DE19634446A1 - Enzymatic synthesis of optically active hydroxamic acids and their conversion to optically active primary amines by Lossen rearrangement - Google Patents

Abstract

The description relates to a process for producing optically active hydroxamic acids of the general formula (I) in which R<1>, R<2> and R<3> are different and represent a cyclic or linear, aliphatic or aromatic, substituted or unsubstituted hydrocarbon radical which may contain hetero-atoms, characterised in that a racemate of chiral amides, carboxylic acid esters or caboxylic acids of the general formula (II) in which R<1>, R<2> and R<3> are defined as above and X is -NH2, -OR or -OH, R being any organic radical, is reacted with hydroxyl amine NH2OH in the presence of an acyl transferase and the optically active hydroxamic acid (I) thus produced is separated from the unreacted enantiomer of the general formula (II). The optically active hydroxamic acid thus obtained can be converted to the corresponding optically primary amines by Lossen transposition.

Description

Die Erfindung betrifft die enzymatische Synthese optisch aktiver Hydroxamsäuren und ihre Umsetzung zu optisch aktiven primären Aminen durch Lossen-Umlagerung.The invention relates to the enzymatic synthesis optically active hydroxamic acids and their conversion to optically active primary amines by Lossen rearrangement.

Hydroxamsäuren stellen pharmazeutisch hochinteressante Verbindungen dar. Es existieren Hydroxamsäurederivate mit antibakteriellen und fungiziden Eigenschaften (Duda et al., 1965, Hase et al., 1971) Alkylaminopropionhydroxamsäuren zeigen hypotensive Eigenschaften (Coutts et al., 1971). Desweiteren wurden für Hydroxamsäuren hypocholesterinämische Wirkungen nachgewiesen (Ludwig et al., 1967). p-Butoxy­ phenylacethydroxamsäure besitzt endzündungshemmende Wirkung (Dell et al., 1971) und wird in der Humanmedizin eingesetzt. Einige Hydroxamsäuren wurden auf ihre Wirksamkeit gegen Malaria untersucht (Hynes, 1970; Hynes & Hack, 1972).Hydroxamic acids are pharmaceutically very interesting Compounds. There are hydroxamic acid derivatives with antibacterial and fungicidal properties (Duda et al., 1965, Hase et al., 1971) alkylaminopropionic hydroxamic acids show hypotensive properties (Coutts et al., 1971). Furthermore, hypocholesterolemic for hydroxamic acids Effects detected (Ludwig et al., 1967). p-butoxy phenylacethydroxamic acid has anti-inflammatory activity (Dell et al., 1971) and is used in human medicine. Some hydroxamic acids have been tested for their effectiveness Malaria (Hynes, 1970, Hynes & Hack, 1972).

Von besonderer Bedeutung sind jedoch enantiomerenreine Hydroxamsäuren. Gegenüber den Racematen weisen sie eine höhere pharmakologische Aktivität auf. Desweiteren erschließen sie durch die Lossen-Umlagerung auch einen neuen Weg zu chiralen primären Aminen. Auch diese Substanzklasse ist pharmakologisch von großer Bedeutung. So werden z. B. chirale β-Aminoalkohole in großen Mengen als β-Adrenozeptor- Antagonisten, kurz β-Blocker, eingesetzt.Of particular importance, however, enantiomerically pure Hydroxamic acids. Opposite the Racematen they have one higher pharmacological activity. Furthermore open up a new one through the Lossen rearrangement Way to chiral primary amines. Also this substance class is pharmacologically important. So z. B.  chiral β-amino alcohols in large quantities as β-adrenoceptor Antagonists, short β-blockers used.

Die Herstellung von enantiomerenreinen Hydroxamsäuren durch klassische Verfahren der organischen Chemie ist jedoch auf­ wendig. Sie erfordert in der Regel eine Racemattrennung oder den Einsatz von metallorganischen Katalysatoren, die jedoch zur Herstellung von Arzneimitteln im allgemeinen ungeeignet sind. Solche Verfahren sind beispielsweise in der DE-PS 24 00 531, der EP-A-203 379 sowie der EP-A-268 215 beschrie­ ben.The preparation of enantiomerically pure hydroxamic acids by However, classical methods of organic chemistry is up manoeuvrable. It usually requires a racemate separation or the use of organometallic catalysts, however generally unsuitable for the preparation of medicaments are. Such methods are for example in DE-PS 24 00 531, EP-A-203 379 and EP-A-268 215 beschrie ben.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Hydroxamsäuren be­ reitzustellen, bei dem die vorgenannten Probleme nicht auf­ treten.Thus, the invention is based on the object, a new Process for the preparation of optically active hydroxamic be in which the aforementioned problems do not arise to step.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Acyltransfera­ sen, Amide, Carbonsäureester und Carbonsäuren, die an den α- Kohlenstoffatomen ein Chiralitätszentrum besitzen, in Gegen­ wart von Hydroxylamin enantioselektiv zu optisch aktiven Hydroxamsäuren umsetzen können.Surprisingly, it has now been found that Acyltransfera esters, amides, carboxylic esters and carboxylic acids which are attached to the α- Carbon atoms have a chiral center, in counter were of hydroxylamine enantioselective to optically active Hydroxamic acids can implement.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Her­ stellung optisch aktiver Hydroxamsäuren der allgemeinen FormelThe invention therefore provides a method for producing position of optically active hydroxamic acids of the general formula

worin R¹, R² und R³ verschieden sind und für einen cycli­ schen oder linearen, aliphatischen oder aromatischen, sub­ stituierten oder unsubstituierten Kohlenwasserstoffrest, der ggf. Hetereoatome enthalten kann, stehen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Racemat aus chiralen Amiden, Carbonsäureestern oder Carbonsäuren der allgemeinen Formel:wherein R¹, R² and R³ are different and are a cycli or linear, aliphatic or aromatic, sub substituted or unsubstituted hydrocarbon radical, the may contain heteroatoms, stand thereby  characterized in that a racemate of chiral amides, Carboxylic esters or carboxylic acids of the general formula:

worin R¹, R² und R³ wie oben definiert sind und X für -NH₂, -OR oder -OH steht, wobei R ein beliebiger organischer Rest ist,
mit Hydroxylamin NH₂OH in Gegenwart einer Acyltransferase umsetzt und anschließend die gebildete optisch aktive Hydro­ xamsäure (I) von dem nichtumgesetzten Enantiomeren der allgemeinen Formel (II) abtrennt.wherein R¹, R² and R³ are as defined above and X is -NH₂, -OR or -OH, where R is any organic radical,
with hydroxylamine NH₂OH in the presence of an acyltransferase and then the resulting optically active hydroxamic acid (I) from the unreacted enantiomers of the general formula (II).

Geeignete Acyltransferasen, d. h. Enzyme, die den Acylrest auf das Hydroxylamin übertragen, sind an sich bekannt. Sie können beispielsweise aus den folgenden Mikroorganismen iso­ liert werden: Mycobacteriaceae, Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Arthrobacter, Aspergillus nidulans, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacterium sp. R312 Methylophilus methylotrophus, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus rhodochrous J1 und Rhodococcus erythropolis MP50.Suitable acyltransferases, d. H. Enzymes that contain the acyl residue transferred to the hydroxylamine, are known per se. you For example, iso may be derived from the following microorganisms Mycobacteriaceae, Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Arthrobacter, Aspergillus nidulans, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacterium sp. R312 Methylophilus methylotrophus, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus rhodochrous J1 and Rhodococcus erythropolis MP50.

Als ganz besonders geeignet erweist sich die aus Rhodococcus erythropolis MP50 isolierte Acyltransferase. Von allen untersuchten Amidasen hatte diese die höchsten spezifischen Aktivitäten und das breiteste Substratspektrum. Amidase- und Acyltransferaseaktivität sind im selben Enzym zu finden. Auch die Amidase-Aktivität ist hoch, die Acyltransferase- Aktivität ist jedoch deutlich höher, vermutlich da Hydroxyl­ amin der bessere Akzeptor als Wasser für den Acylrest ist. Somit kann durch Verwendung dieser speziellen Acyltrans­ ferasen, d. h. der aus Rhodococcus erythropolis MP50 iso­ lierten Acyltransferase, die Hydrolyse der als Ausgangs­ material eingesetzten Amide und Ester weitgehend vermieden werden.The Rhodococcus species is particularly suitable erythropolis MP50 isolated acyltransferase. From all This had the highest specific amidases investigated Activities and the widest substrate spectrum. Amidase and Acyltransferase activity can be found in the same enzyme. The amidase activity is also high, the acyltransferase Activity, however, is significantly higher, presumably because hydroxyl amine is the better acceptor than water for the acyl radical. Thus, by using this particular acyltrans  ferasen, d. H. from Rhodococcus erythropolis MP50 iso lled acyltransferase, the hydrolysis of the starting material used amides and esters largely avoided become.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann sowohl ein Rohextrakt der Acyltransferase aus den genannten Mikroorganismen als auch eine gereinigte Form eingesetzt werden. Die Verwendung des Rohextrakts weist den Vorteil auf, daß die Stufe der Reinigung des Enzyms unterbleiben kann. Für spezielle Anwendungen empfiehlt sich jedoch die Verwendung von gereinigter Acyltransferase. Insbesondere zeigt sich, daß die katalytische Aktivität der gereinigten Acyltransferase höher ist als die des Rohextrakts, so daß reaktionsträge Ausgangsmaterialien vorzugsweise mit der gereinigten Acyltransferase umgesetzt werden.In carrying out the method according to the invention can both a crude extract of the acyltransferase from the said Microorganisms used as well as a purified form become. The use of the crude extract has the advantage that the stage of purification of the enzyme be omitted can. For special applications, however, we recommend the Use of purified acyltransferase. In particular shows that the catalytic activity of the purified Acyltransferase is higher than that of the crude extract, so that inert starting materials preferably with the purified acyltransferase are reacted.

Die Gewinnung und Reinigung der Acyltransferase aus Rhodococcus erythropolis MP50 ist in "Purification and properties of an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which enantioselectively hydrolyses 2-arylpropionamides" B. Hirrlinger, A. Stolz & H.-J. Knackmuss, Journal of Bacteriology, 1996, Vol. 178(12), S. 3501-3507, beschrieben.The recovery and purification of the acyltransferase Rhodococcus erythropolis MP50 is in "Purification and properties of an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which enantioselectively hydrolyses 2-arylpropionamides "B. Hirrlinger, A. Stolz & H.-J. Knackmuss, Journal of Bacteriology, 1996, Vol. 178 (12), pp. 3501-3507.

Die Zellen oder das gereinigte Enzym können direkt oder in immobilisierter Form eingesetzt werden. Die Immobilisation ermöglicht eine mehrfache Verwendung des Biokatalysators und vereinfacht die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Immobilisie­ rung von ganzen Zellen oder von gereinigtem Enzym nach an sich bekannten Methoden. Ganze Zellen werden z. B. mit Alginat, -Carrageenan, Polyurethan oder Polyacrylamiden im­ mobilisiert (I. Chibata, T. Tosa & T. Sato, 1983, Immobilized Cells in Preparation of Fine Chemicals, Advances In Biotechnological Processes (A.R. Liss, Hrsg.), Band 1, S. 203-222.The cells or the purified enzyme may be directly or in immobilized form can be used. Immobilization allows multiple use of the biocatalyst and simplifies the workup of the reaction mixture. in the Under the present invention, the immobilization takes place whole cells or purified enzyme known methods. Whole cells are z. B. with Alginate, carrageenan, polyurethane or polyacrylamides in mobilized (I. Chibata, T. Tosa & T. Sato, 1983, Immobilized Cells in Preparation of Fine Chemicals, Advances  In Biotechnological Processes (A.R. Liss, ed.), Vol. 1, p. 203-222.

Gereinigtes Enzym wird entweder durch Adsorption an geeig­ nete Trägermaterialien (Celite, Cellulose) durch ionische Bindung an ein Ionentauscherharz (DEAE-Cellulose, Sephadex), durch kovalente Bindungen an einen Carrier (poröse Glaskü­ gelchen, Cellulose, Dextran, Agarose) oder durch Einlagern in ein Gel (Alginat, Agar, Polyacrylamid) immobilisiert (O.R. Zaborsky, 1973, Immobilized Enzymes, CRC Press, Cleveland, Ohio; M.D. Trevan, 1980, Immobilized Enzymes: Introduction and Applications in Biotechnology, Wiley, New York; W Hartmeier, 1986, Immobilisierte Biokatalysatoren, Springer, Berlin).Purified enzyme is either by adsorption on Nete carrier materials (celite, cellulose) by ionic Binding to an ion exchange resin (DEAE-cellulose, Sephadex), by covalent bonds to a carrier (porous glass gel, cellulose, dextran, agarose) or by storage immobilized in a gel (alginate, agar, polyacrylamide) (O.R. Zaborsky, 1973, Immobilized Enzymes, CRC Press, Cleveland, Ohio; M.D. Trevan, 1980, Immobilized Enzymes: Introduction and Applications in Biotechnology, Wiley, New York; W Hartmeier, 1986, Immobilized Biocatalysts, Springer, Berlin).

Da es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um eine enzymkatalysierte Reaktion handelt, ist der pH-Wert des Reaktionsmediums zu beachten. Er sollte im allgemeinen in einem Bereich von pH = 5,5 bis 9 und vorzugsweise in einem Bereich von pH = 6,5 bis 7,5 liegen. Hierzu können geeignete Puffersysteme, wie Natriumphosphatpuffer und Tris/HCl-Puffer verwendet werden.Since it is in the process of the invention to a enzyme-catalyzed reaction, is the pH of the Respect reaction medium. He should generally be in a range of pH = 5.5 to 9 and preferably in one Range of pH = 6.5 to 7.5. For this purpose, suitable Buffer systems, such as sodium phosphate buffer and Tris / HCl buffer be used.

Prinzipiell können beliebige Amide, Carbonsäureester und Carbonsäuren als Ausgangsmaterial zur Herstellung der ge­ wünschten Hydroxamsäuren eingesetzt werden, solange das dem Carbonylkohlenstoff benachbarte Kohlenstoffatom, d. h. das α- Kohlenstoffatom chiral ist. Das bedeutet, daß die an diesem Kohlenstoffatom vorhandenen Substituenten verschieden sein müssen. Diese Substituenten können beliebige cyclische oder lineare aliphatische oder aromatische substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffreste sein und können ggf. Heteroatome, wie Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff, Phosphor usw., enthalten. In principle, any amides, carboxylic acid esters and Carboxylic acids as starting material for the preparation of ge Wanted hydroxamic acids are used, as long as that Carbonyl carbon adjacent carbon atom, d. H. the α- Carbon atom is chiral. That means that at this Carbon atom substituents present different have to. These substituents may be any cyclic or linear aliphatic or aromatic substituted or be unsubstituted hydrocarbon radicals and may possibly Heteroatoms, such as oxygen, sulfur, nitrogen, phosphorus etc., included.  

Als besonders geeignet erweisen sich Substituenten, wie Methyl, Ethyl, n-Pentyl, Isopropyl, Cyclohexyl, Phenyl und Naphthyl.Substituents prove to be particularly suitable, such as Methyl, ethyl, n-pentyl, isopropyl, cyclohexyl, phenyl and Naphthyl.

Besonders geeignete Ausgangsmaterialien sind daher Alkylaminopropionsäure, p-Butoxyphenylessigsäure, 2- Phenylpropionsäure, 2-(6-Methoxy-2-naphthyl)propionsäure (Naproxen), 2-(3′-Benzoylphenyl)propionsäure (Ketoprofen), 2-Methylbutansäure und 2-(1-Naphthyl)propionsäure und deren Ester oder Amide.Particularly suitable starting materials are therefore Alkylaminopropionic acid, p-butoxyphenylacetic acid, 2- Phenylpropionic acid, 2- (6-methoxy-2-naphthyl) propionic acid (Naproxen), 2- (3'-benzoylphenyl) propionic acid (ketoprofen), 2-methylbutanoic acid and 2- (1-naphthyl) propionic acid and their Esters or amides.

Im allgemeinen ist bevorzugt, die Amide der unter die all­ gemeine Formel (I) fallenden Verbindungen einzusetzen, da sie reaktiver als die entsprechenden Carbonsäuren bzw. Car­ bonsäureester sind.In general, it is preferred that the amides of the under use common formula (I) falling compounds, since they are more reactive than the corresponding carboxylic acids or car are esters of boronic acid.

Die Konzentration der Reaktanten in dem Reaktionsmedium ist nicht besonders kritisch. Im allgemeinen setzt man die Ver­ bindungen der Formel (I) in einer Konzentration von 0,5 bis 0,001 mol/l und vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 mol/l ein. Die Konzentration des Hydroxylamins beträgt im allgemeinen 1,0 bis 0,1 mol/l und vorzugsweise 0,5 bis 0,2 mol/l. Somit beträgt das Verhältnis der Verbindungen der Formel (I) zu Hydroxylamin im allgemeinen 1 : 10 bis 1 : 2 und vorzugsweise 1 : 5. Die Aktivität der Acyltransferase beträgt im allgemeinen 3,5 bis 37 Units/mg Protein und vorzugsweise 13 Units/mg Protein (mit 2-Phenylpropionamid als Substrat).The concentration of reactants in the reaction medium is not very critical. In general, the Ver compounds of the formula (I) in a concentration of 0.5 to 0.001 mol / l and preferably in a concentration of 0.1 mol / l. The concentration of hydroxylamine is in general 1.0 to 0.1 mol / l, and preferably 0.5 to 0.2 minor. Thus, the ratio of the compounds is Formula (I) to hydroxylamine generally 1: 10 to 1: 2 and preferably 1: 5. The activity of the acyltransferase is generally from 3.5 to 37 units / mg of protein, and preferably 13 units / mg protein (with 2-phenylpropionamide as substrate).

Der wesentliche Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß die Acyltransferase selektiv lediglich die Umsetzung eines Enantiomeren des als Ausgangsmaterial eingesetzten Racemats aus optisch aktiven Amiden, Carbon­ säureestern oder Carbonsäuren mit Hydroxylamin zur entspre­ chenden Hydroxamsäure katalysiert, während sein Spiegelbild bei der Reaktion nicht verändert wird. Somit erhält man zunächst direkt nach der Umsetzung ein Reaktionsgemisch, das die optisch reine Hydroxamsäure neben den nichtumgesetzten Enantiomeren des Ausgangsmaterials enthält. Diese beiden Komponenten können in einfacher Weise durch Ausschütteln des Reaktionsgemischs mit Essigsäureethylester, Diethylether oder Methylenchlorid voneinander getrennt werden. Dabei geht man im allgemeinen wie folgt vor:
Die wäßrige Reaktionslösung wird mit Natronlauge auf pH = 10 eingestellt. Man extrahiert das Amid mit einem der voran­ stehend genannten organischen Lösungsmitteln. Anschließend wird die wäßrige Phase mit Salzsäure auf pH = 2 eingestellt. Jetzt wird die Hydroxamsäure durch Ausschütteln in die or­ ganische Phase überführt und so isoliert.The main advantage of the method is the fact that the acyltransferase selectively catalyzes only the reaction of an enantiomer of the racemate used as starting material of optically active amides, carboxylic acid esters or carboxylic acids with hydroxylamine to corre sponding hydroxamic acid, while its mirror image does not change in the reaction becomes. Thus, first, immediately after the reaction, a reaction mixture containing the optically pure hydroxamic acid in addition to the unreacted enantiomers of the starting material is obtained. These two components can be separated from each other in a simple manner by shaking out the reaction mixture with ethyl acetate, diethyl ether or methylene chloride. This is generally done as follows:
The aqueous reaction solution is adjusted to pH = 10 with sodium hydroxide solution. The amide is extracted with one of the above-mentioned organic solvents. Subsequently, the aqueous phase is adjusted to pH = 2 with hydrochloric acid. Now the hydroxamic acid is transferred by shaking into the or ganic phase and so isolated.

Die auf diese Weise gewonnene optisch aktive Hydroxamsäure kann dann in an sich bekannter Weise durch Lossen-Umlagerung in das entsprechende optisch aktive und enantiomerenreine primäre Amin umgewandelt werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von op­ tisch aktiven, primären Aminen der allgemeinen FormelThe thus obtained optically active hydroxamic acid can then in a conventional manner by Lossen rearrangement in the corresponding optically active and enantiomerically pure primary amine are converted. Another object of the Invention is therefore a process for the preparation of op table active, primary amines of the general formula

worin R¹, R² und R³ wie voranstehend definiert sind, bei dem man die, wie voranstehend beschrieben, erhaltene optisch aktive Hydroxamsäure der allgemeinen Formel (I) O-acyliert und die O-acylierte Hydroxamsäure durch Erhitzen oder durch die Behandlung mit Basen in aprotischen Lösungsmitteln zum entsprechenden Isocyanat umsetzt und das Isocyanat mit Wasser unter Abspaltung von CO₂ zum Amin der allgemeinen Formel (III) reagieren läßt. wherein R¹, R² and R³ are as defined above, in which the optically obtained as described above active hydroxamic acid of general formula (I) O-acylated and the O-acylated hydroxamic acid by heating or by the treatment with bases in aprotic solvents for corresponding isocyanate and the isocyanate with Water with elimination of CO₂ to the amine of the general React formula (III).  

Die Lossen-Umlagerung verläuft somit nach dem folgenden Reaktionsschema:The Lossen rearrangement thus follows the following Scheme:

Als Basen sind Verbindungen, wie NaOH, KOH, NaNH₂, Na₂CO₃ geeignet, wobei die Art der verwendeten Basen von der Struktur der gewünschten Hydroxamsäure abhängt.As bases are compounds such as NaOH, KOH, NaNH₂, Na₂CO₃ suitable, wherein the type of bases used by the Structure of the desired hydroxamic acid depends.

Zweckmäßige aprotische Lösungsmittel sind beispielsweise Toluol, Benzol oder Xylol.Suitable aprotic solvents are, for example Toluene, benzene or xylene.

Um die O-acylierte Hydroxamsäure möglichst quantitativ und rasch zu zersetzen, sind im allgemeinen Temperaturen von 100°C bis 150°C und vorzugsweise 100°C zweckmäßig.To the O-acylated hydroxamic acid as quantitatively and as possible are rapidly decomposing temperatures of 100 ° C to 150 ° C and preferably 100 ° C appropriate.

Da bei der Lossen-Umlagerung die absolute Konfiguration des α-Kohlenstoffatoms der als Ausgangsmaterial eingesetzten optisch aktiven Hydroxamsäure erhalten bleibt (vgl. Campbell & Kenyon, 1946), sind die als Produkt der Lossen-Umlagerung erhaltenen primären Amine ebenfalls optisch aktiv.Since in the Lossen rearrangement the absolute configuration of the α-carbon of the starting material used optically active hydroxamic acid is retained (see Campbell & Kenyon, 1946), are the product of the Lossen rearrangement obtained primary amines also optically active.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven, primären Aminen ist es jedoch nicht er­ forderlich, das nichtumgesetzte Enantiomere der bei der Her­ stellung der optisch aktiven Hydroxamsäuren eingesetzten Amide, Carbonsäureester oder Carbonsäuren nach der ersten enzymkatalysierten Umsetzung zu entfernen, d. h. die reine, optisch aktive Hydroxamsäure einzusetzen. Die Umsetzung kann auch in der Weise geführt werden, daß man das Racemat aus den chiralen Amiden, Carbonsäureestern oder Carbonsäuren zu­ nächst unter Enzymkatalyse mit Hydroxylamin umsetzt, und das dabei erhaltene Reaktionsgemisch, in dem neben der optisch aktiven Hydroxamsäure das nichtumgesetzte Enantiomere des Ausgangsmaterials enthalten ist, mit einem Carbodiimid unter Protonenkatalyse reagieren läßt, wodurch intermediär ein Isocyanat und ein entsprechendes Harnstoffderivat gebildet wird. Das Isocyanat reagiert dann sofort mit dem in dem Reaktionssystem enthaltenen Wasser zu einer Carbaminsäure, die ihrerseits zu Kohlendioxid und dem gewünschten primären, optisch aktiven Amin zerfällt. Das Amin kann dann von dem nichtumgesetzten Enantiomeren des Ausgangsmaterials in ein­ facher Weise getrennt werden.In the inventive method for the preparation of However, it is not him optically active, primary amines necessary, the unreacted enantiomers of the Her  position of the optically active hydroxamic acids used Amides, carboxylic esters or carboxylic acids after the first enzyme-catalyzed reaction to remove, d. H. the pure, to use optically active hydroxamic acid. The implementation can also be conducted in such a way that the racemate from the chiral amides, carboxylic acid esters or carboxylic acids too next under enzyme catalysis with hydroxylamine, and the This reaction mixture obtained, in addition to the optical active hydroxamic acid is the unreacted enantiomer of the Starting material is included, with a carbodiimide below Reacting proton catalysis, which intermediates a Isocyanate and a corresponding urea derivative formed becomes. The isocyanate then reacts immediately with that in the Reaction system contained water to a carbamic acid, in turn to carbon dioxide and the desired primary, optically active amine decomposes. The amine can then be from the unreacted enantiomers of the starting material in a be separated in a separate way.

Die Umsetzung mit Carbodiimid bietet den Vorteil, daß die in einem wäßrigen Reaktionssystem anfallende optisch aktive Hydroxamsäure gleich weiterverarbeitet werden kann und somit eine Reinigungsstufe unterbleiben kann. Die Derivatisierung mit einem Carbodiimid ist erforderlich, da die klassischen chemischen Methoden der O-Acylierung von Hydroxamsäure nur in aprotischen Lösungsmitteln durchgeführt werden können, diese jedoch für enzymkatalysierte Reaktionen unzweckmäßig sind.The reaction with carbodiimide has the advantage that the in an optically active resulting from an aqueous reaction system Hydroxamic acid can be processed immediately and thus a cleaning step can be omitted. The derivatization with a carbodiimide is required as the classic chemical methods of O-acylation of hydroxamic acid only can be carried out in aprotic solvents, however, these are inconvenient for enzyme-catalyzed reactions are.

Als solche Carbodiimide sind beispielsweise 1-Benzyl-3-(3′- dimethylaminopropyl)carbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2′-morpho­ linoethyl)carbodiimid und 1-Ethyl-3-(3′-dimethylaminopro­ pyl)carbodiimid geeignet. Als besonders zweckmäßig erweist sich das 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC). Dieses Carbodiimid ist beispielsweise in Sheehan, J.C., P.A. Cruickshank & G.L. Boshart, 1961, A convenient synthesis of water-soluble carbodiimides, J. Org. Chem. 26, 2525-2528, beschrieben.As such carbodiimides, for example, 1-benzyl-3- (3'- dimethylaminopropyl) carbodiimide, 1-cyclohexyl-3- (2'-morpho linoethyl) carbodiimide and 1-ethyl-3- (3'-dimethylaminopro pyl) carbodiimide. As particularly useful proves the 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). This carbodiimide is for example in Sheehan,  J.C., P.A. Cruickshank & G.L. Boshart, 1961, A convenient synthesis of water-soluble carbodiimides, J. Org. Chem. 26, 2525-2528.

Da bei der Herstellung der optisch aktiven Hydroxamsäure im allgemeinen ein Überschuß an Hydroxylamin eingesetzt wird, ist es zweckmäßig, das überschüssige Hydroxylamin vor der Umsetzung der Reaktionsmischung mit dem Carbodiimid zu ent­ fernen. Hierzu wird das Reaktionsgemisch auf einen pH im Bereich von pH = 0 bis 2 und vorzugsweise im Bereich von pH = 1 angesäuert. Das Hydroxylamin zersetzt sich dann leicht zu Ammonium und Distickstoffmonoxid (vgl. Holleman, A.F. & E. Wiberg, 1985, Lehrbuch der Anorganischen Chemie, 91.-100. Auflage, S. 591, Walter de Gruyter Verlag, Berlin, New York).As in the preparation of optically active hydroxamic acid in general an excess of hydroxylamine is used, it is expedient, the excess hydroxylamine before Reaction of the reaction mixture with the carbodiimide to ent distant. For this purpose, the reaction mixture is adjusted to a pH in Range of pH = 0 to 2 and preferably in the range of acidified pH = 1. The hydroxylamine then decomposes easily to ammonium and dinitrogen monoxide (see Holleman, A. F. & E. Wiberg, 1985, Textbook of Inorganic Chemistry, 91.-100. Edition, p. 591, Walter de Gruyter Verlag, Berlin, New York).

Nach dem Ansäuern wird das Reaktionsgemisch auf eine Tempe­ ratur im Bereich von 40°C bis 100°C und vorzugsweise auf 80°C so lange erhitzt, bis keine Gasentwicklung mehr zu beobachten ist. Anschließend gibt man zu dem Reaktions­ gemisch eine Base, wie beispielsweise Natronlauge, um den pH auf einen Wert von pH = 4 bis 6 und vorzugsweise auf pH = 5,0 einzustellen.After acidification, the reaction mixture is brought to a temperature temperature in the range of 40 ° C to 100 ° C, and preferably on 80 ° C heated until no more gas evolution is watching. Then you give to the reaction mix a base, such as caustic soda, around the pH to a value of pH = 4 to 6 and preferably to pH = 5.0.

Anschließend erfolgt dann die Derivatisierung mit dem Carbo­ diimid gemäß dem folgenden allgemeinen Schema:This is followed by derivatization with the carbo diimide according to the following general scheme:

worin R¹ bis R⁵ wie voranstehend definiert sind.wherein R¹ to R⁵ are as defined above.

Setzt man beispielsweise racemisches 2-Phenylpropionamid als Ausgangsmaterial bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein, so erhält man zunächst S-(-)-Phenylethylamin und R-2-Phenylpro­ pionamid gemäß dem folgenden Formelschema:If, for example, racemic 2-phenylpropionamide is used as Starting material in the inventive method, so first, S - (-) - phenylethylamine and R-2-phenylpro are obtained pionamide according to the following formula scheme:

Das gewünschte optisch aktive, primäre Amin kann von dem nichtumgesetzten Enantiomeren des Ausgangsmaterials in ein­ facher Weise abgetrennt werden. Hierzu kann wie folgt vorge­ gangen werden: Die wäßrige Reaktionslösung wird mit Salz­ säure auf pH = 1 angesäuert und mit Essigsäureethylester oder Diethylether oder Methylenchlorid extrahiert. Das Amid befindet sich nun in der organischen Phase. Danach wird der pH-Wert der wäßrigen Phase mit Natronlauge auf pH = 10 gebracht und das Amin mit den genannten Lösungsmitteln ex­ trahiert.The desired optically active primary amine can be derived from the unreacted enantiomers of the starting material in a be separated in a separate way. This can be done as follows The aqueous reaction solution is washed with salt acid to pH = 1 and acidified with ethyl acetate or diethyl ether or methylene chloride. The amide is now in the organic phase. After that, the pH of the aqueous phase with sodium hydroxide to pH = 10 brought and the amine with the solvents mentioned ex tracted.

Auf diese Weise können optisch aktive, primäre Amine wie S- (-)-Phenylethylamin, 5-2-Aminobutan oder S-1-(1-Naphthyl)- ethylamin erhalten werden, die sonst nur durch aufwendige Racemattrennung zugänglich wären.In this way, optically active, primary amines such as (-) - phenylethylamine, 5-2-aminobutane or S-1- (1-naphthyl) - ethylamine are obtained, otherwise only by consuming Racemat separation would be accessible.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.The invention will be more apparent from the following examples explained.

Zur Bestimmung der Hydroxamsäuren wurde dabei wie folgt vor­ gegangen:
Als zweizähnige Liganden bilden Hydroxamsäuren stabile, stark gefärbte Chelatkomplexe mit Eisen(III)-Ionen. Diese Trishydroxamatoeisen(III)-Komplexe [Fe(RCONHO)₃] haben ein Absorptionsmaximum bei 500 nm und erscheinen dem Auge tief dunkelrot gefärbt. Diese Eigenschaft wird zur qualitativen (Buckles, R.E. & C.J. Thelen, 1950. Qualitative determination of carboxylic esters. Scope and limitations of hydroxamic acid test. Anal. Chem. 22, 676-678) und quantita­ tiven (Brammar, W.J. & P.H. Clarke, 1964, Induction and repression of Pseudomonas aeruginosa amidase. J. Gen. Microbiol. 37, 307-319) Bestimmung von Hydroxamsäuren ge­ nutzt. Um den Eisenkomplex zu erhalten, mischt man eine hydroxamsäurehaltige Lösung mit einer salzsauren Eisen(III)chlorid-Lösung. Die Extinktion wird in einer Glas­ küvette bei 500 nm spektralphotometrisch bestimmt.To determine the hydroxamic acids, the procedure was as follows:
As bidentate ligands, hydroxamic acids form stable, highly colored chelate complexes with iron (III) ions. These Trishydroxamatoeisen (III) complexes [Fe (RCONHO) ₃] have an absorption maximum at 500 nm and appear deep dark red to the eye. This property is considered qualitative (Buckles, RE & CJ Thelen, 1950. Qualitative determination of carboxylic esters, Scope and limitations of hydroxamic acid test, Anal. Chem., 22, 676-678) and quantitative (Brammar, WJ & PH Clarke, 1964, Induction and repression of Pseudomonas aeruginosa amidase, J. Gen. Microbiol., 37, 307-319) uses determination of hydroxamic acids. To obtain the iron complex, mix a hydroxamic acid-containing solution with a hydrochloric acid iron (III) chloride solution. The extinction is determined spectrophotometrically in a glass cuvette at 500 nm.

Eisen(III)chlorid-Lösung (modifiziert nach Hoare, D.G., A. Olson & D.E. Koshland JR., 1968. The reaction of hydroxamic acids with water-soluble carbodiimides. A Lossen rearrangement J. Am. Chem. Soc. 90, 1638-1643):Iron (III) chloride solution (modified according to Hoare, D.G., A. Olson & D.E. Koshland JR., 1968. The reaction of hydroxamic acids with water-soluble carbodiimides. A Lossen rearrangement J. Am. Chem. Soc. 90, 1638-1643):

FeCl₃×6 H₂O: 13,51 g
konz. Salzsäure (12 M): 3,33 ml
H₂O: ad 500 mlFeCl₃ × 6 H₂O: 13.51 g
conc. Hydrochloric acid (12 M): 3.33 ml
H₂O: ad 500 ml

Die Lösung wurde durch ein Filter mit 0,45 µm Porengröße filtriert, um Trübungen zu entfernen. The solution was passed through a 0.45 μm pore size filter filtered to remove turbidity.  

Zu 300 µl einer hydroxamsäurehaltigen Probe [Hydroxamsäure, gelöst in Tris/HCl-Puffer (30 mM, pH 7,5) pipettierte man 600 µl der salzsauren Eisen(III)chlorid-Lösung. Es bildete sich sofort ein tiefrot gefärbte Eisenkomplex. Die Extink­ tion wurde spektralphotometrisch bestimmt. Eichgeraden wurden mit Acethydroxamsäure und 2-Phenylpropionhydroxam­ säure, gelöst in Tris/HCl-Puffer (30 mM, pH 7,5), gemessen. Diese zeigten eine lineare Abhängigkeit von Extinktion und Hydroxamatkonzentration im Bereich von 0,0 bis 1,5 mM Hydro­ xamsäure. Die molaren Extinktionskoeffizienten (ε_{λ max}500 nm) wurden für die Acethydroxamsäure zu 3500 lmol^-1 cm^-1, für Phenylacethydroxamsäure zu 3800 lmol^-1 cm^-1 und für die 2- Phenylpropionhydroxamsäure zu 4500 lmol^-1 cm^-1 bestimmt.To 300 ul of a hydroxamic acid-containing sample [hydroxamic acid, dissolved in Tris / HCl buffer (30 mM, pH 7.5) was pipetted 600 .mu.l of the hydrochloric acid iron (III) chloride solution. It immediately formed a deep red colored iron complex. The extinction was determined spectrophotometrically. Calibration lines were measured with acethydroxamic acid and 2-phenylpropionhydroxamic acid dissolved in Tris / HCl buffer (30 mM, pH 7.5). These showed a linear dependence of absorbance and hydroxamate concentration in the range of 0.0 to 1.5 mM hydroxamic acid. The molar extinction coefficients (ε _{λ max} 500 nm) were determined to be 3500 lmol ^-1 cm ^-1 for the acethydroxamic acid, 3800 lmol ^-1 cm ^-1 for phenylacethydroxamic acid and 4500 lmol ^-1 cm ^-1 for the 2-phenylpropionohydroxamic acid.

Enzymaktivitäten wurden sowohl mittels HPLC, als auch durch photometrische Methoden bestimmt. Die photometrischen Mes­ sungen erfolgten bei Raumtemperaturen in 1-ml-Glasküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm.Enzyme activities were determined both by HPLC and by determined photometric methods. The photometric mes Solutions were performed at room temperatures in 1 ml glass cuvettes with a layer thickness of 1 cm.

Die spezifische Aktivität wird in Enzymeinheiten pro mg Protein (U/mg) angegeben. Eine Unit ist die enzymatische Aktivität, die den Umsatz von 1 µmol Substrat bzw. die Bil­ dung von 1 µmol Produkt in einer Minute katalysiert.The specific activity is expressed in units of enzyme per mg Protein (U / mg) indicated. One unit is the enzymatic one Activity, the conversion of 1 .mu.mol substrate or the Bil catalysed 1 μmol product in one minute.

Beispiel 1example 1

Zellen von Rhodococcus erythropolis MP50 wurden in ammo­ niumfreiem Mineralmedium mit Succinat (10 mM) als Kohlen­ stoff- und Energiequelle, Ketoprofenamid (1 mM) als Stick­ stoffquelle und 3% Komplexmedium (NB) angezogen. Am Ende der exponentiellen Wachstumsphase wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in Tris/HCl-Puffer (30 mM, pH 7,5) einmal gewaschen und in demselben Puffer zu einer optischen Dichte (OD_{546 nm}) von 16,0 resuspendiert. In zwei 25 ml-Er­ lenmeyerkolben mit Schikanen wurden je 2,75 Tris/HCl-Puffer (30 mM, pH 7,5) vorgelegt und mit 54 mg Phenylacetamid (PAA) oder 23,6 mg Acetamid versetzt. Die Kolben wurden anschlie­ ßend bei 30°C in einem Schüttelwasserbad inkubiert, bis sich das PAA bzw. das Acetamid vollständig gelöst hatten. Dazu fügte man jeweils 1 ml einer frisch bereiteten und mit NaOH (10 M) frisch neutralisierten Hydroxylamin-Hydrochlorid-Lö­ sung (2 M) hinzu. Der Umsatz wurde durch Zugabe von je 0,25 ml der Zellsuspension gestartet. Das Gesamtvolumen be­ trug 4 ml. Die optische Dicht (OD_{546 nm}) im Versuch war 1,0. Der Ansatz enthielt 0,1 M Amid und 0,5 M Hydroxylamin. In Abständen von 2 min wurden je 0,3 ml der Zellsuspensionen entnommen und auf 600 µl einer salzsauren Eisen(III)chlorid- Lösung pipettiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand nochmals mit Eisen(III)chlorid- Lösung 1 zu 10 verdünnt. Die Extinktion wurde bei 500 nm gemessen und der Gehalt an Phenylacethydroxamsäure () bzw. Acethydroamsäure (⬩) mittels der jeweiligen Eichgeraden bestimmt (vgl. Fig. 1). Parallel dazu wurden entsprechende Ansätze ohne Ruhezellen inkubiert, um die Entstehung von Hydroxamsäure durch eine chemische Reaktion auszuschließen. Im Beobachtungszeitraum von 30 min war keine Hydroxam­ säurebildung in den Kontrollansätzen nachzuweisen.Cells of Rhodococcus erythropolis MP50 were grown in ammonium-free mineral medium with succinate (10 mM) as carbon and energy source, ketoprofenamide (1 mM) as nitrogen source and 3% complex medium (NB). At the end of the exponential growth phase, the cells were harvested by centrifugation, washed once in Tris / HCl buffer (30 mM, pH 7.5) and resuspended in the same buffer to an optical density (OD _{546 nm} ) of 16.0. 2.75 Tris / HCl buffer (30 mM, pH 7.5) were placed in each of two 25 ml Erlenmeyer flasks with baffles and admixed with 54 mg of phenylacetamide (PAA) or 23.6 mg of acetamide. The flasks were then incubated at 30 ° C in a shaking water bath until the PAA or acetamide had completely dissolved. To this was added in each case 1 ml of a freshly prepared and with NaOH (10 M) freshly neutralized hydroxylamine hydrochloride solution (2 M). The conversion was started by adding 0.25 ml each of the cell suspension. The total volume was 4 ml. The optical density (OD _{546 nm} ) in the experiment was 1.0. The mixture contained 0.1 M amide and 0.5 M hydroxylamine. 0.3 ml of the cell suspensions were removed at intervals of 2 min and pipetted onto 600 μl of a hydrochloric acid iron (III) chloride solution. The cells were removed by centrifugation and the supernatant diluted once more with ferric chloride solution 1 to 10. The extinction was measured at 500 nm and the content of Phenylacethydroxamsäure () or Acethydroamsäure (⬩) determined by means of the respective calibration line (see Fig. 1). At the same time, similar approaches without rest cells were incubated to exclude the formation of hydroxamic acid by a chemical reaction. During the observation period of 30 min, no hydroxamic acid formation was detectable in the control batches.

In einem weiteren Ansatz (4 ml Gesamtvolumen, OD_{546 nm} = 1,0) wurden Ruhezellen von Stamm MP50 mit PAA (100 mM) ohne Hydroxylamin inkubiert. Alle 5 min wurden 0,3 ml der Zell­ suspension entnommen, die Zellen durch Zentrifugation ent­ fernt und die Konzentration von Phenylessigsäure (∎) mit­ tels HPLC bestimmt.In another approach (4 ml total volume, OD _{546 nm} = 1.0) resting cells of strain MP50 were incubated with PAA (100 mM) without hydroxylamine. 0.3 ml of the cell suspension were taken every 5 min, the cells were removed by centrifugation and the concentration of phenylacetic acid (■) was determined by HPLC.

Wie sich Fig. 1 entnehmen läßt, zeigt Rhodococcus erythropolis MP50 mit Acetamid und Phenylacetamid (PAA) als Substrat in Gegenwart von Hydroxylamin Acyltransferase-Ak­ tivität, die deutlich höher liegt als die spezifische Akti­ vität der Zellen bei der Hydrolyse von PAA zur korrespon­ dierenden Carbonsäure.As can be seen Fig. 1, shows Rhodococcus erythropolis MP50 with acetamide and phenylacetamide (PAA) as a substrate in the presence of hydroxylamine acyltransferase activity Ak, which is significantly higher than the specific Akti tivity of the cells in the hydrolysis of PAA to korrespon dating carboxylic acid ,

Die spezifischen Aktivitäten betrugen für die Bildung von PES bzw. Phenylacethydroxamsäure 0,54 bzw. 7,83 U/mg Pro­ tein. Die Acethydroxamsäure wurde mit einer spezifischen Aktivität von 2,22 U/mg Protein gebildet.The specific activities were for the formation of PES or phenylacethydroxamic acid 0.54 and 7.83 U / mg Pro ton. The Acethydroxamsäure was with a specific Activity of 2.22 U / mg protein.

Beispiel 2Example 2

Nachdem Acyltransferase-Aktivität in ruhenden Zellen von Stamm MP50 in Beispiel 1 nachgewiesen werden konnte, wurden die Versuche mit Rohextrakten aus induzierten Zellen wieder­ holt. Es konnte ebenfalls in Gegenwart von Hydroxylamin Acyltransferase-Aktivität gegenüber PAA und Acetamid nachge­ wiesen werden (Fig. 2). Die enzymatische Hydrolyse von PAA zu PES erfolgte mit einer spezifischen Aktivität von 0,67 U/mg Protein. Die spezifischen Aktivitäten bei der Bildung von Phenylacethydroxamsäure bzw. Acethydroxamsäure waren 7,27 U/mg bzw. 7,80 U/mg Protein und damit um mehr als das Zehnfache höher als bei der Hydrolyse von PAA.After acyltransferase activity could be detected in resting cells of strain MP50 in Example 1, experiments were retrieved with crude extracts from induced cells. It was also shown to be active in the presence of hydroxylamine acyltransferase activity towards PAA and acetamide ( Figure 2). The enzymatic hydrolysis of PAA to PES was with a specific activity of 0.67 U / mg protein. The specific activities in the formation of phenylacethydroxamic acid and acethydroxamic acid were 7.27 U / mg and 7.80 U / mg protein, respectively, more than ten times higher than in the hydrolysis of PAA.

Experimentell wurde dabei wie folgt vorgegangen:
Zellen von Rhodococcus erythropolis MP50 wurden mit Keto­ profenamid (1 mM) als Stickstoffquelle angezogen und in der späten exponentiellen Phase geerntet. Aus ihnen wurde Roh­ extrakt bereitet. 10 µl des Rohextraktes (6,5 µg Protein) wurden mit 640 µl Tris/HCl-Puffer (30 mM, pH 7,5) in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß verdünnt und mit 250 µl einer frisch neutralisierten, wäßrigen Hydroxylaminhydrochlorid­ lösung (2 M) gemischt. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 100 µl einer methanolischen Phenylacetamid-Lösung (PAA, 50 mM) oder einer Lösung von Acetamid (50 mM) in Tris/HCl-Puf­ fer (30 mM, pH 7,5) gestartet und fand bei Raumtemperatur statt. Das Gesamtvolumen betrug 1 ml. Die Konzentrationen des Amids und des Hydroxylamins im Umsatz waren 5 mM und 0,5 M. Alle zwei Minuten wurden 100 µl des Ansatzes entnom­ men und mit 800 µl einer salzsauren Eisen(III)chlorid-Lösung gemischt. Die stark salzsaure Lösung denaturierte das Pro­ tein und beendete die enzymatische Reaktion. Ausgefälltes Protein wurde abzentrifugiert und die Extinktion des Über­ standes bei 500 nm spektralphotometrisch bestimmt. Die Be­ stimmung der Konzentration von Phenylacethydroxamsäure () bzw. Acethydroxamsäure (⬩) erfolgte mit entsprechenden Eichgeraden. Zur Bestimmung der Amidase-Aktivität wurden 10 µl Rohextrakt in 0,89 ml Tris/HCl-Puffer (30 mM, pH 7,5) verdünnt. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 100 µl metha­ nolischer PAA-Lösung gestartet. Das Gesamtvolumen betrug 1 ml und die PAA-Konzentration war 5 mM. In regelmäßigen Zeitabständen wurden je 100 µl des Reaktionsgemisches auf 10 µl 1 N HCl pipettiert, ausgefälltes Protein abzentrifu­ giert und die PES-Konzentration (∎) mittels HPLC bestimmt.Experimentally, the procedure was as follows:
Rhodococcus erythropolis MP50 cells were grown with keto-profenamide (1 mM) as a nitrogen source and harvested in the late exponential phase. From them, raw extract was prepared. 10 μl of the crude extract (6.5 μg protein) were diluted with 640 μl Tris / HCl buffer (30 mM, pH 7.5) in an Eppendorf reaction vessel and treated with 250 μl of a freshly neutralized, aqueous hydroxylamine hydrochloride solution (2 M). mixed. The reaction was started by adding 100 μl of a methanolic phenylacetamide solution (PAA, 50 mM) or a solution of acetamide (50 mM) in Tris / HCl buffer (30 mM, pH 7.5) and took place at room temperature , The total volume was 1 ml. The concentrations of the amide and the hydroxylamine in the reaction were 5 mM and 0.5 M. Every two minutes, 100 μl of the mixture were removed and mixed with 800 μl of a hydrochloric acid iron (III) chloride solution. The strongly hydrochloric acid solution denatured the protein and terminated the enzymatic reaction. Precipitated protein was centrifuged off and the extinction of the supernatant was determined by spectrophotometry at 500 nm. The determination of the concentration of phenylacethydroxamic acid () or acethydroxamic acid (⬩) was carried out using appropriate calibration lines. To determine the amidase activity, 10 μl crude extract was diluted in 0.89 ml Tris / HCl buffer (30 mM, pH 7.5). The reaction was started by adding 100 .mu.l metha nolischer PAA solution. The total volume was 1 ml and the PAA concentration was 5 mM. At regular intervals each 100 .mu.l of the reaction mixture was pipetted to 10 .mu.l of 1 N HCl, precipitated protein abzentrifu giert and the PES concentration (∎) determined by HPLC.

Beispiel 3Example 3

Eine Acyltransferase-Aktivität konnte in Ruhezellen und in Rohextrakt von Stamm MP50 nachgewiesen werden. Es blieb noch zu zeigen, ob tatsächlich die Amidase- und Acyltransferase- Aktivität von demselben Enzym herrührten. Die Hydroxamsäure­ bildung mit zur Homogenität gereinigter Amidase bewies, daß es sich bei Acyltransferase und Amidase um ein und dasselbe Enzym handelte (Tab. 1).An acyltransferase activity could be observed in resting cells and in Crude extract of strain MP50 can be detected. It still remained to show whether the amidase and acyltransferase Activity derived from the same enzyme. The hydroxamic acid Formation with amidase purified to homogeneity proved that Acyltransferase and amidase are one and the same Enzyme acted (Table 1).

Wie die nachstehende Tabelle 1 zeigt, war die Acyltrans­ ferase-Aktivität gegenüber 2-Phenylpropionamid rund dreimal so hoch wie die Amidase-Aktivität. Die Bildung von Acet­ hydroxamsäure verlief viermal so rasch wie die Verseifung zur Essigsäure und die Phenylacethydroxamsäure entstand sogar neunmal rascher als Phenylessigsäure. Die Amidase aus Stamm MP50 zeigte also durchweg bei der Hydroxamsäurebildung höhere spezifische Aktivitäten als bei der Hydrolyse der Amide zu den Carbonsäuren.As Table 1 below shows, the acyltrans ferase activity towards 2-phenylpropionamide around three times as high as the amidase activity. The formation of acet hydroxamic acid was four times as fast as saponification to acetic acid and the Phenylacethydroxamsäure arose even nine times faster than phenylacetic acid. The amidase off  Thus, strain MP50 was consistently involved in hydroxamic acid formation higher specific activities than in the hydrolysis of Amides to the carboxylic acids.

Tabelle 1 Table 1

Spezifische Aktivitäten bei der Bildung von Carbonsäuren und Hydroxamsäuren aus Carbonsäureamiden durch die gereinigte Amidase Specific activities in the formation of carboxylic acids and hydroxamic acids from carboxylic acid amides by the purified amidase

Zur Bestimmung der Acyltransferase-Aktivität wurden in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß 10 µl gereinigte Amidase (2,6 µg Protein) mit 0,64 ml Na-Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) verdünnt. Dazu wurden 0,25 ml einer frisch zubereiteten und mit Natronlauge neutralisierten Hydroxylaminhydrochloridlö­ sung (2 M) pipettiert. Der Umsatz wurde durch Zugabe von 0,1 ml einer methanolischen Stammlösung (50 mM) des jewei­ ligen Amids gestartet. Acetamid (50 mM) wurde in Na-Phos­ phatpuffer (10 mM, pH 7,5) gelöst und dann zugegeben. Das Gesamtvolumen betrug 1 ml. Die Konzentrationen von Hydroxyl­ amin und dem jeweiligen Amid waren 0,5 M bzw. 5 mM. In einem Zeitraum von 20 min wurden viermal je 0,1 ml des Reaktions­ gemischs auf 0,8 ml salzsaurer Eisen(III)chlorid-Lösung pi­ pettiert und die Extinktion des Hydroxamsäure-Komplexes photometrisch bei 500 nm gemessen. Die Konzentration der Hydroxamsäuren wurde über entsprechende Eichgeraden ermit­ telt.To determine the acyltransferase activity were in a Eppendorf reaction tube 10 μl of purified amidase (2.6 μg Protein) with 0.64 ml of Na phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) diluted. To this was added 0.25 ml of a freshly prepared and with sodium hydroxide neutralized Hydroxylaminhydrochloridlö solution (2 M). Sales were increased by addition of 0.1 ml of a methanolic stock solution (50 mM) of jewei started with lousy amide. Acetamide (50mM) was dissolved in Na-Phos phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) and then added. The Total volume was 1 ml. The concentrations of hydroxyl amine and the respective amide were 0.5 M and 5 mM, respectively. In one Period of 20 min were four times each 0.1 ml of the reaction  mixed to 0.8 ml of hydrochloric iron (III) chloride solution pi petted and the extinction of the hydroxamic acid complex measured photometrically at 500 nm. The concentration of Hydroxamic acids were obtained via appropriate calibration lines telt.

Zur Bestimmung der Amidase-Aktivität wurde dieselbe Protein­ menge in 0,89 ml Na-Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) verdünnt und dann mit dem jeweiligen Amid (5 mM) versetzt. Die Kon­ zentrationen der gebildeten Carbonsäuren wurden mittels HPLC gemessen. Beim Umsatz von Acetamid wurde die Menge an frei­ gesetztem Ammonium durch Indophenol-Methode bestimmt.The same protein was used to determine amidase activity diluted in 0.89 ml of Na phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) and then the respective amide (5 mM) was added. The Kon concentrations of the carboxylic acids formed were determined by HPLC measured. In the conversion of acetamide, the amount of free set ammonium determined by indophenol method.

Beispiel 4Example 4

Der Nachweis, daß die Acyltransferasen und insbesondere die aus Rhodococcus erythropolis MP50 gewonnene Acyltransferase als enantioselektiver Katalysator wirkt, wurde wie folgt geführt:
Als Modellsubstrat für die Untersuchungen wurde racemisches 2-Phenylpropionamid (2-PPA) gewählt. Das gereinigte Enzym wurde mit (R,S)-2-PAA (5 mM) in Gegenwart von Hydroxylamin (0,5 M) inkubiert. Die Hydroxamsäurebildung wurde dabei so­ wohl photometrisch als auch durch Ionenpaar-Chromatographie verfolgt.The demonstration that the acyltransferases and in particular the acyltransferase obtained from Rhodococcus erythropolis MP50 acts as an enantioselective catalyst was carried out as follows:
As a model substrate for the investigations, racemic 2-phenylpropionamide (2-PPA) was chosen. The purified enzyme was incubated with (R, S) -2-PAA (5 mM) in the presence of hydroxylamine (0.5 M). The formation of hydroxamic acid was monitored both photometrically and by ion-pair chromatography.

Die Versuche ergaben, daß sich die Hydroxamsäurebildung nach 50%igem Umsatz des Substrats drastisch verlangsamte (Fig. 3). Die Untersuchung der enzymatisch gebildeten 2-Phenyl­ propionhydroxamsäure (2-PPHS) mittels einer chiralen HPLC-Säule zeigte, daß bis zu einem Umsatz von 46% des Substrats nur ein Enantiomeres der Hydroxamsäure entstanden war. Die Bildung von 2-PPS war in Anwesenheit von Hydroxylamin nicht zu beobachten. Tatsächlich war die Amidase aus Stamm MP50 in der Lage, racemisches 2-PPA enantioselektiv zu 2-PPHS umzu­ setzen.The experiments showed that hydroxamic acid formation slowed dramatically after 50% conversion of the substrate ( Figure 3). Examination of the enzymatically formed 2-phenylpropionhydroxamic acid (2-PPHS) by means of a chiral HPLC column showed that only one enantiomer of the hydroxamic acid had been formed up to a conversion of 46% of the substrate. The formation of 2-PPS was not observed in the presence of hydroxylamine. In fact, the amidase from strain MP50 was able to convert racemic 2-PPA enantioselectively to 2-PPHS.

Die spezifische Aktivität zu Beginn der Umsetzung betrug 9,73 U/mg Protein für die Hydroxamsäurebildung und lag damit etwas unter dem maximal erreichten Wert von 13,02 U/mg (vgl. Tab. 1). Sehr deutlich war die ausgeprägte Abnahme der Ak­ tivität zu sehen, wenn 50% des racemischen Substrats um­ gesetzt waren.The specific activity at the beginning of the reaction was 9.73 U / mg protein for hydroxamic acid formation and was thus slightly below the maximum value of 13.02 U / mg (cf. Tab. 1). Very clear was the pronounced decrease of the Ak to see if 50% of the racemic substrate around were set.

Die Trennung der enzymatisch gebildeten Hydroxamsäure durch eine chirale HPLC-Säule zeigte, daß bis zu einem Umsatz von 46% nur ein Enantiomeres auftrat. Der Enantiomerenüberschuß lag also über 99%.The separation of enzymatically formed hydroxamic acid by a chiral HPLC column showed that to a conversion of 46% only one enantiomer occurred. The enantiomeric excess So it was over 99%.

Experimentell wurde dabei wie folgt vorgegangen:
10 µl gereinigte Amidase (2,6 µg Protein) wurden in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß in 0,64 ml Na-Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) verdünnt und dann bei Raumtemperatur mit 0,25 ml einer frisch bereiteten und neutralisierten Hydroxylaminchlorid-Lösung (2 M) 10 min lang inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 0,1 ml einer methanolischen Lösung von (R,S)-2-PPA (50 mM Stammlösung) gestartet. Das Gesamtvolumen betrug 1 ml. Die Konzentration von Hydroxyl­ amin war 0,5 M. Die Amidkonzentration betrug zu Beginn 5 mM. In regelmäßigen Zeitabständen wurden jeweils 50 µl des Reak­ tionsgemischs auf 5 µl 1 N HCl pipettiert Denaturiertes Protein wurde abzentrifugiert und die Amid- () bzw. Hydroxamsäurekonzentration (⚫) durch Ionenpaar-Chromat­ graphie bestimmt. Das Enantiomerenverhältnis (○) der 2-PPHS wurde mit einer chiralen HPLC-Säule (Chiral-HSA) untersucht. Dazu mußten 2-PPA und 2-PPHS vorher durch eine Grom-Sil 120 TMS-2CP-Fertigsäule getrennt werden. Experimentally, the procedure was as follows:
10 μl of purified amidase (2.6 μg protein) was diluted in an Eppendorf tube in 0.64 ml of Na phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) and then at room temperature with 0.25 ml of a freshly prepared and neutralized hydroxylamine chloride Solution (2 M) for 10 min. The reaction was started by adding 0.1 ml of a methanolic solution of (R, S) -2-PPA (50 mM stock solution). The total volume was 1 ml. The concentration of hydroxylamine was 0.5 M. The amide concentration was initially 5 mM. At regular intervals in each case 50 .mu.l of the reac tion mixture were pipetted to 5 .mu.l 1 N HCl denatured protein was centrifuged off and the amide () or hydroxamic acid concentration (⚫) determined by ion-pair chromatography. The enantiomeric ratio (○) of 2-PPHS was investigated with a chiral HPLC column (Chiral-HSA). For this, 2-PPA and 2-PPHS had to be previously separated by a Grom-Sil 120 TMS-2CP-finished column.

Beispiel 5Example 5

Zur Umsetzung der in Beispiel 4 hergestellten optisch reinen 2-Phenylpropionhydroxamsäure in das entsprechende ebenfalls optisch reine 1-Phenylethylamin wurde wie folgt vorgegangen:
Zur Entfernung des überschüssigen Hydroxylamins wurde das in Beispiel 4 erhaltene Reaktionsprodukt zunächst mit 1 N HCl angesäuert. Danach betrug der pH-Wert der Lösung etwa 0 bis 1. Durch das Ansäuern zersetzte sich das Hydroxylamin zu Ammonium und Distickstoffmonoxid. Diese Zersetzung wurde da­ durch gefördert, daß das Reaktionsgemisch für 10 min in einem Wasserbad bei 80°C gehalten wurde. Nach Beendigung der Gasentwicklung wurde der pH-Wert wieder mit Natronlauge auf etwa 5 eingestellt.The reaction of the optically pure 2-phenylpropionohydroxamic acid prepared in Example 4 in the corresponding likewise optically pure 1-phenylethylamine was carried out as follows:
To remove the excess hydroxylamine, the reaction product obtained in Example 4 was first acidified with 1N HCl. Thereafter, the pH of the solution was about 0 to 1. By acidification, the hydroxylamine decomposed to ammonium and nitrous oxide. This decomposition was promoted by that the reaction mixture was kept in a water bath at 80 ° C for 10 min. After completion of the evolution of gas, the pH was adjusted again to about 5 with sodium hydroxide solution.

Anschließend wurde die etwa 10fache Menge an 1-Ethyl-3-(3′- dimethylaminopropyl)carboiimid (EDC) - bezogen auf die 2- Phenylpropionhydroxamsäure - zugegeben.The approximately 10-fold amount of 1-ethyl-3- (3'- dimethylaminopropyl) carboiimide (EDC) - based on the 2- Phenylpropionhydroxamic acid - added.

Die Konzentration des gebildeten 1-Phenylethylamins wurde durch Ionenpaar-Chromatographie bestimmt und sein Enantio­ merenüberschuß mit Hilfe einer chiralen HPLC-Säule (Crownpak CR(+)) ermittelt.The concentration of the formed 1-phenylethylamine was determined by ion-pair chromatography and its enantio merenüberschuß using a chiral HPLC column (Crownpak CR (+)).

Beispiel 6Example 6

Mit denselben Reaktanten, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde eine Umsetzung durchgeführt, wobei jedoch für jeden Zeitpunkt, an dem die enzymatische Hydroxamsäurebildung ab­ gestoppt werden sollte, ein eigener Ansatz gestartet wurde. Dazu wurden 10 µl der gereinigten Amidase (1,7×10^-3 mg Protein) mit 315 µl Na-Phosphatpuffer (54 mM, pH 7,5) in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß verdünnt und mit 125 µl einer frisch bereiteten und neutralisierten Hydroxylaminhydrochlo­ rid-Lösung (2 M) inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µl einer methanolischen Lösung von 2-PPA (50 mM) gestartet. Das Gesamtvolumen jedes Ansatzes betrug 0,5 ml. Die Konzentrationen von 2-PAA und Hydroxylamin waren 5 mM und 0,5 M. Es wurden 10 identische Ansätze gestartet und in Abständen von jeweils 10 min durch die Zugabe von 50 µl 1 N HCl gestoppt. Ausgefälltes Protein wurde durch Zentrifugation entfernt und aus dem Ansatz wurden 50 µl für HPLC-Messungen zur Konzentrationsbestimmung von 2-PPA und 2-PPHS entnommen. Die verbliebenen 500 µl wurden zur Ver­ kochung des Hydroxylamins in einem Wasserbad 10 min lang auf 80°C erhitzt. Nach Abkühlen der Proben auf Raumtemperatur wurde der pH-Wert durch Zugabe von 29 µl 1 N NaOH auf 4,5 eingestellt. Dazu gab man 9,6 mg EDC (100 mM) und erhitzte erneut für eine Stunde auf 80°C. Die Konzentration des ge­ bildeten 1-Phenylethylamins wurde wie in Beispiel 3 durch Ionenpaar-Chromatographie bestimmt und sein Enantiomeren­ überschuß mit Hilfe einer chiralen HPLC-Säule (Crownpak CR(+)) ermittelt.With the same reactants as described in Example 5, a reaction was carried out, but for each time at which the enzymatic hydroxamic acid formation was stopped off, a separate approach was started. To this was diluted 10 μl of the purified amidase (1.7 × 10 ^-3 mg protein) with 315 μl Na phosphate buffer (54 mM, pH 7.5) in an Eppendorf tube and 125 μl of a freshly prepared and neutralized hydroxylamine hydrochloride Solution (2 M). The enzymatic reaction was started by adding 50 μl of a methanolic solution of 2-PPA (50 mM). The total volume of each batch was 0.5 ml. The concentrations of 2-PAA and hydroxylamine were 5 mM and 0.5 M. 10 identical batches were started and stopped at 10 minute intervals by the addition of 50 μl 1 N HCl , Precipitated protein was removed by centrifugation and 50 μl was taken from the batch for HPLC measurements to determine the concentration of 2-PPA and 2-PPHS. The remaining 500 .mu.l were heated to 80 ° C for 10 minutes to boil the hydroxylamine in a water bath. After cooling the samples to room temperature, the pH was adjusted to 4.5 by addition of 29 μl of 1 N NaOH. To this was added 9.6 mg of EDC (100 mM) and heated again to 80 ° C for one hour. The concentration of the 1-phenylethylamine formed was determined as in Example 3 by ion-pair chromatography and its enantiomeric excess determined using a chiral HPLC column (Crownpak CR (+)).

Beispiel 7Example 7

Zur Herstellung größerer Mengen an Hydroxamsäure wird zu­ nächst zur Gewinnung des enzymatisch aktiven Materials wie folgt vorgegangen:
Zunächst wird ein Kulturmedium für die Anzucht von Rhodo­ coccus erythropolis MP50 mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:To produce larger amounts of hydroxamic acid, the procedure for obtaining the enzymatically active material is as follows:
First, a culture medium for the cultivation of Rhodococcus erythropolis MP50 having the following composition is prepared:

NaHPO₄×12 H₂O|14,0 gNaHPO₄ × 12 H₂O | 14.0 g KH₂PO₄KH₂PO₄ 2,0 g2.0 g CaCl×2 H₂OCaCl × 2 H₂O 0,005 g0.005 g Fe(III)citrat×7 H₂OFe (III) citrate × 7 H₂O 0,02 g0.02 g MgSO₄×7 H₂OMgSO₄ × 7 H₂O 1,0 g 1.0 g   Spurenelementlösung SL6Trace element solution SL6 1,0 ml1.0 ml (nach Pfennig & Lipper, 1966) aber ohne EDTA und FeSO₄ @(after Pfennig & Lipper, 1966) but without EDTA and FeSO₄ @ Dinatriumsuccinatdisodium 1,62 g1.62 g Nutrient Broth-LösungNutrient broth solution 30 ml30 ml Phenylacetonitrilphenylacetonitrile 0,18 g0.18 g H₂OH₂O ad 1000 mlad 1000 ml

10 ml dieses Mediums wurden mit 0,1 ml einer Flüssigkultur von Rhodococcus erythropolis MP50 auf Nutrient Broth ange­ impft und über Nacht in einem Erlenmeyerkolben mit Schikanen bei 30°C auf einem Schüttler bei 150 U/min inkubiert. Diese Kultur diente zum Animpfen von 100 ml frischen Mediums in einem Erlenmeyerkolben mit Schikanen, der unter denselben Bedingungen bei 18 bis 24 h inkubiert wurde. Diese Kultur wiederum diente als Inokulum für 700 ml Kulturmedium in einem 3 l-Erlenmeyerkolben mit Kerben. Die Zellen wurden in der späten exponentiellen Wachstumsphase durch Zentrifu­ gation geerntet, verwendet oder bei -70°C schockgefroren und bei -25°C gelagert. Zellaufschluß, Gewinnung von Rohextrakt und Enzymreinigung erfolgt, wie in Journal of Bacteriology beschrieben. B. Hirrlinger, A. Stolz & H.-J. Knackmuss (1996) Purification and Properties of an Amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which Enantioselectively Hydrolyzes 2-Arylpropionamides, Journal of Bacteriology 178 (12), S. 3501-3507.10 ml of this medium was mixed with 0.1 ml of a liquid culture of Rhodococcus erythropolis MP50 on nutrient broth vaccinates and overnight in an Erlenmeyer flask with harassment incubated at 30 ° C on a shaker at 150 U / min. These Culture was used to inoculate 100 ml of fresh medium in an Erlenmeyer flask with harassment under it Conditions were incubated at 18 to 24 h. This culture in turn served as an inoculum for 700 ml of culture medium in a 3 liter Erlenmeyer flask with notches. The cells were in the late exponential growth phase through centrifuge harvested, used or flash-frozen at -70 ° C stored at -25 ° C. Cell disruption, recovery of crude extract and enzyme purification, as in Journal of Bacteriology described. B. Hirrlinger, A. Stolz & H.-J. Knackmuss (1996) Purification and Properties of an Amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which Enantioselectively Hydrolyzes 2-arylpropionamides, Journal of Bacteriology 178 (12), pp. 3501-3507.

Mit dem so gewonnenen enzymatisch aktiven Material wurde an­ schließend S-2-Phenylpropionhydroxamsäure wie folgt herge­ stellt:
125 U Acyltransferase wurden in Form ganzer Zellen, Roh­ extrakt oder gereinigtem Enzym mit 3,2 l Na-Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) in einer Weithals-Schottflasche mit 10 l Volumen mit Hilfe eines Magnetrührers vermischt. Dazu wurden 1,25 l einer frisch bereiteten und mit Natronlauge auf pH = 7 eingestellten wäßrigen Hydroxylamin-Hydrochlorid-Lösung (2 M) hinzugefügt und 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Die enzymatische Reaktion wurde durch die Zugabe von 3,725 g (0,025 mol) (R,S)-Phenylpropionamid (gelöst in 500 ml Metha­ nol) gestartet. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Ionen­ paar-Chromatographie verfolgt. Nach 120 min war der Umsatz der S-Enantiomeren des Amids zur korrespondierenden Hydro­ xamsäure beendet und die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt, bzw. der Rohextrakt oder das gereinigte Enzym durch Absenken des pH-Wertes mit Natronlauge auf 10 dena­ turiert und dann abzentrifugiert.With the enzymatically active material thus obtained, S-2-phenylpropionohydroxamic acid was subsequently prepared as follows:
125 U acyltransferase were mixed in the form of whole cells, crude extract or purified enzyme with 3.2 l Na phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) in a wide-mouth Schott flask with 10 l volume using a magnetic stirrer. To this was added 1.25 l of a freshly prepared aqueous sodium hydroxylamine solution (pH = 7) (2M) and stirred for 10 min at room temperature. The enzymatic reaction was started by the addition of 3.725 g (0.025 mol) of (R, S) -phenylpropionamide (dissolved in 500 ml of methanol). The course of the reaction was monitored by means of ion pair chromatography. After 120 min, the conversion of the S enantiomers of the amide to the corresponding hydroxamic acid had ended and the cells were removed by centrifugation, or the crude extract or the purified enzyme was titrated to 10 denatured by lowering the pH with sodium hydroxide solution and then centrifuged off.

Zur Trennung der enzymatisch gebildeten S-2-Phenylpropion­ hydroxamsäure von nicht umgesetztem R-2-Phenylpropionamid wurde das Amid durch Ausschütteln mit Essigsäureethylester oder Methylenchlorid aus der alkalischen wäßrigen Lösung ab­ getrennt. Die wäßrige Lösung wurde anschließend mit konz. HCl auf pH = 2 eingestellt und erneut mit Essigsäureethyl­ ester oder Methylenchlorid extrahiert. Nach Entfernen des organischen Lösungsmittels im Vakuum erhielt man 1,9 g (0,012 mol) S-2-Phenylpropionhydroxamsäure. Der Enantiome­ renüberschuß, der mittels Messungen mit einer chiralen HPLC-Säule bestimmt wurde war <99%For the separation of the enzymatically formed S-2-phenylpropion hydroxamic acid of unreacted R-2-phenylpropionamide The amide was extracted by shaking with ethyl acetate or methylene chloride from the alkaline aqueous solution separated. The aqueous solution was then treated with conc. HCl adjusted to pH = 2 and again with ethyl acetate ester or methylene chloride extracted. After removing the organic solvent in vacuo gave 1.9 g (0.012 mol) of S-2-phenylpropionohydroxamic acid. The enantiome renüberschuß, by means of measurements with a chiral HPLC column was determined <99%

Beispiel 8Example 8

Mit dem, wie in Beispiel 7 beschrieben, hergestellten en­ zymatisch aktiven Material wurde S-2-Phenylpropionhydroxam­ säure wie folgt hergestellt:
125 U Acyltransferase wurden in Form immobilisierter ganzer Zellen oder immoblisiertem gereinigtem Enzym mit 3,2 1 Na- Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) in einer Weithals-Schott­ flasche mit 10 l Volumen mit Hilfe eines Magnetrührers ver­ mischt. Dazu wurden 1,25 l einer frisch bereiteten und mit Natronlauge auf pH = 7 eingestellten wäßrigen Hydroxylamin- Hydrochlorid-Lösung (2 M) hinzugefügt und 10 min bei Raum­ temperatur gerührt. Die enzymatische Reaktion wurde durch die Zugabe von 3,725 g (0,025 mol) (R,S)-2-Phenylpropionamid (gelöst in 500 ml Methanol) gestartet. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Ionenpaar-Chromatographie verfolgt. Nach 120 min war der Umsatz des S-Enantiomeren des Amids zur korrespondierenden Hydroxamsäure beendet und die immobili­ sierten Zellen bzw. das immobilisierte Enzym wurden durch Filtration abgetrennt und für erneute Verwendung in Na-Phos­ phatpuffer (10 mM, pH 7,5) bei +4°C gelagert.With the enzymatically active material prepared as described in Example 7, S-2-phenylpropionhydroxamic acid was prepared as follows:
125 U acyltransferase were mixed in the form of immobilized whole cells or immoblisiertem purified enzyme with 3.2 1 Na phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) in a wide-mouth Schott bottle with 10 l volume using a magnetic stirrer ver mixed. To this was added 1.25 l of a freshly prepared aqueous sodium hydroxylamine hydrochloride solution (2M) adjusted to pH = 7 with sodium hydroxide solution and stirred at room temperature for 10 min. The enzymatic reaction was started by the addition of 3.725 g (0.025 mol) of (R, S) -2-phenylpropionamide (dissolved in 500 ml of methanol). The course of the reaction was monitored by ion-pair chromatography. After 120 min, the conversion of the S-enantiomer of the amide to the corresponding hydroxamic acid had ended and the immobilized cells or the immobilized enzyme were separated by filtration and re-used in Na phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) at + Stored at 4 ° C.

Zur Trennung der enzymatisch gebildeten S-2-Phenylpropion­ hydroxamsäure von nicht umgesetztem R-2-Phenylpropionamid wurde die wäßrige Lösung mit Natronlaufe auf pH = 10 ein­ gestellt und das Amid durch Ausschütteln mit Essigsäure­ ethylester oder Methylenchlorid aus der alkalischen wäßrigen Lösung abgetrennt. Die wäßrige Lösung wurde anschließend mit konz. HCl auf pH = 2 eingestellt und erneut mit Essigsäure­ ethylester oder Methylenchlorid extrahiert. Nach Entfernen des organischen Lösungsmittels im Vakuum erhielt man 1,9 g (0,012 mol) S-2-Phenylpropionhydroxamsäure. Der Enantio­ merenüberschuß, der mittels Messungen mit einer chiralen HPLC-Säule bestimmt wurde, war <99%.For the separation of the enzymatically formed S-2-phenylpropion hydroxamic acid of unreacted R-2-phenylpropionamide the aqueous solution with Natronlaufe to pH = 10 and the amide by shaking with acetic acid ethyl ester or methylene chloride from the alkaline aqueous Solution separated. The aqueous solution was then with conc. HCl adjusted to pH = 2 and again with acetic acid extracted ethyl ester or methylene chloride. After removal of the organic solvent in vacuo gave 1.9 g (0.012 mol) of S-2-phenylpropionohydroxamic acid. The Enantio merenüberschuß, by means of measurements with a chiral HPLC column was <99%.

Beispiel 9Example 9

Die nach den in den Beispielen 7 bis 9 beschriebenen Verfah­ ren gewonnenen enantiomerenreinen Hydroxamsäuren können nach O-Acylierung durch Erhitzen oder durch die Behandlung mit Basen in aprotischen Lösungsmitteln in das Isocyanat über­ führt werden. Nach Zugabe von Wasser bildet das Isocyanat eine instabile Carbaminsäure, die unter CO₂-Abgabe zum pri­ mären Amin weiterreagiert. Da die Lossen-Umlagerung unter Konfigurationserhalt am wandernden Kohlenstoffatom verläuft, erhält man als Produkt optisch aktive primäre Amine.The procedure described in Examples 7 to 9 obtained enantiomerically pure hydroxamic acids can after O-acylation by heating or by treatment with Bases in aprotic solvents in the isocyanate over be led. After addition of water, the isocyanate forms an unstable carbamic acid, which under CO₂ delivery to the pri continue to react amine. Since the Lossen rearrangement under  Configuration maintenance at the migrating carbon atom, the product obtained is optically active primary amines.

Beispiel 10Example 10

Zur Erzeugung chiraler primärer Amine ohne vorherige Isola­ tion der Hydroxamsäure wurde wie folgt vorgegangen:
125 U Acyltransferase wurden in Form ganzer Zellen, Roh­ extrakt oder gereinigtem Enzym mit 3,2 l Na-Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) in einer Weithals-Schottflasche mit 10 l Volumen mit Hilfe eines Magnetrührers vermischt. Dazu wurden 1,25 l einer frisch bereiteten und mit Natronlauge auf pH = 7 eingestellten wäßrigen Hydroxylamin-Hydrochlorid-Lösung (2 M) hinzugefügt und 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Die enzymatische Reaktion wurde durch die Zugabe von 3,725 g (0,025 mol) (R,S)-2-Phenylpropionamid (gelöst in 500 ml Methanol) gestartet. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Ionenpaar-Chromatographie verfolgt. Nach 120 min war der Um­ satz des S-Enantiomeren des Amids zur korrespondierenden Hydroxamsäure beendet und die Zellen wurden durch Zentri­ fugation entfernt, bzw. der Rohextrakt oder das gereinigte Enzym durch Ansäuern mit konz. HCl auf pH = 1 denaturiert und dann abzentrifugiert.To produce chiral primary amines without previous Isola tion of hydroxamic acid was as follows:
125 U acyltransferase were mixed in the form of whole cells, crude extract or purified enzyme with 3.2 l Na phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) in a wide-mouth Schott flask with 10 l volume using a magnetic stirrer. To this was added 1.25 l of a freshly prepared aqueous sodium hydroxylamine solution (pH = 7) (2M) and stirred for 10 min at room temperature. The enzymatic reaction was started by the addition of 3.725 g (0.025 mol) of (R, S) -2-phenylpropionamide (dissolved in 500 ml of methanol). The course of the reaction was monitored by ion-pair chromatography. After 120 min, the conversion of the S-enantiomer of the amide to the corresponding hydroxamic acid had ended and the cells were removed by centrifugation, or the crude extract or the purified enzyme was purified by acidification with conc. HCl denatured to pH = 1 and then centrifuged off.

Zur Entfernung des überschüssigen Hydroxylamins wurde die wäßrige Lösung unter Rühren für 30 min auf 80°C erwärmt. Danach war keine Gasentwicklung durch zerfallendes Hydroxyl­ amin mehr zu beobachten. Nach Abkühlen der Lösung auf Raum­ temperatur wurde ihr pH-Wert mit Natronlauge auf pH = 4,5 eingestellt. Zur Derivatisierung der Hydroxamsäure wurden 96 g (0, 62 mol) 1-Ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)carbodi­ imid (EDC) unter Rühren zu der wäßrigen Lösung gegeben und die Lösung danach unter Rühren für 2 h auf 80°C erhitzt. To remove the excess hydroxylamine, the heated aqueous solution with stirring for 30 min at 80 ° C. Thereafter, there was no evolution of gas by decomposing hydroxyl to watch more amin. After cooling the solution to room temperature, its pH was adjusted to pH = 4.5 with sodium hydroxide solution set. For the derivatization of hydroxamic acid were 96 g (0.62 mol) of 1-ethyl-3- (3'-dimethylaminopropyl) carbodi imide (EDC) with stirring to the aqueous solution and the solution is then heated with stirring for 2 h at 80 ° C.  

Zur Trennung des aus der enzymatischen Reaktion verbliebenen R-2-Phenylpropionamids von dem bei der Lossen-Umlagerung entstandenen S-1-Phenylethylamins wurde die wäßrige Lösung mit konz. HCl auf pH = 1 angesäuert und das Amid mit Essig­ säureethylester oder Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wurde danach mit Natronlauge auf pH = 10 ein­ gestellt und das Amin durch Ausschütteln mit Essigsäure­ ethylester oder Methylenchlorid isoliert. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erhielt man 1,2 g (0,096 mol) S-1-Phenylethylamin mit einem Enantiomerenüberschuß < 99%.For separation of remaining from the enzymatic reaction R-2-Phenylpropionamids from that in the Lossen rearrangement resulting S-1-phenylethylamine became the aqueous solution with conc. HCl acidified to pH = 1 and the amide with vinegar extracted with ethyl acetate or methylene chloride. The aqueous solution was then with sodium hydroxide solution to pH = 10 and the amine by shaking with acetic acid ethyl ester or methylene chloride isolated. After removing the Solvent in vacuo gave 1.2 g (0.096 mol) S-1-phenylethylamine with an enantiomeric excess <99%.

Beispiel 11Example 11

Analog zu der in Beispiel 10 beschriebenen Vorgehensweise wurde S-1-Phenylethylamin wie folgt ohne vorherige Isolation der entsprechenden Hydroxamsäure durch Lossen-Umlagerung wie folgt hergestellt:
125 U Acyltransferase wurden in Form immobilisierter ganzer Zellen oder immobilisiertem gereinigtem Enzym mit 3,2 l Na- Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) in einer Weithals-Schott­ flasche mit 10 l Volumen mit Hilfe eines Magnetrührers ver­ mischt. Dazu wurden 1,25 l einer frisch bereiteten und mit Natronlaufe auf pH = 7 eingestellten wäßrigen Hydroxylamin- Hydrochlorid-Lösung (2 M) hinzugefügt und 10 min bei Raum­ temperatur gerührt. Die enzymatische Reaktion wurde durch die Zugabe von 3,725 g (0,025 mol) (R,S)-2-Phenylpropionamid (gelöst in 500 ml Methanol) gestartet. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Ionenpaar-Chromatographie verfolgt. Nach 120 min war der Umsatz des S-Enantiomeren des Amids zur korrespondierenden Hydroxamsäure beendet und die immobili­ sierten Zellen bzw. das immobilisierte Enzym wurden durch Filtration abgetrennt und für erneute Verwendung in Na- Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) bei +4°C gelagert. Analogously to the procedure described in Example 10, S-1-phenylethylamine was prepared as follows without prior isolation of the corresponding hydroxamic acid by Lossen rearrangement as follows:
125 U of acyltransferase were mixed in the form of immobilized whole cells or immobilized purified enzyme with 3.2 l of Na phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) in a wide-mouth Schott bottle with 10 l volume using a magnetic stirrer ver. To this was added 1.25 l of a freshly prepared aqueous sodium hydroxylamine solution (pH = 7) (2M) and stirred at room temperature for 10 min. The enzymatic reaction was started by the addition of 3.725 g (0.025 mol) of (R, S) -2-phenylpropionamide (dissolved in 500 ml of methanol). The course of the reaction was monitored by ion-pair chromatography. After 120 min, the conversion of the S-enantiomer of the amide to the corresponding hydroxamic acid was complete and the immobilized cells or the immobilized enzyme were separated by filtration and re-used in Na phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) at +4 ° C stored.

Zur Entfernung des überschüssigen Hydroxylamins wurde die wäßrige Lösung mit konz. HCl auf pH = 1 eingestellt und unter Rühren für 30 min auf 80°C erwärmt. Danach war keine Gasentwicklung durch zerfallendes Hydroxylamin mehr zu be­ obachten. Nach Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur wurde ihr pH-Wert mit Natronlaufe auf pH = 4,5 eingestellt. Zur Derivatisierung der Hydroxamsäure wurden 96 g (0,62 mol) 1-Ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) unter Rühren zu der wäßrigen Lösung gegeben und die Lösung danach durch Rühren für 2 h auf 80°C erhitzt.To remove the excess hydroxylamine, the aqueous solution with conc. HCl adjusted to pH = 1 and heated to 80 ° C with stirring for 30 min. After that there was no Gas evolution by decomposing hydroxylamine more be obachten. After cooling the solution to room temperature their pH adjusted to pH = 4.5 with Natronlaufe. to Derivatization of hydroxamic acid was 96 g (0.62 mol) 1-Ethyl-3- (3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Stirring was added to the aqueous solution and the solution after heated by stirring for 2 h at 80 ° C.

Zur Trennung des aus der enzymatischen Reaktion verbliebenen R-2-Phenylpropionamids von dem bei der Lossen-Umlagerung entstandenen S-1-Phenylethylamins wurde die wäßrige Lösung mit konz. HCl auf pH = 1 angesäuert und das Amid mit Essig­ säureethylester oder Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wurde danach mit Natronlauge auf pH = 10 eingestellt und das Amin durch Ausschütteln mit Essigsäure­ ethylester oder Methylenchlorid isoliert. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erhielt man 1,2 g (0,096 mol) S-1-Phenylethylamin mit einem Enantiomerenüberschuß (99%.For separation of remaining from the enzymatic reaction R-2-Phenylpropionamids from that in the Lossen rearrangement resulting S-1-phenylethylamine became the aqueous solution with conc. HCl acidified to pH = 1 and the amide with vinegar extracted with ethyl acetate or methylene chloride. The aqueous solution was then with sodium hydroxide solution to pH = 10 Adjust the amine by shaking with acetic acid ethyl ester or methylene chloride isolated. After removing the Solvent in vacuo gave 1.2 g (0.096 mol) S-1-phenylethylamine with an enantiomeric excess (99%.

Claims (14)

1. Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Hydroxamsäuren der allgemeinen Formel worin R¹, R² und R³ verschieden sind und für einen cycli­ schen oder linearen, aliphatischen oder aromatischen, sub­ stituierten oder unsubstituierten Kohlenwasserstoffrest, der ggf. Hetereoatome enthalten kann, stehen, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man ein Racemat aus chiralen Amiden, Carbonsäureestern oder Carbonsäuren der allgemeinen Formel: worin R¹, R² und R³ wie oben definiert sind und X für -NH₂, -OR oder -OH steht, wobei R ein beliebiger organischer Rest ist,
mit Hydroxylamin NH₂OH in Gegenwart einer Acyltransferase umsetzt und anschließend die gebildete optisch aktive Hydro­ xamsäure (I) von dem nichtumgesetzten Enantiomeren der allgemeinen Formel (II) abtrennt. 1. A process for preparing optically active hydroxamic acids of the general formula wherein R¹, R² and R³ are different and represent a cyclic or linear, aliphatic or aromatic, sub-substituted or unsubstituted hydrocarbon radical which may optionally contain heteroatoms, characterized in that a racemate of chiral amides, carboxylic acid esters or carboxylic acids the general formula: wherein R¹, R² and R³ are as defined above and X is -NH₂, -OR or -OH, where R is any organic radical,
with hydroxylamine NH₂OH in the presence of an acyltransferase and then the resulting optically active hydroxamic acid (I) from the unreacted enantiomers of the general formula (II). 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Acyltransferase eine Acyl­ transferase aus den Mikroorganismen der Gruppe Mycobacteriaceae, Mycobacterum smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Arthrobacter, Aspergillus nidulans, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacterium sp. R312. Methylophilus methylotrophus, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus rhodochrous J1 und Rhodococcus erythropolis MP50 verwendet.2. The method according to claim 1, characterized marked records that acyltransferase is an acyl Transferase from the microorganisms of the group Mycobacteriaceae, Mycobacterum smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Arthrobacter, Aspergillus nidulans, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacterium sp. R312. Methylophilus methylotrophus, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus rhodochrous J1 and Rhodococcus erythropolis MP50 used. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Acetyltransferase die Acyl­ transferase aus Rhodococcus erythropolis MP50 verwendet.3. The method according to claim 2, characterized marked records that the acetyltransferase is the acyl transferase from Rhodococcus erythropolis MP50 used. 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Acyltransferase in Form eines Rohextrakts aus den Mikroorganismen einsetzt.4. The method according to claim 2 or 3, characterized marked records that the acyltransferase in the form a crude extract from the microorganisms. 5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Acyltransferase in gereinig­ ter Form einsetzt.5. The method according to claim 2 or 3, characterized gekenn records that the acyltransferase is purified ter form. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegen­ wart eines Puffers bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 durch­ führt.6. Process according to claims 1 to 5, characterized ge indicates that the reaction in counter wait for a buffer at a pH of 6.5 to 7.5 leads. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die Reste R¹, R² und R³ aus der Gruppe, bestehend aus Methyl, Ethyl, n-Propyl, i- Propyl, n-Butyl, i-Butyl, t-Butyl, n-Pentyl, Cyclohexyl, Phenyl, t-Butoxyphenyl, Naphthyl, 3-Benzoylphenyl, Amino, Hydroxy, auswählt. 7. Process according to claims 1 to 6, characterized ge indicates that the radicals R¹, R² and R³ from the group consisting of methyl, ethyl, n-propyl, i- Propyl, n-butyl, i-butyl, t-butyl, n-pentyl, cyclohexyl, Phenyl, t-butoxyphenyl, naphthyl, 3-benzoylphenyl, amino, Hydroxy, selects.   8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Verbindung der Formel (I) Alkylaminopropionsäure, p-Butoxyphenylessigsäure, 2- Phenylpropionsäure, 2-Methylbutansäure, 2-(1-Naphthyl)- propionsäure, 2-(6-Methoxy-2-naphthyl)propionsäure (Naproxen), 2-(3′-Benzoylphenyl)propionsäure (Ketoprofen) und deren Ester oder Amide verwendet.8. The method according to claim 7, characterized characterized in that, as the compound of the formula (I) Alkylaminopropionic acid, p-butoxyphenylacetic acid, 2- Phenylpropionic acid, 2-methylbutanoic acid, 2- (1-naphthyl) - Propionic acid, 2- (6-methoxy-2-naphthyl) propionic acid (Naproxen), 2- (3'-benzoylphenyl) propionic acid (ketoprofen) and their esters or amides used. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel (I) ein Amid verwendet.9. Process according to claims 1 to 8, characterized ge indicates that as a compound of general formula (I) uses an amide. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit der 2- bis 10fachen Menge, vorzugsweise der 5fachen Menge, an Hydroxylamin bei einer Acyltransferaseaktivität von 3000 bis 5000 Units pro mol Substrat, vorzugsweise von 5000 Units pro mol Substrat, umsetzt.10. The method according to claims 1 to 9, characterized ge indicates that the connection of the general formula (I) with 2 to 10 times the amount preferably 5 times the amount of hydroxylamine at a Acyltransferase activity of 3000 to 5000 units per mole Substrate, preferably of 5000 units per mole of substrate, implements. 11. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven primären Aminen der allgemeinen Formel: worin R¹, R² und R³ wie in Anspruch 1 definiert sind, da­ durch gekennzeichnet, daß man die bei dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10 erhaltene optisch aktive Hydroxamsäure der allgemeinen Formel (I) O-acyliert und die O-acylierte Hydroxamsäure durch Erhitzen oder durch die Behandlung mit Basen in aprotischen Lösungsmitteln zum entsprechenden Isocyanat umsetzt und das Isocyanat mit Wasser unter Abspaltung von CO₂ zum Amin der allgemeinen Formel (III) reagieren läßt.11. Process for the preparation of optically active primary amines of the general formula: in which R¹, R² and R³ are as defined in claim 1, characterized in that the optically active hydroxamic acid of the general formula (I) obtained in the process according to claims 1 to 10 is O-acylated and the O-acylated hydroxamic acid is obtained by heating or by the treatment with bases in aprotic solvents to the corresponding isocyanate and the isocyanate react with water with elimination of CO₂ to the amine of the general formula (III). 12. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven primären Aminen der allgemeinen Formel: worin R¹, R² und R³ wie in Anspruch 1 definiert sind, da­ durch gekennzeichnet, daß man die bei dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10 erhaltene optisch aktive Hydroxamsäure der allgemeinen Formel (I) vor ihrer Abtrennung von dem nichtumgesetzten Enantiomeren der all­ gemeinen Formel (II) mit einem Carbodiimid der allgemeinen FormelR₄-N=C=N-R₅ (IV)worin R₄ für Benzyl, Cyclohexyl oder Ethyl und R₅ Dimethyl­ aminopropyl oder Morpholinoethyl stehen, umsetzt und an­ schließend das gebildete optisch aktive primäre Amin der allgemeinen Formel (III) von dem nichtumgesetzten Enantio­ meren der allgemeinen Formel (II) abtrennt.12. Process for the preparation of optically active primary amines of the general formula: wherein R¹, R² and R³ are as defined in claim 1, characterized in that the optically active hydroxamic acid of the general formula (I) obtained in the process according to claims 1 to 10 before separating them from the unreacted enantiomer of the general formula (II) with a carbodiimide of the general formula R₄-N = C = N-R₅ (IV) in which R₄ is benzyl, cyclohexyl or ethyl and R₅ dimethyl aminopropyl or morpholinoethyl, and then reacting the resulting optically active primary amine of the general formula ( III) from the unreacted Enantio mers of the general formula (II). 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man das die optisch aktive Hydroxam­ säure (I) und das nichtumgesetzte Enantiomere (II) enthal­ tende Reaktionsgemisch vor seiner Umsetzung mit dem Carbo­ diimid auf einen pH-Wert von 0 bis 2, vorzugsweise auf einen pH-Wert von 1, ansäuert, das Reaktionsgemisch anschließend auf eine Temperatur von 40°C bis 100°C, vorzugsweise 80°C, erhitzt und die Umsetzung mit dem Carbodiimid nachfolgend bei einem pH-Wert von 4 bis 6, vorzugsweise einem pH-Wert von 5,0, durchführt.13. The method according to claim 12, characterized marked records that one the optically active hydroxam acid (I) and the unreacted enantiomer (II) tende reaction mixture before its implementation with the Carbo diimide to a pH of 0 to 2, preferably one pH of 1, acidified, the reaction mixture then to a temperature of 40 ° C to 100 ° C, preferably 80 ° C, heated and the reaction with the carbodiimide below  at a pH of 4 to 6, preferably a pH of 5.0. 14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man als Carbodiimid 1-Ethyl- 3-(3′-dimethylaminopropyl)carbodiimid verwendet.14. The method according to claim 12 or 13, characterized ge indicates that the carbodiimide is 1-ethyl 3- (3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide used.