DE19703031C2 - Process for the production of NDP sugar - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von NDP-Zucker (Nucleosiddiphosphat-Zucker), die auch als Zucker-Nucleotide bezeichnet werden. Diese Verbin­ dungen sind wichtige Intermediate der Biosynthese von Glycokonjugaten. Ihre Synthese in grösserem Massstab ist somit sehr bedeutend zur in vitro Synthese von Oli­ gosacchariden, besonders im Hinblick auf mögliche Be­ deutungen von Oligosacchariden in medizinisch diagno­ stischen und therapeutischen Anwendungen.The invention relates to a method for manufacturing of NDP sugar (nucleoside diphosphate sugar), which too are referred to as sugar nucleotides. This verb are important intermediates in the biosynthesis of Glycoconjugates. Your synthesis on a larger scale is therefore very important for the in vitro synthesis of oli gosaccharides, especially with regard to possible loading interpretations of oligosaccharides in medical diagnosis tical and therapeutic applications.

NDP-Zucker können nach dem Stand der Technik syntheti­ siert werden, indem ein Zucker-1-Phosphat mit einem Nucleosidtriphosphat (NTP) enzymatisch umgesetzt wird. Meist werden sie jedoch aus natürlichem Material iso­ liert. Als Enzyme werden Pyrophosphorylasen eingesetzt, die die Reaktion mit Hilfe von zweiwertigen Metallka­ tionen als Cofaktoren katalysieren. Es ist eine Viel­ zahl von derartigen Reaktionen bekannt, bei denen ver­ schiedene Zucker-1-Phosphate mit unterschiedlichen Nucleosidtriphosphaten umgesetzt werden. So können die Triphosphate von Uridin (U), Guanosin (G), Cytidin (C) sowie Thymidin (T) jeweils mit den -1-phosphaten von Glucose, Galactose, Fucose und Mannose aber auch von N- Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin umgesetzt werden. Für die jeweiligen Reaktionen kommen jeweils diejenigen Pyrophosphorylasen zum Einsatz, die die Re­ aktion des jeweiligen Zucker-1-phosphates und des NTP's katalysieren. Diese sind dem Fachmann bekannt und kön­ nen durch moderne Klonierungs- und Expressionsmethoden erhalten werden. Als Cofaktoren sind die zweiwertigen Metallkationen, wie Mn²⁺, Zn²⁺ und insbesondere Mg²⁺, welches eine besonders gute Aktivität als Cofaktor auf­ weist, bekannt.According to the prior art, NDP sugars can be synthesized by enzymatically reacting a sugar 1-phosphate with a nucleoside triphosphate (NTP). However, they are usually isolated from natural material. Pyrophosphorylases are used as enzymes, which catalyze the reaction with the help of divalent metal cation as cofactors. A large number of such reactions are known in which various sugar-1-phosphates are reacted with different nucleoside triphosphates. The triphosphates of uridine (U), guanosine (G), cytidine (C) and thymidine (T) can each be reacted with the -1-phosphates of glucose, galactose, fucose and mannose but also of N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine will. For the respective reactions, those pyrophosphorylases are used which catalyze the reaction of the respective sugar 1-phosphate and the NTP. These are known to the person skilled in the art and can be obtained by modern cloning and expression methods. The divalent metal cations, such as Mn ²⁺ , Zn ²⁺ and in particular Mg ²⁺ , which have a particularly good activity as a cofactor, are known as cofactors.

Als Reaktionsprodukte können beispielhaft UDP-Glucose, CDP-Glucose, dTDP-Glucose (= desoxy TDP-Glucose), UDP- N-Acetylglucosamin, UDP-Galactose, UDP-N- Acetylgalactosamin, GDP-Fucose und GDP-Mannose ange­ führt werden. Nebenprodukte dieser Reaktionen sind Py­ rophosphat-Anionen PP_i, die in einer weiteren enzymati­ schen Folgereaktion in zwei Phosphatanionen (2 P_i) überführt werden.As reaction products, examples include UDP-glucose, CDP-glucose, dTDP-glucose (= deoxy TDP-glucose), UDP-N-acetylglucosamine, UDP-galactose, UDP-N-acetylgalactosamine, GDP-fucose and GDP-mannose. By-products of these reactions are pyrophosphate anions PP _i , which are converted into two phosphate anions (2 P _i ) in a further enzymatic subsequent reaction.

Die Synthesen werden üblicherweise in Rührkesseln durchgeführt, die im Batchbetrieb gefahren werden.The syntheses are usually carried out in stirred tanks carried out in batch mode.

Aus der DE-PS 39 37 892 ist auch ein Durchflussmembran­ reaktor bekannt, der in der chemischen Verfahrenstech­ nik eingesetzt wird. Bei ihm werden die umzusetzenden Reaktanden durch einen Reaktionsraum geleitet, dessen Querschnitt durch eine Membran durchtrennt wird, die als Ultrafiltrationsmembran ausgebildet ist und Molekü­ le ab einer definierten Größe zurückhält. From DE-PS 39 37 892 is also a flow-through membrane reactor known in chemical engineering nik is used. With him, the ones to be implemented Reactants passed through a reaction space, the Cross section is separated by a membrane that is designed as an ultrafiltration membrane and molecule holds back from a defined size.  

Die bei den oben beschriebenen Reaktionen eingesetzten Pyrophosphorylasen unterliegen inhibitiven Einflüssen, die die Enzymaktivität in weitem Ausmaß senken, so dass die Reaktionsgeschwindigkeit während der Reaktion ab­ nimmt.The used in the reactions described above Pyrophosphorylases are subject to inhibitory influences, that greatly reduce enzyme activity so that the reaction rate decreases during the reaction takes.

So findet beispielsweise eine Produktinhibierung durch den bei der Reaktion gebildeten NDP-Zucker statt. Diese Produktinhibierung verläuft kompetitiv zur Reaktion des Enzyms mit dem NTP. Desweiteren senken auch die bei der Umsetzung gebildeten Pyrophosphatanionen PP_i die Akti­ vität der Pyrophosphorylasen - jedoch werden diese durch eine weitere Abbaureaktion dem Gleichgewicht ent­ zogen, wodurch diese Einwirkung vermindert wird.For example, the NDP sugar formed during the reaction inhibits the product. This product inhibition competes with the reaction of the enzyme with the NTP. Furthermore, the pyrophosphate anions PP _i formed during the reaction also reduce the activity of the pyrophosphorylases - however, these are deprived of equilibrium by a further degradation reaction, as a result of which this effect is reduced.

Zusätzlich wurde bisher davon ausgegangen, dass sich auch die Cofaktoren, wie Mg²⁺, einfach inhibierend auf die Enzymaktivität auswirken. Daher wurden die Pyro­ phosphorylasen bisher nicht für den Einsatz in indu­ striellem Massstab in Betracht gezogen.In addition, it was previously assumed that the cofactors, such as Mg ²⁺ , also have a simple inhibitory effect on the enzyme activity. Therefore, the pyro phosphorylases have so far not been considered for use on an industrial scale.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das höhere Raum-Zeit- Ausbeuten ermöglicht und ein Absinken der Enzymaktivi­ tät beziehungsweise der Reaktionsgeschwindigkeit wäh­ rend des Reaktionsverlaufes weitestgehend verhindert.It is therefore the object of the invention to provide a method to provide the higher space-time Yields and a decrease in the enzyme activi speed or the reaction rate largely prevented during the course of the reaction.

Die Herstellung von Nucleosiddiphosphat-Zuckern mittels Pyrophosphorylasen soll einer Produktion in größerem Massstab zugänglich gemacht werden. The production of nucleoside diphosphate sugars by means of Pyrophosphorylases are said to be of major production Scale be made accessible.  

Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, dass die Aktivität nicht, wie angenommen einer einfachen Inhi­ bierung durch den Cofaktor unterliegt, sondern, dass die sich im Laufe der Reaktion einstellende Erhöhung des Verhältnisses von Cofaktor zu NTP zur Erniedrigung der Enzymaktivität führt.Surprisingly, it has now been shown that the Activity not, as assumed a simple Inhi cofactor, but that the increase that occurs in the course of the reaction the ratio of cofactor to NTP for degradation of enzyme activity.

Obwohl bei Enzymreaktionen im Substratsättigungsbereich mit einer Reaktionskinetik Null-ter Ordnung gerechnet würde, zeigt sich auch im Sättigungskonzentrationsbe­ reich eine Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit vom Konzentrationsverhältnis Cofaktor/NTP.Although with enzyme reactions in the substrate saturation range with zero-order reaction kinetics would also show up in the saturation concentration level rich a dependence of the reaction rate on the concentration ratio cofactor / NTP.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf­ gabe daher erfindungsgemäß gelöst, mit dem im kenn­ zeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmal.Starting from the preamble of claim 1, the therefore solved according to the invention with which in the kenn Drawing part of claim 1 specified feature.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren ist es nunmehr möglich, NTP mit Zucker-1-phosphat in Anwesenheit von zweiwertigen Metallkationen-Cofaktoren mittels Pyro­ phosphorylasen über lange Zeiträume mit hoher Ausbeute umzusetzen.It is now with the method according to the invention possible to use NTP with sugar 1-phosphate in the presence of divalent metal cation cofactors using pyro long-term phosphorylases with high yield to implement.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben. Advantageous developments of the invention are in the Subclaims specified.  

Im folgenden soll das erfindungsgemäße Verfahren bei­ spielhaft erläutert werden.In the following, the method according to the invention is intended to: be explained playfully.

Die Zeichnungen zeigen Darstellungen des erfindungsge­ mäßen Verfahrens im Vergleich zu der Verfahrensweise nach dem Stand der Technik.The drawings show representations of the fiction procedure compared to the procedure According to the state of the art.

Es zeigt:It shows:

Fig. 1: Ein allgemeines Schema für die enzy­ matischen Reaktion des Guanosintri­ phosphates (GTP) mit Mannose-1- Phosphat zu Guanosindiphospho-Mannose (GDP-Mannose) Fig. 1: A general scheme for the enzymatic reaction of guanosine tri phosphate (GTP) with mannose-1-phosphate to guanosine diphospho-mannose (GDP-mannose)

Fig. 2: Der Konzentrationsverlauf der Reakti­ onskomponenten Mg²⁺ und GTP während der Reaktion nach dem Stand der Technik. Fig. 2: The concentration profile of the reaction components Mg ²⁺ and GTP during the reaction according to the prior art.

Fig. 3: Der zeitliche Konzentrationsverlauf der Komponenten Mg²⁺ und GTP nach dem erfindungsgemässen Verfahren. Fig. 3: The time course of concentration of the components Mg ²⁺ and GTP according to the inventive method.

Fig. 4: Die Abhängigkeit der Pyrophosphoryla­ seaktivität vom Mg²⁺/GTP-Verhältnis für die Umsetzung von GTP und Mannose-1- phosphat zu GDP-Mannose. Fig. 4: The dependence of Pyrophosphoryla activity on the Mg ²⁺ / GTP ratio for the conversion of GTP and mannose-1-phosphate to GDP-mannose.

Fig. 5: Den zeitlichen Verlauf der Pyrophos­ phorylaseaktivität für eine Verfah­ rensführung nach dem Stand der Technik und nach dem erfindungsgemässen Ver­ fahren. FIG. 5 shows the time course of Pyrophos phorylaseaktivität for a procedural rensführung according to the prior art and according to the inventive drive Ver.

Fig. 6: Einen für die Durchführung der Reakti­ on geeigneten Durchflussreaktor. Fig. 6: A flow reactor suitable for carrying out the reaction.

Fig. 7: Eine Grafik mit dem zeitlichen Verlauf der kontinuierlichen Produktion von GDP-Mannose im Durchflussreaktor unter verschiedenen Betriebszuständen. Fig. 7: A graph with the time course of the continuous production of GDP-mannose in the flow reactor under different operating conditions.

Fig. 8: Eine vergleichende Darstellung der Reaktionsverläufe in einem konventio­ nellen Rührkessel bei unterschiedli­ chen Konzentrationsverhältnissen zwischen GTP und Mannose-1-phosphat. Fig. 8: A comparative representation of the course of the reaction in a conventional stirred kettle with different concentration ratios between GTP and mannose-1-phosphate.

Fig. 9: Eine vergleichende Grafik zwischen einer erfindungsgemäßen Reaktionsführ­ ung in einem Durchflußreaktor und ei­ ner Kaskade bestehend aus zwei Durch­ flussreaktoren. Fig. 9: A comparative graph between a reaction according to the invention in a flow reactor and a cascade consisting of two flow reactors.

Fig. 10: Eine Grafik in der der Umsatz von Man­ nose-1-phosphat in einem Durchflussre­ aktor in Abhängigkeit vom Konzentrati­ onsverhältnis zwischen GTP und Manno­ se-1-phosphat dargestellt ist. Fig. 10: A graph in which the turnover of nose-1-phosphate in a flow reactor is shown as a function of the concentration ratio between GTP and mannose-1-phosphate.

Fig. 11: Eine Grafik, die das sich während der Reaktion einstellende Verhältnis zwi­ schen Mg²⁺ und GTP nach dem Stand der Technik darstellt. Fig. 11: A graph showing the relationship between Mg ²⁺ and GTP established during the reaction according to the prior art.

Bei der in Fig. 1 dargestellten Reaktion wird Guano­ sintriphosphat (GTP) mit Mannose-1-phosphat in einer enzymkatalysierten Reaktion mit GDP-Mannosepyrophos­ phorylase EC 2.7.7.13 (recombinantes Enzym aus Escheri­ chia Coli. Quelle des Gens: Salmonella Enterica) zu Guanosindiphospho-Mannose (GDP-Mannose) umgesetzt. Als Cofaktor wird Mg²⁺ eingesetzt. Als Nebenprodukt ent­ steht das Pyrophosphatanion PP_i das in einer Folgereak­ tion zu Phosphatanionen P_i, abgebaut wird. Bekannterma­ ssen findet bei einer derartigen Reaktion eine Inhibie­ rung der Pyrophosphorylase sowohl durch die GDP- Mannose, das Pyrophosphat als auch durch einen Über­ schuß des Cofaktors Mg²⁺ statt.In the reaction shown in Fig. 1, guano sintriphosphate (GTP) with mannose-1-phosphate in an enzyme-catalyzed reaction with GDP-mannose pyrophos phorylase EC 2.7.7.13 (recombinant enzyme from Escherichia coli. Source of the gene: Salmonella Enterica) to guanosine diphospho -Mannose (GDP-Mannose) implemented. Mg ^{2+ is} used as the cofactor. A by-product is the pyrophosphate anion PP _i, which is degraded in a subsequent reaction to phosphate anions P _i . As is known, in such a reaction there is an inhibition of the pyrophosphorylase both by the GDP-mannose, the pyrophosphate and by an excess of the cofactor Mg ²⁺ .

In Fig. 2 wird der bei der in Fig. 1 wiedergegebenen Reaktion entstehende Konzentrationsverlauf des GTP (Kurve 1) sowie des Mg²⁺ (Gerade 2) schematisch darge­ stellt. In ihr ist als Abszisse x die Zeit (ohne Ein­ heiten) und als Ordinate y die Konzentration (ohne Ein­ heit) angegeben. Der in dieser Darstellung wiedergege­ bene Konzentrationsverlauf stellt sich bei einer nach dem Stand der Technik durchgeführten Reaktion in einem Rührkessel ein, der im Batchbetrieb gefahren wird.In FIG. 2, resulting in the illustrated in FIG. 1, reaction concentration during the GTP (curve 1) and of Mg ²⁺ (straight line 2) schematically represents Darge. It shows the time (without units) as the abscissa and the concentration (without unit) as the ordinate y. The concentration curve shown in this diagram is obtained in a reaction carried out according to the prior art in a stirred tank which is operated in batch mode.

In Fig. 3 wird der Konzentrationsverlauf derselben Komponenten wie in Fig. 2 nach dem erfindungsgemässen Verfahren dargestellt. Die Abszissen und Ordinatenbe­ zeichnungen x und y sind hier die selben, wie in Fig. 2. Es ist Fig. 2 zu entnehmen, daß erfindungsgemäss sowohl die Mg²⁺-(Gerade 1) als auch die GTP- Konzentration (Gerade 2) konstantgehalten wird. FIG. 3 shows the concentration profile of the same components as in FIG. 2 using the method according to the invention. The abscissa and ordinate designations x and y are the same here as in FIG. 2. It can be seen from FIG. 2 that according to the invention both the Mg ²⁺ (straight line 1 ) and the GTP concentration (straight line 2 ) are kept constant becomes.

In Fig. 4 ist grafisch wiedergegeben, bei welchem Kon­ zentrationsverhältnis zwischen Mg²⁺ und GTP die Aktivi­ tät der Pyrophosphorylase am größten ist.In Fig. 4 is graphically shown at which concentration ratio between Mg ²⁺ and GTP the activity of the pyrophosphorylase is greatest.

Es sind hierbei:
Abszisse x: Konzentrationsverhältnis zwischen Mg²⁺ und GTP (c_Mg2+/c_GTP), dimensionslos.
Ordinate y: Volumenbezogene Aktivität der GDP-Mannose­ pyrophosphorylase Dimension: U/ml (1U = 1 µmol Umsatz/min)Here are:
Abscissa x: concentration _ratio between Mg ²⁺ and GTP (c _{Mg2 +} / c _GTP ), dimensionless.
Ordinate y: Volume-related activity of GDP-mannose pyrophosphorylase Dimension: U / ml (1U = 1 µmol conversion / min)

Die Kurve wurde durch eine Schar von drei verschieden­ artigen Punkten gelegt, die verschiedenen Werten für die GTP-Konzentration (c_GTP) entsprechen.The curve was drawn through a group of three different types of points, which correspond to different values for the GTP concentration (c _GTP ).

Es sind für
⚫ C_GTP = 12 mM
+ c_GTP = 16 mM
○ c_GTP = 20 mM. It is for
⚫ C _GTP = 12 mM
+ c _GTP = 16 mM
○ c _GTP = 20 mM.

Unabhängig von der GTP-Konzentration zeigt sich, dass ein Konzentrationsverhältnis c_Mg2+/c_GTP von ca. 0,9 zur besten Enzymaktivität für die Pyrophosphorylase führt. Weiterhin gute Werte sind für c_Mg2+/c_GTP = 0,75 bis 1,25 zu entnehmen.Regardless of the GTP concentration, it can be seen that a concentration _ratio c _{Mg2 +} / c _GTP of approx. 0.9 leads to the best enzyme activity for the pyrophosphorylase. Good values can also be found for c _{Mg2 +} / c _GTP = 0.75 to 1.25.

Fig. 5 zeigt schematisch den zeitlichen Verlauf der Pyrophosphorylaseaktivität im Vergleich zwischen der Verfahrensweise nach dem in Kurve 1 dargestellten Stand der Technik und der in Gerade 2 dargestellten erfin­ dungsgemässen Verfahrensweise, bei der das Konzentrati­ onsverhältnis zwischen GTP und Mg²⁺ konstant gehalten wird. Abszisse x (= Zeit) und Ordinate y (Aktivität der Pyrophosphorylase) sind dimensionslos dargestellt, da wie in den Fig. 2 und 3 gleiche Zeitintervalle le­ diglich vergleichend wiedergegeben sind. Der Grafik in Fig. 5 ist zu entnehmen, dass die Pyrophosphorylaseak­ tivität bei einer erfindungsgemässen Verfahrensführung über den gesamten Vergleichszeitraum gleichbleibende Aktivitäten sicherstellt, während nach der Verfahrens­ führung nach dem Stand der Technik eine Abnahme der Py­ rophosphorylaseaktivität zu verzeichnen ist. Fig. 5 shows schematically the time course of the pyrophosphorylase activity in the comparison between the procedure according to the prior art shown in curve 1 and the inventive method shown in line 2 , in which the concentration ratio between GTP and Mg ^{2+ is} kept constant. The abscissa x (= time) and the ordinate y (activity of the pyrophosphorylase) are shown dimensionless, since, as in FIGS . 2 and 3, the same time intervals are shown only for comparison. The graphic in FIG. 5 shows that the pyrophosphorylase activity ensures constant activities over the entire comparison period in a process management according to the invention, while a decrease in the pyrophosphorylase activity can be observed according to the prior art process management.

Der in Fig. 6 dargestellte Durchflussreaktor umfasst eine Zuleitung 1 in der als Substrate S GTP, Mannose-1- phosphat und der Cofaktor Mg²⁺ zugeführt werden. Die Zuleitung 1 mündet in den Reaktionsraum 2, der das En­ zym Pyrophosphorylase beinhaltet. Im Reaktionsraum 2 ist eine Ultrafiltrationsmembran 3 so angebracht, dass sie einen Querschnitt durch das Fliessvolumen der ein­ geführten Substratlösung ausbildet. An den Reaktions­ raum 2 schliesst sich hinter der Ultrafiltrationsmem­ bran 3 eine Austrittsleitung 4 an, durch die die Pro­ dukte P, in diesem Beispiel GDP-Mannose und P_i, sowie nicht abreagiertes GTP, Mannose-1-phosphat und der Co­ faktor Mg²⁺ den Durchflussreaktor verlassen. Die flä­ chigen Gebilde 5 im Reaktionsraum stellen das Enzym Py­ rophosphorylase dar.The flow reactor shown in FIG. 6 comprises a feed line 1 in which GTP, mannose-1-phosphate and the cofactor Mg ^{2+ are} supplied as substrates S. The feed line 1 opens into the reaction chamber 2 , which contains the enzyme pyrophosphorylase. An ultrafiltration membrane 3 is attached in the reaction space 2 in such a way that it forms a cross section through the flow volume of the introduced substrate solution. An outlet line 4 connects to the reaction chamber 2 behind the ultrafiltration membrane 3 , through which the products P, in this example GDP-mannose and P _i , as well as unreacted GTP, mannose-1-phosphate and the co-factor Mg ^{2 +} leave the flow reactor. The flat structures 5 in the reaction space represent the enzyme pyrophosphorylase.

Die in Fig. 7 dargestellte Grafik zeigt die Ausbeuten an GDP-Mannose, die bei kontinuierlichem Betrieb in ei­ nem Durchflußreaktor unter verschiedenen Verweilzeiten erzielt wurden.The graph shown in Fig. 7 shows the yields of GDP-mannose, which were achieved with continuous operation in a flow reactor with different residence times.

Es zeigt die Abszisse x: Die Anzahl der Verweilzeiten. Die Ordinate y: Die Ausbeute in Bezug auf Mannose-1- Phosphat η_{GDP-Man, Man-1-P} Dimension %.It shows the abscissa x: the number of dwell times. The ordinate y: the yield in relation to mannose-1-phosphate η _{GDP-Man, Man-1-P} dimension%.

Die vertikalen gestrichelten Linien charakterisieren jeweils neue Versuchsabschnitte mit neuen Parametern für die Verweilzeit im Durchflussreaktor. Die Angaben τ = x min bezeichnen die Verweilzeiten für die jeweils neuen Versuchsabschnitte. Der mit dem Pfeil ← charak­ terisierte Punkt bedeutet eine Zudosierung des Enzyms von 100 µl der Pyrophosphorylase einer Konzentration von 87,6 mU/ml. Characterize the vertical dashed lines new test sections with new parameters for the residence time in the flow reactor. The information τ = x min denote the dwell times for each new test sections. The one with the arrow ← charak terized point means an addition of the enzyme of 100 µl of a concentration of pyrophosphorylase of 87.6 mU / ml.  

Die in Fig. 8 dargestellte Grafik zeigt die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit, die durch die Verwendung eines GTP-Überschusses in Bezug auf die Konzentration des Mannose-1-phosphates bei klassischer Reaktions­ durchführung in einem Batch-Reaktor hervorgerufen wird. In ihr sind:
Die Abszisse x: Die Reaktionsdauer, Dimension: min.
Die Ordinate y: Die GDP-Mannose Konzentration (c_GDP-Man Dimension: mM)
Die Symbole: Das Konzentrationsverhältnis
⚫ GTP: Man-1-P = 1 : 1
○ GTP: Man-1-P = 1 : 2
Δ GTP: Man-1-P = 2 : 1The graph shown in Fig. 8 shows the increase in the reaction rate, which is caused by the use of an excess of GTP in relation to the concentration of mannose-1-phosphate in a conventional reaction in a batch reactor. In it are:
The abscissa x: the reaction time, dimension: min.
The ordinate y: the GDP-Mannose concentration (c _GDP-Man Dimension: mM)
The symbols: the concentration ratio
⚫ GTP: Man-1-P = 1: 1
○ GTP: Man-1-P = 1: 2
Δ GTP: Man-1-P = 2: 1

Parameter für alle drei Reaktionen sind: 5 µl/ml Pyro­ phosphorylaselösung (0,044 U/ml), sowie T = 25°C und pH = 8.Parameters for all three reactions are: 5 µl / ml pyro phosphorylase solution (0.044 U / ml), as well as T = 25 ° C and pH = 8th.

Die in Fig. 9 dargestellte Grafik zeigt die Steigerung der Raum-Zeitausbeute (RZA oder η_RZ) bei der Verwendung von zwei in einer Kaskade angeordneten Durchflußreakto­ ren im Vergleich zur Reaktionsführung in nur einem Durchflussreaktor. Für die Grafik ist die Gesamt- Pyrophosphorylasekonzentration als Parameter konstant. The graph shown in Fig. 9 shows the increase in space-time yield (RZA or η _RZ ) when using two flow reactors arranged in a cascade compared to the reaction in only one flow reactor. For the graphic, the total pyrophosphorylase concentration as a parameter is constant.

Es ist:
Die Abszisse x: Umsatz %
Die Ordinate y: RZA Dimension: g/l . d
τ = Verweilzeit in der Reaktionslösung im Durchflussre­ aktor, die durch Computersimulation variiert wurde.It is:
The abscissa x: sales%
The ordinate y: RZA dimension: g / l. d
τ = residence time in the reaction solution in the flow reactor, which was varied by computer simulation.

Kurve 1 zeigt den Verlauf für einen Durchflußreaktor, Kurve 2 für zwei in Serie geschaltete Reaktoren, die von der Reaktionslösung hintereinander durchlaufen wer­ den. Fig. 9 ist das Ergebnis einer Computersimulation auf der Basis des mathematischen Modells in Formel 1.Curve 1 shows the course for a flow reactor, curve 2 for two reactors connected in series, which pass through one after the other by the reaction solution. Fig. 9 is the result of a computer simulation based on the mathematical model in Formula 1.

In der in Fig. 10 dargestellten Grafik ist die Abhän­ gigkeit des Umsatzes von Mannose-1-phosohat vom Ver­ hältnis der Konzentrationen des GTP zu Mannose-1- phosphat wiedergegeben.The graph depicted in FIG. 10 shows the dependency of the conversion of mannose-1-phosphate on the ratio of the concentrations of the GTP to mannose-1-phosphate.

Es zeigt: Die Abszisse x: c_GTP/c_Man-1-P dimensionslos
Die Ordinate Y: U_man-1-P in %It shows: The abscissa x: c _GTP / c _Man-1-P dimensionless
The ordinate Y: U _man-1-P in%

Bei der in Fig. 11 dargestellten Grafik ist die Abszisse x: Die Zeit (dimensionslos) und die Ordinate y: das Mengenverhältnis zwischen Mg²⁺ und GTP (Mg²⁺/GTP dimensionslos). Dieser Verlauf stellt sich in einem Rührkessel ein, wenn nach dem Stand der Technik im Batch-Betrieb gearbeitet wird. In the graph shown in FIG. 11, the abscissa is x: the time (dimensionless) and the ordinate y: the quantitative ratio between Mg ²⁺ and GTP (Mg ²⁺ / GTP is dimensionless). This process occurs in a stirred tank when batch operation is carried out according to the prior art.

Im Folgenden soll die Erfindung am Beispiel der Her­ stellung von GDP-Mannose erläutert werden.In the following, the invention should be based on the example of Her position of GDP-Mannose.

Erfindungsgemäß wird bei der Herstellung der GDP- Mannose das Mengenverhältnis von Mg²⁺ und Guanosintri­ phosphat (GTP), also Mg²⁺/GTP konstantgehalten. Eine Re­ aktionsführung, bei der diese Voraussetzung erfüllt ist, kann mit dem Betrieb des in Fig. 6 dargestellten Durchflussreaktors gewährleistet werden. Hierbei befin­ det sich im Reaktionsraum 2 die für die Durchführung der Reaktion benötigte GDP-Mannose-Pyrophosphorylase EC 2.7. 7.13 in wässriger Lösung, die durch einen Tris- Puffer bei pH 8 konstantgehalten wird. Durch die Zulei­ tung 1 wird Mg²⁺, Mannose-1-phosphat und GTP zugeführt - die GTP-Konzentration wird dabei auf einem konstantem Wert gehalten. Die bei der Reaktion entstehenden Pro­ dukte GDP-Mannose und Phosphat, das durch den Abbau von Pyrophosphat entsteht, sowie überschüssiges Mg²⁺ ver­ lassen den Reaktionsraum 2 über die Ultrafiltrations­ membran, durch die die Pyrophosphorylase als Makromole­ kül zurückgehalten wird. Die das Pyrophosphat PP_i ab­ bauende anorganische Pyrophosphatase wird ebenfalls durch die Ultrafiltrationsmembran zurückgehalten.According to the invention, the quantitative ratio of Mg ²⁺ and guanosine tri phosphate (GTP), ie Mg ²⁺ / GTP, is kept constant during the production of the GDP mannose. A reaction control, in which this requirement is met, can be ensured with the operation of the flow reactor shown in FIG. 6. The GDP-mannose pyrophosphorylase EC 2.7 required for carrying out the reaction is located in the reaction space 2 . 7.13 in aqueous solution, which is kept constant at pH 8 by a Tris buffer. The feed line 1 supplies Mg ²⁺ , mannose-1-phosphate and GTP - the GTP concentration is kept at a constant value. The products produced during the reaction, GDP-mannose and phosphate, which are produced by the breakdown of pyrophosphate, as well as excess Mg ²⁺ leave the reaction chamber 2 via the ultrafiltration membrane, which retains the pyrophosphorylase as a macromole. The inorganic pyrophosphatase that breaks down the pyrophosphate PP _i is also retained by the ultrafiltration membrane.

Bei dieser Verfahrensweise treten folgende Effekte auf:
The following effects occur with this procedure:

• 1. Erfindungsgemäß wird das Verhältnis Mg²⁺/GTP kon­ stantgehalten, was überraschenderweise zu einer gleich­ bleibend hohen Enzymaktivität der Pyrophosphorylase und somit höheren Raum-Zeitausbeute gegenüber einer Reakti­ on in einem Rührkessel mit Batch-Betrieb führt. Das Konstanthalten dieses Konzentrationsverhältnisses ist für die Raum-Zeitausbeute stark begünstigend, auch wenn sich das Substrat GTP (Guanosintriphosphat) in Bezug auf die Enzymreaktion im Konzentrationsättigungsbereich befindet, bei dem nach bisheriger Vorstellung ein Ab­ sinken der GTP-Konzentration innerhalb des Sättigungs­ bereiches keinen Einfluß auf die Reaktionsgeschwindig­ keit hatte. Es wird im kontinuierlichen Betrieb eine konstante, maximale, Reaktionsgeschwindigkeit einge­ stellt (Fig. 5).1. According to the invention, the Mg ²⁺ / GTP ratio is kept constant, which surprisingly leads to a consistently high enzyme activity of the pyrophosphorylase and thus a higher space-time yield compared to a reaction in a stirred tank with batch operation. Keeping this concentration ratio constant is very beneficial for the space-time yield, even if the substrate GTP (guanosine triphosphate) is in the concentration saturation range with regard to the enzyme reaction, in which, according to the previous conception, a decrease in the GTP concentration within the saturation range has no influence had the speed of reaction. There is a constant, maximum, reaction speed is set in continuous operation ( Fig. 5).
• 2. Durch den Einsatz des GTP oder allgemeiner des NTP in konstantem Überschuß zu Mannose-1-phosphat konkur­ riert das Substrat GTP bzw. NTP erfolgreicher um das aktive Zentrum der Pyrophosphorylase, wodurch die Reak­ tion begünstigt wird (Fig. 8) Eine Simulation von Syn­ thesen in Durchflußreaktoren bei verschiedenen Substratverhältnissen zeigt, daß ein Verhältnis von 1,4 zwischen GTP und Man-1-P einen guten Kompromiß aus Um­ satz und Kosten für im Überschuß eingesetztes Substrat darstellt. (Fig. 10).
  Als kinetisches Modell für die Reaktion, die in Fig. 1 dargestellt ist, kann durch folgende Formel angegeben werden, die die experimentellen Ergebisse sehr gut wie­ dergibt:
  In ihr sind:
  ν = Reaktionsgeschwindigkeit U/ml
  ν_max = maximale Reaktionsgeschwindigkeit 8,75 U/ml
  c_GTP = Konzentration GTP mM
  c_Man-1-P = Konzentration Mannose-1-phosphat mM
  K^Man-1-P _m = Michaelis-Menten-Konstante Man-1-P 15,17 µM
  K^GTP _m = Michaelis-Menten-Konstante GTP 42,7 µM
  c_GDP-Man = Konzentration GDP-Mannose mM
  K^GDP-Man _i,GTP = Inhibitorkonstante von GDP-Mannose 8,6 µM
  c_PPi = Konzentration PP_i µM
  K^PPi _i,GTP = Inhibitorkonstante von PP_i 15,8 µM
  In diesem kinetischen Modell ist eine kompetitive Pro­ duktinhibierung des Enzyms durch GDP-Mannose zu GTP mit einer Inhibitorkonstante von K_i = 8,6 µM. Dieses Modell ist Grundlage für Computer-Simulationen von Reaktions­ verläufen in verschiedenen Reaktoren und unter ver­ schiedenen Reaktionsbedingungen.
  Die unter Punkt 1. angegebene Wirkung wird für die Her­ stellung von GDP-Mannose, wie Fig. 4 zu entnehmen ist, mit einem optimalem Konzentrationsverhältnis von Mg²⁺/GTP von 0,9 erreicht. Verhältnisse darüber oder darunter führen zu einer verringerten Aktivität des En­ zyms und damit einer geringeren Reaktionsgeschwindig­ keit. Jedoch werden auch noch in Intervallen von Ver­ hältnissen zwischen 0,75 und 1,4 oder 0,8 und 1,1 gute Ergebnisse erzielt.
  Durch Variation der Verweilzeit des Reaktionsgemisches kommt es zu unterschiedlichen Umsätzen und Raum-Zeit- Ausbeuten. Die durch die vertikalen gestrichelten Lini­ en der Fig. 7 abgegrenzten Abschnitte stellen Ver­ suchsabschnitte dar, in denen die Durchflussgeschwin­ digkeit der Reaktionslösung, die umgekehrt proportional der Verweilzeit τ ist, als Parameter variiert wurde. Der Figur ist zu entnehmen, dass bei mit gleichen Ver­ weilzeiten charakterisierten Segmenten gleiche Umsätze erzielt werden. Die jeweils mit zunehmender Betriebs­ zeit des Durchflussreaktors absinkenden Umsätze sind auf natürliche Denaturierung der Pyrophosphorylase zu­ rückzuführen. Das Ansteigen des Umsatzes im Segment 2 der Fig. 7 ist lediglich auf ein Ansteigen der Tempe­ ratur während des Betriebs zurückzuführen.2. By using the GTP or more generally the NTP in constant excess to mannose-1-phosphate, the substrate GTP or NTP competes more successfully around the active center of the pyrophosphorylase, which favors the reaction ( FIG. 8). A simulation of Syn theses in flow reactors with different substrate ratios shows that a ratio of 1.4 between GTP and Man-1-P represents a good compromise between sales and costs for substrate used in excess. ( Fig. 10).
  The kinetic model for the reaction shown in FIG. 1 can be given by the following formula, which very well reflects the experimental results:
  In it are:
  ν = reaction rate U / ml
  ν _max = maximum reaction rate 8.75 U / ml
  c _GTP = concentration of GTP mM
  c _Man-1-P = concentration of mannose-1-phosphate mM
  K ^Man-1-P _m = Michaelis-Menten constant Man-1-P 15.17 µM
  K ^GTP _m = Michaelis-Menten constant GTP 42.7 µM
  c _GDP-Man = concentration GDP-Mannose mM
  K ^GDP-Man _{i, GTP} = inhibitor constant of GDP-mannose 8.6 µM
  c _PPi = concentration PP _i µM
  K ^PPi _{i, GTP} = inhibitor constant of PP _i 15.8 µM
  In this kinetic model there is a competitive product inhibition of the enzyme by GDP-mannose to GTP with an inhibitor constant of K _i = 8.6 µM. This model is the basis for computer simulations of reaction processes in different reactors and under different reaction conditions.
  The under point 1 . The specified effect is achieved for the manufacture of GDP-mannose, as can be seen in FIG. 4, with an optimal concentration ratio of Mg ²⁺ / GTP of 0.9. Ratios above or below lead to a reduced activity of the enzyme and thus a lower reaction speed. However, good results are still obtained at intervals between ratios between 0.75 and 1.4 or 0.8 and 1.1.
  Varying the residence time of the reaction mixture leads to different conversions and space-time yields. The sections delimited by the vertical dashed lines in FIG. 7 represent test sections in which the flow rate of the reaction solution, which is inversely proportional to the residence time τ, was varied as a parameter. The figure shows that the same sales are achieved with segments characterized with the same dwell times. The sales which decrease with increasing operating time of the flow reactor are due to natural denaturation of the pyrophosphorylase. The increase in sales in segment 2 of FIG. 7 is only due to an increase in temperature during operation.
• 3. Durch die Verwendung zweier Durchflußreaktoren, die mit jeweils halben Reaktorvolumina und gleicher Enzym­ konzentration in einer Kaskade angeordnet sind, lässt sich die Raum-Zeit Ausbeute noch weiter erhöhen, da sich der gleiche Umsatz durch eine höhere Gesamtreakti­ onsgeschwindigkeit schon bei kleineren Verweilzeiten als in einem einzelnen Durchflußreaktor erzielen lässt (Fig. 9). Selbstverständlich können auch drei oder meh­ rere Durchflussreaktoren in Serie durchlaufen werden, jedoch zeigt sich, dass bereits bei dem Einsatz von zwei Durchflussreaktoren sehr gute Ergebnisse erzielt werden.3. By using two flow reactors, each with half reactor volumes and the same enzyme concentration in a cascade, the space-time yield can be increased even further, since the same conversion due to a higher overall reaction rate with shorter residence times than in can achieve a single flow reactor ( Fig. 9). Of course, three or more flow reactors can also be run in series, but it turns out that very good results are achieved when two flow reactors are used.

Die Erfindung ist nicht auf die Reaktion von Guanosin­ triphosphat mit Mannose-1-phosphat unter katalytischer Einwirkung von GDP-Mannose-Pyrophosphorylase in Verbin­ dung mit Mg²⁺ als Cofaktor beschränkt.The invention is not limited to the reaction of guanosine triphosphate with mannose-1-phosphate under the catalytic action of GDP-mannose pyrophosphorylase in conjunction with Mg ²⁺ as a cofactor.

Vielmehr ist der überraschende Effekt, dass die En­ zymaktivität bei der Umsetzung von Nucleosidtriphospha­ ten mit Zucker-1-Phosphaten unter Mitwirkung von Cofak­ toren in Form von zweiwertigen Metallkationen über lan­ ge Zeiträume auf einem hohen Niveau konstant gehalten werden kann, wenn man das Verhältnis zwischen dem Nucleosidtriphosphat und der Konzentration des zweiwer­ tigen Metallkationencofaktors konstant hält, allgemein festgestellt worden.Rather, the surprising effect is that the En enzyme activity in the implementation of Nucleosidtriphospha with sugar-1-phosphates with the participation of Cofak gates in the form of divalent metal cations over lan Periods kept constant at a high level can be, if you look at the relationship between the  Nucleoside triphosphate and the concentration of two metal cation cofactor, generally been found.

So können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Nucleosidtriphosphate von Uridin (U), Guanosin (G), Cy­ tidin (C), Thymidin (T) und d-Thymidin (dT) mit den Zucker-1-Phosphaten der Mannose, der Galactose, der Glucose, der Fucose, des N-Acetylglucosamins oder des N-Acetylglucosamins umgesetzt werden. Für jede Reaktion können dabei beispielsweise die Cofaktoren Mg²⁺, Mn²⁺ oder beispielsweise Zn²⁺ eingesetzt werden.Thus, the nucleoside triphosphates of uridine (U), guanosine (G), cytidine (C), thymidine (T) and d-thymidine (dT) with the sugar-1-phosphates of mannose, galactose, or Glucose, fucose, N-acetylglucosamine or N-acetylglucosamine can be reacted. The cofactors Mg ²⁺ , Mn ²⁺ or, for example, Zn ²⁺ can be used for each reaction.

Als Pyrophosphorylasen dienen die jeweils das entspre­ chende Zucker-1-phosphat umsetzenden Pyrophosphoryla­ sen. Diese sind für das -1-phosphat
des Glucose-1-phosphates: UDP-Glucose- Pyrophosphorylase,
des Galactose-1-phosphates: UDP-Galactose-Pyrophospho­ rylase,
des Fucose-1-phosphates: GDP-Fucose-Pyrophosphorylase,
des Mannose-1-phosphates: GDP-Mannose- Pyrophosphorylase,
des -1-phosphates des N-Acetylglucosamins: UDP-GlcNAc- Pyrophosphorylase,
des -1-phosphates des N-Acetylgalactosamins: UDP- GalNAc-Pyrophosphorylase. The pyrophosphorylases used are the corresponding sugar 1-phosphate-converting pyrophosphorylases. These are for the -1-phosphate
des glucose-1-phosphates: UDP-glucose pyrophosphorylase,
of galactose-1-phosphate: UDP-galactose pyrophosphorylase,
of fucose-1-phosphate: GDP-fucose pyrophosphorylase,
of mannose-1-phosphate: GDP-mannose pyrophosphorylase,
the -1-phosphate of N-acetylglucosamine: UDP-GlcNAc pyrophosphorylase,
of the -1-phosphate of N-acetylgalactosamine: UDP-GalNAc pyrophosphorylase.

Weitere Verbindungen, die durch das erfindungsgemässe Verfahren erhalten werden können sind:
Die Adenosindiphosphate der Glucose, des N-Acetyl- Glucosamins, der Galactose, der Mannose,
die Cytidindiphosphat-Glucose, Thymidindiphosphat-Gluco­ se, desoxy-Thymidindiphosphat-Glucose, desoxy- Thymidindiphosphat-Galactose,
die Uridindiphosphate der Glucose, des N-Acetyl- Glucosamins, der Galactose, des N-Acetylgalactosamins, der Glucuronsäure, der Galacturonsäure, der Xylose, der Arabinose sowie desoxy-Uridindiphosphat-Galactose,
die Guanosindiphosphate der Mannose, der Fucose und der Glucose.Further compounds which can be obtained by the process according to the invention are:
Adenosine diphosphates of glucose, N-acetyl-glucosamine, galactose, mannose,
cytidine diphosphate glucose, thymidine diphosphate glucose, deoxy thymidine diphosphate glucose, deoxy thymidine diphosphate galactose,
the uridine diphosphates of glucose, N-acetyl-glucosamine, galactose, N-acetylgalactosamine, glucuronic acid, galacturonic acid, xylose, arabinose and deoxy-uridine diphosphate-galactose,
the guanosine diphosphates of mannose, fucose and glucose.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass ein Verfahren zur kontinuierlichen Synthese von Zucker-Nucleotiden zur Verfügung gestellt werden konnte, das aufgrund der Charakteristik der enzymkatalysierten Reaktion folgende Vorteile gegenüber dem Stand der Technik bietet:
Konstante, maximale Reaktionsgeschwindigkeit der Reak­ tion durch fest einstellbares Verhältnis der Konzentra­ tionen von Nucleosidtriphosphat und dem zweiwertigen Metallkation-Cofaktor insbesondere beim Betrieb in ei­ nem Durchflußreaktor.In summary, it could be said that a method for the continuous synthesis of sugar nucleotides could be made available which offers the following advantages over the prior art due to the characteristics of the enzyme-catalyzed reaction:
Constant, maximum reaction speed of the reaction due to a fixed ratio of the concentrations of nucleoside triphosphate and the divalent metal cation cofactor, especially when operating in a flow reactor.

Überwindung der Produktinhibierung durch den bei der Reaktion gebildeten Nucleosiddiphosphat-Zucker durch den Einsatz des Substrates Nucleosidtriphosphat (NTP) im Überschuß zum Zucker-1-phosphat zum einen und durch Produktion in einer Kaskade von Durchflussreaktoren zum anderen.Overcoming product inhibition by using the Reaction formed by nucleoside diphosphate sugar the use of the substrate nucleoside triphosphate (NTP)  in excess of sugar-1-phosphate on the one hand and through Production in a cascade of flow reactors for other.

Die erfindungsgemässe Wirkung, dass die RZA erhöht wird bzw. die Enzymaktivität abgesehen von natürlicher Dena­ turierung über lange Zeiträume kostant bleibt, kann auch erreicht werden, wenn in einem Rührkessel - also im Batch-Betrieb - bei sinkender NTP-Konzentration ge­ arbeitet und ein Komplexbildner zugegeben wird, der entsprechend der Abnahme der NTP-Konzentration den Co­ faktor, wie Mg²⁺, komplexiert und somit dem Reaktions­ gleichgewicht entzieht.The effect according to the invention that the STA is increased or the enzyme activity remains costly for long periods apart from natural denaturation can also be achieved if a stirred kettle - ie in batch mode - works with a decreasing NTP concentration and is a complexing agent is added, which complexes the co-factor, such as Mg ²⁺ , in accordance with the decrease in the NTP concentration and thus removes the reaction equilibrium.

Die erfindungsgemäße Wirkung tritt auch ein, wenn die NTP-Konzentration konstant gehalten wird und die Kon­ zentration des Cofaktors leicht schwankt. Die Grenzen für gute Ergebnisse sind in diesem Fall dadurch gege­ ben, daß die Cofaktor-Konzentration nicht soweit absin­ ken darf, daß der Cofaktor nicht als limitierender Fak­ tor für die Reaktionsgeschwindigkeit wirksam wird und dass andererseits kein zu großer Überschuß an Cofaktor entstehen darf, damit keine inhibierende Wirkung auf­ tritt. Diese Grenzen sind allerdings für jede Reaktion individuell verschieden und können durch einfache Ver­ suche ermittelt werden.The effect according to the invention also occurs when the NTP concentration is kept constant and the Kon the concentration of the cofactor fluctuates slightly. The limits in this case, for good results ben that the cofactor concentration does not decrease so far ken that the cofactor is not a limiting factor Tor for the reaction rate is effective and that on the other hand not too much excess of cofactor may arise so that no inhibitory effect on occurs. However, these limits are for every reaction individually different and can by simple ver search can be determined.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von NDP-Zucker, bei dem ein Zucker-1-Phosphat mit einem Nucleosidtriphosphat (NTP) in Anwesenheit eines zweiwertigen Metall­ kations als Cofaktor über eine das Zucker-1-phosphat und das NTP umsetzende Pyrophosphorylase in einem Reaktionsgemisch reagiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Konzentrationsverhältnis zwischen Cofaktor und NTP zeitlich konstant gehalten wird.1. A process for the preparation of NDP sugar, in which a sugar 1-phosphate reacts with a nucleoside triphosphate (NTP) in the presence of a divalent metal cation as a cofactor via a pyrophosphorylase which converts the sugar 1-phosphate and the NTP in a reaction mixture, characterized in that the concentration ratio between the cofactor and the NTP is kept constant over time. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Cofaktors und des NTP zeitlich konstant gehalten wird.2. The method according to claim 1, characterized, that the concentration of the cofactor and the NTP is kept constant over time. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das NTP in konstantem Überschuß zu dem Zucker- 1-phosphat eingesetzt wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that the NTP is in constant excess to the sugar 1-phosphate is used. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Nucleosidtriphosphate die der Nucleoside Uridin, Guanosin, Cytidin, Adenosin oder Thymidin eingesetzt werden.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized, that as nucleoside triphosphates that of nucleosides Uridine, guanosine, cytidine, adenosine or thymidine  be used. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Zucker-1-phosphate die -1-phosphate der Glucose, des N-Acetylglucosamin, der Galactose, des N-Acetylgalactosamin, der Fucose oder der Mannose eingesetzt werden.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized, that as sugar-1-phosphates the -1-phosphates of Glucose, N-acetylglucosamine, galactose, des N-acetylgalactosamine, fucose or mannose be used. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als zweiwertiges Metallkation eine Komponente aus der Gruppe Mg²⁺, Mn²⁺ und Zn²⁺ eingesetzt wird.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that a component from the group Mg ²⁺ , Mn ²⁺ and Zn ^{2+ is} used as the divalent metal cation. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einem Membrandurchflussreaktor durchgeführt wird.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized, that the reaction in a membrane flow reactor is carried out. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in mindestens 2 in einer Kaskade in Verbindung stehenden Membrandurchflussreaktoren durchgeführt wird.8. The method according to claim 7, characterized, that the reaction in at least 2 in a cascade related membrane flow reactors is carried out.