DE19712702A1

DE19712702A1 - Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten

Info

Publication number: DE19712702A1
Application number: DE1997112702
Authority: DE
Inventors: Thorsten Sembritzki; Marion Sela; Klaus Dr Metzner
Original assignee: Buna Sow Leuna Olefinverbund GmbH
Current assignee: Dow Olefinverbund GmbH
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 1998-10-01

Description

Das Verfahren findet Anwendung zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) in Form von Polyhydroxybuttersäure (PHB), Polyhydroxyvaleriansäure oder Copolymeren dieser Polyhydroxyalkansäuren, welche in der Zellmasse von Mikroorganismen oder pflanzlicher Biomasse, die diese Polyhydroxyalkansäuren als innerzellulären Reservestoff akkumulieren, enthalten sind.

Zur Gewinnung von PHA aus der Zellmasse eines Mikroorganismus sind Lösungs- und Fällverfahren bekannt, bei denen die PHA in gelöster Form aus der Zellstruktur entfernt und von der Restbiomasse abgetrennt wird. So werden nach US 3044942 1.2-Dichlorethan im Gemisch mit Ethanol, nach EP 024810 Dichlormethan und nach US 3275610 Chloroform als Lösungsmittel für das PHA angewendet. Aus der von der Zellmasse abgetrennten PHA-haltigen Lösung wird durch geeignete Fällmittel das PHA in einer festen Form gewonnen. Nach DD 229428 erfolgt das Herauslösen von Polyhydroxybuttersäure aus der Biomasse mit Essigsäureanhydrid bei erhöhten Temperaturen, hier bei 100 bis 140°C. Aus der Polymerlösung fällt die Polyhydroxy buttersäure durch Herabsetzen der Temperatur in pulverförmigem Zustand aus. Nachteilig wirkt sich beim Umgang mit chlorierten Kohlenwasserstoffen als Lösungs mittel jedoch der damit verbundene Recycling- bzw. Entsorgungsaufwand des ver schmutzten Solvents aus. Des weiteren bedingen diese Stoffe erhöhte Anforderun gen an die Anlagengestaltung und -sicherheit. Für die Gewinnung eines farbstofffreien Polyhydroxyalkanoats wird in WO 93/23554 als gängiges Extraktionsmittel Essigsäure genannt, welche in Kombination mit Es sigsäureanhydrid bzw. unter Zusatz von 1-10% eines aliphatischen Carbonsäure anhydrids oder eines Lactons einer β-Hydroxycarbonsäure verwendet wird. Mit die sem Verfahren werden in der Praxis sehr gute Ergebnisse erzielt, jedoch sind diese abhängig von der Art der verwendeten Mikroorganismen sowie vom späteren Ein satzzweck. Das beschriebene Verfahren wurde speziell für Bakterien entwickelt, die der Gruppe PPFM (pink pigmented facultatively methylotrophic) zugeordnet werden. Neben dem Extraktionsschritt zur Gewinnung des Polymeren mußte demnach zu sätzlich eine Lösung zur Eliminierung des roten Farbstoffes gefunden werden. Dies ist bei anderen Mikroorganismen nicht unbedingt nötig.

Um den Reinheitsgrad des extrahierten Polymers zu erhöhen sind unterschiedliche Behandlungsweisen bekannt, die in unterschiedlicher Form auf Restbiomassebe standteile wirken. So wird in der Patentanmeldung WO 94/24302 ein Verfahren dar gestellt, welches mit Hilfe eines oxidierenden Mediums in Gegenwart eines Kom plexbildners die Zellhüllen der Mikroorganismen auflöst. Beispielsweise wird zur Gewinnung von Polyhydroxybuttersäure ein Wasserstoffperoxid bei einer Behand lungstemperatur zwischen 60 und 1 80°C als oxidierendes Mittel eingesetzt. Als Vorstufe zur oxidativen Behandlung ist eine physikalische Vorbereitung des Zellmaterials möglich, insbesondere durch eine Temperaturbehandlung im Bereich zwischen 100 und 200°C. Ein weiterer Effekt von Peroxiden, beispielsweise Was serstoffperoxid, kommt in der Patentanmeldung WO 94/10289 für einen Prozeß zur Gewinnung von Produkten aus einer wäßrigen Zusammensetzung zur Zersetzung von Nucleinsäuren zur Anwendung, wenn die Menge an Nucleinsäure ausreicht, die Viskosität derartig zu erhöhen, daß nachfolgende Prozeßschritte beeinträchtigt wer den. Die Konzentration der in Wasser gelösten Nucleinsäuren wird mit < 0,1 g/l an gegeben, beispielsweise 0,5-20 g/l.

Biologische Verfahren sind durch den Einsatz kostenintensiver Enzyme und auf wendigerer Verfahrensbedingungen in der Regel sehr teuer. Zudem stellt sich, ebenso wie beim Einsatz chemischer Substanzen und Detergenzien, das Problem der späteren Abtrennung, da neben der Reinigung des Polymeren von Biomassebe standteilen eine "Verschmutzung" durch neue Materialien auftritt. Ein weiterer Nach teil chemischer Behandlungsmethoden ist die zumeist damit verbundene Schädi gung des zu reinigenden Polymers, welche sich in Form von Molekulargewichtsab bau äußert.

Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines kostengünstigen und effektiven Verfahrens zur Gewinnung von in einer bakteriellen Biomasse enthaltenen PHA, wobei der Restgehalt an Biomasse, ausgedrückt durch den Stickstoffgehalt in der PHA, sehr gering zu halten ist. Das Verfahren soll die Molekularmasse der fermen tativ erzeugten Polyhydroxyalkanoate nicht negativ beeinflussen.

Die Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen dargestellte Erfindung gelöst. Die sich in der Fermentationsbrühe befindliche bakterielle Biomasse kann zunächst einem mechanischen Zellaufschluß, beispielsweise in einer Rührwerkskugelmühle oder einem Hochdruckhomogenisator unterzogen werden. Der Aufschluß dient zur Zerstörung der festen Zellhülle und Freisetzung wasserlöslicher bzw. mit Wasser ausspülbarer Zellkomponenten. Weiterhin wird eine vergrößerte Oberfläche für den Angriff biologischer oder chemischer Substanzen geschaffen. Die Abtrennung der in der Fermentationsbrühe gelösten Substanzen bzw. leichter Schwebeteilchen und Zellbruchstücke erfolgt in bekannter Weise durch Filtration, Separation oder Dekan tieren. Im Anschluß daran wird die Biomasse als Ausgangspunkt der Wasch- und Extraktionsschritte getrocknet.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß bei Behandlung der getrockneten Bio masse aus Zellbruchstücken und PHA mit dem Extraktionsmittel Essigsäure bei ei ner Temperatur unterhalb der bekannten Extraktionstemperatur zur Gewinnung von PHA aus einer Biomasse ein Reinigungseffekt erreicht werden kann, das heißt, eine PHA mit hoher Reinheit gewonnen werden kann. Da die üblichen Extraktionstemperaturen bei der Verwendung von Essigsäure als Extraktionsmittel im Bereich von 85-105°C, zur Lösung des Polymeren jedoch in jedem Fall über 70°C liegen, wird die Vorreinigung der Biomasse unter Rühren in einem Temperaturbereich zwischen Raumtemperatur und 50°C durchgeführt. Der Vorteil der Verwendung von Essigsäure liegt in der Vermeidung eines aufwendigen Trenn- bzw. Trocknungsschrittes vor der Polymerextraktion. Nach der Abtrennung des Reinigungsmittels Essigsäure von der Biomasse wird die Biomasse ohne noch maliges Trocknen mit dem Extraktionsmittel Essigsäure in der bereits aus dem Stand der Technik bekannten Weise bei Extraktionstemperatur extrahiert. Die Aufarbeitung des Extraktes aus Extraktionsmittel und gereinigter PHA durch Fällung ist hinrei chend bekannt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für solche PHAs wie Poly hydroxybuttersäure, Polyhydroxyvaleriansäure oder deren Copolymere anwendbar. Gleichfalls ist das Verfahren aber auch für Gemische aus den genannten PHAs an wendbar.

Der Reinigungsprozeß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann in seiner Ef fektivität dadurch unterstützt werden, daß dem Extraktionsmittel Essigsäure in der Verfahrensstufe der Behandlung der Biomasse unterhalb der Extraktionstemperatur Essigsäureanhydrid in einer Menge bis zu 10% bezogen auf Essigsäure zugesetzt wird.

Eine weitere Bedingung für den Reinigungseffekt ergab sich aus anwendungstech nischen Versuchen. Da viele Verarbeitungstechnologien die Produkte über den Schmelzzustand des Ausgangsmaterials erzeugen, wurden in einer Laborpresse bei 150°C, 150 bar und einer Verweilzeit von drei Minuten Prüfkörper hergestellt. Nach dem Preßvorgang zeigte sich bei den mit Essigsäure extrahierten, ursprünglich wei ßen Polymerproben eine Verfärbung, die je nach Mikroorganismus und Vorbehand lung zwischen einem Karamel- und dunklem Braunton variierte. Die Verfärbung trat interessanter Weise auch bei Proben auf, deren Stickstoffgehalt, einem Maß für den Restbiomasseanteil, weit unter 0,1% lag.

Um den bloßen Temperatureinfluß auszuschließen, wurden bei identischen Bedin gungen mit Chloroform extrahierte PHB-Proben verpreßt, die jedoch reinweiße bzw., milchig trübe Prüfkörper ergaben. Da eine Adsorption von in Essigsäure gelösten oder ausgeschwemmten Biomassepartikel an die PHB vermutet wurde, wurde als Gegenprobe mit Chloroform extrahierte PHB im Filtrat des Essigsäure Fällbades eingeweicht, gewaschen und getrocknet. Nach dem Verpressen zeigte sich auch hier eine karamelbraune Verfärbung der Prüfkörper, so daß eine besondere Anfor derung an die Reinigung in der Vermeidung dieses Effektes lag.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an folgenden Beispielen näher erläutert:
Durch einen Fermentationsprozeß im batch-Verfahren werden Mikroorganismen durch eine entsprechende Wachstumsphase mit anschließend initiierter Akkumula tion zur Einlagerung von Polyhydroxybuttersäure in der Zelle kultiviert. Die erziel bare Polymerkonzentration hängt sehr stark von der Art des Mikroorganismus und den Fermentationsbedingungen ab. Für technisch relevante Prozesse wird von ei nem Polymeranteil größer 50% der Zelltrockenmasse ausgegangen. Durch Kultivierung des Mikroorganismus Methylobacterium rhodesianum wurde nach Beendigung des Fermentationsprozesses ein PHB-Gehalt von 52% erzielt. Die Ausgangsbiomassekonzentration, bezogen auf die Trockensubstanz, betrug 50 g/l. Bei Methylocystis spez. wurden vergleichbare Werte erreicht, diese lagen bei 48% PHB sowie einer Zelldichte von 50 g/l.

Zum Vergleich wurden beide Mikroorganismen, ausgehend von sprühgetrockneter Biomasse, einer reinen Säureextraktion, einer Kaltwäsche sowie einer Kombination aus Kaltwäsche und Extraktion unterzogen. Zum Vergleich wurden beide Biomassen mit Chloroform extrahiert. Einen Überblick über die verwendeten Rezepturen gibt folgende Aufstellung:

A: Essigsäure-Extraktion

1. 10 g Biomasse mit 200 ml Essigsäure 15 Minuten bei 100°C extrahieren
2. Anschließend die Suspension sofort über Nutsche mit Filterpapier filtieren.
3. Als Fällmittel werden 1 l Wasser vorgelegt und das Filtrat wird eingerührt.
4. Gefällte PHB absaugen.
5. Die PHB wird zweimal mit Wasser nachgewaschen.
6. Die Trocknung der PHB erfolgt bei 60°C.

B: Essigsäure-Kaltwäsche mit anschließen der Essigsäure Extraktion

1. 25 g Biomasse mit 500 ml Essigsäure bei Raumtemperatur 10 Minuten rühren, anschließend die Suspension absaugen und erneut mit 500 ml Essigsäure verset zen.
2. Ansatz 15 Minuten bei 100° C extrahieren.
3. Anschließend sofort filtrieren, falls das Filtrat vergelt, muß der Saugerlenmeyer auf 70°C temperiert werden.
4. Zur Fällung 2 l Wasser vorlegen und die Essigsäure-Lösung in dünnem Strahl eingießen
5. Gefällte PHB absaugen.
6. Die PHB wird zweimal mit Wasser nachgewaschen.
7. Die Trocknung der PHB erfolgt bei 60°C.

Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle dargestellt:

Bei der Biomasse Methylocystis spez. liegt die Ausbeute an PHB bei der Essigsäure- Extraktion deutlich höher (ca. 95%), als bei der Extraktion mit Chloroform (ca. 65-80%). Die nach der Chloroform-Extraktion im Filterkuchen noch vorhandene PHB kann durch Essigsäure fast vollständig extrahiert werden. Dabei beträgt die Mol masse der extrahierten PHB 740.000. Es zeigt sich, daß, speziell bei der Verwen dung von Methylocystis spez., eine deutliche Verringerung des Stickstoffgehaltes festzustellen ist. Interessant ist der geringe Abfall des Stickstoffwertes nach der Kaltwäsche. Dieser weist darauf hin, daß durch die Wäsche nicht nur stickstoffhal tige Verbindungen entfernt werden. Der positive Effekt der Reinigung durch die Vor wäsche ist jedoch bei der thermischen Beanspruchung des Produktes deutlich zu bemerken.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten, welche durch Fermenta tion eines Mikroorganismus in den Zellen akkumuliert vorliegen, durch mechani schen Zellaufschluß, anschließender Abtrennung der Zellbruchstücke und gelö ster Substanzen sowie Trocknung der Polyhydroxyalkanoathaltigen Biomasse und Extraktion der Polyhydroxyalkanoate durch das Extraktionsmittel Essigsäure da durch gekennzeichnet, daß die Biomasse nach der Trocknung für die Dauer von 5 Minuten bis 2 Stunden mit dem Extraktionsmittel bei Temperaturen unterhalb der Extraktionstemperatur behandelt wird, das Extraktionsmittel von der Biomasse abgetrennt und diese in gewohnter Weise mit dem Extraktionsmittel bei Extrakti onstemperatur extrahiert und das Polyhydroxyalkanoat ausgefällt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyhydroxyalka noat eine Polyhydroxybuttersäure, eine Polyhydroxyvaleriansäure oder ein Co polymer dieser ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Extraktionsmittel Essigsäureanhydrid zugesetzt wird.