DE19724185C1 - New bipyridinium compounds useful as vascular endothelial cell growth factor blockers - Google Patents
New bipyridinium compounds useful as vascular endothelial cell growth factor blockersInfo
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- C07D213/06—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom containing only hydrogen and carbon atoms in addition to the ring nitrogen atom
- C07D213/22—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom containing only hydrogen and carbon atoms in addition to the ring nitrogen atom containing two or more pyridine rings directly linked together, e.g. bipyridyl
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft Bipyridiniumderivate mit VEGF-Rezeptor-Blocker Eigenschaften und deren Verwendung zur Behandlung von verschiedenen Erkrankungen.The invention relates to bipyridinium derivatives with VEGF receptor blocker properties and their use in the treatment of various diseases.
Persistente Angiogenese kann die Ursache für verschiedene Erkrankungen wie Psoriasis, Rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Diabetische Retinopathie und Neovaskulares Glaukom sein oder zu einer Verschlimmerung dieser Erkrankungen führen.Persistent angiogenesis can cause various diseases such as Psoriasis, rheumatoid arthritis, hemangioma, angiofribroma, diabetic Retinopathy and neovascular glaucoma, or worsening of them Lead diseases.
Ein Inhibitor mit VEGF-Rezeptor-Blocker Eigenschaften kann zur Behandlung derartiger Erkrankungen und anderer VEGF-induzierter pathologischer Angiogenese und vaskularer permeabiler Bedingungen, wie Tumor-Vaskularisierung, verwendet werden.An inhibitor with VEGF receptor blocker properties can be used for treatment such diseases and other VEGF-induced pathological angiogenesis and vascular permeable conditions such as tumor vascularization become.
Es ist bekannt, daß durch lösliche Rezeptoren und Antikörper gegen VEGF das Wachstum von Tumoren gehemmt werden kann.It is known that by soluble receptors and antibodies against VEGF that Growth of tumors can be inhibited.
In der WO 94/21679 sind vaskulare endotheliale Zellwachstumsfaktor(VEGF)-In hibitoren beschrieben, die natürlichen Ursprungs sind oder rekombinant hergestellte lösliche Formen darstellen. Es wird ferner beschrieben, daß die löslichen Formen des Rezeptors an den Wachstumsfaktor mit hoher Affinität binden und nicht zu Signaltransduktionen führen. Derartige lösliche Formen des Rezeptors binden VEGF und inhibieren seine Funktion.In WO 94/21679 vascular endothelial cell growth factor (VEGF) -In described hibitors, which are of natural origin or recombinantly produced represent soluble forms. It is also described that the soluble forms of Bind receptor to the growth factor with high affinity and not to Lead signal transduction. Such soluble forms of the receptor bind VEGF and inhibit its function.
Nachteilig an den bekannten Inhibitoren ist, daß diese aus hochmolekularen Peptiden bestehen, deren Isolierung bzw. Herstellung, Charakterisierung und Reinigung mit großem Arbeitsaufwand verbunden ist. Ferner lassen sich derartige hochmolekulare Verbindungen in der Regel nicht ohne Probleme zu Medikamenten formulieren und anschließend als Medikament applizieren.A disadvantage of the known inhibitors is that they consist of high molecular weight peptides exist, their isolation or manufacture, characterization and cleaning with a lot of work is involved. Such high molecular weight can also be used Compounds usually do not formulate drugs without problems and then apply as a medication.
Ferner ist die Haltbarkeit derartiger Präparate geringer als bei niedermolekularen Verbindungen.Furthermore, the shelf life of such preparations is lower than that of low-molecular ones Links.
Aus der US 3,628,958 sind strukturanaloge Stoffe bekannt, deren Anwendung aber auf einem völlig anderen Gebiet liegen. Aus der WO 95/21613 sind Chinazoline bekannt, deren Wirkung den erfindungsgemäßen Verbindungen analog sind.Structurally analogous substances are known from US Pat. No. 3,628,958, but their use is based on in a completely different area. Quinazolines are known from WO 95/21613, the effects of which are analogous to the compounds according to the invention.
Es wurden nun Bipyridiniumderivate der allgemeinen Formel I
There were now bipyridinium derivatives of the general formula I
in der
R1, R3, R6 und R8 Wasserstoff, C1-C6-Alkyl, die Gruppe -COCH3 oder
die Gruppe -CO2CH3,
R2, R4, R5, R7, R9 und R10 Wasserstoff und Hydroxy und die Gruppe -CO2CH3,
Alkylen1-2 C2-C5-Alkylen,
X⁻ F⁻, Cl⁻, Br⁻ oder J⁻
bedeuten,
wobei, falls X⁻ für Br⁻ und Alkylen für Ethylen steht, R1-R10 nicht für Wasserstoff steht,
gefunden, die gegenüber den bekannten Verbindungen bessere Eigenschaften
aufweisen.in the
R 1 , R 3 , R 6 and R 8 are hydrogen, C 1 -C 6 alkyl, the group -COCH 3 or the group -CO 2 CH 3 ,
R 2 , R 4 , R 5 , R 7 , R 9 and R 10 are hydrogen and hydroxy and the group -CO 2 CH 3 ,
Alkylene 1-2 C 2 -C 5 alkylene,
X⁻ F⁻, Cl⁻, Br⁻ or J⁻
mean,
where, if X⁻ is Br⁻ and alkylene is ethylene, R 1 -R 10 is not hydrogen, found to have better properties than the known compounds.
Bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der
R1, R3, R6 und R8 Wasserstoff, Propyl, t-Butyl, 2-Methyl-2-butyl,
2-Methyl-2-pentyl und die Gruppe -COCH3,
R2, R4, R5, R7, R9 und R10 Wasserstoff und Hydroxy,
Alkylen1 und Alkylen2 C2-C5-Alkyl und
X⁻ Br⁻
bedeuten.Preferred compounds of the general formula I are those in which
R 1 , R 3 , R 6 and R 8 are hydrogen, propyl, t-butyl, 2-methyl-2-butyl, 2-methyl-2-pentyl and the group -COCH 3 ,
R 2 , R 4 , R 5 , R 7 , R 9 and R 10 are hydrogen and hydroxy,
Alkylene 1 and alkylene 2 C 2 -C 5 alkyl and
X⁻ Br⁻
mean.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Verbindung der allgemeinen Formel I,
in der
R1-R10 für Wasserstoff,
Alkylen für Ethylen und
X⁻ für Br⁻ steht,
als pharmazeutischen Wirkstoff.The invention further relates to the use of the compound of general formula I in which
R 1 -R 10 for hydrogen,
Alkylene for ethylene and
X⁻ stands for Br⁻,
as an active pharmaceutical ingredient.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen kommen als pharmazeutische Wirkstoffe zur Anwendung und können alleine oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel I enthält, zusammen mit pharmazeutisch geeigneten Lösungen und Trägern appliziert werden. The compounds of the invention come as active pharmaceutical ingredients Application and can be used alone or in the form of a pharmaceutical Composition containing one or more compounds of general formula I contains, applied together with pharmaceutically suitable solutions and carriers become.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können alleine, als Gemisch oder als Zusammensetzung gemeinsam mit pharmazeutisch geeigneten Lösungen und Trägern enteral, parenteral, intravenös, subkutan, oral oder transdermal appliziert werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen und deren Zusammensetzungen und Gemische können zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen wie Psoriasis, Rheumatoider Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Diabetischer Retinopathie und Neovaskularem Glaukom und anderer VEGF-induzierter pathologischer Angiogenese, VEGF-bedingter Gefäßpermeabilisierung, Ödemen, Schlaganfall und vaskularer permeabiler Bedingungen, wie Tumor-Vaskularisierung, verwendet werden.The compounds of the invention can be used alone, as a mixture or as Composition together with pharmaceutically suitable solutions and carriers enterally, parenterally, intravenously, subcutaneously, orally or transdermally. The compounds according to the invention and their compositions and mixtures can be used to manufacture a drug for the treatment of diseases such as Psoriasis, rheumatoid arthritis, hemangioma, angiofribroma, diabetic Retinopathy and neovascular glaucoma and other VEGF-induced pathological angiogenesis, VEGF-related vascular permeabilization, edema, Stroke and vascular permeable conditions such as tumor vascularization, be used.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung des Wachstums von Tumoren und Metastasen verwendet werden.In particular, the compounds of the invention can be used to prepare a Medicinal product used to inhibit the growth of tumors and metastases become.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, deren Zusammensetzungen und Gemische, können auch zur Behandlung von Erkrankungen mit angiogenem Hintergrund wie Endometriose, Adenomyosis, Dysfunktionale Blutung des Uterus, Choriocarcinoma, Ektopische Schwangerschaft und Erkrankungen des Ovars verwendet werden.The compounds according to the invention, their compositions and mixtures, can also be used to treat diseases with an angiogenic background such as Endometriosis, adenomyosis, dysfunctional uterine bleeding, choriocarcinoma, Ectopic pregnancy and diseases of the ovary can be used.
Geeignete Zusammensetzungen können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden, wobei alle für eine Formulierung der Verbindungen der allgemeinen Formel I in der Pharmazie verwendbaren Lösungen, Träger und Zusatzstoffe zum Einsatz kommen können (Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania, 1980).Suitable compositions can be prepared by methods known per se are, all for a formulation of the compounds of general formula I in solutions, carriers and additives that can be used in pharmacy are used can (Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania, 1980).
Für den therapeutischen Einsatz kommen verschiedene Dosen der erfindungsgemäßen Verbindungen in Frage. So hängt die applizierbare Dosis von der jeweiligen Verbindung, dem Individuum, der Applikationsart (enteral, parenteral, intravenös, subkutan, oral, transdermal) und von der Schwere der zu behandelnden Krankheit ab. Different doses of the invention come for therapeutic use Connections in question. The dose that can be applied depends on the particular dose Connection, the individual, the type of application (enteral, parenteral, intravenous, subcutaneously, orally, transdermally) and depending on the severity of the disease to be treated.
Die Verbindungen können nach dem unten aufgeführten Schema hergestellt werden.The compounds can be prepared according to the scheme below.
Verbindungen der Formel IV sind in der Literatur bekannt und teilweise auch käuflich zu erwerben. Sie können beispielsweise hergestellt werden, indem man ein Phenol der Formel II in Gegenwart einer Base mit einem Dihalogenalkan der Formel III in einem polaren Lösungsmittel wie z. B. Tetrahydrofuran umsetzt.Compounds of the formula IV are known in the literature and some are also commercially available acquire. For example, they can be made by using a phenol Formula II in the presence of a base with a dihaloalkane of the formula III in one polar solvents such as B. tetrahydrofuran.
Es ist bekannt (C. C. Wamser et al., Synthetic Commun., 23(9), 1339-1349 (1993)), daß die Alkylierung des 4,4'-Bipyridyls schrittweise durchgeführt werden kann. So wird Schritt 2 in einem unpolaren Lösungsmittel wie z. B. Toluol durchgeführt, wobei die Verbindungen der Formel VI aus dem Reaktionsgemisch ausfallen. Schritt 3 wird dann in einem etwas polareren Lösungsmittel wie z. B. Acetonitril ausgeführt, in dem Verbindungen der Formel VI löslich sind, jedoch Verbindungen der Formel I ausfallen.It is known (C.C. Wamser et al., Synthetic Commun., 23 (9), 1339-1349 (1993)), that the alkylation of 4,4'-bipyridyl can be carried out step by step. So will Step 2 in a non-polar solvent such as. B. toluene, the Compounds of formula VI precipitate out of the reaction mixture. Step 3 will then in a slightly more polar solvent such as e.g. B. executed acetonitrile in which Compounds of formula VI are soluble, but compounds of formula I fail.
Falls Alkylen1 und Alkylen2 und auch die Reste R1 und R6, R2 und R7, R3 und R8, R4 und R9, R5 und R10 identisch sind, können Schritt 2 und 3 in einer Reaktion durchgeführt werden, indem man die doppelte Menge der Verbindung der Formel IV in einem etwas polareren Lösungsmittel wie z. B. Acetonitril einsetzt. If alkylene 1 and alkylene 2 and also the radicals R 1 and R 6 , R 2 and R 7 , R 3 and R 8 , R 4 and R 9 , R 5 and R 10 are identical, steps 2 and 3 can be carried out in one reaction be carried out by double the amount of the compound of formula IV in a somewhat more polar solvent such as. B. uses acetonitrile.
2,6 g Natriumhydrid (55%ig in Öl) werden zweimal mit je 10 ml Hexan
gewaschen und mit 70 ml Tetrahydrofuran versetzt. 14,1 g 2,4-Bis-(2-methyl-2-butyl)-
phenol in 30 ml Tetrahydrofuran werden dazugetropft. Nach 10 min
werden 25 ml Dimethylsulfoxid und 16,4 ml Dibrompentan dazugegeben. Die
Mischung wird 4 h bei 90°C gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur
wird das ausgefallene Salz abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Das Produkt wird
durch Vakuumdestillation gereinigt.
Kp: 205-210°C, 0,25 Torr.2.6 g of sodium hydride (55% in oil) are washed twice with 10 ml of hexane each time and 70 ml of tetrahydrofuran are added. 14.1 g of 2,4-bis (2-methyl-2-butyl) phenol in 30 ml of tetrahydrofuran are added dropwise. After 10 minutes, 25 ml of dimethyl sulfoxide and 16.4 ml of dibromopentane are added. The mixture is stirred at 90 ° C for 4 h. After cooling to room temperature, the precipitated salt is filtered off and the filtrate is concentrated. The product is purified by vacuum distillation.
Bp: 205-210 ° C, 0.25 Torr.
0,47 g 4,4'-Bipyridyl werden in 90 ml Acetonitril gelöst und mit 5,75 g 1-Brom-5-(2,4-bis-
(2-methyl-2-butyl)-phenoxy)-pentan versetzt. Die Mischung wird 72 h bei
80°C gerührt und anschließend auf ca. 20 ml eingeengt. Die Kristalle werden
abgesaugt, mit Diethylether gewaschen und getrocknet.
Fp: 230-231°C.
0.47 g of 4,4'-bipyridyl are dissolved in 90 ml of acetonitrile, and 5.75 g of 1-bromo-5- (2,4-bis (2-methyl-2-butyl) phenoxy) pentane are added . The mixture is stirred at 80 ° C. for 72 h and then concentrated to about 20 ml. The crystals are filtered off, washed with diethyl ether and dried.
Mp: 230-231 ° C.
In analoger Verfahrensweise wurden auch folgende Verbindungen hergestellt:
The following compounds were also prepared in an analogous manner:
In analoger Verfahrensweise wurden auch die folgenden am 04.02.1996
nachgereichten Verbindungen, hergestellt und gemäß Anwendungsbeispiel 3 auf ihre
Wirksamkeit getestet:
In an analogous procedure, the following compounds, which were submitted on February 4, 1996, were also prepared and tested for their effectiveness in accordance with Example 3:
Menschliche Nabelschnüre werden mit konischen Vorrichtung kanüliert und mit sterilem PBS-Puffer gewaschen, der Kalzium, Magnesium und Penicillin/Streptomycin enthält, um Blutzellen zu entfernen. Die Adern werden dann mit PBS-Puffer, der Chymotrypsin (0,1%) enthält, gefüllt und bei Raumtemperatur für 25 Minuten inkubiert. Nach leichter manueller Massage der Nabelschnüre wird die Zellsuspension in ein Gefäß gebracht, das 2 ml fötales Kälberserum enthält. Nach der Verdünnung mit Puffer werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, einmal mit Puffer gewaschen und pro Nabelschnur in zwei 25 cm2 Kulturflaschen ausgesät. Die Flaschen sind mit 10 µg/ml Kollagen, ggf. mit 1 µg/ml Fibronectin beschichtet. Die Kulturmedien enthalten M 199, 10% fötales Kälberserum (FCS), 10% Humanserum (HS), Glutamin oder Glutamax (2 mM), Penicillin (50 U/ml), Streptomycin (100 U/ml), Ascorbinsäure (0,00127 mM), Brenztraubensäure (1 mM) und 1% nichtessentielle Aminosäuren, 10 µg/ml Endothelialer-Zellwachstumsfaktor aus Rinderhirn und 7,5 µg/ml Heparin. 3 Stunden nach Ausplattierung werden die anhaftenden Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen, der Magnesium und Kalziumionen enthält. Danach werden die Zellen unter Standardbedingungen in dem oben beschriebenen Medium kultiviert. Anschließend werden die Zellen einer Trypsinverdauung ausgesetzt (0,02% Trypsin, 0,01% EDTA in phosphatgepufferter Salzlösung ohne bivalente Ionen), in Mikrotiterplatten mit einer Dichte von 1,6×104 Zellen/Well ausgesät und anschließend 3 bis 7 Tage kultiviert.Human umbilical cords are cannulated with a conical device and washed with sterile PBS buffer containing calcium, magnesium and penicillin / streptomycin to remove blood cells. The veins are then filled with PBS buffer containing chymotrypsin (0.1%) and incubated at room temperature for 25 minutes. After a gentle manual massage of the umbilical cords, the cell suspension is placed in a vessel that contains 2 ml of fetal calf serum. After dilution with buffer, the cells are collected by centrifugation, washed once with buffer and seeded in two 25 cm 2 culture bottles per umbilical cord. The bottles are coated with 10 µg / ml collagen, possibly with 1 µg / ml fibronectin. The culture media contain M 199, 10% fetal calf serum (FCS), 10% human serum (HS), glutamine or Glutamax (2 mM), penicillin (50 U / ml), streptomycin (100 U / ml), ascorbic acid (0.00127 mM), pyruvic acid (1 mM) and 1% non-essential amino acids, 10 µg / ml endothelial cell growth factor from bovine brain and 7.5 µg / ml heparin. 3 hours after plating, the adherent cells are washed twice with PBS buffer containing magnesium and calcium ions. The cells are then cultivated under standard conditions in the medium described above. The cells are then subjected to trypsin digestion (0.02% trypsin, 0.01% EDTA in phosphate-buffered saline solution without divalent ions), sown in microtiter plates with a density of 1.6 × 10 4 cells / well and then cultured for 3 to 7 days .
300 000 HUVEC wurden in jede Kavität einer 48-Kavitätenplatte ausgesät. Anschließend wurden die Zellen zwei Tage in einem Komplettmedium kultiviert und dann mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, die Kalzium und Magnesiumchlorid enthält. Anschließend wurden bei 4°C 100 µl Medium M 199 ohne Zusätze, aber mit 0,1% Rinderserumalbumin, hinzugefügt. Anschließend wurden jeweils 10 µl einer Lösung der erfindungsgemäßen Verbindungen hinzugefügt. Das Ganze wurde in DMSO gelöst und anschließend verdünnt. Danach wurden 40 µl 125l-VEGF hinzugefügt. Nach 2 Stunden Inkubationszeit bei 4°C wurde das Medium abgesaugt und 3mal mit 500 µl PBS gewaschen. Die Zellen wurden anschließend mit 100 µl 0,5% Natriumdodecylsulfat-Lösung unter gleichmäßigem Schütteln lysiert. Die Lösung wurde in ein Zählröhrchen zur Messung der γ-Strahlung gegeben. Das Resultat ergibt sich aus der Konzentration, die die spezifische Bindung zu 50% reduziert.300,000 HUVEC were sown in each well of a 48 well plate. The cells were then cultured in a complete medium for two days then washed with phosphate buffered saline, the calcium and Contains magnesium chloride. Then 100 .mu.l medium M 199 were without at 4 ° C. Additives but with 0.1% bovine serum albumin added. Then were 10 µl each of a solution of the compounds according to the invention are added. The The whole was dissolved in DMSO and then diluted. Then 40 ul 125l-VEGF added. After 2 hours of incubation at 4 ° C the medium aspirated and washed 3 times with 500 ul PBS. The cells were then with 100 µl 0.5% sodium dodecyl sulfate solution lysed with constant shaking. The Solution was placed in a counter tube to measure γ-radiation. The result results from the concentration that reduces the specific binding by 50%.
Man schüttelt Mikrotiterplatten mit 50 µl einer VEGFR II-Lösung (0,4 µg/ml), die durch Infektion mit Baculoviren aus Überständen von SF-9 Zellen gewonnen wurden. Danach wird weitere 30 min durch Zugabe von 4% BSA-Lösung in PBS-Puffer blockiert. Die Lösung wird entfernt und die Kavitäten werden mit 0,1% BSA in PBS-Puffer gewaschen.Microtiter plates are shaken with 50 µl of a VEGFR II solution (0.4 µg / ml) Baculovirus infection was obtained from supernatants from SF-9 cells. After that is blocked for a further 30 min by adding 4% BSA solution in PBS buffer. The Solution is removed and the wells are filled with 0.1% BSA in PBS buffer washed.
10 µl der erfindungsgemäßen Verbindungen oder nicht markiertes VEGF in PBS/0,1% BSA und danach 40 µl 125l-VEGF in PBS/ BSA (ca. 15 000 cpm oder 300-600 pM) werden auf die Mikrotiterplatten gegeben. Man inkubiert bei Raumtemperatur unter Schütteln für 60 min, entfernt die Radioaktivität, wäscht innerhalb von 10 Sekunden 3mal mit 0,1% BSA in PBS-Puffer, fügt 100 µl 0,5% SDS-Lösung hinzu und schüttelt 30 min. 80 µl der Lösung werden im γ-Zähler gemessen.10 µl of the compounds according to the invention or unlabelled VEGF in PBS / 0.1% BSA and then 40 µl 125l VEGF in PBS / BSA (approx. 15,000 cpm or 300-600 pM) are placed on the microtiter plates. Incubate at room temperature Shake for 60 min, remove the radioactivity, wash within 10 seconds 3 times with 0.1% BSA in PBS buffer, add 100 µl 0.5% SDS solution and shake 30 min. 80 µl of the solution are measured in the γ counter.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle I dargestellt.The results are shown in Table I.
100 000 HUVEC wurden in 12 Wellplatten plattiert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen auf Eis gelegt und frisches Medium wurde hinzugefügt, mit der Lösungsmittel-Kontrolle, VEGF oder VEGF plus erfindungsgemäße Verbindungen in eiskaltem Medium M 199, mit 0,1% BSA. Die Inkubation wurde für 1 Stunde fortgesetzt. Anschließend wurde das Medium entfernt und eiskalter RIPA-Puffer (50 mM HEPES pH 7,2,10 mM EDTA; 0,1% SDS; 1% NP-40; 0,5% Deoxycholat; 50 mM Na-Pyrophosphat; 100 mM NaF; 2 mM ortho-Vanadat; 1 mM Zinkacetat; 1,25 mM PMSF; 10 µg/ml Aprotinin) hinzugefügt. Die DNA wurde über eine Millipore-Filtration entfernt (0,65 mM). 50 µl Weizenkeimaggluti nin-Sepharose wurde zu dem Filtrat hinzugefügt und das Gemisch wurde unter einstündigem Rollen bei 4°C inkubiert. Die Sepharose wurde durch Zentrifugation getrennt, der Überstand wurde verworfen und 25 µl eines zweifach konzentrierten SDS-Elek trophorese-Puffers gemäß Laemmli wurde hinzugefügt und für 5 Minuten gekocht. Proteine wurden auf einem 6%igen SDS-Gel gemäß ihrer Größe getrennt. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran durch halbtrockenes Elektroblotting übertragen. Die Membran wurde mit 0,25% Tween in PBS, der Magnesium- und Kalziumchlorid enthält, blockiert. Nach drei 15-minütigen Waschschritten mit 0,05% Tween im gleichen Puffer wurden Meerettich-gekoppelte-Antiphosphotyrosin- monoklonale-Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 1000, was einer Konzentration von 250 ng/ml entspricht, in 0,05% Tween enthaltenden Puffer hinzugefügt. Nach jeweils drei 15-minütigen Waschschritten wurde der Blot mit einem Verstärkerchemolumineszenz-System entwickelt.100,000 HUVEC were clad in 12 corrugated sheets. After 48 hours, the cells put on ice and fresh medium was added with the solvent control, VEGF or VEGF plus compounds according to the invention in ice-cold medium M 199, with 0.1% BSA. Incubation was continued for 1 hour. Then that was Medium removed and ice-cold RIPA buffer (50 mM HEPES pH 7.2.10 mM EDTA; 0.1% SDS; 1% NP-40; 0.5% deoxycholate; 50 mM Na pyrophosphate; 100 mM NaF; 2 mM ortho vanadate; 1 mM zinc acetate; 1.25 mM PMSF; 10 µg / ml aprotinin) added. The DNA was removed via Millipore filtration (0.65 mM). 50 µl wheat germ aggluti Nin-Sepharose was added to the filtrate and the mixture was added under incubated for 1 hour at 4 ° C. The Sepharose was centrifuged separated, the supernatant was discarded and 25 µl of a twice concentrated SDS-Elek Laemmli trophorese buffers were added and cooked for 5 minutes. Proteins were separated on a 6% SDS gel according to their size. The Proteins were applied to a PVDF membrane by semi-dry electroblotting transfer. The membrane was coated with 0.25% Tween in PBS, the Magnesium and Contains calcium chloride, blocked. After three 15 minute washes with 0.05% Tween in the same buffer were horseradish-coupled-antiphosphotyrosine monoclonal antibodies in a dilution of 1: 1000, which is a concentration of Corresponds to 250 ng / ml, added in a buffer containing 0.05% Tween. After each the blot was washed with a three Amplifier chemiluminescence system developed.
Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.The results of the tests are shown in Table I below.
In der Tabelle I steht µM für die Substratkonzentrationen, die die 125l-VEGF-Bindung am Rezeptor zu 50% hemmen oder die Wirkung von VEGF auf die Rezeptorautophos phorylierung zu 50% unterdrücken. In Table I µM stands for the substrate concentrations that the 125l-VEGF binding inhibit 50% of the receptor or the effect of VEGF on the receptor autophos suppress phorylation to 50%.
Claims (7)
in der
R1, R3, R6 und R8 Wasserstoff, C1-C6-Alkyl, die Gruppe -COCH3 oder die Gruppe -CO2CH3,
R2, R4, R5, R7, R9 und R10 Wasserstoff und Hydroxy und die Gruppe -CO2CH3,
Alkylen1-2 C2-C5-Alkylen,
X⁻ F⁻, Cl⁻, Br⁻ oder J⁻
bedeuten,
wobei, falls X⁻ für Br⁻ und Alkylen für Ethylen steht, R1-R10 nicht für Wasserstoff steht.1. Bipyridinium derivatives of the general formula I
in the
R 1 , R 3 , R 6 and R 8 are hydrogen, C 1 -C 6 alkyl, the group -COCH 3 or the group -CO 2 CH 3 ,
R 2 , R 4 , R 5 , R 7 , R 9 and R 10 are hydrogen and hydroxy and the group -CO 2 CH 3 ,
Alkylene 1-2 C 2 -C 5 alkylene,
X⁻ F⁻, Cl⁻, Br⁻ or J⁻
mean,
where, if X⁻ is Br⁻ and alkylene is ethylene, R 1 -R 10 is not hydrogen.
R1, R3, R6 und R8 Wasserstoff, Propyl, t-Butyl, 2-Methyl-2-butyl, 2-Methyl-2-pentyl und die Gruppe -COCH3,
R2, R4, R5, R7, R9 und R10 Wasserstoff und Hydroxy,
Alkylen1 und Alkylen2 C2-C5-Alkyl und
X⁻ Br⁻
bedeuten.2. bipyridinium derivatives of the general formula I, according to claim 1, in the
R 1 , R 3 , R 6 and R 8 are hydrogen, propyl, t-butyl, 2-methyl-2-butyl, 2-methyl-2-pentyl and the group -COCH 3 ,
R 2 , R 4 , R 5 , R 7 , R 9 and R 10 are hydrogen and hydroxy,
Alkylene 1 and alkylene 2 C 2 -C 5 alkyl and
X⁻ Br⁻
mean.
R1-R10 für Wasserstoff,
Alkylen für Ethylen und
X⁻ für Br⁻ steht,
zur Herstellung eines Arzneimittels.3. Use of the compounds according to claims 1 and 2 and compounds of general formula I in which
R 1 -R 10 for hydrogen,
Alkylene for ethylene and
X⁻ stands for Br⁻,
for the manufacture of a drug.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997124185 DE19724185C1 (en) | 1997-06-02 | 1997-06-02 | New bipyridinium compounds useful as vascular endothelial cell growth factor blockers |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997124185 DE19724185C1 (en) | 1997-06-02 | 1997-06-02 | New bipyridinium compounds useful as vascular endothelial cell growth factor blockers |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19724185C1 true DE19724185C1 (en) | 1999-03-11 |
Family
ID=7831874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1997124185 Expired - Lifetime DE19724185C1 (en) | 1997-06-02 | 1997-06-02 | New bipyridinium compounds useful as vascular endothelial cell growth factor blockers |
Country Status (1)
| Country | Link |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3628958A (en) * | 1970-03-02 | 1971-12-21 | Eastman Kodak Co | Bipyridinium compound/nitrosubstituted n-heterocyclic compound desensitized silver halide emulsion |
| WO1995021613A1 (en) * | 1994-02-09 | 1995-08-17 | Sugen, Inc. | Compounds for the treatment of disorders related to vasculogenesis and/or angiogenesis |
-
1997
- 1997-06-02 DE DE1997124185 patent/DE19724185C1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3628958A (en) * | 1970-03-02 | 1971-12-21 | Eastman Kodak Co | Bipyridinium compound/nitrosubstituted n-heterocyclic compound desensitized silver halide emulsion |
| WO1995021613A1 (en) * | 1994-02-09 | 1995-08-17 | Sugen, Inc. | Compounds for the treatment of disorders related to vasculogenesis and/or angiogenesis |
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