DE19718248A1

DE19718248A1 - New nucleic acid encoding nCL-3 calpain

Info

Publication number: DE19718248A1
Application number: DE1997118248
Authority: DE
Inventors: T Dear Dr Neil; Thomas Prof Dr Boehm
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1997-04-30
Publication date: 1998-11-05

Abstract

The murine cDNA (I) for nCL-3 calpain of 2459 bp, its allelic variants encoding a protein having 60-100% homology at the amino acid (aa) level, analogues and derivatives are new. Also new are: (1) the corresponding human cDNA (Ia) of 1975 bp; (2) gene constructs containing (I) and (Ia) plus regulatory sequences; and (3) proteins (II) encoded by (I).

Description

Die Erfindung betrifft neue Calpaine und ihre Herstellung. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zum Screening nach neuen Calpaininhibitoren und deren Verwendung.The invention relates to novel calpains and their preparation. Furthermore, the invention relates to methods for screening after new calpain inhibitors and their use.

Calpaine gehören zu den intrazellulären, nicht-lysosomalen Enzymen aus der Gruppe der Cystein-Proteasen. Sie sind an der Ca²⁺ -abhängigen Signaltransduktion in eukaryontischen Zellen be teiligt, d. h. sie regulieren abhängig von der Ca²⁺ Konzentration zelluläre Funktionen. Calpaine kommen ubiquitär in tierischen Geweben bzw. Zellen von beispielsweise Mensch, Hühnern, Kaninchen oder in der Ratte vor. Auch in niederen Tieren wie beispielsweise in Drosophila melanogaster oder Caenorhabditis elegans wurden Calpaine gefunden. In Hefen, Pilzen oder Bakterien konnten bisher keine Calpaine nachgewiesen werden.Calpains belong to the intracellular, non-lysosomal enzymes of the group of cysteine proteases. They are involved in the Ca ² ⁺-dependent signal transduction in eukaryotic cells, ie they regulate cellular functions depending on the Ca ² ⁺ concentration. Calpains occur ubiquitously in animal tissues or cells of, for example, humans, chickens, rabbits or in the rat. Calpains have also been found in lower animals such as Drosophila melanogaster or Caenorhabditis elegans. In yeasts, fungi or bacteria no calpains have been detected so far.

Bisher sind drei Hauptisoformen dieser ubiquitären Calpaine bekannt, die sich in vitro durch ihre Kalzium-abhängige Aktivier barkeit unterscheiden. Calpain I ( = µCalpain ) wird durch µ-mo lare Kalziumion-Konzentrationen aktiviert, während Calpain II (= mCalpain) erst durch millimolare Konzentrationen an Kalziumionen aktiviert wird. Beide Calpaine bestehen aus zwei Untereinheiten, einer großen Untereinheit mit ca. 80 kDa und einer kleinen Unter einheit von ca. 30 kDa. Beide Untereinheiten des aktiven Hetero dimers besitzen Bindungsstellen für Kalzium. Die große Unterein heit wird aus folgenden vier Proteindomänen (= I-IV) aufgebaut: einer Proteasedomäne (= Domäne II), einer Kalzium-bindenden Domäne (= Domäne IV) und zwei weiterer Domänen (= Domäne I und III), deren Funktion unklar ist. Die kleine 30 K-Untereinheit be steht aus einer Kalzium-bindenden Untereinheit (= IV') und einer weiteren Untereinheit (= V), deren Funktion unklar ist. Zusätz lich zu diesen beiden Calpaintypen wurde ein dritter bezüglich der Kalziumaktivierung intermediärer Typ (= µ/m 80 K) im Huhn ge funden (Wang K.K.W. et al., TiPS, Vol. 15, 1994 : 412-419, Suzuki, K et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 376, 1995 : 523- 529).So far, there are three major isoforms of these ubiquitous calpains known to be in vitro by their calcium-dependent activator distinguishability. Calpain I (= μCalpain) is replaced by μ-mo lare calcium ion concentrations activated while calpain II (= mCalpain) only by millimolar concentrations of calcium ions is activated. Both calpains consist of two subunits, a large subunit with about 80 kDa and a small sub unit of approx. 30 kDa. Both subunits of the active hetero dimers possess binding sites for calcium. The big one The unit consists of the following four protein domains (= I-IV): a protease domain (= domain II), a calcium-binding Domain (= domain IV) and two other domains (= domain I and III), whose function is unclear. The small 30 K subunit be consists of a calcium-binding subunit (= IV ') and a further subunit (= V) whose function is unclear. Zusätz To these two types of calpe was added a third the calcium activation intermediary type (= μ / m 80 K) in chicken ge (Wang K.K.W. et al., TiPS, Vol. 15, 1994: 412-419, Suzuki, K. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 376, 1995: 523- 529).

Neben diesen ubiquitär vorkommenden Calpainen wurden in letzter Zeit zwei neue gewebespezifisch exprimierte Calpaine identifi ziert. nCL-1 (= p94) ist ein in Hühnern, Ratten und Menschen vor kommendes, Muskel-spezifisches Calpain, das vermutlich als Mono mer aktiv sein könnte und nur aus der 80 kd Untereinheit besteht. Neben nCL-1 gibt es ein Magen-spezifische Calpain, das in zwei Splicing-Varianten nCL-2 und nCb-2' vorkommen kann. nCL-2' unter scheidet sich gegenüber nCL-2 durch das Fehlen der Kalzium-bin denden Region (Sorimachi, H.S. et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, No. 26, 1993 : 19476-19482, Sorimachi, H:S: et al., FEBS Lett. 343, 1994 : 1-5). Auch in Drosophila wurde ein Calpain-homologes Protein (= CalpA), das mit Actin interagiert und vermutliche eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung spielt, gefunden, daß zwei verschiedene Splicing-Varianten aufweist (Mol. Cell. Biol. Vol. 15, No. 2, 1995 : 824-834). Auch hier fehlt der kürzeren Variante die Kalziumbindestelle.In addition to these ubiquitous occurring calpaines have been in the last Time two new tissue-specific expressed calpains identifi ed. nCL-1 (= p94) is present in chickens, rats and humans Coming, muscle-specific calpain, probably as a mono could be active and only consists of the 80 kd subunit. In addition to nCL-1, there is a stomach-specific calpain that works in two Splicing variants nCL-2 and nCb-2 'may occur. nCL-2 'under differs from nCL-2 due to the absence of calcium bin region (Sorimachi, H.S. et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, No. 26, 1993: 19476-19482, Sorimachi, H: S: et al., FEBS Lett. 343, 1994: 1-5). Also in Drosophila became a Calpain homologous Protein (= CalpA), which interacts with actin and putative one plays an important role in embryonic development, found that has two different splicing variants (Mol. Cell. Biol. Vol. 15, no. 2, 1995: 824-834). Again, the shorter is missing Variant the calcium binding site.

Man vermutet, daß Calpaine bei verschiedenen physiologischen Prozessen wichtige Rollen spielen. Eine Vielzahl von cytoskele talen, membrangebundenden oder regulatorischen Proteinen wie Pro teinkinase C, Phospholipase C, Spectrin, Cytoskelett-Proteine wie MAP2, Muskelproteine, Neurofilamente und Neuropeptide, Plättchen proteine, - "Epidermal Growth Factor" -, NMDA-Rezeptor und Pro teine, die an der Mitose beteiligt sind, sowie weitere Proteine sind Calpainsubstrate (Barrett M.J. et al., Life Sci. 48, 1991: 1659-69, Wang K.K. et al., Trends in Pharmacol. Sci., 15, 1994: 412-419). Die normale physiologische Funktion der Calpaine ist bis heute noch nicht klar verstanden.It is suspected that calpains at different physiological Processes play important roles. A variety of cytoskeletons talen, membrane-bound or regulatory proteins such as Pro teinkinase C, phospholipase C, spectrin, cytoskeletal proteins such as MAP2, muscle proteins, neurofilaments and neuropeptides, platelets proteins, "Epidermal Growth Factor", NMDA Receptor and Pro tees involved in mitosis, as well as other proteins are calpain substrates (Barrett M.J. et al., Life Sci. 48, 1991: 1659-69, Wang K.K. et al., Trends in Pharmacol. Sci., 15, 1994: 412-419). The normal physiological function of calpains is not yet understood.

Bei verschiedenen pathophysiologischen Prozessen und Krankheiten wurden erhöhte Calpain-Spiegel gemessen, zum Beispiel bei: Ischämien des Herzen (z. B. Herzinfarkt), der Niere oder des Zentralnervensystems (z. B. Hirnschlag), Entzündungen, Muskel dystrophien, Katarakten der Augen (Grauer Star), Verletzungen des Zentralnervensystems (z. B. Trauma), Alzheimer Krankheit, HIV-in duzierte Neuropathy, Parkinsonsche- und Huntigtonsche Krankheit usw. (siehe Wang K.K. oben). Man vermutet einen Zusammenhang dieser Krankheiten mit einem erhöhten und anhaltenden intrazellu lären Kalziumspiegel. Dadurch werden Kalzium-abhängige Prozesse überaktiviert und unterliegen nicht mehr der physiologischen Regelung. Dementsprechend kann eine Überaktivierung von Calpainen auch pathophysiologische Prozesse auslösen.In various pathophysiological processes and diseases increased calpain levels were measured, for example: Ischaemias of the heart (eg, myocardial infarction), kidney, or kidney Central nervous system (eg, stroke), inflammation, muscle dystrophies, cataracts of the eyes (cataracts), injuries of the Central nervous system (eg trauma), Alzheimer's disease, HIV-in reduced neuropathy, Parkinson's disease and Huntigton's disease etc. (see Wang K.K. above). One suspects a connection These diseases have an elevated and persistent intracellu calcium levels. This causes calcium-dependent processes overactivated and are no longer subject to the physiological Regulation. Accordingly, overactivation of calpains may occur also trigger pathophysiological processes.

Daher wurde postuliert, daß Inhibitoren der Calpain-Enzyme für die Behandlung dieser Krankheiten nützlich sein können. Ver schiedene Untersuchungen bestätigten dies. So haben Seung-Chyul Hong et al. (Stroke 1994, 25 (3), 663-669) und Bartus R.T. et al. (Neurological Res. 1995, 17, 249-258) eine neuroprotektive Wirkung von Calpaininhibitoren in akuten neurodegenerativen Störungen, wie sie nach Hirnschlag auftreten, gezeigt. Ebenso verbesserten nach experimentellen Gehirntraumata Calpaininhi bitoren die Erholung der auftretenden Gedächtnisleistungsdefizite und neuromotorischen Störungen (Saatman K.E. et al., Proc. Natl. Therefore, inhibitors of calpain enzymes have been postulated for the treatment of these diseases may be useful. Ver various investigations confirmed this. So have Seung-chyul Hong et al. (Stroke 1994, 25 (3), 663-669) and Bartus R.T. et al. (Neurological Res. 1995, 17, 249-258) a neuroprotective Effect of calpain inhibitors in acute neurodegenerative Disorders as they occur after stroke are shown. As well improved after experimental brain trauma calpaininhi bake the recovery of memory memory deficits and neuromotor disorders (Saatman K.E. et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 93, 1996 : 3428-3433). Edelstein C.L. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1995, 7662-7666) fand eine protektive Wirkung von Calpaininhibitoren auf durch Hypoxie geschädigten Nieren. Yoshida K.I. et al. (Jap. Circ. J. 59 (1), 1995, 40-48) konnten günstige Effekte von Calpaininhibitoren nach cardialen Schädigungen aufzeigen, die durch Ischämie oder Reperfusion erzeugt wurden. Da Calpaininhibitoren die Freisetzung von β-AP4-Protein hemmen, wurde eine potentielle Anwendung als Therapeutikum der Alzheimer Krankheit vorgeschlagen (Higaki J. et al., Neuron, 14, 1995 : 651-659). Die Freisetzung von Inter leukin-1a wird ebenfalls durch Calpaininhibitoren gehemmt (Watanabe N. et al., Cytokine, 6 (6), 1994 : 597-601). Weiterhin wurde gefunden, daß Calpaininhibitoren cytotoxische Effekte an Tumorzellen zeigen (Shiba E. et al., 20th Meeting Int. Ass. Breast Cancer Res., Sendai Jp, 1994, 25.-28. Sept., Int. J. Onco. 5 (Suppl.), 1994, 381). Auch bei der Restenose und bei Arthritis spielt Calpain eine wichtige Rolle und Calpaininhibi toren können das Krankheitsbild positiv beeinflussen (March K:L: et al. Circ. Res. 72, 1993 : 413-423, Suzuki K. et al., Biochem J., 285, 1992 : 857-862).Acad. Sci. USA, 93, 1996: 3428-3433). Gemstone C.L. et al. (Proc Natl Acad Sci., USA, 92, 1995, 7662-7666) found one protective effect of calpain inhibitors on by hypoxia damaged kidneys. Yoshida K.I. et al. (Jap. Circ. J. 59 (1), 1995, 40-48) showed favorable effects of calpain inhibitors after cardiac damage caused by ischemia or Reperfusion were generated. Since calpaininhibitoren the release of β-AP4 protein was a potential application as Therapeutic of Alzheimer's disease proposed (Higaki J. et al., Neuron, 14, 1995: 651-659). The release of Inter leucine-1a is also inhibited by calpain inhibitors (Watanabe N. et al., Cytokines, 6 (6), 1994: 597-601). Farther Calpain inhibitors were found to have cytotoxic effects Tumor cells show (Shiba E. et al., 20th Meeting Int. Breast Cancer Res., Sendai Jp, 1994, 25.-28. Sept., Int. J. Onco. 5 (Suppl.), 1994, 381). Also in restenosis and at Calpain plays an important role in arthritis and calpaininhibi factors can positively influence the clinical picture (March K: L: et al. Circ. Res. 72, 1993: 413-423, Suzuki K. et al., Biochem J., 285, 1992: 857-862).

Weitere mögliche Anwendungen von Calpaininhibitoren sind Wang K.K. (Trends in Pharmacol. Sci., 15, 1994 : 412-419) zu entnehmen.Other possible applications of calpain inhibitors are Wang K.K. (Trends in Pharmacol Sci., 15, 1994: 412-419).

Der potenteste und selektivste Calpaininhibitor ist das natürlich vorkommende intrazelluläre Protein Calpastatin. Es hemmt sowohl Calpain I als auch Calpain II, nicht jedoch andere Cystein- bzw. Thiolproteasen wie Cathepsin B, L oder Papain. Das aus ca. 700 Aminosäuren bestehende Calpastatin hat jedoch den Nachteil, daß es für therapeutische Möglichkeiten aufgrund der Größe und der Unpassierbarkeit der Zellmembran nicht in Frage kommt. Neben niedermolekularen peptidischen Calpaininhibitoren wurden eine Reihe nicht-peptidischer Inhibitoren identifiziert. Nachteil dieser Inhibitoren ist, daß sie instabil sind, rasch metaboli siert werden und zum Teil toxisch sind. Viele Calpaininhibitoren zeichnen sich außerdem durch eine mangelnde Selektivität aus, d. h. sie hemmen nicht nur Calpain I und II sondern auch andere Cysteinproteasen wie Papain, Chymotrypsin, Elastase oder Cathepsin B und L.The most potent and selective calpain inhibitor is natural occurring intracellular protein calpastatin. It inhibits both Calpain I as well as calpain II, but not other cysteine or Thiol proteases such as cathepsin B, L or papain. This from approx. However, 700 amino acids of calpastatin have the disadvantage that it is for therapeutic options due to the size and the impassability of the cell membrane is out of the question. Next Low molecular weight peptidic calpain inhibitors have been Series of non-peptidic inhibitors identified. disadvantage of these inhibitors is that they are unstable, rapidly metaboli be siert and are partially toxic. Many calpain inhibitors are also characterized by a lack of selectivity, d. H. they not only inhibit Calpain I and II but also others Cysteine proteases such as papain, chymotrypsin, elastase or Cathepsin B and L.

Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf nach selektiven, hoch wirksamen Calpaininhibitoren. Für das Screening nach diesen selektiven, gut wirksamen Calpaininhibitoren sind hochspezifische Testsysteme erforderlich, die es ermöglichen selektive Inhibito ren zu identifizieren. Üblicherweise werden die Screeningtests mit den ubiquitär vorkommenden Calpainen Calpain I und Calpain II durchgeführt. There is therefore still a need for selective, high effective calpain inhibitors. For the screening of these Selective, well-effective calpain inhibitors are highly specific Test systems required that allow selective inhibito to identify. Usually, the screening tests with the ubiquitous calpaines Calpain I and Calpain II carried out.

Für das Auffinden selektiver Inhibitoren ist es notwendig und wünschenswert weitere Calpaine zur Testung zur Verfügung zu stellen, die möglichst gewebespezifisch exprimiert werden, so daß die Inhibitoren auf ihre Selektivität zwischen den einzelnen Calpainen geprüft werden können.For finding selective inhibitors it is necessary and it is desirable to provide additional calpains for testing represent, which are expressed as possible tissue-specific, so that the inhibitors on their selectivity between the individual Calpainen can be tested.

Darüber hinaus sind weitere neue Calpaine gesuchte Proteine, da sie mit hoher Wahrscheinlichkeit bei den verschiedenen Krank heitsbildern bzw. Krankheiten unterschiedlich exprimiert werden und eine wichtige Rolle bei diesen Krankheiten spielen.In addition, more new calpains are sought after proteins they are very likely to be different health conditions or diseases are expressed differently and play an important role in these diseases.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Mittel zur Profilie rung und Identifizierung von Calpaininhibitoren zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen Calpaininhibitoren zu identifizieren, die einerseits nur gegenüber einem Calpain inhibierende Wirkung aufweisen, und anderseits gegenüber mehreren Calpainen inhibie rende Wirkung aufweisen und diese als therapeutisches Target zur Verfügung zu stellen.The object of the present invention was to provide agents for profiling tion and identification of calpain inhibitors which make it possible to identify calpain inhibitors, on the one hand only against a calpain inhibitory effect and on the other hand to several calpainene inhibie and have this effect as a therapeutic target for To make available.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Calpain sowie seine allelischen Varianten, Analoge oder Derivate.The invention relates to a novel calpain and its allelic variants, analogs or derivatives.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Identifizie rung von Calpaininhibitoren, wobei man das Calpain nCL-3 codiert durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 6 aus Geweben oder Zellen, in denen das Enzym nCL-3 exprimiert wird, isoliert und die Inhibierung der Spaltung eines Substrats des Enzyms nCL-3 und in mindestens einem weiteren Test die Inhibierung der Spaltung eines Substrats der Enzyme Calpain I und/oder II durch Test substanzen mißt und die Testsubstanzen auswählt, die mindestens gegen eines der Calpaine eine inhibierende Wirkung zeigen oder die Testsubstanzen auswählt, die das Enzym nCL-3 nicht hemmen, jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II oder die das Enzym nCL-3 hemmen, nicht jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II oder die nCL-3 und die Enzyme Calpain I und/oder II hemmen.The invention also provides a method for Identifizie Calpaininhibitoren, where the calpain nCL-3 encoded by the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 from tissues or Cells in which the enzyme nCL-3 is expressed, isolated and the inhibition of cleavage of a substrate of the enzyme nCL-3 and in at least one other test inhibition of cleavage a substrate of the enzymes calpain I and / or II by test measures substances and selects the test substances that at least show an inhibitory effect against one of the calpains or select the test substances that do not inhibit the enzyme nCL-3, however, the enzymes calpain I and / or II or the enzyme nCL-3 inhibit, but not the enzymes calpain I and / or II or the nCL-3 and the enzymes calpain I and / or II inhibit.

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Identi fizierung von Calpaininhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inhibierung der Spaltung eines Substrates des Enzyms nCL-3 bzw. der Calpaine I und/oder II durch Testsubstanzen in zellu lären Systemen bestimmt und solche Testsubstanzen auswählt, die die Zellmembran passieren und die intrazelluläre Aktivität des Enzyms nCL-3 und/oder der Calpaine I und/oder II hemmen.Furthermore, the subject of the invention is a method for Identi fication of calpain inhibitors, characterized in that the inhibition of cleavage of a substrate of the enzyme nCL-3 or the calpains I and / or II by test substances in cellu determined and selects those test substances that the cell membrane happen and the intracellular activity of the Enzyme nCL-3 and / or calpains I and / or II inhibit.

Mit Hilfe der Calpain-spezifischen Primer wurden über das so genannte Domain-Fingerprinting (Boehm T., Oncogene 8, 1993 : 1385- 1390) unter Verwendung von genomischer DNA Calpain-spezifische Sequenzsignaturen mittels PCR-Technik hergestellt, die vorteil hafterweise auch zur besseren Differenzierung der Calpainse quenzen Intronsequenzen enthalten.With the help of calpain-specific primers were on the so domain fingerprinting (Boehm T., Oncogene 8, 1993: 1385- 1390) using calpain-specific genomic DNA Sequence signatures produced by PCR technique, the advantage also for better differentiation of calpainse quenching intron sequences.

Die in Tabelle 1 genannten redundanten PCR-Primer wurden bei der Klonierung des Gens für nCL-3 verwendet.The redundant PCR primers listed in Table 1 were at the cloning of the gene used for nCL-3.

Redundante PCR Primer, die zur Klonierung von nCL-3 (=2930) ver wendet wurdenRedundant PCR primers used for the cloning of nCL-3 (= 2930) ver were used

Mit dem Primerpaar Ca16 und Ca19 (siehe Tab. 1) ließ sich ein Klon mit der Bezeichnung 29/30 (=2930) darstellen. Dieser Klon kodiert für ein Gen, dessen Genprodukt als neues Calpain die Bezeichnung nCL-3 erhielt. Die Nucleinsäuresequenz des Klons 29/30 (= nCb-3 bzw. 2930) ist Sequenz SEQ ID NO: 1 zu entnehmen. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Calpains nCL-3 ist der Sequenz SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Die unter Berücksichtigung eines vorhandenen Introns deduzierte Aminosäuresequenz weist eine typische Calpainsignatur auf, wobei eine Zuordnung zu den be kannten Calpain-Subfamilien µCalpain, mCalpain, nCL-1 oder nCL-2 aufgrund der geringen Homologie nicht möglich ist (siehe Tab. 2). Fig. 3 ist die Homologie zu bekannten Calpain-Subfamilien zu entnehmen. Es handelt sich bei dem Calpain nCL-3 um ein neues bisher unbekanntes Calpain.With the primer pair Ca16 and Ca19 (see Tab. 1) a clone with the designation 29/30 (= 2930) could be represented. This clone encodes a gene whose gene product as new calpain was named nCL-3. The nucleic acid sequence of clone 29/30 (= nCb-3 or 2930) is shown in sequence SEQ ID NO: 1. The deduced amino acid sequence of calpain nCL-3 can be found in the sequence SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence deduced in consideration of an existing intron has a typical calpain signature, whereby an assignment to the known calpain subfamilies μCalpain, mCalpain, nCL-1 or nCL-2 is not possible due to the low homology (see Tab. 2). FIG. 3 shows the homology to known calpain subfamilies. It is in the Calpain nCL-3 is a new previously unknown calpain.

Sequenzanalysen zeigten die typischen drei Aminosäurereste (Cys81, His252 und Asn284) des katalytischen Zentrums von Cysteinproteasen. Die aus der Gensequenz abgeleiteten Aminosäure reste 75-86 (QGQVGNCWFVAA) stimmen mit dem konservierten Muster typischer Thiolproteasen überein.Sequence analyzes showed the typical three amino acid residues (Cys81, His252 and Asn284) of the catalytic center of Cysteine proteases. The amino acid derived from the gene sequence residues 75-86 (QGQVGNCWFVAA) agree with the conserved pattern typical thiol proteases.

Tabelle 2Table 2 Homologie (%) auf Aminosäureebene zwischen Maus nCL-3 (=2930) und anderen CalpainenHomology (%) at the amino acid level between mouse nCL-3 (= 2930) and other calpaines

NameSurname % Homologie% Homology Nematode tra-3Nematode tra-3 34,534.5 Drosophila CalpADrosophila calpA 31,531.5 Huhn p94Chicken p94 31,231.2 Mensch p94Human p94 30,930.9 Maus p94Mouse p94 30,530.5 Ratte p94Rat p94 30,030.0 Huhn µ/mChicken μ / m 28,828.8 Huhn mChicken m 27,827.8 Mensch mHuman m 27,327.3 Huhn µChicken μ 25,425.4 Schwein p94Pig p94 25,425.4 Ratte mRat m 24,424.4 Ratte nCL-2Rat nCL-2 23,923.9 Nematode CPL1Nematode CPL1 23,123.1 Mensch µHuman μ 23,123.1 SchistosomaSchistosoma 21,721.7 Kaninchen mRabbit m 16,116.1 Schwein mPig m 15,815.8 Schwein µPig μ 15,615.6 Maus CAP4Mouse CAP4 13,713.7 Kaninchen µRabbit μ 12,912.9

Das in der Sequenz SEQ ID NO: 5 gezeigte Intron (von Nukleotid 109 bis 514) wurde durch Vergleich mit der cDNA festgelegt.The intron shown in the sequence SEQ ID NO: 5 (from nucleotide 109 to 514) was determined by comparison with the cDNA.

Sequenzvergleiche zwischen der Maus 29/30-Sequenz (nCL-3) in ver schiedensten Datenbanken wie Genbank.nr und Genbank.dbest ergaben Homologien zu CalpA, Tra-3 und einer humanen Sequenz mit der Be zeichnung EST01106 Homo sapiens cDNA clone HHCPE79 (siehe Fig. 2). Die DNA- und Aminosäuresequenzen wurden auf Homologie mit nicht-redundanten Nucleinsäure-, Protein- und EST-Datenbanken am National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov) untersucht. Die Aminosäuresequenz vergleiche wurden mit Clustal W (Thompson et al. Nucl. Acids Res. 22, 1994, 4673-468=) durchgeführt.Sequence comparisons between the mouse 29/30 sequence (nCL-3) in various databases such as Genbank.nr and Genbank.dbest revealed homologies to CalpA, Tra-3 and a human sequence with the designation EST01106 Homo sapiens cDNA clone HHCPE79 (see Fig. 2). The DNA and amino acid sequences were examined for homology with non-redundant nucleic acid, protein and EST databases at the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). The amino acid sequence comparisons were performed with Clustal W (Thompson et al., Nucl. Acids Res. 22, 1994, 4673-468 =).

nCL-3 weist im Vergleich zu den anderen Calpainen (Fig. 2) neben einer verkürzten Domäne I ein verändertes C-terminales Ende auf, das keine ausgeprägte Homologie zur Domäne IV der anderen Cal paine hat. Im Bereich der Domäne IV liegt die Konsensussequenz der Ca²⁺-Bindungsstelle der Calpaine (sog. "EFhand"). Diese Ca²⁺-Bindungsstelle fehlt im Falle von nCL-3, daß heißt möglicher weise wird kein Ca²⁺ an der Domäne IV gebunden und das Protein auf anderem Wege aktiviert. Es ist damit das einzige Vertebraten- Calpain, dem die Calmodulin ähnliche Domäne IV fehlt.In contrast to the other calpaines ( FIG. 2), nCL-3 has, besides a truncated domain I, an altered C-terminal end which has no pronounced homology to the domain C of the other cal legs. In the area of domain IV, the consensus sequence of the Ca ² ⁺ binding site of the calpains (so-called "EFhand"). This Ca ² ⁺ binding site is absent in the case of nCL-3, that is possibly no Ca ² ⁺ is bound to the domain IV and activated the protein by other means. It is the only vertebrate calpain lacking the calmodulin-like domain IV.

Bei CalpA handelt es sich um ein gewebsspezifisches exprimiertes Calpainhomologes von Drosophila (Theopold V. et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 15, No. 2, 1995 : 824-834). Es wird in einigen Neuronen des Zentralen Nervensystems, in verstreuten Zellen des Mitteldarms und in Blutzellen von Drosophila exprimiert. Von CalpA wurden zwei verschiedene Splicing-Varianten gefunden. Der kürzeren Variante fehlt die Calpain-typische Kalziumbindungs stelle.CalpA is a tissue-specific expressed Calpain homologues of Drosophila (Theopold V. et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 15, no. 2, 1995: 824-834). It will be in some Neurons of the central nervous system, in scattered cells of the Midgut and expressed in blood cells of Drosophila. From CalpA found two different splicing variants. The shorter variant lacks the calpain-typical calcium binding location.

Die Homologie auf Aminosäureebene zwischen CalpA und nCL-3 be trägt 31,5% (siehe Tab. 2).The homology at the amino acid level between CalpA and nCL-3 be carries 31.5% (see Table 2).

Tra-3 ist an der Geschlechtsbestimmung von Caenorhabditis elegans beteiligt. In einer Kaskade von mehreren Genen und deren Genpro dukten entscheidet tra-3 mit darüber, ob sich Caenorhabditis Männchen oder Hermaphroditen entwickeln (Kuwabara P.E. et al., TIG, Vol. 8, No. 5, 1992 : 164-168). Tra-3 scheint an der Sper matogenese beteiligt zu sein.Tra-3 is at the sex determination of Caenorhabditis elegans involved. In a cascade of several genes and their gene pro tractors decide with tra-3 whether Caenorhabditis Males or hermaphrodites (Kuwabara P.E. et al., TIG, Vol. 8, no. 5, 1992: 164-168). Tra-3 seems to be on the sperm to be involved in matogenesis.

Die Homologie auf Aminosäureebene zwischen tra-3 und nCL-3 beträgt 34,5% (s. Tab 2). Möglicherweise ist auch nCL-3 an der Geschlechtsbestimmung beteiligt.The homology at the amino acid level between tra-3 and nCL-3 is 34.5% (see Table 2). Maybe nCL-3 is also on the Sex determination involved.

Weitere Homologien zwischen nCL-3 und anderen Calpainen sind Tabelle 2 zu entnehmen.Further homologies between nCL-3 and other calpaines are Table 2.

Zwischen nCL-3 und der humanen Teilsequenz EST01106 besteht die größte Homologie. Die Teilsequenz EST01106 wurde aus einer Hippo campusbibliothek gewonnen. Über die Funktion ist nichts bekannt (Nature 355, 6361, 1992 : 632-634). Ebenfalls unbekannt ist die vollständige Gensequenz und ob es sich bei der Sequenz um ein Calpaingen handelt.Between nCL-3 and the human subsequence EST01106 exists the greatest homology. The subsequence EST01106 became a Hippo won the campus library. About the function is not known (Nature 355, 6361, 1992: 632-634). Also unknown is the complete gene sequence and whether the sequence is a Calpaingen acts.

Die Sequenzvergleiche zwischen CalpA, Tra-3, EST01106 und nCL-3 werden in Fig. 2 wiedergegeben.The sequence comparisons between CalpA, Tra-3, EST01106 and nCL-3 are shown in FIG .

Ausgehend von humaner Hippocampus Marathon-Ready cDNA (Clontech) konnte mit Hilfe einer modifizierten RACE-Methode (= rapid ampli fication of cDNA ends) nach Frohman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, 8998-9002) bzw. Edwards et al. (Nucl. Acids Res. 19, 1991, 5227-5232) unter Verwendung der oben genannten Primer (Ca16 und Ca19) die Gesamtsequenz des Klones EST01106 klo niert werden. Wobei die 3'Region der cDNA zunächst nicht mit Hilfe des Reversen-Primers des Clontech-Kit's zu klonieren war. Erst unter Verwendung eines Primers, der komplementär zur humanen EST-Sequenz war, und eines Reversen Primers, der komplementär zur cDNA-Sequenz der letzten 6 Aminosäuren der Maus nCL-3-Sequenz (5'-tcagacagccgtgagagagg-3') war, konnte das 3'Ende kloniert werden.Starting from Human Hippocampus Marathon-Ready cDNA (Clontech) could with the help of a modified RACE method (= rapid ampli Fication of cDNA ends) according to Frohman et al. (Proc Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, 8998-9002) and Edwards et al. (Nucl. Acids Res. 19, 1991, 5227-5232) using the above Primer (Ca16 and Ca19) the total sequence of the clone EST01106 klo be defined. Where the 3'Region of the cDNA initially not with Clonech kit's cloning primer was to be cloned. Only by using a primer that is complementary to the human EST sequence, and a reverse primer complementary to cDNA sequence of the last 6 amino acids of the mouse nCL-3 sequence (5'-tcagacagccgtgagagagg-3 '), the 3'nd could be cloned become.

Die von der Gensequenz SEQ ID NO: 6 abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 7) zeigt 92.2% Homologie zur Maus nCL-3 Sequenz (siehe Fig. 4). Diese Ähnlichkeit entspricht der Homologie auf Aminosäureebene zwischen dem Humanen und dem Mäuse in-Calpain (97%) und dem Humanen und dem Mäuse p94 (93,5%) wie unsere Sequenzierungen zeigten. EST01106 ist damit mit hoher Wahrschein lichkeit das humane Ortholog der Maus nCL-3 Sequenz. Fig. 4 zeigt außerdem die Sequenzen von Caenorhabditis tra-3, Drosophila CalpA, Maus p94, Maus in-Calpain, humanen µ-Calpain und Ratten nCL-2. Aminosäuren, die zwischen den verschiedenen Calpainen und nCL-3 übereinstimmen sind durch Punkte gekennzeichnet. Striche deuten bücken an, die um eine maximale Übereinstimmung der Sequenzen zu erreichen, eingeführt wurden. Die C-terminalen Enden der alternativen Splicingprodukte der nCL-3- und CalpA-Tran skripte sind über und unter der jeweiligen Gesamtsequenz angege ben, startend mit dem Beginn der unterschiedlichen Sequenz. Sterne geben die zwischen allen Calpainen konservierten Reste an. Die beiden Aminosäuresequenzen, die den Oligonucleotiden Ca16 und Ca19 entsprechen, wurden durch Kästchen gekennzeichnet. Durch Pfeile werden die "plice sites" der korrespondierenden Maus nCL-3-DNA markiert.The amino acid sequence deduced from the gene sequence SEQ ID NO: 6 (SEQ ID NO: 7) shows 92.2% homology to the mouse nCL-3 sequence (see FIG. 4). This similarity corresponds to the homology at the amino acid level between the human and mouse in-calpain (97%) and the human and mouse p94 (93.5%) as our sequencing showed. EST01106 is thus highly likely to be the human ortholog of the mouse nCL-3 sequence. Figure 4 also shows the sequences of Caenorhabditis tra-3, Drosophila CalpA, mouse p94, mouse in-calpain, human μ-calpain and rat nCL-2. Amino acids that match between the different calpains and nCL-3 are indicated by dots. Dashes indicate stooping, which has been introduced to achieve maximum match of the sequences. The C-terminal ends of the alternative splicing products of the nCL-3 and CalpA transcripts are indicated above and below the respective overall sequence, starting with the beginning of the different sequence. Stars indicate the residues conserved between all calpains. The two amino acid sequences corresponding to oligonucleotides Ca16 and Ca19 were boxed. Arrows indicate the "plice sites" of the corresponding mouse nCL-3 DNA.

Fig. 5 gibt den phylogenetischen Stammbaum der verschiedenen Calpaine wieder. Die phylogenetischen Analysen zur Aufstellung dieses Stammbaums wurden unter Verwendung der nächsten Nachbar- Methode (Saitou et al. Mol. Biol. Evol. 4, 1987, 406-425) unter Ausschluß der Lücken durchgeführt. Mit Hilfe dieser phylogeneti schen Analysen konnten die Vertebraten-Calpaine in sechs ver schiedene Gruppen aufgeteilt werden (Fig. 5, rechte Seite). Die Nicht-Vertebraten-Calpaine lassen sich der nCL-3 Gruppe als nächste Nachbarn zuordnen oder stehen in einer eigenen Gruppe. Die nCL-3 Gene bilden damit eine eigene Gruppe von Calpainen, die eine größere Ähnlichkeit zu Invertebraten Calpaine haben als zu Vertebraten Calpaine. Die Länge der horizontalen Linien ist pro portional zur phylogenetischen Entfernung der verschiedenen Cal paine. Die Länge der vertikalen Linien ist ohne Bedeutung. Die für die Aufstellung des phylogenetischen Stammbaums verwendeten Sequenzen haben die folgenden SWISSPROT- und EMBL-Nummern ("accession numbers"): Mensch m (P17655), µ (P07384), p94 (P20807); Ratten m (Q07009), nCL-2 (D14480), p94 (P16259); Maus p94 (X92523); Hühner m (D38026), µ (D38027), µ/m (P00789), p94 (D38028); Nematoden tra-3 (U12921); Drosophila Calp A (Q11002) und Dm (X78555), Schistosoma (P27730). Fig. 5 represents the phylogenetic tree of the various calpains. The phylogenetic analyzes for the preparation of this family tree were performed using the nearest neighbor method (Saitou et al., Mol. Biol., Evol., 4, 1987, 406-425), excluding the gaps. Using these phylogenetic analyzes, the vertebrate calpains could be divided into six different groups ( Figure 5, right-hand side). The non-vertebrate calpains can be assigned to the nCL-3 group as nearest neighbors or stand in their own group. The nCL-3 genes thus form a separate group of calpaines, which have a greater similarity to invertebrate calpains than to vertebrates calpains. The length of the horizontal lines is proportional to the phylogenetic distance of the various cal legs. The length of the vertical lines is irrelevant. The sequences used to construct the phylogenetic tree have the following SWISSPROT and EMBL (accession numbers) numbers: human m (P17655), μ (P07384), p94 (P20807); Rats m (Q07009), nCL-2 (D14480), p94 (P16259); Mouse p94 (X92523); Chickens m (D38026), μ (D38027), μ / m (P00789), p94 (D38028); Nematodes tra-3 (U12921); Drosophila Calp A (Q11002) and Dm (X78555), Schistosoma (P27730).

Die nCL-3 Genstruktur wird in Fig. 6 wiedergegeben. Die Exon/In tron-Splicing Übergänge innerhalb der kodierenden Sequenz des Ge nes wurden durch Vergleich der DNA-Sequenzen von genomischer DNA und cDNA ermittelt. Es wurden II Introns innerhalb der kodieren den Sequenz ermittelt. In Fig. 4 wird die Position der "splicing sites" durch Pfeile markiert. Die Position des zuerst mit den Primern Ca16 und Ca19 amplifizierten genomischen Fragments wird durch Klammern markiert.The nCL-3 gene structure is shown in FIG . The exon / intron splicing transitions within the coding sequence of the gene were determined by comparing the DNA sequences of genomic DNA and cDNA. II introns were detected within the encode the sequence. In Fig. 4, the position of the "splicing sites" is marked by arrows. The position of the genomic fragment first amplified with the primers Ca16 and Ca19 is marked by parentheses.

Fig. 6b zeigt die Lage der "splicing sites" verschiedener Calpaine. überraschenderweise besitzen nCL-3 und tra3 trotz der relativ großen Homologie keine gemeinsamen "splice sites". Die Übereinstimmung in der Lage einiger "splice sites" zwischen nCL-3 und den Vertebraten Calpainen deutet auf eine gemeinsame Ent stehung der Gene hin. Das Fragezeichen über den letzten konser vierten splice site im Hühner µ/m-Calpaingen deutet an, daß die publizierte Sequenz um diese Schnittstelle herum nicht in Über einstimmung ist mit der ursprünglichen cDNA-Sequenz. Fig. 6b shows the location of the "splicing sites" of various calpains. Surprisingly, despite the relatively large homology, nCL-3 and tra3 do not share common splice sites. The agreement in the location of some "splice sites" between nCL-3 and the vertebrates Calpainen indicates a common origin of the genes. The question mark on the last konser fourth splice site in the chicken μ / m-Calpaingen indicates that the published sequence around this interface is not in agreement with the original cDNA sequence.

Neben dem in Sequenz SEQ ID NO: 1 dargestellten nCL-3-Gen wurde eine verkürzte Form, die in Sequenz SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, identifiziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des ver kürzten nCL-3-Gens ist der Sequenz SEQ ID NO: 4 zu entnehmen. Dieses verkürzte nCL-3-Gen, das die Bezeichnung nCL-3' trägt, entsteht vermutlich durch alternatives Splicing. Semi-quanti tative RT-PCR-Analysen mit mRNA, die aus dE17-Zellen isoliert wurden, unter Verwendung von Primern, die die flankierenden Regionen des Introns abdecken (siehe Fig. 6), zeigten, daß das nicht gesplicte Produkt etwa 0,5% der n-CL3 mRNA ausmacht.In addition to the nCL-3 gene shown in sequence SEQ ID NO: 1, a truncated form shown in sequence SEQ ID NO: 3 was identified. The deduced amino acid sequence of the shortened nCL-3 gene is shown in the sequence SEQ ID NO: 4. This truncated nCL-3 gene, called nCL-3 ', is thought to be due to alternative splicing. Semi-quantitative RT-PCR analyzes with mRNA isolated from dE17 cells using primers covering the flanking regions of the intron (see Figure 6) showed that the unspliced product was about 0.5 % of n-CL3 mRNA.

Das erfindungsgemäße neue Calpain nCL-3 wird in vielen Geweben mit unterschiedlicher Intensität exprimiert (Fig. 1). In der untersuchten mRNA Analysen wird nCL-3 klar ersichtlich in der Haut, der Niere, dem Herz, der Lunge, dem Thymus und in der Leber exprimiert.The novel calpain nCL-3 according to the invention is expressed in different tissues with different intensity ( FIG. 1). In the analyzed mRNA analysis, nCL-3 is clearly expressed in the skin, kidney, heart, lung, thymus, and liver.

Auch im Menschen wird das nCL-3 Gen unterschiedlich stark expri miert. In allen untersuchten Geweben wurde eine geringe Ex pression nachgewiesen. Im Kolon, im Hoden, in der Niere, in der Leber und in der Luftröhre wurde eine starke Expression gefunden.Also in humans, the nCL-3 gene is expri different degrees mized. In all examined tissues a small ex confirmed. In the colon, in the testes, in the kidney, in the Liver and in the trachea strong expression was found.

Das nCL-3 Gen wurde auf Chromosom 7 bei Mäusen und Chromosom II beim Menschen lokalisiert. Es liegt auf dem langen Arm des menschlichen Chromosoms bei etwa 84 cM (= centi Morgen). Dies ist 12-14 cM von der kartierten Position des µ-Calpains (11q13) entfernt. nCL-3 konnte sehr nahe am Glycoprotein A-Gen katiert werden (11q13.5-q14).The nCL-3 gene was located on chromosome 7 in mice and chromosome II localized in humans. It lies on the long arm of the human chromosome at about 84 cM (= centi morning). This is 12-14 cM from the mapped position of μ-calpain (11q13) away. nCL-3 catalyzed very close to the glycoprotein A gene become (11q13.5-q14).

Das Maus Orthologe nCL-3 Gen wurde zwischen 44 und 53 cM auf dem Maus Chromosom 7 lokalisiert.The mouse orthologous nCL-3 gene was between 44 and 53 cM on the Mouse chromosome 7 localized.

Für die Identifizierung von selektiven Calpaininhibitoren sind möglichst spezifische Verfahren zur Identifizierung der Inhi bitoren erforderlich. Wichtig dabei ist, daß die selektierten In hibitoren nur das gewünschte oder die gewünschten Calpaine hemmen, nicht jedoch andere Cystein-Proteasen und damit in physiologische Prozesse eingreifen.For the identification of selective calpain inhibitors are as specific as possible procedures for identifying the Inhi Bakers required. It is important that the selected In hibitor only the desired or desired calpains but not other cysteine proteases and thus in intervene physiological processes.

Die auf ihre inhibitorische Aktivität hin zu prüfenden Test substanzen können beispielsweise chemische Substanzen, mikro bielle oder pflanzliche Extrakte sein. Sie werden üblicherweise neben den Test auf ihre Inhibitoraktivität gegenüber nCL-3, Calpain I und/oder II auf ihre Aktivität gegenüber Cathepsin B oder andere Thiolproteasen getestet.The test to be tested for its inhibitory activity Substances can be, for example, chemical substances, micro be bielle or herbal extracts. They usually become in addition to testing for their inhibitory activity on nCL-3, Calpain I and / or II on their activity against cathepsin B or other thiol proteases tested.

Idealerweise sollten gute Inhibitoren keine oder nur geringe Aktivität gegenüber Cathepsin B, L, Elastase, Papain, Chymo trypsin oder andere Cystein-Proteasen aufweisen, aber eine gute Aktivität gegenüber den Calpainen I und II aufweisen. Ideally, good inhibitors should have little or no effect Activity against cathepsin B, L, elastase, papain, chymo have trypsin or other cysteine proteases, but a good one Have activity against calpains I and II.

Durch das erfindungsgemäße neue Calpain nCL-3 können mit den erfindungsgemäßen Verfahren Inhibitoren identifiziert werden, die zu ihrer inhibitorischen Wirkung zwischen den verschiedenen Calpainen Calpain I, II, nCL-1 nCL-2 und/oder nCL-3 diskrimi nieren können.The inventive novel calpain nCL-3 can with the inventive method inhibitors are identified to their inhibitory effect between the various Calpains Calpain I, II, nCL-1 nCL-2 and / or nCL-3 diskrimi can kidney.

Die verschiedenen Inhibitortests wurden dabei wie folgt durchge führt:The various inhibitor tests were carried out as follows leads:

Cathepsin B-TestCathepsin B test

Die Cathepsin B-Hemmung wurde analog einer Methode von S. Hasnain et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 235-240 bestimmt.The cathepsin B inhibition was analogous to a method of S. Hasnain et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 235-240.

Zu 88 µl Cathepsin B (Cathepsin B aus menschlicher Leber von der Firma Calbiochem, verdünnt auf 5 Units in 500 µM Puffer) werden 2 µl einer Inhibitorlösung, hergestellt aus der zu testenden che mischen Substanz, einem mikrobiellen oder pflanzlichen Extrakt und DMSO (Endkonzentration: 100 µM bis 0,01 µM) zugegeben. Dieser Ansatz wird für 60 Minuten bei Raumtemperatur (= 25°C) vorinku biert und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 10 µl 10 mM Z-Arg-Arg-pNA (in Puffer mit 10% DMSO) gestartet. Die Reaktion wird 30 Minuten bei 405 nm im Mikrotiterplattenreader verfolgt. Aus den maximalen Steigungen werden anschließend die IC₅₀'s be stimmt.To 88 μl of cathepsin B (cathepsin B from human liver from Calbiochem, diluted to 5 units in 500 μM buffer), 2 μl of an inhibitor solution prepared from the chemical substance to be tested, a microbial or plant extract and DMSO (final concentration: 100 μM to 0.01 μM). This approach is pre-incubated for 60 minutes at room temperature (= 25 ° C) and then the reaction by the addition of 10 ul of 10 mM Z-Arg-Arg-pNA started (in buffer with 10% DMSO). The reaction is followed for 30 minutes at 405 nm in the microtiter plate reader. From the maximum gradients are then the IC ₅₀ 's be true.

Calpain I und II-TestCalpain I and II test

Die Aktivität der Calpaininhibitoren wurde in einem colorimetri schen Test mit Casein nach Hammarsten (Merck, Darmstadt) als Sub strat untersucht. Der Test wurde in Mikrotiterplatten, entspre chend der Veröffentlichung von Buroker-Kilgore und Wang in Anal. Biochem. 208, 1993, 387-392, durchgeführt. Als Enzyme wurde Calpain I (0,04 U/Test) aus Erythrozyten und Calpain II (0,2 U/Test) aus Nieren, beide vom Schwein, der Firma Calbiochem, benutzt. Die zu testenden Substanzen wurden mit dem Enzym für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei eine Konzentration von 1% des Lösungsmittels DMSO nicht überschritten wurde. Nach Zugabe des Bio-Rad Farbreagenz erfolgte die Messung der optischen Dichte bei 595 nm in dem Easy Reader EAR 400 der Firma SLT. Die 50%ige Aktivität des Enzyms ergibt sich aus den optischen Dichten, die bei der maximalen Aktivität des Enzyms ohne Inhibi toren und der Aktivität des Enzyms ohne Zugabe von Kalzium be stimmt wurden. The activity of calpain inhibitors was determined in a colorimetri test with casein according to Hammarsten (Merck, Darmstadt) as sub strat examined. The test was in microtiter plates, corre sp Following the release of Buroker-Kilgore and Wang in Anal. Biochem. 208, 1993, 387-392. As enzymes became Calpain I (0.04 U / test) from erythrocytes and calpain II (0.2 U / test) from kidneys, both from the pig, the company Calbiochem, used. The substances to be tested were labeled with the enzyme for Incubated for 60 minutes at room temperature, with a concentration of 1% of the solvent DMSO was not exceeded. To The addition of the Bio-Rad color reagent was followed by the measurement of the optical Density at 595 nm in the Easy Reader EAR 400 from SLT. The 50% activity of the enzyme results from the optical Densities at the maximum activity of the enzyme without inhibi and the activity of the enzyme without the addition of calcium were correct.

Die Aktivität von Calpaininhibitoren kann ferner mit dem Substrat Suc-Leu Tyr-AMC bestimmt werden. Diese fluorimetrische Methode ist bei Zhaozhao Li et al, J. Med. Chem. 1993, 36, 3472-3480 beschrieben.The activity of calpain inhibitors may also be with the substrate Suc-Leu Tyr-AMC can be determined. This fluorimetric method is in Zhaozhao Li et al, J.Med.Chem. 1993, 36, 3472-3480 described.

Da Calpaine intrazelluläre Cysteinproteasen sind, müssen Calpaininhibitoren die Zellmembran passieren, um den Abbau von intrazellulären Proteinen durch Calpain zu verhindern. Einige bekannte Calpaininhibitoren, wie zum Beispiel E 64 und Leupeptin, überwinden die Zellmembranen nur schlecht und zeigen dement sprechend, obwohl sie gute Calpaininhibitoren darstellen nur schlechte Wirkung an Zellen. Es ist deshalb vorteilhaft einen zusätzlichen Test für die Membrangängigkeit von potentiellen Calpaininhibitoren wie den humanen Plättchentest durchzuführen.Since calpains are intracellular cysteine proteases Calpain inhibitors pass through the cell membrane to help break down to prevent intracellular proteins by calpain. Some known calpain inhibitors, such as E 64 and leupeptin, overcome the cell membranes poorly and show dementia although they represent good calpain inhibitors only bad effect on cells. It is therefore advantageous one additional test for membrane permeability of potential Calpaininhibitoren as the human platelet test.

Plättchen-Test zur Bestimmung der zellulären Aktivität von CalpaininhibitorenPlatelet assay for determination of cellular activity of calpain inhibitors

Der Calpainvermittelte Abbau von Proteinen in Plättchen wurde, wie von Zhaozhao Li et al., J. Med. Chem., 36, 1993, 3472-3480 beschrieben, durchgeführt. Humane Plättchen wurden aus frischem Natrium-Citrat-Blut von Spendern isoliert und in Puffer (5 mM Hepes, 140 mM NaCl und 1 mg/ml BSA, pH 7,3) auf 10⁷ Zellen/ml ein gestellt.Calpain-mediated degradation of proteins in platelets was performed as described by Zhaozhao Li et al., J. Med. Chem., 36, 1993, 3472-3480. Human platelets were isolated from fresh sodium citrate blood from donors and placed in buffer (5 mM Hepes, 140 mM NaCl and 1 mg / ml BSA, pH 7.3) at 10 ⁷ cells / ml.

Plättchen (0,1 ml) werden für 5 Minuten in 1 µl an verschiedenen Konzentrationen an potentiellen Inhibitoren (gelöst in DMSO) vor inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von Kalziumionophor A 23187 (1 µM im Test) und Kalzium (5 mM im Test) und eine weitere Inku bation von 5 Minuten bei 37°C. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden die Plättchen in SDS-Page Probenpuffer aufgenommen, 5 Minuten bei 95°C gekocht und die Proteine in einem 8%igen Gel aufgetrennt. Der Abbau der beiden Proteine Actin bindendes Pro tein (= ABP) und Tal in wurde durch quantitative Densitometrie verfolgt. Nach der Zugabe von Kalzium und Ionophor verschwanden diese Proteine und es entstanden neue Banden von kleiner 200 Kd Molekulargewicht. Daraus wird die halb maximale Enzymaktivität mit oder als Kontrolle ohne Inhibitor bestimmt.Platelets (0.1 ml) are mixed for 5 minutes in 1 μl of different Concentrations of potential inhibitors (dissolved in DMSO) incubated. This was followed by the addition of calcium ionophore A 23187 (1 μM in the test) and calcium (5 mM in the test) and another Inku 5 minutes at 37 ° C. After a centrifugation step the platelets were taken up in SDS-page sample buffer, Boiled for 5 minutes at 95 ° C and the proteins in an 8% gel separated. The degradation of the two proteins actin binding Pro tein (= ABP) and valley in was determined by quantitative densitometry tracked. After the addition of calcium and ionophore, they disappeared these proteins and new bands of less than 200 Kd were created Molecular weight. This will be the half maximum enzyme activity with or as a control without inhibitor.

Ebenfalls geeignet für die Testung der Membrangängigkeit sind Gewebsteile wie Gehirnschnitte oder Zellkulturen.Also suitable for testing membrane permeability Tissue parts such as brain slices or cell cultures.

Test auf Hemmung gegenüber nCL-3 wird in Zellen durchgeführt, die dieses Protein exprimieren und sich dieses mit einem spezifischen Antikörper nachweisen läßt. Werden Zellen mit z. B: Kalzium und dem entsprechenden Ionophor stimuliert, führt dies zu einer Aktivierung von nCL-3. Takaomi Saido beschrieb 1992 im J. Bio chem. Vol. 11, 81-86 die autolytische Transition von µ-Calpain nach Aktivierung und der Nachweis mit Antikörpern. Entsprechende Antikörper werden für den Nachweis von nCL-3 erzeugt. Calpain- Inhibitoren verhindern die autolytische Transition und eine ent sprechende Quantifizierung ist mit Antikörpern möglich.Assay for inhibition to nCL-3 is performed in cells that express this protein and associate this with a specific Detect antibody. Are cells with z. B: calcium and stimulates the corresponding ionophore, this leads to a Activation of nCL-3. Takaomi Saido described in 1992 in J. Bio chem. Vol. 11, 81-86 the autolytic transition of μ-calpain after activation and detection with antibodies. Appropriate Antibodies are generated for the detection of nCL-3. calpain Inhibitors prevent the autolytic transition and an ent speaking quantification is possible with antibodies.

Neben den beschriebenen in vitro Tests so wie dem zellulären Plättchentest eignen sich alle weiteren dem Fachmann bekannten Calpaintests wie der Test auf Hemmung des Glutamat induzierten Zelltods an corticalen Neuronen (Maulucci-Gedde M.A. et al., J. Neurosci. 7, 1987 : 357-368), der Kalzium-vermittelte Zelltod in NT2-Zellen (Squier M.K.T. et al., J. Cell. Physiol., 159, 1994 : 229-237, Patel T. et al., Faseb Journal 590, 1996 : 587- 597) oder die Analyse in Gewebsproben nach Abbauprodukten von Proteinen wie Spectrin, MAP2 oder Tau (Ami Arai et al., Brain Research, 1991, 555, 276-280, James Brorson et al., Stroke, 1995, 26, 1259-1267).In addition to the described in vitro tests such as the cellular Platelet test are all other known in the art Calpaint tests such as the test induced inhibition of glutamate Cell deaths on cortical neurons (Maulucci-Gedde M.A. et al., J. Neurosci. 7, 1987: 357-368), calcium-mediated cell death in NT2 cells (Squier M.K.T. et al., J. Cell. Physiol., 159, 1994: 229-237, Patel T. et al., Faseb Journal 590, 1996: 587- 597) or the analysis in tissue samples after degradation products of Proteins such as Spectrin, MAP2 or Tau (Ami Arai et al., Brain Research, 1991, 555, 276-280, James Brorson et al., Stroke, 1995, 26, 1259-1267).

Für die in vitro-Tests von nCL-3 wird das Calpain nCL-3 oder seine tierischen oder sein humanes Homologes aus Geweben oder Zellen in denen das Enzym exprimiert wird wie beispielsweise der Niere, dem Thymus, der Leber, der Lunge, oder aus Zellen oder Mikroorganismen, die mindestens eine Genkopie und/oder einen Vektor mit mindestens einer Genkopie des nCL-3-Gens enthalten, aufgereinigt und als Rohextrakt oder als reines Enzym verwendet.For the in vitro tests of nCL-3, calpain nCL-3 or its animal or human homologue of tissues or Cells in which the enzyme is expressed such as the Kidney, thymus, liver, lung, or cells or Microorganisms containing at least one gene copy and / or a Containing vector with at least one gene copy of the nCL-3 gene, purified and used as crude extract or as pure enzyme.

Für die erfindungsgemäßen Verfahren werden die verschiedenen Calpaininhibitortests vorteilhafterweise in Kombination mit dem Test auf Hemmung der nCL-3-Enzymaktivität durch potentielle In hibitoren durchgeführt. Dabei werden Inhibitoren so ausgewählt, daß sie entweder nur das Enzym nCL-3 hemmen und nicht die anderen Calpaine oder umgedreht nur die anderen Calpaine und nicht das Enzym nCL-3 oder das Enzym nCL-3 und mindestens ein weiteres Calpain.For the inventive method, the various Calpaininhibitortests advantageously in combination with the Assay for inhibition of nCL-3 enzyme activity by potential In hibitors performed. It selects inhibitors that they either inhibit only the enzyme nCL-3 and not the others Calpaine or just turned over the other calpains and not that Enzyme nCL-3 or the enzyme nCL-3 and at least one more Calpain.

Die verschiedenen Inhibitortests werden dabei so ausgeführt, das neben dem Test auf die inhibierende Wirkung der Testsubstanz gegenüber nCL-3, Calpain I und/oder II als Kontrolle die Tests ohne die Testsubstanz durchgeführt wird. Durch diese Testanord nung lassen sich einfach die inhibitorischen Wirkungen der Test substanzen erkennen.The various inhibitor tests are carried out in this way this in addition to the test for the inhibitory effect of the test substance to nCL-3, calpain I and / or II as controls the tests without the test substance is carried out. Through this test arrangement can be simply the inhibitory effects of the test recognize substances.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren verwendet das Enzym nCL-3 zum Screening nach neuen Calpaininhibitoren, wobei diese Inhibitoren vorteilhafterweise generell alle Calpaine oder ein zelne Calpaine wie Calpain I, II, nCL-1, nCL-2 oder nCL-3 hemmen können. Die verschiedenen Testsubstanzen können dabei einzeln oder parallel in Testsystemen getestet werden. Vorteilhafterweise werden die Testsubstanzen in parallelen, automatisierten Test systemen auf ihre inhibitorische Wirkung hin gescreent.Another method of the invention uses the enzyme nCL-3 for the screening of novel calpain inhibitors, these being Inhibitors advantageously generally all calpains or a inhibit individual calpains such as calpain I, II, nCL-1, nCL-2 or nCL-3 can. The different test substances can be individually or tested in parallel in test systems. advantageously, The test substances are in parallel, automated test systems screened for their inhibitory effect.

Für die Inhibitortests sind generell alle Substanzen geeignet. So stammen die Substanzen beispielsweise aus der klassischen che mischen Synthese, aus der Kombinatorik, aus mikrobiellen, tieri schen oder pflanzlichen Extrakten. Unter mikrobiellen Extrakten sind beispielsweise Fermentationsbrühen, Zellaufschlüsse von Mikroorganismen oder Substanzen nach Biotransformation zu ver stehen. Auch Zellfraktionen sind für die Tests geeignet.For the inhibitor tests, all substances are generally suitable. So For example, the substances come from the classical che mix synthesis, from combinatorics, from microbial, tieri or vegetable extracts. Under microbial extracts For example, fermentation broths, cell digests of Microorganisms or substances after biotransformation to ver stand. Cell fractions are also suitable for the tests.

Für die Klonierung des nCL-3 Gens oder seiner tierischen Homo logen oder seines humanen Homologen eignen sich alle prokaryon tischen oder eukaryontischen Expressionssysteme, die zur Isolie rung eines enzymatisch aktiven Genprodukts geeignet sind. Bevor zugt werden Expressionssysteme, die eine Expression der nCL-3-Gensequenzen in bakteriellen, pilzlichen oder tierischen Zellen ganz besonders bevorzugt in Insektenzellen ermöglicht. Unter enzymatisch aktivem Genprodukt sind nCL-3-Proteine zu ver stehen, die direkt nach Isolierung aus dem Expressionsorganismus wie beispielsweise aus einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle oder nach Renaturierung ein aktives Protein ergeben, das in der Lage ist mindestens ein bekanntes Calpainsubstrat wie die oben genannten oder über Autokatalyse sich selbst zu spalten.For the cloning of the nCL-3 gene or its animal homo lodge or its human homologue are all prokaryon or eukaryotic expression systems leading to isolation tion of an enzymatically active gene product are suitable. before Expression systems expressing expression of the nCL-3 gene sequences in bacterial, fungal or animal Cells very particularly preferably in insect cells allows. Under enzymatically active gene product nCL-3 proteins are ver standing, immediately after isolation from the expression organism such as from a prokaryotic or eukaryotic Cell or after renaturation, an active protein which is in at least one known calpain substrate such as the above or via autocatalysis to split itself.

Für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität sind alle dem Fachmann bekannten Calpaintests wie in vitro-Tests wie die oben beschriebenen Tests für Calpain I und II oder zelluläre Tests wie der Plättchentest geeignet. Dabei können als Detektionsmöglich keit Tests verwendet werden, die auf Basis eines colorimetrischen Assays (Buroker-Kilgore M. et al., Anal. Biochem. 208, 1993 : 387- 392) oder auf Basis eines Fluoreszenz-Assays beruhen.For the determination of the enzymatic activity are all the One skilled in the art knows of calpaint tests such as in vitro tests like those above described tests for calpain I and II or cellular tests such as the platelet test suitable. It can be used as Detektionsmöglich Tests are used based on a colorimetric test Assays (Buroker-Kilgore M. et al., Anal. Biochem. 208, 1993: 387- 392) or based on a fluorescence assay.

Außerdem sind auch alle Teilsequenzen, die das katalytische Zentrum des nCL-3 Gens und/oder weitere Sequenzen des nCL-3 Gens und/oder andere Calpaingensequenzen und/oder andere Sequenzen enthalten und enzymatische Aktivität zeigen, unter enzymatische aktivem Genprodukt von nCL-3 zu verstehen.In addition, all subsequences that are the catalytic Center of the nCL-3 gene and / or other sequences of the nCL-3 gene and / or other calpain sequences and / or other sequences contain and show enzymatic activity under enzymatic to understand the active gene product of nCL-3.

Unter Wirtsorganismen sind alle prokaryotischen oder eukaryon tischen Organismen, die als Wirtsorganismen geeignet sind, sind beispielsweise Bakterien wie Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptococcus carnosus, Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pilze wie Aspergillus niger, Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda, Trichoplusia-Zellen oder alle anderen Insektenzellen, die für eine virale Expression geeignet sind, oder tierische Zellen wie CV1, COS, C127, 3T3 oder CHO oder humane Zellen zu verstehen.Among host organisms are all prokaryotic or eukaryotic organisms that are suitable as host organisms for example, bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptococcus carnosus, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, fungi such as Aspergillus niger, insect cells such as Spodoptera frugiperda, Trichoplusia cells or any other insect cells responsible for a viral expression are suitable, or animal cells such as CV1, COS, C127, 3T3 or CHO or human cells.

Unter Expressionssysteme sind die Kombination aus den oben bei spielhaft genannten Expressionsorganismen und den zu den Organis men passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie das T7 RNA Polymerase/Promoter System oder Vektoren mit regula torischen Sequenzen für den Phagen λ zu verstehen.Among expression systems are the combination of the above in playfully mentioned expression organisms and the to the organ suitable vectors such as plasmids, viruses or phages such as T7 RNA polymerase / promoter system or vectors with regula to understand toric sequences for the phage λ.

Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressionssysteme die Kombina tion aus Escherichia coli und seinen Plasmiden und Phagen oder das Baculovirus-System und die entsprechenden Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda zu verstehen.Preferably, the term expression systems Kombina tion from Escherichia coli and its plasmids and phages or the baculovirus system and the corresponding insect cells such as To understand Spodoptera frugiperda.

Für die vorteilhafte erfindungsgemäße Expression des nCL-3-Gens sind außerdem weitere 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen geeignet.For the advantageous expression according to the invention of the nCL-3 gene are also other 3 'and / or 5' terminal regulatory Suitable sequences.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression des nCL-3 Gens ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion ex primiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.These regulatory sequences are intended to target expression of the nCL-3 gene. This can, for example, depending on Host organism means that the gene only after induction ex is primed or overexpressed, or that it expresses immediately and / or overexpressed.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs weise die nCL-3 Genexpression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.The regulatory sequences or factors may be preferred Ways to positively influence nCL-3 gene expression and thereby increase. So can a reinforcement of the regulatory elements advantageously at the transcription level by strong transcription signals such as promoters and / or enhancers be used. In addition, however, is also a reinforcement of Translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.

Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte nCL-3-Genexpression bewirken.By "enhancer" are meant, for example, DNA sequences the over an improved interaction between RNA polymerase and DNA cause increased nCL-3 gene expression.

Dem nCL-3-Gen mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne Regulatorgen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet sein, so daß das Gen in einer Genstruktur enthalten ist.The nCL-3 gene with or without an upstream promoter or with or without regulatory gene, one or more DNA sequences can be pre- and / or be downstream so that the gene is in a gene structure is included.

Die Genexpression des nCL-3-Gens läßt sich darüber hinaus auch durch Erhöhen der nCL-3-Genkopienzahl erhöhen. Zur Erhöhung der Genkopienzahl wird das nCL-3-Gen beispielsweise in einem CHO- Expressionsvektor amplifiziert. Als Vektoren eignen sich auch Vektoren der pED-Reihe - dicistronische Vektoren -, die auch das amplifizierbare Markergen Dihydrofolat Reduktase enthalten. Details können den Current Protocols in Molecular Biology Vol. 2, 1994 entnommen werden.In addition, the gene expression of the nCL-3 gene can be increase by increasing nCL-3 gene copy number. To increase the Gene copy number, the nCL-3 gene is expressed, for example, in a CHO Expression vector amplified. As vectors are also suitable Vectors of the pED series - dicistronic vectors - that too the amplifiable marker gene dihydrofolate reductase. Details can be found in the Current Protocols in Molecular Biology Vol. 2, 1994 be removed.

Eine Steigerung der nCL-3-Enzymaktivität läßt sich zum Beispiel gegenüber dem Ausgangsenzym durch Veränderung des nCL-3-Gens oder seiner tierischen Homologen durch klassische Mutagenese wie UV-Bestrahlung oder Behandlung mit chemischen Mutagentien und/oder durch gezielte Mutagenese wie site directed mutagenesis, Deletion(en), Insertion(en) und/oder Substitution(en) erzielen. Eine Erhöhung der Enzymaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem das katalytische Zentrum so verändert wird, daß das zu spaltende Substrat rascher umgesetzt wird. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität neben der beschriebenen Genamplifikation durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzymbiosynthese re primieren und/oder durch Synthese aktiver statt inaktiver nCL-3-Proteine erreicht werden. Auf diesem Weg können erhöhte Enzymmengen für die in vitro-Tests zur Verfügung gestellt werden.An increase in nCL-3 enzyme activity can be, for example to the parent enzyme by altering the nCL-3 gene or its animal homologs by classical mutagenesis such as UV irradiation or treatment with chemical mutagens and / or by targeted mutagenesis such as site-directed mutagenesis, Achieve deletion (s), insertion (s) and / or substitution (s). An increase in enzyme activity can be achieved, for example be changed by the catalytic center is changed so that the to be cleaved substrate is reacted faster. Also, one can increased enzyme activity in addition to the described gene amplification by eliminating factors that affect enzyme biosynthesis prime and / or by synthesis active instead of inactive nCL-3 proteins are achieved. This way can be increased Enzyme quantities are provided for the in vitro tests.

nCL-3 oder seine tierischen Homologen lassen sich vorteilhafter weise ausgehend von genomischer DNA oder cDNA unter Verwendung beispielsweise der PCR-Technik (siehe Molekular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, Kapitel 14, 1-35, ISBN 0-87969-309-6 und Saiki et al., Science, 1988, Vol. 239, 487ff) klonieren, bevor zugt läßt sich nCL-3 unter Verwendung von genomischer DNA und besonders bevorzugt unter Verwendung von genomischer DNA aus Mauszellen oder humanen Zellen klonieren.nCL-3 or its animal homologs are more advantageous wise starting from genomic DNA or cDNA using For example, the PCR technique (see Molecular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, chapters 14, 1-35, ISBN 0-87969-309-6 and Saiki et al., Science, 1988, Vol. 239, 487ff) before nCL-3 can be added using genomic DNA and more preferably using genomic DNA Cloning mouse cells or human cells.

Als Wirtsorganismus für die Klonierung eignen sich beispielsweise alle Escherichia coli-Stämme, bevorzugt der Escherichia coli Stamm DH10B. Als Vektoren für die Klonierung sind alle Vektoren geeignet, die für die Expression in Escherichia coli geeignet sind (siehe Molecular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, ISBN 0-87969-309-6). Besonders geeignet sind beispielsweise Vektoren, die sich von pBR oder pUC ableiten oder shuttle-Vektoren, ganz besonders geeignet ist pBluescript.For example, as the host organism for the cloning are all Escherichia coli strains, preferably Escherichia coli Strain DH10B. As vectors for cloning are all vectors suitable for expression in Escherichia coli (see Molecular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, ISBN 0-87969-309-6). Particularly suitable are, for example, vectors, derived from pBR or pUC or shuttle vectors, whole pBluescript is particularly suitable.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind nCL-3-Gene mit Nukleotid sequenzen erhältlich, die für die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz oder deren Allelvariantionen kodieren. Unter Allelvarianten sind nCL-3-Varianten zu verstehen, die 60 bis 100% Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 70 bis 100%, ganz be sonders bevorzugt 80 bis 100% aufweisen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Inser tion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die nCL-3-Aktivität aber erhalten bleibt.After isolation and sequencing, nCL-3 genes are nucleotide available for the sequences indicated in SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence or encode their Allelvariantionen. Under Allelic variants are nCL-3 variants that account for 60 to 100% Homology at the amino acid level, preferably 70 to 100%, very be more preferably 80 to 100%. Allelic variants include In particular, functional variants that by deletion, Inser tion or substitution of nucleotides from that shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 are available, wherein but the nCL-3 activity is preserved.

Unter Analoge von nCL-3 sind beispielsweise seine tierischen Homologen, verkürzte Sequenzen wie nCL-3' (siehe SEQ ID NO: 3), Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz besonders antisense RNA zu verstehen.Examples of analogs of nCL-3 are its animal Homologs, truncated sequences such as nCL-3 '(see SEQ ID NO: 3), Single-stranded DNA or RNA coding and non-coding DNA sequence to understand particularly antisense RNA.

Derivate von nCL-3 sind beispielsweise solche Derivate, die enzy matisch nicht oder nur schwer spaltbar sind wie die Nucleinsäure phosphonate oder -phosphothioate, bei denen die Phospatgruppe der Nucleinsäuren gegen eine Phosphonat- bzw Thioatgruppe ersetzt wurde.Derivatives of nCL-3 are, for example, those derivatives which are enzy are not difficult or difficult to cleave like the nucleic acid phosphonates or -phosphothioates in which the phosphate group of the Replaces nucleic acids with a phosphonate or thioate group has been.

Auch der Promotor, der der angegebenen Nukleotidsequenz vorge schalten ist, kann durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit des Promotors beein trächtigt ist. Des weiteren kann der Promotor auch durch Ver änderung seiner Sequenz in seiner Wirksamkeit erhöht oder kom plett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen aus getauscht werden.Also, the promoter that preceded the specified nucleotide sequence can be switched by one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or deletion (s), without but that the functionality or effectiveness of the promoter impressed is pregnant. Furthermore, the promoter may also be replaced by Ver change in its sequence in its effectiveness increased or kom clears by more effective promoters of alien organisms it will be exchanged.

Die nach den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Cal paininhibitoren eignen sich zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe der kardio vaskulären, immunologischen, entzündlichen, allergischen, neuro logischen, neurodegenerativen, oder onkologischen Erkrankungen wie beispielsweise Restenose, Arthritis, Ischämien des Herzen, der Niere oder des Zentralnervensystems (z. B. Hirnschlag), Ent zündungen, Muskeldystrophien, Katarakten der Augen (Grauer Star), Verletzungen des Zentralnervensystems (z. B. Trauma), Alzheimer Krankheit, HIV-induzierte Neuropathy, Parkinsonsche- und Huntig tonsche Krankheit.The Cal identified by the methods of the invention paininhibitors are suitable for the production of medicines Treatment of diseases selected from the group of cardio vascular, immunological, inflammatory, allergic, neuro logical, neurodegenerative, or oncological diseases such as restenosis, arthritis, ischemia of the heart, the kidney or the central nervous system (eg stroke), Ent inflammations, muscular dystrophies, cataracts of the eyes (cataracts), Injuries to the central nervous system (eg trauma), Alzheimer's Disease, HIV-induced neuropathy, Parkinson's disease and Huntig mental illness.

Die erfindungsgemäßen nCL-3-Gensequenzen eignen sich vorteil hafterweise auch zur Diagnose von Krankheiten beispielsweise zur Diagnose von Muskeldystrophie oder zur Gentherapie. The nCL-3 gene sequences according to the invention are advantageously suitable legally also for the diagnosis of diseases such as Diagnosis of muscular dystrophy or gene therapy.

BeispieleExamples Beispiel 1example 1 Klonierung des nCL-3-GensCloning of the nCL-3 gene

Für die Klonierung des nCL-3-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 wurde genomische DNA aus Mauszellen ES E14 verwendet. Es wurden die 5'-3' (= Vorwärts) und 3'-5' (= Rückwärts)-Sequenzen der Primer CAL6 und CAL9 (siehe Tabelle 1) sowie folgende PCR-Bedingungen (siehe Molekular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, Kapitel 14, 1-35, ISBN 0-87969-309-6 und Saiki et al., Science, 1988, Vol. 239, 487ff) für die Klonierung verwendet:
Genomic DNA from mouse cells ES E14 was used for the cloning of the nCL-3 gene with the sequence SEQ ID NO: 1. The 5'-3 '(= forward) and 3'-5' (= reverse) sequences of the primers CAL6 and CAL9 (see Table 1) and the following PCR conditions (see Molecular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, chapters 14, 1-35, ISBN 0-87969-309-6 and Saiki et al., Science, 1988, vol. 239, 487ff) for cloning:

250 ng Vorwärts-Primer
250 ng Rückwärts-Primer
1,5 mM MgCl2
0,2 mM dNTPs
50 mM KCl
10 mM Tris pH 9,0
1 µg genomische DNA
2 Units Taq Polymerase.250 ng forward primer
250 ng reverse primer
1.5 mM MgCl 2
0.2 mM dNTPs
50 mM KCl
10 mM Tris pH 9.0
1 μg genomic DNA
2 units Taq polymerase.

Es wurden 35 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei 45 Sekunden 94°C, 45 Sekunden 48°C und 2 Minuten die Temperatur auf 72°C gehalten wurde. Das nCL-3-Gen wurde in den Vektor pBluescript (SK+) mit dem Enzym EcoRV einkloniert (siehe Holton et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19., No. 5, 1156ff.). Mit dem pBluescript-Vektor mit dem einklonierten nCL-3-Gen wurde der Escherichia coli Stamm DH10B entsprechend Maniatis et al. transformiert (siehe Molekular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Labo ratory Press, Second Edition 1989, Band 1, Kapitel 1, 74-84, ISBN 0-87969-309-6 und Saiki et al., Science, 1988, Vol. 239, 487ff).35 PCR cycles were performed, with 45 seconds 94 ° C, 45 seconds 48 ° C and 2 minutes, the temperature maintained at 72 ° C. has been. The nCL-3 gene was in the vector pBluescript (SK +) with the enzyme EcoRV (see Holton et al., Nucleic Acids Research, Vol. 5, 1156ff.). With the pBluescript vector with the cloned nCL-3 gene became the Escherichia coli strain DH10B according to Maniatis et al. transformed (see Molecular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Labo Ratory Press, Second Edition 1989, Volume 1, Chapter 1, 74-84, ISBN 0-87969-309-6 and Saiki et al., Science, 1988, Vol. 239, 487ff).

Auf diesem Wege läßt sich auch die humane Sequenz des nCL-3 Gens mit der SEQ ID NO: 6 klonieren, wobei von 0,1 ng cDNA oder 0,5 µg genomischer DNA ausgegangen werden kann. Der Klonierungsansatz kann außerdem vorteilhafterweise 0,1% Triton X-100 enthalten.In this way, the human sequence of the nCL-3 gene can be cloning with SEQ ID NO: 6, with 0.1 ng cDNA or 0.5 μg Genomic DNA can be assumed. The cloning approach may also advantageously contain 0.1% Triton X-100.

Beispiel 2Example 2 Expression des nCL-3-Gens in verschiedenen MausgewebenExpression of the nCL-3 gene in different mouse tissues

Für die Expression wurde mRNA aus dE12 Embryonen und aus Haut-, Niere-, Herz-, Lunge-, Gehirn-, Thymus- und Dünndarmgewebe der Maus isoliert. Für die Extraktion der mRNA wurden die Gewebe in flüssigem Stickstoff dispergiert und in 10 ml einer Lösung aus 4 M Guanidinium-Isothiocyanat, 25 mM NaCitrat, 0,5% Sarcosyl und 72 µl 2-Mercaptoethanol resuspendiert. Anschließend wurden 1 ml NaAcetat (pH 4,0), 10 ml wassergesättigtes Phenol und 2 ml Chlo roform unter Mischen zugegeben. Die Proben wurden 20 Minuten in zentrifugiert (5000×g, 4°C). Der Niederschlag wurde verworfen. Aus dem Überstand wurde die RNA mit einem Volumen Isopropanol bei -20°C (mindestens eine Stunde Fällung) ausgefällt und erneut für 30 Minuten (19000×g, 4°C) zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 300 µl resuspendiert und erneut mit NaAcetat/Ethanol in der Kälte gefällt und mit 70% Ethanol, abzentrifugiert (19000×g, 4°C), gewaschen und in 300 µl Wasser gelöst. Anschließend wurde die mRNA-Konzentration bei 250 nm im Photometer und in einem Aga rosegel mit einer 5 µl mRNA-Probe gegen eine Referenz bestimmt.For expression, mRNA from dE12 embryos and skin, Kidney, heart, lung, brain, thymus and small intestinal tissues of the Mouse isolated. For the extraction of the mRNA, the tissues were analyzed in dispersed liquid nitrogen and in 10 ml of a solution 4 M guanidinium isothiocyanate, 25 mM Na citrate, 0.5% Sarcosyl and 72 μl of 2-mercaptoethanol are resuspended. Subsequently, 1 ml NaCethylate (pH 4.0), 10 ml of water-saturated phenol and 2 ml of Chlo roform with mixing. The samples were in for 20 minutes centrifuged (5000 x g, 4 ° C). The precipitate was discarded. From the supernatant, the RNA was added with one volume of isopropanol -20 ° C (at least one hour of precipitation) precipitated and again for Centrifuged for 30 minutes (19,000 xg, 4 ° C). The rainfall was resuspended in 300 μl and again with NaAcetat / ethanol in the Cold precipitated and centrifuged with 70% ethanol (19,000 × g, 4 ° C), washed and dissolved in 300 ul of water. Subsequently was the mRNA concentration at 250 nm in the photometer and in an Aga rosegel with a 5 μl mRNA sample against a reference.

Über RT-PCR, in dem ausgehend von der isolierten mRNA zunächst 5 eine cDNA-Kopie mit Hilfe der Reversen Transcriptase erstellt wurde, wurde mit Hilfe der folgenden zwei Primer
Using RT-PCR in which a cDNA copy was first prepared from the isolated mRNA using reverse transcriptase, the following two primers were used

a) Vorwärtsprimer 5'-tagctcgagtggacgtaatcgtcgatgac-3'a) Forward primer 5'-tagctcgagtggacgtaatcgtcgatgac-3 '
b) Rückwärtsprimer 5'-tagctcgagtgctgtaggctgtgcatacg-3'b) reverse primer 5'-tagctcgagtgctgtaggctgtgcatacg-3 '

die Expression des nCL-3-Gens in den verschiedenen Mausgeweben bestimmt (siehe the expression of the nCL-3 gene in the different mouse tissues determined (see

Fig.FIG.

1).1).

Die cDNA wurde nach einem Protokoll von der Firma GIBCO wie folgt hergestellt:
Zu 5 µg mRNA (isoliert nach der oben beschriebenen Methode) wurden 2 µl oligo(dT) und 12 µl DEPC dH₂0 gegeben. Dieser Ansatz wurde 10 Minuten bei 70°C inkubiert und anschließend auf Eis gestellt. Zur Probe wurden in der angegebenen Reihenfolge 2 µl 10×Puffer, 2 µl 25 mM MgCl₂₁ 1 µl 10 mM dNTPs, 2 µl 0,1 M DTT gegeben. Nach 5 Minuten Inkubation bei 23°C wurde 1 µl Super script Reverse Transcriptase hinzugegeben und das ganze 10 Min. bei 25°C, 50 Min. bei 42°C und 15 Min. bei 70°C weiter inku biert. Danach wurde 1 µl RNAse H und 79 µl dH₂O zugegeben und je 20 Min. bei 37°C und 15 Min. bei 70°C die Reaktion weiter durch geführt. 1 µl dieser cDNA wurde für die RT-PCR-Reaktion ver wendet. The cDNA was prepared according to a protocol from GIBCO as follows:
To 5 ug mRNA (isolated according to the method described above) 2 ul oligo (dT) and 12 ul DEPC dH ₂ 0 were added. This mixture was incubated for 10 minutes at 70 ° C and then placed on ice. To the sample was added in the order given 2 μl of 10 × buffer, 2 μl of 25 mM MgCl _21, 1 μl of 10 mM dNTPs, 2 μl of 0.1 M DTT. After incubation for 5 minutes at 23 ° C., 1 μl of Super Script reverse transcriptase was added and the mixture was incubated for a further 10 minutes at 25 ° C., 50 minutes at 42 ° C. and 15 minutes at 70 ° C. Thereafter, 1 .mu.l of RNAse H and 79 .mu.l of dH ₂ O was added and the reaction was continued for 20 min. At 37 ° C and 15 min. At 70 ° C. 1 μl of this cDNA was used for the RT-PCR reaction.

Die PCR-Reaktion für die Nachweis der Expression von nCL-3 wurde wie folgt durchgeführt:
The PCR reaction for the detection of expression of nCL-3 was performed as follows:

250 ng Vorwärts-Primer
250 ng Rückwärts-Primer
1,5 mM MgCl2
0,2 mM dNTPs
50 mM KCl
10 mM Tris pH 9,0
1 µg cDNA
2 Units Taq Polymerase.250 ng forward primer
250 ng reverse primer
1.5 mM MgCl 2
0.2 mM dNTPs
50 mM KCl
10 mM Tris pH 9.0
1 μg of cDNA
2 units Taq polymerase.

Es wurden 35 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei 45 Sekunden 94°C, 45 Sekunden 58°C und 1 Minute die Temperatur auf 72°C gehalten wurde.35 PCR cycles were performed, with 45 seconds 94 ° C, Held 58 ° C for 45 seconds and the temperature at 72 ° C for 1 minute has been.

In den getesteten Geweben zeigte sich, daß nCL-3 in den dE12-Em bryonen exprimiert wird. nCL-3 wird auch in der Haut, der Niere, dem Herz, der Lunge und im Thymus exprimiert. Im Gehirn und im Dünndarm ist die Expression schwächer als in den vorgenannten Organen (in Abb. 1 nicht zu sehen). Als interner Standard wurde hprt (= Hypoxanthin-phosphor-ribosyl-transferase) ver wendet.In the tissues tested, it was found that nCL-3 is expressed in the dE12-embryonic. nCL-3 is also expressed in the skin, kidney, heart, lung and thymus. In the brain and in the small intestine, the expression is weaker than in the aforementioned organs (not visible in Fig. 1). Hprt (= hypoxanthine-phosphorus-ribosyl-transferase) was used as an internal standard.

Beispiel 3Example 3 Klonierung der humanen Sequenz des nCL-3Cloning of the human sequence of nCL-3

Das 3' Ende der Maus bzw. Humanen nCL-3 cDNA wurde mit der sog. RACE-Methode (= rapid amplification of cDNA ends), wie von Frohman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, 8998-9002) bzw. Edwards et al. (Nucl. Acids Res. 19, 1991, 5227-5232) be schrieben, ermittelt. Für die humane Sequenz des 5' und 3' Endes wurde humane Hippocampus Marathon-Ready cDNA (Clontech) verwen det. Für die Maus-Sequenz wurde wie unter Beispiel 2 beschrieben cDNA aus Tag 12 Mäuseembryonen verwendet. Das humane 3' Ende konnte nicht mit dem Reversen-Primer des Kit's isoliert werden. Die Klonierung gelang mit Hilfe eines zur humanen EST-Sequenz komplementären Vorwärts-Primers und eines Reversen-Primers, der den letzten 6 Aminosäuren der Maus nCL-3 Sequenz (5'-tcagacagc cgtgagagagg-3') entsprach.The 3 'end of the mouse or human nCL-3 cDNA was with the so-called. RACE method (= rapid amplification of cDNA ends), as of Frohman et al. (Proc Natl Acad Sci USA 85, 1988, 8998-9002) or Edwards et al. (Nucl. Acids Res. 19, 1991, 5227-5232) written, determined. For the human sequence of the 5 'and 3' ends was human Hippocampus Marathon-Ready cDNA (Clontech) verwen det. For the mouse sequence was described as in Example 2 cDNA from day 12 mouse embryos used. The humane 3 'end could not be isolated with the kit's reverse primer. The cloning was accomplished using a human EST sequence complementary forward primer and a reverse primer, the the last 6 amino acids of the mouse nCL-3 sequence (5'-tcagacagc cgtgagagagg-3 ') corresponded.

Beispiel 4Example 4 Isolierung und Charakterisierung von Cosmid KlonenIsolation and characterization of cosmid clones

Cosmid Klone mit dem Maus nCl-3 Gen wurden aus einer Cosmidbi bliothek, die aus genomischer ES-Mäusezellen-DNA durch Klonierung in den Vector pSuperCos (Stratagene) hergestellt wurde, isoliert. Die Bibliothek war in 348 "Pools" a 1000 Klone unterteilt worden. Positive "Pools" wurden mit Hilfe der PCR-Analyse unter Verwen dung von nCL-3-spezifischen Primern identifiziert. Diese "Pools" wurden anschließend ausplattiert und und gescreent. Positive Klone wurden über Koloniehybridisierung mit³²P-markierten Maus nCL-3 cDNA-Fragmenten identifiziert.Cosmid clones with the mouse nCl-3 gene were isolated from a cosmid biolibrary prepared from ES mouse genomic DNA by cloning into the Vector pSuperCos (Stratagene). The library had been divided into 348 "pools" and a thousand clones. Positive "pools" were identified by PCR analysis using nCL-3 specific primers. These "pools" were then plated and screened. Positive clones were identified by colony hybridization with ³² P-labeled mouse nCL-3 cDNA fragments.

Beispiel 5Example 5 RNA ExpressionsanalyseRNA expression analysis

Die Expression des humanen nCL-3 wurde über Hybridisierung eines Humanen RNA "Master Blots" (Clontech) mit einem³²P-markierten humanen nCL-3 Fragment (Nucleotid 1-928 kodierend für die Ami nosäuren 1-295) untersucht. Die Hybridisierung und die hoch stringenten Waschbedingungen wurden entsprechend den Anweisungen des Hersteller durchgeführt.The expression of human nCL-3 was examined by hybridization of a human RNA "master blot" (Clontech) with a ³² P-labeled human nCL-3 fragment (nucleotide 1-928 encoding the amino acids 1-295). Hybridization and high stringency wash conditions were performed according to the manufacturer's instructions.

Beispiel 6Example 6 Lokalisierung des nCL-3 Gens auf dem ChromosomLocalization of the nCL-3 gene on the chromosome

Die Lokalisierung des Gens in der Maus erfolgte durch PCR-Analyse genomischer DNA, die von somatischen Maus×Hamster-Zellhybriden isoliert worden war, wie sie von Williamson et al. (Mamm. Genome 6, 1995, 429-432) beschrieben worden war, unter Verwendung eines Sets von DNAs wie sie Schupp et al. (Immunogenet. 45, 1997, 180-187) zu entnehmen ist. Als Primer-Sequenzen wurden 5'-tgca cagcctacagcataag-3' und 5'-tcagacagccgtgagagagg-3' verwendet. Mit Hilfe dieser Primer konnte ein etwa 2.7 kb großes Fragment von Maus und keine Hamster DNA amplifiziert werden. Die PCR Reak tionen wurden mit dem "Expand Long Template PCR System (Boehrin ger Mannheim) entsprechend den Anweisungen des Herstellers bei einer "Annealing"-Temperatur von 58°C durchgeführt.The localization of the gene in the mouse was carried out by PCR analysis genomic DNA derived from somatic mouse × hamster cell hybrids isolated as described by Williamson et al. (Mammal Genome 6, 1995, 429-432) using a set of DNAs as described by Schupp et al. (Immunogen., 45, 1997, 180-187) can be seen. As primer sequences were 5'-tgca cagcctacagcataag-3 'and 5'-tcagacagccgtgagagagg-3'. With The help of this primer was a fragment of about 2.7 kb Mouse and no hamster DNA are amplified. The PCR Reak tions were performed with the "Expand Long Template PCR System (Boehrin ger Mannheim) according to the manufacturer's instructions an annealing temperature of 58 ° C.

Die Lokalisierung des Gens im Mensch erfolgte mit Hilfe des NIGMS Mensch/Nager somatischen Zellhybrid "mapping panels" (Coriell Cell Repositories). Als Primer-Sequenzen für die PCR-Reaktion wurden folgende Primer verwendet : 5'-acttcatcttc tggcttcttgacttc-3' und 5' gctgcatcaaccacaaggacac-3'. Die PCR- Amplification wurde mit einer "Anealing"-Temperatur von 58°C durchgeführt und führte zu einem 600 bp Fragment. Die Ergebnisse wurden auf Übereinstimmung zwischen der Anwesenheit von menschli chen Chromosomen und dem PCR-Produkt untersucht. Die genaue Loka lisierung des Gens im menschlichen Chromosom erfolgte mit Hilfe des "Genebridge 4 RH Panels" (Research Genetics) und Über mittelung der PCR-Ergebnisse an den Lokalisierungsservice das MIF Center for Genome Research (http://www-genome.wi.mit.edu). The localization of the gene in humans was carried out with the help of the NIGMS Human / rodent somatic cell hybrid mapping panels (Coriell Cell repositories). As primer sequences for the PCR reaction the following primers were used: 5'-acttcatcttc tggcttcttgacttc-3 'and 5' gctgcatcaaccacaaggacac-3 '. The PCR Amplification was performed with an annealing temperature of 58 ° C performed and resulted in a 600 bp fragment. The results were on agreement between the presence of menschli chromosomes and the PCR product. The exact Loka The gene was synthesized in the human chromosome with the help of Genebridge 4 RH Panel (Research Genetics) and About Communicate the PCR results to the localization service the MIF Center for Genome Research (http://www-genome.wi.mit.edu).

Beispiel 7Example 7 Cathepsin B-TestCathepsin B test

Die Cathepsin B-Hemmung wurde analog einer Methode von S.Hasnain et al., J.Biol.Chem. 1993, 268, 235-40 bestimmt.The cathepsin B inhibition was analogous to a method of S.Hasnain et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 235-40.

Zu 88 µl Cathepsin B (Cathepsin B aus menschlicher Leber (Calbiochem), verdünnt auf 5 Units in 500 µM Puffer) werden 2 µl einer Inhibitor-Lösung, hergestellt aus Inhibitor und DMSO (End konzentrationen: 100 µM bis 0,01 µM). Dieser Ansatz wird für 60 Minuten bei Raumtemperatur (25°C) vorinkubiert und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 10 µl 10 mM Z-Arg-Arg-pNA (in Puffer mit 10% DMSO) gestartet. Die Reaktion wird 30 Minuten bei 405 nM im Mikrotiterplattenreader verfolgt. Aus den maximalen Steigungen werden anschließend die IC₅₀ bestimmt.To 88 μl of cathepsin B (cathepsin B from human liver (Calbiochem) diluted to 5 units in 500 μM buffer) is added 2 μl of an inhibitor solution prepared from inhibitor and DMSO (final concentrations: 100 μM to 0.01 μM). This approach is preincubated for 60 minutes at room temperature (25 ° C) and then the reaction is started by adding 10 μl of 10 mM Z-Arg-Arg-pNA (in buffer with 10% DMSO). The reaction is followed for 30 minutes at 405 nM in the microtiter plate reader. From the maximum gradients, the IC ₅₀ are then determined.

Beispiel 8Example 8 Calpain-TestCalpain test

Die Aktivität der Calpain Inhibitoren wurde in einem colorimetri schen Test mit Casein nach Hammarsten (Merck, Darmstadt) als Sub strat untersucht. Der Test wurde in der Mikrotiterplatte, ent sprechend der Veröffentlichung von Buroker-Kilgore und Wang in Anal. Biochemistry 208, 387-392 (1993), durchgeführt. Als Enzym wurde 29/30, welches in einem der oben beschriebenen Systemen ex primiert und anschließend gereinigt wurde, verwendet. Die Sub stanzen wurden mit dem Enzym für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei eine Konzentration von 1% des Lösungsmittels DMSO nicht überschritten wurde. Nach Zugabe des Bio-Rad Farbrea genz erfolgte die Messung der optischen Dichte bei 595 nm in dem Easy Reader EAR 400 der Firma SLT. Die 50%ige Aktivität des En zyms ergibt sich aus den optischen Dichten, die bei der maximalen Aktivität des Enzyms ohne Inhibitoren und der Aktivität des En zyms ohne Zugabe von Kalzium bestimmt wurden.The activity of calpain inhibitors was determined in a colorimetri test with casein according to Hammarsten (Merck, Darmstadt) as sub strat examined. The test was carried out in the microtiter plate, ent Speaking of the release of Buroker-Kilgore and Wang in Anal. Biochemistry 208, 387-392 (1993). As an enzyme was 29/30, which in one of the systems described above ex primed and then cleaned. The sub Punching was done with the enzyme for 60 minutes at room temperature incubated, leaving a concentration of 1% of the solvent DMSO was not exceeded. After adding the Bio-Rad Farbrea The measurement of the optical density at 595 nm in the Easy Reader EAR 400 from SLT. The 50% activity of En zyms results from the optical densities, which at the maximum Activity of the enzyme without inhibitors and the activity of En zyms were determined without the addition of calcium.

Beispiel 9Example 9 Plättchen-Test zur Bestimmung der zellulären Aktivi tät von Calpain-InhibitorenPlatelet test to determine cellular activity calpain inhibitors

Der Calpain-vermittelte Abbau von Proteinen in Plättchen wurde, wie von Zhaozhao Li et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 3472-3480 be schrieben, durchgeführt. Humane Plättchen wurden aus frischem Natrium-Citrat-Blut von Spendern isoliert und in Puffer (5 mM Hepes, 140 mM NaCl und 1 mg/ml BSA, pH 7,3) auf 10⁷ Zellen/ ml eingestellt.The calpain-mediated degradation of proteins in platelets was performed as described by Zhaozhao Li et al., J.Med.Chem., 1993, 36, 3472-3480. Human platelets were isolated from fresh sodium citrate blood from donors and adjusted to 10 ⁷ cells / ml in buffer (5 mM Hepes, 140 mM NaCl and 1 mg / ml BSA, pH 7.3).

Plättchen (0,1 ml) werden für 5 Minuten mit 1 µl an verschiedenen Konzentrationen an Inhibitoren (gelöst in DMSO) vorinkubiert.Platelets (0.1 ml) are mixed for 5 minutes with 1 μl of different Concentrations of inhibitors (dissolved in DMSO) preincubated.

Danach erfolgte die Zugabe von Kalziumionophor A 23187 (1 µM im Test) und Kalzium (5 mM im Test) und eine weitere Inkubation von 5 Minuten bei 37°C. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden die Plättchen in SDS-Page Probenpuffer aufgenommen, 5 Minuten bei 95°C gekocht und die Proteine in einem 8%igen Gel aufgetrennt. Der Abbau der beiden Proteine Act in bindendes Protein (ABP) und Talin wurde durch quantitative Densitometrie verfolgt, da nach der Zugabe von Kalzium und Ionophor diese Proteine verschwanden und eine neue Bande im Bereich von 200 Kd Molekulargewicht ent stand. Daraus wird die halb maximale Enzymaktivität bestimmt. This was followed by the addition of calcium ionophore A 23187 (1 μM im Test) and calcium (5 mM in the test) and a further incubation of 5 minutes at 37 ° C. After a centrifugation step, the Platelets added to SDS-Page Sample Buffer for 5 minutes Cooked 95 ° C and the proteins separated in an 8% gel. The degradation of both proteins Act into binding protein (ABP) and Talin was tracked by quantitative densitometry as post the addition of calcium and ionophore these proteins disappeared and a new band in the range of 200 Kd molecular weight ent was standing. From this the half maximum enzyme activity is determined.

SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LISTING

Claims

1. nCL-3-Calpaingen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 sowie seine allelischen Varianten, die auf der abgeleiteten Aminosäure ebene eine Homologie von 60 bis 100% aufweisen, Analoge oder Derivate.1. nCL-3-Calpaingen having the sequence SEQ ID NO: 1 and its allelic variants based on the deduced amino acid level have a homology of 60 to 100%, analogues or Derivatives.

2. nCL-3-Calpaingen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Analogen um eine verkürzte Gensequenz handelt.2. nCL-3-Calpaingen according to claim 1, characterized that the analogue is a truncated gene sequence is.

3. nCL-3-Calpaingen nach Anspruch 1 codiert durch die Sequenz SEQ ID NO: 6.3. nCL-3-Calpaingen according to claim 1 encoded by the sequence SEQ ID NO: 6.

4. Genkonstrukt enthaltend ein nCL-3-Calpaingen gemäß den An sprüchen 1 bis 3, das funktionell mit einem oder mehreren Regulationssignalen zur Erhöhung der Genexpression funktio nell verknüpft ist.4. Gene construct containing an nCL-3-Calpaingen according to the An 1 to 3, which is functional with one or more Regulatory signals to increase gene expression funktio is linked.

5. Aminosäuresequenzen codiert durch nCL-3-Gene gemäß An spruch 1.5. Amino acid sequences encoded by nCL-3 genes according to An Claim 1.

6. Verfahren zur Identifizierung von Calpaininhibitoren, wobei man ein Calpain codiert durch eine Sequenz gemäß Anspruch l aus Geweben oder Zellen, in denen das Enzym nCL-3 exprimiert wird, isoliert und die Inhibierung der Spaltung eines Sub strats des Enzyms nCL-3 und in mindestens einem weiteren Test die Inhibierung der Spaltung eines Substrats der Enzyme Calpain I und/oder II durch Testsubstanzen mißt und die Test substanzen auswählt, die mindestens gegen eines der Calpaine eine inhibierende Wirkung zeigen.6. A method for identifying calpain inhibitors, wherein a calpain encoded by a sequence according to claim l from tissues or cells in which the enzyme expresses nCL-3 is isolated and inhibiting the cleavage of a sub strats of the enzyme nCL-3 and in at least one other Test the inhibition of cleavage of a substrate of the enzymes Calpain I and / or II by test substances and measures the test selects substances that are resistant to at least one of the calpains show an inhibitory effect.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Testsubstanzen auswählt, die das Enzym nCL-3 nicht hemmen, jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II.7. The method according to claim 6, characterized in that one the test substances does not select the enzyme nCL-3 inhibit, but the enzymes calpain I and / or II.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Testsubstanzen auswählt, die das Enzym nCL-3 hemmen, nicht jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II. 8. The method according to claim 6, characterized in that one select the test substances that inhibit the enzyme nCL-3, but not the enzymes calpain I and / or II.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekenn zeichnet, daß man die Testsubstanzen auswählt, die in zellu lären Systemen die Zellmembran passieren.9. Process according to claims 6 to 8, characterized marked draws that one selects the test substances, which in zellu The cellular membrane can pass through the laryngeal systems.

10. Verfahren zur Herstellung des Enzyms nCL-3, dadurch gekenn zeichnet, daß man eine Kopie der Gensequenzen für nCL-3 gemäß Anspruch 1 in einen Vektor kloniert und in einem dem Vektor entsprechenden Wirtsorganismus das Gen für das Enzym nCL-3 exprimiert und anschließend das Enzym aus dem Wirtsorganismus isoliert.10. A process for the preparation of the enzyme nCL-3, characterized gekenn characterized in that a copy of the gene sequences for nCL-3 according to Claim 1 cloned in a vector and in a vector corresponding host organism, the gene for the enzyme nCL-3 and then expressing the enzyme from the host organism isolated.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Vektor verwendet der in prokaryontischen oder eukaryon tischen Zellen die Expression des Gens für nCL-3 ermöglicht.11. The method according to claim 10, characterized in that one a vector used in prokaryotic or eukaryotic table cells allows the expression of the gene for nCL-3.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtsorganismus Bakterien, pilzliche oder tierische Zellen verwendet.12. The method according to claim 10, characterized in that one as a host bacterium, fungal or animal Cells used.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vektor Baculoviren und als Wirtsorganismus Insektenzellen verwendet.13. The method according to claim 10, characterized in that one as a vector baculoviruses and as a host organism insect cells used.

14. Verwendung eines Calpaininhibitors identifizierbar gemäß den Ansprüchen 6 bis 9 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten bei denen eine Calpainfehlfunktion vorliegt.14. Use of a Calpaininhibitors identifiable according to the Claims 6 to 9 for the preparation of medicaments for Treatment of diseases involving calpain malfunction is present.

15. Verwendung eines Calpaininhibitors nach Anspruch 14 zur Her stellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten aus gewählt aus der Gruppe der kardiovaskulären, immunologischen, entzündlichen, allergischen, neurologischen, neurodegene rativen, oder onkologischen Erkrankungen.15. Use of a Calpaininhibitors according to claim 14 for Her medication for the treatment of diseases selected from the group of cardiovascular, immunological, inflammatory, allergic, neurological, neurodegenic or oncological diseases.

16. Verwendung des Calpains nCL-3 gemäß Anspruch 5 in Test systemen.16. Use of calpain nCL-3 according to claim 5 in test systems.

17. Verwendung des Calpains nCL-3 gemäß Anspruch 5 zur Her stellung von Antikörpern.17. Use of calpain nCL-3 according to claim 5 for Her position of antibodies.

18. Verwendung einer Gensequenz gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von antisense mRNA. 18. Use of a gene sequence according to claim 1 for the preparation of antisense mRNA.

19. Verwendung der antisense mRNA nach Anspruch 18 zur Her stellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten bei denen eine Calpainfehlfunktion vorliegt.19. Use of the antisense mRNA according to claim 18 for Her medication for the treatment of diseases where there is a calpain malfunction.

20. Verwendung eines Calpaingens gemäß Anspruch 1 zur Diagnose von Krankheiten oder in der Gentherapie.20. Use of a Calpaingens according to claim 1 for diagnosis of diseases or in gene therapy.