DE19724781A1 - Determining DNA damage and repair - Google Patents

Determining DNA damage and repair

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Abstract

Determination of DNA damage and repair in human or animal tissues and cells, cell lines of human or animal origin, subcellular fractions and isolated DNA using of PicoGreen as a fluorescing dye or the use of any other fluorescing dye which binds specifically to double stranded or single stranded DNA, is new.

Description

Prinzipprinciple

Die DNA ist ein doppelsträngiges Molekül, bei dem die beiden Stränge durch Wasserstoffbrücken zusammengehalten werden und zu einer rechtsgängigen Doppelspirale umeinandergewunden sind. Diese Struktur bedingt daß das Molekül auch dann noch gut zusammenhält, wenn in den Strängen Brüche vorhanden sind, wie sie bei DNA-Veränderungen sehr häufig vorkommen. Voraussetzung ist, daß die Einzelstrangbrüche auf beiden Strängen gegeneinander versetzt sind. Wird die DNA oder auch Zellen stark alkalischer Lösung ausgesetzt, so lösen sich die Wasserstoffbrücken zwischen den beiden Strängen. Die Moleküle würden sofort auseinanderfallen, wären sie nicht umeinandergewickelt. Dadurch können sie sich erst nach der Entwindung trennen, was erhebliche Zeit (Minuten bis Stunden) beansprucht. DNA, bei der die Einzelstränge Brüche aufweisen, entwindet sich erheblich schneller als ungeschädigte. Durch die Zugabe von fluoreszierenden Farbstoffen, die nur an doppelsträngige, aber nicht an einzelsträngige DNA binden und durch anschließende Messung der Fluoreszenz ist es möglich, den Anteil an doppelsträngiger DNA zu bestimmen. Die Methode erlaubt somit die Bestimmung der Zahl der Einzelstrangbrüche in DNA.DNA is a double-stranded molecule in which the two strands pass through Hydrogen bonds are held together and a right-handed Double spiral are wound around each other. This structure determines that the molecule holds together even if there are breaks in the strands, as is very common with DNA changes. The prerequisite is that the Single strand breaks are offset against each other on both strands. Will the DNA or cells exposed to a strongly alkaline solution, then they dissolve Hydrogen bonds between the two strands. The molecules would instantly fall apart if they weren't wrapped around each other. This allows them to only separate after unwinding, which takes considerable time (minutes to hours) claimed. DNA, in which the single strands have breaks, unwinds considerably faster than undamaged. By adding fluorescent Dyes that only bind to double-stranded, but not to single-stranded DNA and by subsequently measuring the fluorescence, it is possible to determine the proportion to determine double-stranded DNA. The method thus allows the determination the number of single-strand breaks in DNA.

Als Fluoreszenzfarbstoff dient bei der beschriebenen Methode PicoGreen, das spezifisch an Doppelstrang-DNA und nicht an Einzelstrang-DNA bindet (Haugland "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", Sixth Edition, Molecular Probes Inc., Eugene, USA, Kapitel 8.3, S. 161-174 (1996)). Als Beispiel ist nachfolgend die Verwendung dieser Methode zur Schnellbestimmung von DNA-Schäden in Lymphozyten von Strahlentherapie-Patienten, in humanen und tierischen Zellinien sowie in tierischen Gewebeproben beschrieben.In the described method, PicoGreen is used as the fluorescent dye, that specifically binds to double-stranded DNA and not to single-stranded DNA (Haugland "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", Sixth Edition, Molecular Probes Inc., Eugene, USA, Chapter 8.3, pp. 161-174 (1996)). As An example below is the use of this method for quick determination of DNA damage in lymphocytes from radiation therapy patients, in human and animal cell lines and in animal tissue samples.

Beispiele für die Durchführung des AssaysExamples of performing the assay Materialienmaterials

Die bei den nachfolgend beschriebenen Experimenten verwendeten Chemikalien wurden von E. Merck (Darmstadt, Deutschland) oder von Sigma Chemical Co. (St. Luis, USA) bezogen. Der Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen wurde von Molecular Probes, Leiden, Niederlande, erworben.The chemicals used in the experiments described below were from E. Merck (Darmstadt, Germany) or from Sigma Chemical Co. (St. Luis, USA). The fluorescent dye PicoGreen was from Molecular Probes, Leiden, The Netherlands.

Durchführung des AssaysCarrying out the assay

Die Detektion erfolgt in dem geschilderten Beispiel mittels eines Fluoreszenz-ELISA- Platten-Readers (Fluoroskan II, Labsystems, Helsinki, Finnland); sie kann auch mit anderen Systemen, die Fluoreszenz erfassen können, erfolgen: z. B. Zweistrahl­ photometer, HPLC-Fluoreszenzdetektor.In the example described, the detection is carried out by means of a fluorescence ELISA Plate readers (Fluoroskan II, Labsystems, Helsinki, Finland); she can also with other systems that can detect fluorescence occur: z. B. Double beam photometer, HPLC fluorescence detector.

LÖSUNGENSOLUTIONS

  • - PicoGreen dsDNA-Quantifizierungsreagenz P-7581 Stock in DMSO (Molecular Probes)- PicoGreen dsDNA quantification reagent P-7581 Stock in DMSO (Molecular Probes)
  • - TE-Puffer
    10 mM Tris-HCl
    1 mM EDTA
    pH 7.4    - TE buffer
    10 mM Tris-HCl
    1mM EDTA
    pH 7.4
  • - Lyselösung:
    9 M Harnstoff
    0.1% SDS
    0.2 M EDTA
    pH 10.0    - Lysis solution:
    9 M urea
    0.1% SDS
    0.2 M EDTA
    pH 10.0
  • - Lyselösung mit PicoGreen:
    Verdünnung der konzentrierten originalen PicoGreen-Lösung:
    20 µl/ml Lyselösung    - Lysis solution with PicoGreen:
    Dilution of the concentrated original PicoGreen solution:
    20 µl / ml lysis solution
  • - NaOH-Lösung:
    Aus einer 0. 1 M NaOH-Lösung wird durch Verdünnung eine 0.05 M NaOH-Lösung hergestellt. Aus dieser NaOH-Lösung wird die 0.025 M NaOH-Arbeitslösung unmittelbar vor den Experimenten hegestellt. Der pH wird jedesmal durch Zugabe von 0.5 ml Lyselösung zu der 0.025 M NaOH-Arbeitslösung überprüft. Der pH muß gleich 12.40 sein.    - NaOH solution:
    A 0.05 M NaOH solution is prepared from a 0.1 M NaOH solution by dilution. The 0.025 M NaOH working solution is prepared from this NaOH solution immediately before the experiments. The pH is checked each time by adding 0.5 ml of lysis solution to the 0.025 M NaOH working solution. The pH must be equal to 12.40.
VORGEHENSWEISEMETHOD

  • 1. Es wird eine Zellsuspension in TE-Puffer pH 7.4 (falls bequemer, in Zentrifugationsmedium) hergestellt mit einer Zelldichte von 150.103 Zellen/ml. (Anmerkung: in Experimenten mit Lymphozyten, etwa 3500-4500 Zellen/25 µl, ca. 30 ng DNA). 1. A cell suspension is prepared in TE buffer pH 7.4 (if more convenient, in centrifugation medium) with a cell density of 150.10 3 cells / ml. (Note: in experiments with lymphocytes, approx. 3500-4500 cells / 25 µl, approx. 30 ng DNA).
  • 2. Die Lyse der Zellen findet direkt auf schwarzen Mikrotiterplatten (Microplates) für 40 Min. bis 1 h im Dunkeln auf Eis statt. Zu 25 µl Zellsuspension werden langsam 25 µl Lyselösung mit PicoGreen hinzugefügt. Es darf nicht gemischt und nicht geschüttelt werden.2. The lysis of the cells takes place directly on black microtiter plates (microplates) for 40 minutes to 1 hour in the dark on ice instead. 25 µl of lysis solution with PicoGreen are slowly added to 25 µl of cell suspension added. It must not be mixed or shaken.
  • 3. Die DNA-Denaturierung (DNA-Entwindung) läßt man bei pH 12.40 wie folgt ablaufen:
    Zu jeder Probe wird 250 µl der 0.025 M NaOH-Lösung hinzugegeben, um einen pH von 12.40 zu erhalten.
    Fluoreszenz-Leerwerte:
    25 µl H2O (oder TE-Puffer)
    25 µl Lyselösung mit PicoGreen
    250 µl 0.025 M NaOH-Lösung.    3. DNA denaturation (DNA unwinding) is carried out as follows at pH 12.40:
    250 µl of the 0.025 M NaOH solution is added to each sample in order to obtain a pH of 12.40.
    Fluorescence blank values:
    25 µl H 2 O (or TE buffer)
    25 µl lysis solution with PicoGreen
    250 µl 0.025 M NaOH solution.
  • 4. Messung für 1 h, etwa alle 5 Min. (5 Min. entspricht der Zeit, die für die Ablesung einer Mikrotiterplatte benötigt wird).
    Exzitation: 480 nm, Fluoroscan-Filter 2
    Emission: 520 nm, Fluoroscan-Filter 2     4. Measurement for 1 hour, approximately every 5 minutes (5 minutes corresponds to the time required to read a microtiter plate).
    Excitation: 480 nm, fluoroscan filter 2
    Emission: 520 nm, fluoroscan filter 2
  • 5. Berechnung:
    Da jede Probe im Hinblick auf den Leerwert korrigiert werden muß, wird von den Werten der Mittelwert des Leerwerts subtrahiert. Es werden Mehrfachbestimmungen jeder einzelnen Probe sowie des Leerwertes durchgeführt (jeweils 4-6 Bestimmungen). Der Wert für die nichtbehandelten oder Referenz- Zellen zum Zeitpunkt 0 wird als 100% dsDNA gesetzt; alle anderen Werte werden entsprechend dieser Festlegung berechnet. Die gemessenen Effekte werden als "Strand Scission Factor" (SSF) ausgedrückt und nach einem Zeitraum der Denaturierung von 20 Min. folgendermaßen berechnet:
    SSF = log (% dsDNA in der behandelten Probe/% dsDNA in der Kontrollprobe).
    Negative Werte für SSF zeigen eine erhöhte Frequenz von Strangbrüchen an.    5. Calculation:
    Since each sample must be corrected for the blank, the mean of the blank is subtracted from the values. Multiple determinations of each individual sample and the blank value are carried out (4-6 determinations each). The value for the untreated or reference cells at time 0 is set as 100% dsDNA; all other values are calculated according to this definition. The measured effects are expressed as "Strand Scission Factor" (SSF) and calculated after a denaturation period of 20 minutes as follows:
    SSF = log (% dsDNA in the treated sample /% dsDNA in the control sample).
    Negative values for SSF indicate an increased frequency of strand breaks.
Durchführung des Assays bei GewebeprobenCarrying out the assay on tissue samples

Das Protokoll für Gewebe entspricht dem für Zellsuspensionen mit folgenden Modifikationen: The protocol for tissue corresponds to that for cell suspensions with the following Modifications:  

  • 1. Das Gewebe muß sofort nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.1. The tissue must be kept in liquid nitrogen immediately after removal will.
  • 2. Die Gewebe-Menge, die für eine Vertiefung der Mikrotiterplatte (ein Microplate Well) benötigt wird, beträgt gewöhnlich 25 µg.2. The amount of tissue required for a well of the microtiter plate (a microplate Well) is usually 25 µg.
  • 3. Man homogenisiert 10 mg des Gewebes in 1 ml Homogenisationspuffer in einem Mörser mit einem Pistill unter flüssigem Stickstoff.
    Homogenisationspuffer: TE-Puffer (siehe oben) oder anderer geeigneter Puffer mit 10% Cryoprotektor (Dimethylsulfoxid, Glycerin etc.).    3. Homogenize 10 mg of the tissue in 1 ml of homogenization buffer in a mortar with a pestle under liquid nitrogen.
    Homogenization buffer: TE buffer (see above) or other suitable buffer with 10% cryoprotector (dimethyl sulfoxide, glycerin etc.).
  • 4. Man verdünnt das Homogenisat 10-fach mit TE-Puffer.4. Dilute the homogenate 10-fold with TE buffer.
  • 5. In jede Vertiefung (Well) wird 25 µl des Homogenisats gegeben; dann werden 25 µl der Lyselösung mit PicoGreen (siehe oben) hinzugegeben.5. 25 µl of the homogenate is added to each well; then 25 Add µl of the lysis solution with PicoGreen (see above).
  • 6. Weiter wird entsprechend der Prozedur für Zellsuspensionen vorgegangen.6. The procedure for cell suspensions is then followed.
Anwendung der MethodeApplication of the method

Um die Anwendbarkeit und Sensitivität der neuen Methode zu demonstrieren, wurde sie zur Bestimmung von DNA-Strangbrüchen in Lymphozyten von Patienten vor und nach Strahlentherapie, zum Nachweis von DNA-Strangbrüchen und deren Reparatur in bestrahlten Blutproben (Bestimmung der Empfindlichkeit der Methode) sowie zur Messung von DNA-Strangbrüchen (durch Gentoxine oder Bestrahlung induziert) in humanen und tierischen Zellinien und tierischen Gewebeproben eingesetzt.In order to demonstrate the applicability and sensitivity of the new method, before and for the determination of DNA strand breaks in lymphocytes of patients after radiation therapy, for the detection of DNA strand breaks and their repair in irradiated blood samples (determination of the sensitivity of the method) and for Measurement of DNA strand breaks (induced by genotoxins or radiation) in human and animal cell lines and animal tissue samples.

a) Anwendung in der Strahlentherapiea) Application in radiation therapy

Ein wichtiger Bestandteil der modernen Krebsbehandlung ist die Strahlentherapie. Der Effekt einer Strahlentherapie hängt von verschiedenen Faktoren der Tumor- und Wirtszelle, wie unterschiedlichen Strahlensensibilitäten, ab (Peters et aL: The tumor radioresistance in clinical radiotherapy, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 8 : 101-108, 1982; Peters et aL: Predictive assays of tumor radiocurability, Cancer Treat. Symp. 1 : 67-74, 1984). Das Ausmaß der DNA-Schädigung von Tumorzellen nach einer Bestrahlung wird u. a. vom Gehalt an polymorphen DNA-Reparaturenzymen bestimmt. Die beschriebene Methode kann zur Bestimmung der individuellen Strahlensensibilität von Patienten anhand von Tumor-Biopsiematerial oder Lymphozyten der Patienten als prätherapeutischer Test vor eine Bestrahlung (Gamma-Strahlung eines kobalt-60-Gerätes, Photonen oder Elektronen eines Linearbeschleunigers unterschiedlicher Energie) verwendet werden. Es wird angenommen, daß die Fähigkeit zur DNA-Reparatur von Patient zu Patient unterschiedlich sein kann. Deshalb ist die Bestimmung der zellulären DNA-Re­ paraturkapazität für DNA-Schäden, die durch Bestrahlung hervorgerufen werden ein erfolgversprechender prätherapeutischer Sensibilitätstest, der eine Entscheidung darüber erlaubt, ob eine Strahlentherapie bei den betreffenden Patienten erfolgreich sein wird oder nicht. Weiterhin kann dieser Test zur Festlegung der optimalen Dosis bei einer Strahlentherapie verwendet werden.Radiation therapy is an important part of modern cancer treatment. The effect of radiation therapy depends on various factors of the tumor and Host cell, such as different radiation sensitivities (Peters et al: The tumor radio resistance in clinical radiotherapy, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 8: 101-108, 1982; Peters et al: Predictive assays of tumor radiocurability, Cancer Treat. 1: 67-74, 1984). The extent of DNA damage from tumor cells radiation is u. a. on the content of polymorphic DNA repair enzymes certainly. The method described can be used to determine the individual  Radiation sensitivity of patients based on tumor biopsy material or Lymphocytes of the patient as a pre-therapeutic test before radiation (Gamma radiation from a cobalt 60 device, photons or electrons from a Linear accelerator of different energy) can be used. It will believed that the ability to repair DNA from patient to patient can be different. That is why the determination of cellular DNA-Re repair capacity for DNA damage caused by radiation a promising pre-therapeutic sensitivity test that makes a decision about whether radiotherapy is successful in the patient concerned will be or not. This test can also be used to determine the optimal dose can be used in radiation therapy.

b) Anwendung in der Gewässerüberwachungb) Application in water surveillance

Die beschriebene Methode kann weiterhin zur Gewässerüberwachung (kommunale und industrielle Klärwerkszu- und -abläufe, Flußwasserproben) angewandt werden. Untersucht werden die Wässer mit Hilfe dieses Tests entweder durch Direktinkubationen von Geweben, Zellen oder Organismen oder bei schwacher Gentoxizität, z. B. bei Flußwässern, können die zu untersuchenden Wässer auch aufkonzentriert werden.The described method can also be used for water monitoring (municipal and industrial sewage plant inflows and outflows, river water samples) are used. The waters are examined using this test either by Direct incubation of tissues, cells or organisms or in the case of weak ones Genotoxicity, e.g. B. in river waters, the waters to be examined can also be concentrated.

c) Anwendung zur Bestimmung von DNA-Schäden nach Chemotherapie oder Behandlung mit Modell- und Umwelt-Gentoxinenc) Application for the determination of DNA damage after chemotherapy or Treatment with model and environmental genotoxins

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit ist die Benutzung der beschriebenen Methode zur Messung des Auftretens von DNA-Schäden in Gewebeschnitten und Zellsuspensionen nach Chemotherapie oder Behandlung mit Modell- und Umwelt- Gentoxinen (Mutagene und Cancerogene). Auch läßt sich die beschriebene Methode zum Nachweis von DNA-Schäden und -Reparatur in marinen Organismen anwenden (Biomonitoring von Umweltstreß).Another application is the use of the described method for measuring the occurrence of DNA damage in tissue sections and Cell suspensions after chemotherapy or treatment with model and environmental Genotoxins (mutagens and carcinogens). The described can also be Method for the detection of DNA damage and repair in marine organisms apply (biomonitoring of environmental stress).

d) Vergleich mit anderen Tests für DNA-Schädend) Comparison with other tests for DNA damage

Vergleich mit den beiden herkömmlichen, empfindlichsten Assays. FADU und AFE: Fluoreszenz-Analyse der alkalischen DNA-Entwindung (FADU): Bei der FADU-Technik wird die Entwindung der DNA in alkalischer Lösung nach einer definierten Zeit durch Neutralisierung gestoppt. Die FADU-Methode mißt nicht die Kinetik der Entwindung, erfordert bei den Kontrollen eine Ultraschallbehandlung der Proben (mögliche Infektionsgefahr bei Patientenblutproben durch Aerosolbildung) und ist in der beschriebenen Form nicht auf Mikrotiterplatten durchführbar. Comparison with the two conventional, most sensitive assays. FADU and AFE: Fluorescence analysis of alkaline DNA unwinding (FADU): In the FADU technique is the unwinding of the DNA in alkaline solution according to a defined Time stopped by neutralization. The FADU method does not measure the kinetics of the Unwinding requires ultrasound treatment of the samples during the controls (possible risk of infection in patient blood samples due to aerosol formation) and is in the form described cannot be carried out on microtiter plates.  

Alkalische Filter-Elution (AFE): Dabei gibt man die auf DNA-Schäden zu untersuchende Zellen auf Filter und behandelt sie zunächst zur Entfernung von Nicht-DNA-Anteilen mit einer neutralen Lyselösung. Die DNA bleibt dabei auf dem Filter zurück. Danach durchströmt man die Filter mit der darauf befindlichen DNA langsam über mehrere Stunden mit stark alkalischer Lösung, wobei die ausgewaschene Lösung in Fraktionen gesammelt wird. Diese Prozedur ist im Gegensatz zu dem hier beschriebenen Assay zeitaufwendig (Arbeitsdauer mehr als 4 h), kompliziert in der Durchführung (sie kann nur von erfahrenem Personal gehandhabt werden) und störanfällig (häufiges Undichtwerden der Filter und Filterhalter).Alkaline filter elution (AFE): You add the DNA damage examining cells on filters and treating them first to remove Non-DNA portions with a neutral lysis solution. The DNA stays on the Filter back. Then you flow through the filter with the DNA on it slowly over several hours with a strongly alkaline solution, the washed out solution is collected in fractions. This procedure is in the Contrary to the assay described here time consuming (working time more than 4 h), complicated to carry out (it can only be done by experienced personnel handled) and prone to failure (frequent leakage of the filter and Filter holder).

Vergleich mit weiteren SchnelltestsComparison with other rapid tests

Ein Vergleich mit weiteren Testsystemen, die so entwickelt wurden, daß sie routinemäßig mit hohem Probendurchsatz in 8 oder weniger Stunden durchführbar sind, ergibt folgendes: im Gegensatz zu der beschriebenen Methode
A comparison with other test systems that were developed in such a way that they can be routinely carried out with high sample throughput in 8 or less hours shows the following: in contrast to the method described

  • - läßt der DNA-Synthese Inhibitionstest (DIT) nur die unter der Reparatur bestehende Schäden erkennen,- The DNA synthesis inhibition test (DIT) leaves only those under repair recognize existing damage,
  • - zeigt der Viskotest im wesentlichen nur die aktuellen Strangbrüche an,- the viscotest essentially only shows the current strand breaks,
  • - zeigt der umu-Test nur die erzeugten Mutationen an.- the umu test only shows the mutations generated.
Bestimmung der DNA-Strangbrüche in Lymphozyten von Patienten vor und nach StrahlentherapieDetermination of DNA strand breaks in lymphocytes from patients before and after radiation therapy Durchführungexecution

Die Isolierung der Lymphozyten von Tumorpatienten bzw. von normalen Spendern erfolgt aus peripherem Blut mittels spezieller Zentrifugenröhrchen. Diese Zentrifugenröhrchen besitzen perforierte Plastikeinsätze über einem Poly­ saccharose/Natriummetrizoat-Dichtegradienten. Dadurch kann eine beträchtliche Verringerung des Zeitaufwandes erzielt werden. Die Blutentnahme erfolgte vor und unmittelbar nach der Bestrahlung. Im folgenden wird angegeben: die Diagnose (D), das Bestrahlungsfeld (BF), der Zeitraum in Tagen (d) zwischen dem letzten Bestrahlungstag vor der Blutentnahme (LBT), die bis dahin applizierte Gesamtdosis (GD) sowie die jeweilige Einzeldosis (ED) in Gray (Gy).
Lymphocytes from tumor patients and normal donors are isolated from peripheral blood using special centrifuge tubes. These centrifuge tubes have perforated plastic inserts over a poly sucrose / sodium metrizoate density gradient. As a result, a considerable reduction in the time required can be achieved. Blood was drawn before and immediately after the radiation. The following is indicated: the diagnosis (D), the radiation field (BF), the period in days (d) between the last radiation day before the blood sample (LBT), the total dose applied up to that point (GD) and the respective individual dose (ED) in Gray (Gy).

Patient P1: D: Rektum-Ca; BF: Becken; LBT: 2 d; GD: 9 Gy; ED: 1,8 Gy.
Patient P2: D: M. Hodgkin; BF: Thoraxmantelfeld; LBT: 2 d; GD: 12 Gy; ED: 2 Gy.
Patient P3: D: Mamma-Ca; BF: Mamma-Kobalt; LBT: 5 d; GD: 48 Gy; ED: 2 Gy.
Patient P4: D: Mamma-Ca; BF: Mamma und Sternum-Kobalt; LBT: 5 d; GD: 16 Gy; ED:2Gy.
Patient P5: D: Collum-Ca; BF: Becken, komb. Radiochemo; LBT: 3 d; GD: 14,4 Gy; ED: 1,8 Gy.
Patient P6: D: Corpus-Ca; BF: Becken; LBT: 3 d; GD: 39,6 Gy; ED: 1,8 Gy.
Patient P7: D: Hals-LK-Spätmetastasen bei Tonsillen-Ca; BF: Kopf-Hals; LBT: 3 d; GD:38Gy;ED:2Gy.
Patient P8: D: Gaumen-Ca; BF: Kopf-Hals; LBT: 3 d; GD: 48 Gy; ED: 2 Gy.Patient P1: D: rectum Ca; BF: basin; LBT: 2 d; GD: 9 Gy; ED: 1.8 Gy.
Patient P2: D: M. Hodgkin; BF: thoracic mantle field; LBT: 2 d; GD: 12 Gy; ED: 2 Gy.
Patient P3: D: Mamma-Ca; BF: Mamma Cobalt; LBT: 5 d; GD: 48 Gy; ED: 2 Gy.
Patient P4: D: Mamma-Ca; BF: Mamma and Sternum Cobalt; LBT: 5 d; GD: 16 Gy; ED: 2Gy.
Patient P5: D: Collum-Ca; BF: pool, comb. Radiochemo; LBT: 3 d; GD: 14.4 Gy; ED: 1.8 Gy.
Patient P6: D: Corpus Ca; BF: basin; LBT: 3 d; GD: 39.6 Gy; ED: 1.8 Gy.
Patient P7: D: Neck LK late metastases with tonsil Ca; BF: head and neck; LBT: 3 d; GD: 38Gy; ED: 2Gy.
Patient P8: D: palate ca; BF: head and neck; LBT: 3 d; GD: 48 Gy; ED: 2 Gy.

ErgebnisResult

Wie Abb. 1 zeigt, steigt der Wert für den Strand Scission Factor (SSF), der ein Maß für die DNA-Schäden (Einzelstrangbrüche) darstellt, bei den Patienten Nr. 1, 2, 4, 6, 7 und 8 an. In Abb. 1 wurde als Kontrolle jeweils die DNA der Patienten vor der Bestrahlung genommen; wiedergegeben ist somit die Änderung des Zustandes der DNA (DNA-Schäden, Einzelstrangbrüche) bei den Patienten im Verlauf der Bestrahlung. Bei Patient Nr. 3 ergibt sich eine Abnahme (möglicherweise durch das Auftreten von DNA-Quervernetzungen bedingt), Patient Nr. 5 zeigt keine Änderung des SSC. In Abb. 2 wurden die SSC-Werte der Patienten im Vergleich zu einer weitgehend intakten Kontroll-DNA berechnet. Dabei zeigt sich, daß bei den Patienten bereits vor der Bestrahlung beträchtliche individuelle Unterschiede im Zustand der DNA (DNA-Einzelstrangbrüche) bestanden (Abb. 2). Die Werte für den SSF Patienten nehmen bei den meisten (vorbestrahlten) Patienten nach Bestrahlung weiter zu (Abb. 2).As Fig. 1 shows, the value for the Strand Scission Factor (SSF), which is a measure of DNA damage (single strand breaks), rises in patients No. 1, 2, 4, 6, 7 and 8. In Fig. 1, the DNA of the patient was taken as a control before the irradiation; the change in the state of the DNA (DNA damage, single-strand breaks) in the patients during the course of the radiation is thus reproduced. There is a decrease in patient No. 3 (possibly due to the occurrence of DNA cross-links), patient No. 5 shows no change in the SSC. In Fig. 2, the SSC values of the patients were calculated in comparison to a largely intact control DNA. It can be seen that there were considerable individual differences in the state of the DNA (DNA single-strand breaks) in the patients even before irradiation ( Fig. 2). The values for the SSF patient continue to increase in most (pre-irradiated) patients after radiation ( Fig. 2).

Bestimmung der Sensitivität des Assays und der Messung der DNA-Reparatur (humane Lymphozyten)Determination of sensitivity of the assay and measurement of DNA repair (human lymphocytes) Durchführungexecution

Bei diesen Untersuchungen wurden humane Lymphozyten nach Blutentnahme unterschiedlichen Strahlendosen ausgesetzt und anschließend der Zustand der DNA und die DNA-Reparatur bestimmt. Die Lymphozyten wurden in nur 0,5%igem fetalem Kälberserum gehalten und dann mit verschiedenen Strahlendosen behandelt. Zur Untersuchung der DNA-Reparatur wurden die Zellen nach der Bestrahlung für 0 bis 24 Stunden weiter inkubiert.In these studies, human lymphocytes were taken after blood was drawn exposed to different radiation doses and then the condition of the DNA and DNA repair determined. The lymphocytes were only 0.5% fetal calf serum and then with different radiation doses treated. To investigate the DNA repair, the cells were examined after the Irradiation was further incubated for 0 to 24 hours.

ErgebnisResult

Abb. 3 zeigt, daß mit zunehmender Dosis der SSC im Bereich 0.5 bis 2.5 Gray fast linear zunimmt. Nach Inkubation der nach Bestrahlung von EDTA-Blut isolierten Lymphozyten für 2 h war ein Großteil der induzierten Strangbrüche repariert (Abb. 3). Fig. 3 shows that with increasing dose the SSC increases almost linearly in the range 0.5 to 2.5 Gray. After incubation of the lymphocytes isolated after irradiation of EDTA blood for 2 h, a large part of the induced strand breaks was repaired ( Fig. 3).

Zeitabläufe für Untersuchungen an Patienten-LymphozytenTime lapse for examinations on patient lymphocytes Schema I (Bestimmung von DNA-Schäden und deren Reparatur in Patienten­ lymphozyten nach Bestrahlung in vitro)Scheme I (determination of DNA damage and its repair in patients lymphocytes after radiation in vitro)

  • 1. Blutentnahme (EDTA-Blut).1. Blood collection (EDTA blood).
  • 2. Bestrahlung mit unterschiedlichen Strahlendosen.2. Irradiation with different radiation doses.
  • 3. Transport von der Strahlenquelle bis zur Zentrifuge: ca. 1 Min.3. Transport from the radiation source to the centrifuge: approx. 1 min.
  • 4. Zentrifugation an präformierten Dichtegradienten in speziellen Zentrifugen­ röhrchen mit perforierten Plastikeinsätzen (UNI-SEP-Zentrifugenröhrchen der Firma Eldan Tech) (10 Min.).4. Centrifugation on preformed density gradients in special centrifuges tubes with perforated plastic inserts (UNI-SEP centrifuge tubes from Company Eldan Tech) (10 min.).
  • 5. Resuspension der peripheren Blut-Lymphozyten (PBLs) in Medium.5. Resuspension of peripheral blood lymphocytes (PBLs) in medium.
Untersuchung der DNA-SchädenInvestigation of DNA damage

6a. Entweder direkte Untersuchung der DNA-Schäden oder Einfrieren des Zell- Pellets in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis und evtl. kurzfristige Lagerung bei -80°C bis zur Untersuchung. (Für das Einfrieren und Wiederauftauen der Proben wurde eine spezielle Technik entwickelt, mit Hilfe derer das hierdurch bedingte eventuelle Auftreten zusätzlicher DNA-Strangbrüche verhindert werden kann. Vorgehen entsprechend wie unter 1.2.3 beschrieben.)6a. Either examine DNA damage directly or freeze the cell Pellets in liquid nitrogen or dry ice and possibly short-term storage -80 ° C until examination. (A special technique was used to freeze and thaw the samples developed, with the help of which the eventual occurrence of additional DNA strand breaks can be prevented. The procedure is the same as in 1.2.3 described.)

Untersuchung der DNA-ReparaturInvestigation of DNA repair

6.b Weiterinkubation der Zellen für 0 bis 24 Stunden.6.b Incubate the cells for 0 to 24 hours.

7.b Zentrifugation (nach 0 bis 24 Stunden): 10 Min.7.b centrifugation (after 0 to 24 hours): 10 min.

8.b Falls notwendig: Einfrieren des Pellets in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis und Lagerung bei -80°C bis zur Weiterverarbeitung.8.b If necessary: freeze the pellet in liquid nitrogen or dry ice and storage at -80 ° C until further processing.

9.b Durchführung des Assay.9.b Perform the assay.

Schema II (Bestimmung von DNA-Schäden in den Lymphozyten bestrahlter Patienten und deren Reparatur in vivo)Scheme II (Determination of DNA damage in the lymphocytes irradiated Patients and their repair in vivo)

  • 1. Blutentnahme (EDTA-Blut) beim Patienten unmittelbar oder bei Reparaturuntersuchungen zu definierten Zeiten nach der Bestrahlung.1. Blood sampling (EDTA blood) from the patient immediately or at Repair examinations at defined times after irradiation.
  • 2. Isolierung der PBLs durch Zentrifugation in präformierten Dichtegradienten (s. o.) (bei 8°C; 10 Min.).2. Isolation of the PBLs by centrifugation in preformed density gradients (see above) (at 8 ° C; 10 min.).
  • 3. Entnahme der PBLs.3. Removal of the PBLs.
  • 4. Durchführung des Assays oder:4. Carrying out the assay or:
  • 5. Einfrieren des Pellets in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis und evtl. kurzfristige Lagerung bei -80°C.5. Freeze the pellet in liquid nitrogen or dry ice and possibly short-term storage at -80 ° C.
  • 6. Durchführung des Assays.6. Perform the assay.
Einfluß der DNA-Konzentration und des pH DurchführungInfluence of DNA concentration and pH execution

Zur Bestimmung der Abhängigkeit der PicoGreen-Fluoreszenz von der DNA-Menge wurde native und denaturierte Kalbsthymus-DNA eingesetzt. Die denaturierte DNA wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 100°C erhalten. Zur Bestimmung der Abhängigkeit der PicoGreen-Fluoreszenz vom pH wurde die DNA-Denaturierung (DNA-Entwindung) bei verschiedenen pH-Werten (zwischen pH 7 und pH 13) durchgeführt.To determine the dependence of PicoGreen fluorescence on the amount of DNA native and denatured calf thymus DNA was used. The denatured DNA was obtained by heating at 100 ° C for 10 minutes. To determine the DNA denaturation was dependent on the PicoGreen fluorescence from the pH (DNA unwinding) at different pH values (between pH 7 and pH 13) carried out.

ErgebnisResult

Abb. 4 zeigt, daß bis zu einer DNA-Menge von 80 ng pro Vertiefung (Well) eine fast lineare Beziehung zwischen der Fluoreszenz und der DNA-Menge besteht. Bei pH-Werten ≧ 12.6 besteht kein Unterschied mehr zwischen den mit nativer und mit denaturierter DNA erhaltenen Fluoreszenzwerten (Abb. 5A,B). Fig. 4 shows that up to a DNA amount of 80 ng per well (well) there is an almost linear relationship between the fluorescence and the amount of DNA. At pH values ≧ 12.6 there is no longer any difference between the fluorescence values obtained with native and with denatured DNA ( Fig. 5A, B).

Bestimmung der DNA-Strangbrüche in L5178Y-Mäuselymphomzellen nach Inkubation mit Nitrochinolin-N-oxid und Bestrahlung mit Cs137Determination of DNA strand breaks in L5178Y mouse lymphoma cells Incubation with nitroquinoline N-oxide and irradiation with Cs137 Durchführungexecution

L5178Y-Mäuselymphomzellen wurden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Nitrochinolin-N-oxid für 1,5 Stunden inkubiert bzw. unterschiedlichen Strahlendosen von Cs137 ausgesetzt. Die Bestimmung der DNA-Strangbrüche erfolgte unmittelbar nach der Inkubation bzw. Bestrahlung.L5178Y mouse lymphoma cells were in the presence of various concentrations incubated on nitroquinoline N-oxide for 1.5 hours or different Exposed to radiation doses of Cs137. Determination of DNA strand breaks took place immediately after incubation or irradiation.

ErgebnisResult

Abb. 6 zeigt eine konzentrationsabhängige Zunahme der DNA-Strangbrüche [Zunahme von SSF x(-1)] nach Inkubation der Zellen mit NQO. Ebenso wurde nach Bestrahlung der Zellen mit Cs137 eine dosisabhängige Zunahme der DNA-Strang­ brüche festgestellt (Abb. 7). Fig. 6 shows a concentration-dependent increase in DNA strand breaks [increase in SSF x (-1)] after incubation of the cells with NQO. A dose-dependent increase in DNA strand breaks was also found after irradiation of the cells with Cs137 ( Fig. 7).

Bestimmung der DNA-Strangbrüche in HeLa-Zellen in Abhängigkeit von der UV-Strahlen­ dosisDetermination of DNA strand breaks in HeLa cells depending on the UV rays dose Durchführungexecution

HeLa-Zellen wurden mit UV-Strahlendosen zwischen 10 und 500 J/m2 bestrahlt. Die Bestimmung der DNA-Strangbrüche erfolgte unmittelbar nach der Bestrahlung.HeLa cells were irradiated with UV radiation doses between 10 and 500 J / m 2 . The DNA strand breaks were determined immediately after the irradiation.

ErgebnisResult

Wie Abb. 7 zeigt, weist SSF x(-1) bei Dosen zwischen 10 und 100 J/m2 negative Werte (wahrscheinlich durch das Auftreten von DNA-Quervernetzungen verursacht) und bei Dosen zwischen 200 und 500 J/m2 positive Werte (Auftreten von DNA- Strangbrüchen) auf.As Fig. 7 shows, SSF x (-1) has negative values at doses between 10 and 100 J / m 2 (probably caused by the occurrence of DNA cross-links) and positive values at doses between 200 and 500 J / m 2 ( Occurrence of DNA strand breaks).

Bestimmung der DNA-Strangbrüche in Muskel- und Leber-Gewebe junger und alter Mäuse in Abhängigkeit von der Strahlendosis (Cs137)Determination of DNA strand breaks in muscle and liver tissue in young and old mice depending on the radiation dose (Cs137) Durchführungexecution

Die Bestimmung der DNA-Strangbrüche in Muskel- und Leber-Gewebe von Mäusen unterschiedlichen Alters wurde entsprechend dem Protokoll für Gewebeproben durchgeführt. Die Bestrahlung erfolgte mit Dosen von 0 bis 200 rad (Cs137).Determination of DNA strand breaks in muscle and liver tissue in mice of different ages was according to the protocol for tissue samples carried out. Irradiation was carried out with doses from 0 to 200 rad (Cs137).

ErgebnisResult

In Mäusemuskel wurde bei Strahlendosen von 24 bis 64 rad eine signifikant (p < 0.001) größere Anzahl an DNA-Strangbrüchen bei jungen im Vergleich zu alten Tieren festgestellt (Abb. 8 oben). Dagegen lag der SSF x(-1) bei den Lebern alter Mäuse höher als bei den Lebern junger Tiere (Ausnahme: Bestrahlung mit 100 rad) (Abb. 8 unten). A significantly larger (p <0.001) larger number of DNA strand breaks was found in young muscles compared to older animals at radiation doses of 24 to 64 rad ( Fig. 8 above). In contrast, the SSF x (-1) was higher in the livers of old mice than in the livers of young animals (exception: radiation with 100 rad) ( Fig. 8 below).

3. Erläuterungen zu den Abbildungen3. Explanations to the pictures

Im nachfolgenden sind die erläuternden Legenden zu den auf den Seiten 15-23 abgebildeten Grafiken aufgeführt:Below are the explanatory legends to those on pages 15-23 shown graphics:

Abb. 1: Zunahme der DNA-Strangbrüche in Strahlenpatienten nach Bestrahlung (Kontroll-DNA: DNA der Patienten vor der Bestrahlung). Fig. 1: Increase in DNA strand breaks in radiation patients after radiation (control DNA: DNA of the patients before radiation).

Abb. 2: DNA-Strangbrüche in Strahlentherapie-Patienten vor und nach Bestrahlung (Kontrolle: nichtbestrahlte humane Lymphozyten-DNA mit geringer DNA-Strangbruchzahl). Fig. 2: DNA strand breaks in radiation therapy patients before and after radiation (control: non-irradiated human lymphocyte DNA with a low number of DNA fragments).

Abb. 3: Abhängigkeit des SSF von der Dosis und Reparatur von DNA-Schäden (humane Lymphozyten). Fig. 3: Dependence of the SSF on the dose and repair of DNA damage (human lymphocytes).

Abb. 4: Abhängigkeit der PicoGreen-Fluoreszenz von der DNA-Menge pro Vertiefung (Well). Eingesetzt wurde native und denaturierte (erhalten durch 10-minü­ tiges Erhitzen auf 100°C) Kalbsthymus-DNA (Sigma). Fig. 4: Dependence of the PicoGreen fluorescence on the amount of DNA per well (well). Native and denatured (obtained by heating to 100 ° C. for 10 minutes) calf thymus DNA (Sigma) was used.

Abb. 5: Abhängigkeit der PicoGreen-Fluoreszenz vom pH. Eingesetzt wurde native und denaturierte (erhalten durch 10-minütiges Erhitzen auf 100°C) Kalbsthymus-DNA (Sigma). (A) Bereich pH 7 bis pH 12. (B) Bereich pH 12 bis pH 13. Fig. 5: Dependence of PicoGreen fluorescence on pH. Native and denatured (obtained by heating at 100 ° C. for 10 minutes) calf thymus DNA (Sigma) was used. (A) pH 7 to pH 12 range. (B) pH 12 to pH 13 range.

Abb. 6: DNA-Strangbrüche in L5178Y-Mäuselymphomzellen nach Inkubation der Zellen für 1,5 Stunden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Nitrochinolin-N-oxid (NQO). Die Bestimmung des SSF erfolgte nach einer Entwindungszeit von 18 Minuten. Die Zellzahl pro Vertiefung (Well) betrug 3600. Fig. 6: DNA strand breaks in L5178Y mouse lymphoma cells after incubation of the cells for 1.5 hours in the presence of various concentrations of nitroquinoline N-oxide (NQO). The SSF was determined after a unwinding time of 18 minutes. The cell number per well was 3600.

Abb. 7: DNA-Strangbrüche in L51 78Y-Mäuselymphomzellen in Abhängigkeit von der Strahlendosis (Bestrahlung mit Cs137). Die Bestimmung des SSF erfolgte nach einer Entwindungszeit von 19,3 Minuten. Die Zellzahl pro Vertiefung (Well) betrug 2800. Fig. 7: DNA strand breaks in L51 78Y mouse lymphoma cells depending on the radiation dose (irradiation with Cs137). The SSF was determined after a unwinding time of 19.3 minutes. The cell number per well was 2800.

Abb. 8: DNA-Strangbrüche in HeLa-Zellen in Abhängigkeit von der UV-Strahlen­ dosis. Fig. 8: DNA strand breaks in HeLa cells as a function of the UV radiation dose.

Abb. 9: DNA-Strangbrüche in Muskel- und Leber-Gewebe junger und alter Mäuse in Abhängigkeit von der Strahlendosis (Bestrahlung mit Cs137). Die Bestimmung des SSF erfolgte nach einer Entwindungszeit von 20 Minuten. Fig. 9: DNA strand breaks in muscle and liver tissue in young and old mice depending on the radiation dose (irradiation with Cs137). The SSF was determined after a unwinding time of 20 minutes.

Claims (8)

1. Verwendung der beschriebenen Methode zum Nachweis von DNA-Schäden in humanen oder tierischen Geweben und Zellen, Zellinien humanen oder tierischen Ursprungs, subzellulären Fraktionen sowie von isolierter DNA.1. Use of the described method for the detection of DNA damage in human or animal tissues and cells, cell lines human or animal Origin, subcellular fractions and isolated DNA. 2. Verwendung der beschriebenen Methode zum Nachweis von DNA-Reparatur in den unter 1. genannten Geweben, Zellen bzw. Molekülen.2. Use of the described method for the detection of DNA repair in the tissues, cells or molecules mentioned under 1. 3. Verwendung der beschriebenen Methode zur Messung des Auftretens von DNA-Schäden nach Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Behandlung mit Modell- und Umwelt-Gentoxinen (Mutagene und Cancerogene) in Gewebeschnitten und Zellsuspensionen.3. Use the described method to measure the occurrence of DNA damage after radiation, chemotherapy and / or treatment with model and Environmental genotoxins (mutagens and cancerogens) in tissue sections and Cell suspensions. 4. Verwendung der beschriebenen Methode zum Nachweis von DNA-Schäden und -Reparatur in humanem (Blutzellen und Gewebebiopsien) und tierischem Probenmaterial (Blutzellen und Gewebe sowie Zellsuspensionen von Vertebraten und Invertebraten, einschließlich marinen Organismen).4. Use of the described method for the detection of DNA damage and -Repair in human (blood cells and tissue biopsies) and animal Sample material (blood cells and tissue as well as cell suspensions of vertebrates and invertebrates, including marine organisms). 5. Verwendung der beschriebenen Methode zum Nachweis von DNA-Schäden und deren Reparatur in humanen oder tierischen Lymphozyten nach deren schneller Isolierung mittels Zentrifugation in UNI-SEP-Röhrchen.5. Use of the described method for the detection of DNA damage and their repair in human or animal lymphocytes after their faster Isolation by centrifugation in UNI-SEP tubes. 6. Verwendung der beschriebenen Methode zum Nachweis von DNA-Schäden in gefrorenen Untersuchungsmaterialien (z. B. Biopsieproben) nach deren schonender Homogenisation in flüssigem Stickstoff bzw. flüssiger Luft in Gegenwart eines Gefrierschutzmittels (wie z. B. Dimethylsulfoxid).6. Use of the described method for the detection of DNA damage in frozen test materials (e.g. biopsy samples) after their more gentle Homogenization in liquid nitrogen or liquid air in the presence of a Antifreeze (such as dimethyl sulfoxide). 7. Verwendung der beschriebenen Methode zur Bestimmung der Entwindung (und deren Umkehr) sowie zum Nachweis von Strangbrüchen in DNA-RNA-Hybriden und Doppelstrang-RNAs.7. Use of the described method for determining the unwinding (and their reversal) and for the detection of strand breaks in DNA-RNA hybrids and Double stranded RNAs. 8. Verwendung der beschriebenen Methode zur Messung der Entwindung (und deren Umkehr) in modifizierten DNAs.8. Use of the described method for measuring the unwinding (and their reversal) in modified DNAs.
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