The type of polymer matrix has on the concentrations the inclusions have little influence, so that areas generally for each polymer matrix can apply.

Zusätzlich können die Polymere – z. B. Polystyrol, PHB oder PLA – je nach Bedarf für die Verarbeitbarkeit oder Anwendungsart unterschiedliche Konzentrationen an weiteren Substanzen wie z. B. nieder- und hochmolekulare Weichmacher, Nukleinierungsmittel, Farbstoffe, technischer Hilfsstoffe etc. enthalten. Diese Substanzen sind für jedes Polymer individuell und an sich bekannt und werden von einem Fachmann je nach gewünschten Endprodukt zudosiert. In addition, the Polymers - e.g. As polystyrene, PHB or PLA - ever as needed for the processability or type of application different concentrations on other substances such. B. low and high molecular weight plasticizers, Nucleic acid, dyes, technical excipients, etc. included. These substances are for each polymer is individually and per se known and used by one Specialist depending on the desired Added end product.

Ausgangsprodukte für die Granulatherstellung der Polymere sind handelsübliche Produkte auf der Basis fossiler oder nachwachsenderoutput products for the Granule production of the polymers are commercially available products based fossil or renewable

Rohstoffe sowie Mischpolymere daraus, die üblicherweise zur Herstellung von immunologischen, enzymatischen oder chemischen Testsystemen verwendet werden. Beispiele hierfür sind die PBH-Formulierung Biomer P152 von Biomer Deutschland und bei PLA die Formulierung Lakty Typ 1012 von Shimazu Corp., Japan ein.raw materials and mixed polymers thereof, which are usually for the production of immunological, enzymatic or chemical Test systems are used. Examples include the PBH formulation Biomer P152 from Biomer Germany and at PLA the formulation Lakty type 1012 from Shimazu Corp., Japan.

Die Ausgangsgranulate der Polymere – bevorzugt Polystyrol, PHB und PLA – werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt. Diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Den Granulaten wird dann in einem Extruder eine geeignete Menge an funktionellen Gruppen liefernde Verbindungen zudosiert, extrudiert und z. B. zu Beads verarbeitet. Die Verarbeitungstemperaturen betragen dabei 110–210 Grad C. Aus dem so gewonnenen Produkt können nach an sich bekannten Verfahren verschiedene Formkörper z. B. Immunosticks, Immunoröhrchen, Kügelchen oder Mikrotiterplatten für die Anwendung in Tests, die auf Bindung einer Substanz beruhen, insbesondere immunologischer, enzymatischer oder chemischer Testsysteme hergestellt werden. Die Rohmatrix mit den Einlagerungen kann jedoch auch für die Beschichtung von Formkörpern (z. B. modifizierte Zellulose oder modifizierte Stärke) durch technische Verfahren – beispielsweise Eintauchen oder Coinjection – verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Formulierungen, aus denen bevorzugt Beads, Immunoröhrchen, Mikrotiterplatten oder Sticks für die Anwendung in immunologischen, enzymatischen und chemischen Testsystemen hergestellt werden, zeigen nach Verarbeitung zu den jeweiligen Endprodukten eine ausreichende Haltbarkeit auch für ihre Anwendung in Test-kits. Die funktionellen Gruppen der Lieferanten, die in die Polymermatrix eingelagert sind, werden nach an sich bekannten Verfahren und chemischen Reaktionen – z. B. Herstellung einer Säureamidbindung zwischen Amino- und Carboxygruppe mit Carbodiimid – durchgeführt. Die weitere Durchführung der Tests erfolgt je nach Testart nach an sich bekannten Verfahren. Die erfindungsgemäßen Formulierungen können für alle bisher eingesetzten. Tests verwendet werden, vorausgesetzt wenigstens ein Reaktand besitzt eine geeignete funktionelle Gruppe für die kovalente Bindung an die Formkörper. Der Unterschied besteht im Vergleich zu konventionellen Verfahren darin, dass jetzt die Formkörper nicht adhäsiv, sondern definiert kovalent beschichtet wurden. Bevorzugt ist dabei der Einsatz in Testsystemen, bei denen Oligonukleotide, Peptide, Oligosaccharide oder niedermolekulare Haptene an die Oberfläche gebunden werden sollen. So werden beispielsweise Blutinhaltsstoffe, Pestizide im Wasser. Toxine oder Pharmaka in Futter- und Lebensmitteln, Bakterien und Viren nachgewiesen. Ein weiteres Einsatzgebiet ist der Nachweis von Peptiden oder Nukleotiden, wie sie beispielsweise für die Medizin oder Genforschung benötigt werden. Durch die definierte kovalente Bindung an die erfindungsgemäßen Formulierungen mit Einlagerungen ist es möglich, eine ausreichende Standardisierung auch bei Haptenen zu erzielen.The Starting granules of the polymers - preferred Polystyrene, PHB and PLA - are produced according to known methods. These procedures are known from the prior art. The granules are then in a Extruder supplying an appropriate amount of functional groups Added compounds, extruded and z. B. processed into beads. The processing temperatures are 110-210 degrees C. From the thus obtained Product can according to methods known per se different moldings z. B. Immunosticks, Immunotubes, globule or microtiter plates for the application in tests, which are based on binding of a substance, in particular immunological, enzymatic or chemical test systems getting produced. However, the raw matrix with the inclusions can also for the coating of moldings (z. B. modified cellulose or modified starch) by technical methods - for example Dipping or Coinjection - used become. The formulations according to the invention, from which preferably beads, immunotubes, microtiter plates or Sticks for the application in immunological, enzymatic and chemical test systems produced, show after processing to the respective end products sufficient durability also for their use in test kits. The functional groups of the suppliers, in the polymer matrix are stored in accordance with known methods and chemical Reactions - eg. B. Preparation of an acid amide bond between amino and carboxy group with carbodiimide - performed. The further implementation The tests are carried out according to the type of test according to known methods. The formulations according to the invention can for all previously used. Tests are used, provided at least a reactant has a suitable functional group for the covalent Bonding to the moldings. The difference is compared to conventional methods in that now the moldings are not adhesively but defined covalently coated. Preference is given the use in test systems, in which oligonucleotides, peptides, Oligosaccharides or low molecular weight haptens bound to the surface should be. For example, blood ingredients, pesticides in the water. Toxins or drugs in feed and food, bacteria and viruses detected. Another field of application is proof of peptides or nucleotides, such as those used in medicine or genetic research needed become. By the defined covalent bond to the formulations according to the invention with storages it is possible to achieve sufficient standardization even with haptens.

Die kovalente Bindung ermöglicht zusätzlich die Minimierung von Matrixeffekten, die bei immunologischen Tests oft auftreten. Da bei den Tests mit Antikörpern gearbeitet wird, nimmt das Milieu, in dem sich der Antikörper befindet, Einfluß auf Bindungskapazität, da die Struktur des Antikörperproteins (IgG) durch pH-Wert oder Ionenstärke der zu untersuchenden Probe beeinflußt wird. Ist das Antigen jedoch kovalent gebunden, können durch Waschschritte unerwünschte Begleitsubstanzen entfernt werden, bevor man durch Zugabe von IgG die eigentliche Testreaktion nach an sich bekannten Verfahren einleitet. Außerdem ist es möglich, wenn sich in einer Probe unterschiedliche Substanzen befinden, die nach bisherigen Verfahren alle adhäsiv binden würden, selektiv nur diejenigen zu koppeln, die eine entsprechende funktionelle Gruppe besitzen. Dies erhöht entscheidend die Spezifität der Testsysteme.The allows covalent bonding additionally the minimization of matrix effects in immunological tests often occur. Since the tests work with antibodies, decreases the environment in which the antibody is located, influence on binding capacity, since the Structure of the antibody protein (IgG) by pH or ionic strength the sample to be examined is affected. Is the antigen, however covalently bound unwanted by washing steps Accompanying substances are removed before adding IgG initiates the actual test reaction according to known methods. Furthermore Is it possible, if there are different substances in a sample, the according to previous methods, all would bind adhesively, selectively only to couple those who have a corresponding functional group have. This increases significantly the specificity the test systems.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen Formulierungen wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Diese dienen jedoch nicht dazu, den Umfang der Erfindung zu beschränken.The Application of the formulations according to the invention is explained in more detail by the following examples. These serve however not to limit the scope of the invention.

Beispiel 1example 1

Herstellung von Polyaspartat/Polystyrol-Beads:Preparation of polyaspartate / polystyrene beads:

Polystyrolgranulat wird in verschiedenen Ansätzen zusammen mit 5%, 2,5%, 1%, 0,5% und 0,1% Polyaspartat (Kaliumsalz, 93% Polymergehalt von Rohm und Haas) einem Extruder zudosiert, extrudiert und zu Beads verarbeitet. Die Schneckentemperaturen betragen 145 Grad C (Zone 1), 190 Grad C (Zone 2), 165 Grad C (Zone 3) und 135 Grad C (Düse). Es entstehen Beads in gleichmäßiger Größe, die entweder direkt oder nach Verarbeitung zu Formkörpern in den Tests eingesetzt werden können.polystyrene granules will be in different approaches together with 5%, 2.5%, 1%, 0.5% and 0.1% polyaspartate (potassium salt, 93% polymer content of Rohm and Haas) added to an extruder, extruded and processed into beads. The screw temperatures are 145 Grade C (Zone 1), 190 degrees C (Zone 2), 165 degrees C (Zone 3) and 135 Grade C (nozzle). It produces beads in uniform size, the either directly or after processing into moldings used in the tests can be.

Beispiel 2Example 2

Herstellung von Polylysin/Polystyrol-Beads:Preparation of polylysine / polystyrene beads:

Polystyrolgranulat wird in verschiedenen Ansätzen zusammen mit 1% und 0,1% Polylysin (HBr-Salz, Molekulargewicht bis 50 000 Da von Bachem) einem Extruder zudosiert, extrudiert und zu Beads verarbeitet. Die Schneckentemperaturen betragen 145 Grad C (Zone 1), 190 Grad C (Zone 2), 165 Grad C (Zone 3) und 135 Grad C (Düse). Es entstehen Beads in gleichmäßiger Größe, die entweder direkt oder nach Verarbeitung zu Formkörpern in den Tests eingesetzt werden können.polystyrene granules will be in different approaches together with 1% and 0.1% polylysine (HBr salt, molecular weight up to 50,000 Da from Bachem) added to an extruder, extruded and closed Processed beads. The screw temperatures are 145 degrees Celsius (Zone 1), 190 degrees C (Zone 2), 165 degrees C (Zone 3), and 135 degrees C (nozzle). It produces beads in uniform size, the either directly or after processing into moldings used in the tests can be.

Beispiel 3Example 3

Herstellung von Polyaspartat/Biomer P152-Beads:Preparation of polyaspartate / biomer P152 beads:

Biomer PHB-Formulierung P152 wird in verschiedenen Ansätzen zusammen mit 5%, 2,5%, 1%, 0,5% und 0,1% Polyaspartat (Kalium-Salz, 93% Polymergehalt von Rohm und Haas) einem Extruder zudosiert, extrudiert und zu Beads verarbeitet. Die Schneckentemperaturen betragen 165 Grad C (Zone 1), 180 Grad C (Zone 2); 155 Grad C (Zone 3) und 110 Grad C (Düse). Es entstehen Beads gleichmäßiger Größe, die entweder direkt oder nach Verarbeitung zu Formkörpern in den Tests eingesetzt werden können.Biomer PHB formulation P152 is used in various approaches together with 5%, 2.5%, 1%, 0.5% and 0.1% polyaspartate (potassium salt, 93% polymer content of Rohm and Haas) are metered into an extruder, extruded and turned into beads processed. The screw temperatures are 165 degrees C (zone 1), 180 degrees C (zone 2); 155 degrees C (zone 3) and 110 degrees C (nozzle). It arise beads of uniform size, the either directly or after processing into moldings used in the tests can be.

Beispiel 4Example 4

Herstellung von Polylysin/Biomer P152-Beads:Preparation of polylysine / biomer P152 beads:

Biomer PHB-Formulierung P152 wird in verschiedenen Ansätzen zusammen mit 2,5% und 0,25% Polylysin (HBr-Salz, Molekulargewicht bis 50 000 Da, Bachem) einem Extruder zudosiert, extrudiert und zu Beads verarbeitet. Die Schneckentemperaturen betragen 165 Grad C (Zone 1), 180 Grad C (Zone 2), 155 Grad C (Zone 3) und 110 Grad C (Düse). Es entstehen Beads gleichmäßiger Größe, die entweder direkt oder nach Verarbeitung zu Formkörpern in den Tests eingesetzt werden könnenBiomer PHB formulation P152 is used in various approaches together with 2.5% and 0.25% polylysine (HBr salt, molecular weight to 50,000 Da, Bachem) metered into an extruder, extruded and processed into beads. The Screw temperatures are 165 degrees C (zone 1), 180 degrees C (zone 2), 155 degrees C (zone 3) and 110 degrees C (nozzle). The result is beads of uniform size, the either directly or after processing into moldings used in the tests can be

Beispiel 5Example 5

Herstellung von Polyaspartat/Lacty Typ 1012-Beads:Preparation of polyaspartate / lacty Type 1012 beads:

Lacty Typ 1012 wird in verschiedenen Ansätzen zusammen mit 5%, 2,5%, 1%, 0,5% und 0,1% Polyaspartat (Kalium-Salz, 93% Polymergehalt, Rohm und Haas) einem Extruder zudosiert, extrudiert und zu Beads verarbeitet. Die Schneckentemperaturen betragen 200 Grad C (Zone 1), 210 Grad C (Zone 2), 165 Grad C (Zone 3) und 155 Grad C (Düse). Es entstehen Beads gleichmäßiger Größe, die entweder direkt oder nach Verarbeitung zu Formkörpern in den Tests eingesetzt werden können.Lacty Type 1012 is used in different approaches together with 5%, 2.5%, 1%, 0.5% and 0.1% polyaspartate (potassium salt, 93% polymer content, Rohm and Haas) are metered into an extruder, extruded and turned into beads processed. The screw temperatures are 200 degrees C (zone 1), 210 degrees C (zone 2), 165 degrees C (zone 3) and 155 degrees C (nozzle). It arise beads of uniform size, the either directly or after processing into moldings used in the tests can be.

Beispiel 6Example 6

Herstellung von Polylysin/Lacty Typ 1012-Beads:Production of polylysine / lacty Type 1012 beads:

Lacty Typ 1012 wird in verschiedenen Ansätzen zusammen mit 1% und 0,1% Polylysin (HBr-Salz, Molekulargewicht bis 50 000 Da, Bachem) einem Extruder zudosiert, extrudiert und zu Beads verarbeitet. Die Schneckentemperaturen betragen 200 Grad C (Zone 1), 210 Grad C (Zone 2), 165 Grad C (Zone 3) und 155 Grad C (Düse). Es entstehen Beads gleichmäßiger Größe, die entweder direkt oder nach Verarbeitung zu Formkörpern in den Tests eingesetzt werden können.Lacty Type 1012 is used in different approaches together with 1% and 0.1% Polylysine (HBr salt, molecular weight to 50,000 Da, Bachem) one Extruder dosed, extruded and processed into beads. The screw temperatures are 200 degrees C (zone 1), 210 degrees C (zone 2), 165 degrees C (zone 3) and 155 degrees C (nozzle). The result is beads of uniform size, the either directly or after processing into moldings used in the tests can be.

Beispiel 7Example 7

Vergleich der kovalenten Bindung von 4-Chlor-2-methyl-phenoxyessigsäure (MCPA) an Polystyrol (PS), Polyhydroxybuttersäure (PHB) und Polylaktid (PLA) mit Einlagerungen von PolylysinComparison of covalent Binding of 4-chloro-2-methyl-phenoxyacetic acid (MCPA) to polystyrene (PS), polyhydroxybutyric (PHB) and polylactide (PLA) with inclusions of polylysine

Beads aus Polymeren von Polystyrol, Biomer P152 und Lacty Typ 1012 mit jeweils 1% Einlagerung an Polylysin werden durch Inkubation von 10μg MCPA in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) mit Carbodiimid (EDC) über Nacht im Kühlschrank beschichtet. Nach Entfernen der Lösung blockt man durch Zugabe von 1%iger Teeen 20-Lösung in PBS freie Bindungsstellen ab (2 Stunden bei Raumtemperatur). Danach wird die Blocklösung entfernt und ein Anti-MCPA-IgG-Alkalische-Phosphatase-Konjugat in PBS zugegeben. Nach einer Stunde Inkubationszeit bei Raumtemperatur werden die Beads gewaschen.Beads of polymers of polystyrene, Biomer P152 and Lacty Type 1012 each with 1% incorporation of polylysine are coated by incubation of 10μg MCPA in phosphate buffered saline (PBS) with carbodiimide (EDC) overnight in the refrigerator. After removal of the solution is blocked by the addition of 1% Teeen 20 solution in PBS free binding sites (2 hours at room temperature). Thereafter, the block solution is removed and an anti-MCPA-IgG alkaline phosphatase conjugate added in PBS give. After one hour of incubation at room temperature, the beads are washed.

Dann gibt man eine Substratlösung aus 1 mg p-Nitrophenylphosphat/1 ml 10% Diethanolaminpuffer pH 9,6 dazu. Nach 60 Minuten bei Raumtemperatur wird der farbige Überstand bei 410 nm gemessen. Als Negativkontrolle werden Beads verwendet, die außer der Beschichtung mit MCPA den selben Versuchsablauf erfahren haben. Durch Substraktion der jeweiligen Negativ-Kontrollen und Positivwerte ergibt sich für jede Beads Art ein DeltaE. Je größer dieser Wert ist. umso besser sind Bindung und Standardisierung.Then you give a substrate solution from 1 mg p-nitrophenyl phosphate / 1 ml 10% diethanolamine buffer pH 9.6 to. After 60 minutes at room temperature, the colored supernatant measured at 410 nm. As a negative control, beads are used the except the coating with MCPA have experienced the same experimental procedure. By subtraction of the respective negative controls and positive values arises for every beads type a DeltaE. The bigger this one Is worth. the better are bonding and standardization.

Führt man den Versuch mit Polymerbeads ohne Einlagerung durch, erhält man Werte, die dem des normalen Pufferbackgrounds entsprechen. Ein DeltaE ist nicht festzustellen.Leading the experiment with polymer beads without incorporation by, you get values, which correspond to that of the normal buffer backround. A DeltaE is not detect.

DeltaE Polystyrol/Polylysin 0,300 Biomer P152/Polylysin 0,706 Lacty Typ 1012/Polylysin 0,774 DeltaE Polystyrene / polylysine 0,300 Biomer P152 / polylysine 0.706 Lactic type 1012 / polylysine 0.774

Es zeigt sich, daß alle Polymere mit Einlagerungen gut binden, daß jedoch PHB und insbesondere auch PLA eine deutlich bessere Bindung als die Polystyrolmatrix aufweist.It it turns out that all Well bind polymers with intercalations, but that PHB and especially PLA has a significantly better bond than the polystyrene matrix.

Beispiel 8Example 8

Kopplung von 4-Chlor-2-methyl-phenoxyessigsäure (MCPA) an Beads aus Formulierungen von PHB mit unterschiedlichen Konzentrationen an Einlagerungen von PolylysinCoupling of 4-chloro-2-methyl-phenoxyacetic acid (MCPA) on beads from formulations of PHB at different concentrations on inclusions of polylysine

Beads aus Biomer P152 mit Einlagerungen von 0,25%, 1% und 2,5% Polylysin werden mit 10μg MCPA beschichtet. Die Versuchsdurchführung erfolgt analog zu Beispiel 7.Beads from Biomer P152 with inclusions of 0.25%, 1% and 2.5% polylysine be with 10μg Coated MCPA. The experiment is carried out analogously to Example 7th

DeltaE Biomer P152/0,25% Polylysin 0,537 Biomer P152/1% Polylysin 0,558 Biomer P152/2,5% Polylysin 0,585 DeltaE Biomer P152 / 0.25% polylysine 0.537 Biomer P152 / 1% polylysine 0.558 Biomer P152 / 2.5% polylysine 0,585

Es zeigt sich, daß Formulierungen mit unterschiedlichem Prozentsatz an Einlagerungen vergleichsweise gut binden. Der 10fache Einsatz an Polylysin wirkt sich nur unerheblich aus.It shows that formulations with different percentage of storages comparatively bind well. The 10-fold use of polylysine has only a negligible effect out.

Beispiel 9Example 9

Vergleich von der Bindung von MCPA an PHB/Polylysin, PLA/Polylysin und NuncCovalinkComparison of the bond of MCPA to PHB / polylysine, PLA / polylysine and NuncCovalink

NuncCovalink sind handelsübliche Mikrotiterplatten aus Polystyrol, deren Oberfläche so verändert wurde,dass über Aminogruppen Moleküle mit Carboxygruppen konjugiert werden können.NuncCovalink are commercially available Polystyrene microtiter plates whose surface has been changed to amino groups molecules can be conjugated with carboxy groups.

Biomer P152/0,25% Polylysin-Matrix, Lacty Typ 1012/1% Polyaspartat und NuncCovalink werden mit je 10μg MCPA beschichtet. Die Durchführung des Versuchs ist analog zu Beispiel 7.Biomer P152 / 0.25% polylysine matrix, lactic type 1012/1% polyaspartate and NuncCovalink are each 10μg Coated MCPA. The implementation of the experiment is analogous to Example 7.

DeltaE NuncCovalink 0,315 Biomer P152/0,25% Polylysin 0,720 Lacty Typ 1012/1% Polylysin 0,758 DeltaE NuncCovalink 0.315 Biomer P152 / 0.25% polylysine 0.720 Lactic type 1012/1% polylysine 0.758

Es zeigt sich deutlich, dass die erfindungsgemäßen Formulierungen eine wesentlich bessere Bindung erzielen als das handelsübliche Produkt.It shows clearly that the formulations according to the invention a substantial achieve better bonding than the commercial product.

Beispiel 10Example 10

Analytische Bestimmung von Phenylharnstoff mit einem Sticktest gemäß der ErfindungAnalytical determination of phenylurea with an embroidery test according to the invention

Ein Stäbchen aus Polystyrol/1% Polyaspartat wird in einem Röhrchen mit 0,3 ml (entspricht etwa 1/3 der Stäbchenlänge) PBS, die 10μg Phenylharnstoff und Carbodiimid (EDC) enthält, über Nacht im Kühlschrank beschichtet. Dann wäscht man das Stäbchen unter fließendem Wasser und gibt zum Abblocken freier Bindungstellen 1 ml 1%ige Tweenlösung in PBS zu. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur entfernt man die Blocklösung und gibt 1 ml Anti-Phenylharnstoff-IgG-Alkalische-Phosphatase-Konjugat in PBS zu. Nach einer weiteren Stunde Inkubationszeit bei Raumtemperatur wäscht man das Stäbchen unter fließendem Wasser. Man stellt eine Substratlösung mit einer Konzentration von 1 mg BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/1 ml AMP-Puffer (9,58 ml 2-Amino-2-methyl-1-propanol, 15 mg Magnesiumchloridhexahydrat, 10μl Triton X-100, 80 ml Wasser, mit conc. HCL auf pH 10,2 einstellen) her.One rod made of polystyrene / 1% polyaspartate is placed in a 0.3 ml tube (equivalent about 1/3 of the rod length) PBS, the 10μg Phenylurea and carbodiimide (EDC), coated overnight in the refrigerator. Then wash one the stick under fluent Water and, to block free binding sites, add 1 ml of 1% Tween solution PBS too. After 2 hours incubation at room temperature, remove the block solution and add 1 ml of anti-phenylurea-IgG alkaline phosphatase conjugate in PBS too. After another hour of incubation at room temperature washes one the stick under fluent Water. Make a substrate solution with a concentration of 1 mg BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate / 1 ml AMP buffer (9.58 ml of 2-amino-2-methyl-1-propanol, 15 mg of magnesium chloride hexahydrate, 10μl Triton X-100, 80 ml of water, with conc. HCL to pH 10.2 adjust) ago.

Man inkubiert das Stäbchen ca 30 Minuten in 1 ml der Substratlösung. Das Substrat präzipitiert auf dem Stäbchen und bleibt haften. So kann man durch einen Vergleich der Färbung des ersten Drittels des Stäbchens mit dem Rest feststellen, ob Phenylharnstoff in der Probe war. Bei 10μg Antigen ergibt sich dabei ein signifikanter Farbunterschied.you incubate the chopstick about 30 minutes in 1 ml of the substrate solution. The substrate precipitated on the stick and sticks. So one can by comparison the coloring of the first third of the stick with the rest determine if phenylurea was in the sample. at 10μg antigen this results in a significant color difference.

Beispiel 11Example 11

Analytische Bestimmung des Pestizids Mecoprop mit einem Sticktest gemäß der Erfindunganalytical Determination of the pesticide Mecoprop with an embroidery test according to the invention

Ein Stäbchen aus PHB/0,25% Polylysin von Biomer wird in einem Röhrchen mit 0,3 ml (entspricht etwa 1/3 der Stäbchenlänge) einer Wasserprobe , die 10μg Mecoprop und Carbodiimid (EDC) enthält, über Nacht im Kühlschrank beschichtet. Man wäscht dann das Stäbchen unter fließenden Wasser und gibt zum Abblocken freier Bindungsstellen 1 ml 1%ige Tweenlösung in PBS dazu. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur entfernt man die Blocklösung und gibt 1 ml Anti-Mecoprop-IgG-Alkalische-Phosphatasekonjugat in PBS zu. Der weitere Versuchsablauf ist analog zu Beispiel 10. Es zeigt sich, daß der Teil des Stäbchens, der der Probe ausgesetzt war, eine deutliche Verfärbung gegenüber dem Rest zeigt.One rod from PHB / 0.25% polylysine from Biomer is in a tube with 0.3 ml (equivalent to about 1/3 of the rod length) of a water sample, the 10μg mecoprop and carbodiimide (EDC) overnight in the fridge coated. You wash then the chopsticks under flowing Water and give 1 ml of 1% to block free binding sites Tweenlösung in PBS. After 2 hours incubation at room temperature one the block solution and add 1 ml of anti-mecoprop IgG alkaline phosphatase conjugate PBS too. The further course of the experiment is analogous to Example 10. It shows that the Part of the chopsticks, which was exposed to the sample, a significant discoloration compared to the Rest shows.

Claims (10)

Formulierung zur Herstellung von biologischen, insbesondere immunologischen, chemischen oder enzymatischen Testsystemen, bestehend aus – einer Polymergrundmasse und – einer reaktive funktionelle Gruppen tragenden Verbindung, welche miteinander homogen vermischt und nicht chemisch vernetzt sind, wobei die Formulierung im festen Zustand an der Oberfläche die reaktiven fiunktionellen Gruppen der in die Polymergrundmasse eingemischten Verbindung trägt, und wobei die reaktiven Gruppen eine spezifische kovalente Anbindung von Molekülen ermöglichen.Formulation for the production of biological, in particular immunological, chemical or enzymatic test systems, consisting of - one Polymer matrix and - one reactive functional group-bearing compound, Which homogeneously mixed with each other and not chemically crosslinked, wherein the formulation in the solid state at the surface of the reactive functional groups of the blended in the polymer matrix compound wearing, and wherein the reactive groups have a specific covalent attachment of molecules enable. Formulierung nach Anspruch 1, wobei die eingemischte Verbindung als reaktive funktionelle Gruppen Amino-, Carboxy- oder Sulfhydrylgruppen trägt.A formulation according to claim 1 wherein the admixed Compound as reactive functional groups amino, carboxy or Carries sulfhydryl groups. Formulierung nach Anspruch 2, wobei die reaktive funktionelle Gruppen tragende Verbindung Oligo- bzw. Polylysin ist.A formulation according to claim 2, wherein the reactive functional group carrying compound is oligo- or polylysine. Formulierung nach Anspruch 2, wobei die reaktive funktionelle Gruppen tragende Verbindung Oligo- bzw. Polyaspartat ist.A formulation according to claim 2, wherein the reactive functional group-carrying compound oligo- or polyaspartate is. Formulierung nach Anspruch 2, wobei die reaktive funktionelle Gruppen tragende Verbindung Oligo- bzw. Polyglutamat ist.A formulation according to claim 2, wherein the reactive functional group-carrying compound oligo- or polyglutamate is. Formulierung nach Anspruch 2, wobei die reaktive funktionelle Gruppen tragende Verbindung Laurylamin ist.A formulation according to claim 2, wherein the reactive functional group bearing compound is lauryl amine. Formulierung nach einem der Ansprüche 1–6, wobei die Polymergrundmasse Polystyrol ist.A formulation according to any one of claims 1-6, wherein the polymer matrix Polystyrene is. Formulierung nach einem der Ansprüche 1–6, wobei die Polymergrundmasse ein nachwachsender Rohstoff aus der Gruppe Polyhydroxybuttersäure, Polylactat, modifizierte Stärke, modifizierte Zellulose ist.A formulation according to any one of claims 1-6, wherein the polymer matrix is a renewable crude substance from the group polyhydroxybutyric acid, polylactate, modified starch, modified cellulose. Formulierung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei die reaktive funktionelle Gruppen tragende Verbindung in einer Konzentration von 0,05 bis 5 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,1 bis 1% bezogen auf die Polymergrundmasse, vorliegt.A formulation according to any one of claims 1-8, wherein the reactive functional Group carrying compound in a concentration of 0.05 to 5 weight percent, preferably 0.1 to 1% based on the polymer matrix, is present. Verwvendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 1–9 zur Weiterverarbeitung für feste Phasen für immunologische, enzymatische und chemische Testsysteme, wobei die feste Phase eine Mikrotiterplatte, ein Kügelchen, ein Immunoröhrchen oder ein Immunostick ist.Use of a formulation according to any one of claims 1-9 for further processing for fixed Phases for immunological, enzymatic and chemical test systems, wherein the solid phase a microtiter plate, a bead, an immunotube or an immunostick is.