DE19631020C2 - Method for the quantitative determination of protein - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein, bei dem das Protein auf ein Zellulosederivat aufgebracht und mit Amidoschwarz gefärbt wird, dann der überschüssige Farbstoff entfernt wird, der an Protein gebundene Farbstoff danach gelöst wird und anschließend spektrophotometrisch quantitativ bestimmt wird, wobei das Protein auf Zelluloseacetat als Träger aufgebracht wird und nach der Einfärbung mit Amidoschwarz Zelluloseacetat und daran gebundenes gefärbtes Protein in einer Auflöselösung aufgelöst werden und dann die spektrophotometrische Bestimmung erfolgt.The present invention relates to a method for quantitative determination of protein where the protein is based on a cellulose derivative applied and stained with amido black then the excess dye that is attached to it is removed Protein-bound dye is then dissolved and is then determined quantitatively by spectrophotometry, the protein being applied to cellulose acetate as a carrier and after staining with amido black cellulose acetate and bound colored protein in a dissolution solution be resolved and then the spectrophotometric Determination takes place.

Aus "Chemical Abstracts", Vol. 92, 1980, Abstract-Nr.: 54505 m ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein der eingangs genannten Art bekannt, bei dem Zelluloseacetat und daran gebundenes Protein in einer Auflöselösung aus einem organischen Lösungsmittel, z. B. Dioxan aufgelöst werden.From "Chemical Abstracts", Vol. 92, 1980, abstract no .: 54505 m is a method for the quantitative determination of protein known of the type mentioned in the cellulose acetate and bound protein in a dissolution solution from one organic solvents, e.g. B. dioxane.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein verbessertes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein der eingangs genannten Gattung zur Verfügung zu stellen, das die Bestimmung des Proteingehalts mit hoher Empfindlichkeit auch bei Anwesenheit von Pufferlösungen, hohen Salzkonzentrationen, Detergenzien oder dergleichen ermöglicht.The object of the present invention is a improved method for the quantitative determination of Protein of the type mentioned at the beginning make the determination of the protein content with high Sensitivity even in the presence of buffer solutions, high salt concentrations, detergents or the like enables.

Die Lösung dieser Aufgabe liefert ein erfindungsgemäßes Verfahren der eingangs genannten Art, bei dem man eine saure Auflöselösung verwendet, die Ameisensäure und/oder Eisessig und/oder Trichloressigsäure enthält und somit stark sauer ist.A solution according to the invention provides this object Process of the type mentioned, in which an acid Dissolving solution uses formic acid and / or glacial acetic acid and / or trichloroacetic acid and therefore strongly acidic is.

Quantifizierungen von beliebigen, spezifischen biochemischen Signalen (z. B. Antigen-Antikörper-Reaktionen, Enzymaktivitäten oder der Einbau von radioaktiven Substanzen) sind zentrale Aufgabenstellungen in der biochemischen und zellbiologischen Forschung. Zwar stehen hochempfindliche Methoden (z. B. die verstärkte Chemoluminiszenz, Radioimmunoassay, ELISA) zur Erfassung selbst niedrigster solcher Signale zur Verfügung, doch krankt die Auswertung solcher Messungen, die etwa auf Western Blots, in Gewebehomogenaten, -schnitten oder an Zellkulturen vorgenommen wurden, an der ungenügend genauen Bestimmbarkeit des Gesamtproteingehalts der jeweiligen Probe. Daher ist eine Methode von allgemeinem und besonderem Interesse, die die exakte Quantifizierung des Gesamtproteins auch in oben genannten Fällen erlaubt und darüberhinaus ein möglichst geringes Probenvolumen erfordert.Quantifications of any specific biochemical Signals (e.g. antigen-antibody reactions, Enzyme activities or the incorporation of radioactive substances) are central tasks in biochemical and cell biological research. There are highly sensitive ones Methods (e.g. enhanced chemiluminescence,  Radioimmunoassay, ELISA) to detect even the lowest such signals are available, but the evaluation is ill such measurements, for example on Western blots, in Tissue homogenates, sections or on cell cultures were made on the insufficiently precise determinability the total protein content of the respective sample. Hence one Method of general and special interest which the exact quantification of the total protein also in above mentioned cases allowed and also a possible small sample volume required.

Die klassischen, weit verbreiteten Verfahren zur Proteinbestimmung, wie etwa die Methode nach Lowry, beschrieben in Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951), J. Biol. Chem. 193, S. 265 bis 275, oder das Biuret-Verfahren, beschrieben in Weichselbaum, T. E. (1946), Amer. J. Clin. Path. 10, S. 40, sowie deren Modifikationen sind nur auf echte Lösungen anwendbar und haben ausnahmslos den Nachteil, da sie mit bestimmten Pufferlösungen, hohen Salzkonzentrationen oder der Anwesenheit von Detergenzien nicht kompatibel sind. Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, wird daher oftmals ein Fällungsschritt eingeschaltet, der jedoch insbesondere in verdünnten Lösungen oft nicht quantitativ oder nicht reproduzierbar verläuft. Erst recht versagen die klassischen Verfahren, wenn das zu bestimmende Protein in Form von Aggregaten, ganzen Zellen oder an Festkörperoberflächen gebunden beziehungsweise adsorbiert vorliegt. In solchen Fällen gestaltet sich die genaue Proteinquantifizierung sehr kompliziert, und die tatsächliche Menge an Protein kann oft nur grob abgeschätzt werden.The classic, widely used procedures for Protein determination, such as the Lowry method, described in Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., and Randall, R.J. (1951), J. Biol. Chem. 193, pp. 265 to 275, or the biuret method, described in Weichselbaum, T. E. (1946), Amer. J. Clin. Path. 10, p. 40, and their Modifications are only applicable to real solutions and have the disadvantage, without exception, since they work with certain Buffer solutions, high salt concentrations or the Presence of detergents are not compatible. Around Avoiding difficulties is therefore often a problem Precipitation step switched on, but especially in diluted solutions often not quantitative or not is reproducible. The classic ones fail even more Procedure when the protein to be determined is in the form of  Aggregates, whole cells or on solid surfaces bound or adsorbed is present. In such In some cases, the exact protein quantification is very good complicated, and the actual amount of protein can often can only be roughly estimated.

Ein Verfahren, bei dem Protein auf einen papierartigen Träger aufgetropft und mit Amidoschwarz 10B angefärbt wird, gefolgt von Elution und photometrischer Bestimmung des Farbstoffes, wurde bereits vor über 30 Jahren von Heinzel in Heinzel, W., Vogt, A., Kallee, E., and Faller, W. (1965), J. Lab. Clin. Med. 66, S. 334 bis 343 publiziert, ohne jedoch zu nennenswerter Verbreitung zu gelangen. Erst seit den Veröffentlichungen von Schaffner und Weissman in Schaffner, W., and Weissmann, C. (1973), Anal. Biochem. 56, S. 502 bis 514 sowie Henkel und Bieger in Henkel, A. W., and Bieger, S. (1994), Anal. Biochem. 223, S. 329 bis 331 wurde ein hierauf basierendes Verfahren etwas bekannter, da Detergenzien, wie z. B. SDS, nicht störend in Erscheinung traten. Sportsman und Elder schlugen außerdem in Sportsman, J. R. and Elder, J. H. (1984), Anal. Biochem. 139, S. 298 bis 300 vor, die photometrische Bestimmung durch den Gebrauch eines Laser-Gel­ scanners zu ersetzen, aber ein solches Gerät dürfte nicht in jedem Labor verfügbar sein.A method in which protein is dropped onto a paper-like support and stained with amido black 10 B, followed by elution and photometric determination of the dye, was already over 30 years ago by Heinzel in Heinzel, W., Vogt, A., Kallee, E ., and Faller, W. (1965), J. Lab. Clin. Med. 66, pp. 334 to 343 published, without, however, achieving any noteworthy dissemination. Only since the publications of Schaffner and Weissman in Schaffner, W., and Weissmann, C. (1973), Anal. Biochem. 56, pp. 502 to 514 and Henkel and Bieger in Henkel, AW, and Bieger, S. (1994), Anal. Biochem. 223, pp. 329 to 331, a method based on this became somewhat better known, since detergents, such as. B. SDS, did not appear disruptive. Sportsman and Elder also suggested in Sportsman, JR and Elder, JH (1984), Anal. Biochem. 139, pp. 298 to 300 propose to replace the photometric determination with the use of a laser gel scanner, but such a device should not be available in every laboratory.

Die vorliegende Erfindung liefert ein modifiziertes und in wesentlichen Punkten verbessertes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Proteinen mittels Amidoschwarz. Mit diesem Verfahren kann das Gesamtprotein - vorliegend als gelöstes Protein, als Proteinkomplex, in Form ganzer Zellen und sogar in Gewebeschnitten - quantitativ und mit hoher Empfindlichkeit bestimmt werden. Ein weiterer entscheidender Vorteil besteht darin, daß mittels unseres Verfahrens die quantitative Bestimmbarkeit von Protein möglich ist, welches an Festkörperoberflächen/Biomaterialien fixiert ist (wiederum gelöst, als Komplex, in Zellen oder in Gewebeschnitten). Darüberhinaus kann die Proteinmenge in allen den genannten Formen auch in Gegenwart von Detergenzien oder hohen Salzkonzentrationen bestimmt werden. Wir halten das Verfahren aufgrund seiner Einfachheit in jedem Labor für durchführbar, in dem Proteinbestimmungen zur täglichen Routine gehören, insbesondere, da in Fällen wie den angeführten die bereits genannten Schwierigkeiten auftreten.The present invention provides a modified and in essential points improved method for quantitative Determination of proteins using amido black. With this The whole protein can be processed - in the present case as a dissolved Protein, as a protein complex, in the form of whole cells and even in tissue sections - quantitative and with high Sensitivity can be determined. Another crucial one The advantage is that by means of our process the quantitative determinability of protein is possible, which is fixed to solid surfaces / biomaterials (again dissolved, as a complex, in cells or in tissue sections). In addition, the amount of protein in all of the above Forms also in the presence of detergents or high  Salt concentrations are determined. We keep the procedure because of its simplicity, feasible in any laboratory, where protein determinations are part of the daily routine, especially since in cases like the ones already mentioned difficulties mentioned occur.

Die Adsorption von Amidoschwarz 10B an ein Protein ist eine stöchiometrische Funktion der in dem jeweiligen Protein vorhandenen und auf seiner Oberfläche zugänglichen freien Aminogruppen. Von den Erfindern wurde nun untersucht, ob die Bestimmung von gebundenem Amidoschwarz sowohl unter extremen Salz- oder Detergenz-Konzentrationen als auch unabhängig vom physikalischen Zustand des jeweiligen Proteins (gelöst, suspendiert, in Membranen oder ganzen Geweben) möglich ist.The adsorption of amido black 10B to a protein is one stoichiometric function of that in the respective protein existing and accessible on its surface free Amino groups. The inventors have now investigated whether the Determination of bound amido black under both extreme Salt or detergent concentrations as well regardless of physical state of the respective protein (dissolved, suspended, in membranes or whole tissues) is possible.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Färbung der proteinhaltigen Probe mit Amidoschwarz, gefolgt von der Extraktion des Farbstoffes in saurer Lösung und dessen anschließender photometrischer Bestimmung. Die Lösung oder die Suspension werden auf Zelluloseacetat aufgebracht und dort mit Amidoschwarz gefärbt. Nach der Entfernung des überschüssigen Farbstoffes wird der gebundene Farbstoff in einer geeigneten Auflöselösung wieder abgelöst. In der Mikroversion erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Photometers die gleichzeitige Bestimmung einer großen Anzahl verschiedener Proben, wobei lediglich 1-2 µl pro Probe erforderlich sind. Mit geringfügigen Modifikationen eignet sich diese Methode auch für solche Proben (Proteine, Zellen, Gewebe), die an Festkörperoberflächen immobilisiert oder adsorbiert sind.The method according to the invention is based on the coloring of the protein-containing sample with amido black, followed by the Extraction of the dye in acid solution and its subsequent photometric determination. The solution or the suspension is applied to cellulose acetate and dyed there with amido black. After removing the excess dye becomes the bound dye in a suitable dissolving solution. In the Microversion allows the method according to the invention under Using a commercial ELISA photometer simultaneous determination of a large number of different Samples, requiring only 1-2 µl per sample. With minor modifications, this method is suitable also for those samples (proteins, cells, tissues) that are Solid surfaces are immobilized or adsorbed.

Als Ergebnis ist zunächst festzuhalten, daß in allen untersuchten Fällen und für alle untersuchten Proben eine lineare Konzentrationsabhängigkeit zwischen eingesetztem Protein und gemessener Extinktion erhalten wurde (r² = 0,950- 0,999). As a result, it should first be noted that in all the cases examined and for all the samples examined, a linear concentration dependency between the protein used and the measured absorbance was obtained (r ² = 0.950-0.999).

Hieraus folgern wir, daß das vorliegende Verfahren es ermöglicht, Proteine (freigesetzt, in Zellfragmenten oder in Gewebeschnitten) sowohl in gelöster als auch in physikalisch ungelöster Form, und zwar in chemisch verschieden zusammengesetzten Lösungen oder in immobilisierter/adsorbierter Form, zu bestimmen. Das Verfahren ist hochempfindlich, einfach in der Durchführung und erfordert keine spezielle Ausrüstung, so daß es in jedem herkömmlich ausgestatteten Labor durchgeführt werden kann.From this we conclude that the present method is enables proteins (released, in cell fragments or in Tissue sections) both in dissolved and in physical undissolved form, in chemically different ways composite solutions or in immobilized / adsorbed form. The The process is highly sensitive and easy to carry out and does not require any special equipment, so it is in everyone conventionally equipped laboratory can be carried out.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es sehr einfach und schnell möglich, bei hoher Sensitivität und unter allen getesteten Bedingungen den Proteingehalt von biologischen Proben quantitativ zu bestimmen. Zudem ist der Test einfach in der Durchführung und erfordert außer einem einfachen Photometer (bzw. im Falle der Mikromethode einem ELISA-Pho­ tometer) keinen besonderen apparativen Aufwand. Beide Geräte stehen normalerweise in jedem Labor zur Verfügung.With the method according to the invention it is very simple and quickly possible, with high sensitivity and among all tested conditions the protein content of biological Determine samples quantitatively. The test is also easy in implementation and requires a simple one Photometer (or in the case of the micro method an ELISA-Pho tometer) no special equipment. Both Devices are usually available in every laboratory.

A) MakromethodeA) Macro method

Die Durchführbarkeit dieser Methode ist unabhängig davon, ob die Probe in physikalischem Sinne echt gelöst ist oder als Aggregat bis hin zu ganzen Zellen vorliegt. Zwischen 5 und 50 µl der Probe werden auf Zelluloseacetat aufgetropft, welche frei in einem Filterhalter hängt (hierzu siehe Fig. 1) oder alternativ dazu in Multi-Well-Schalen eingelegt wird, und anschließend luftgetrocknet. Die Proteine werden 10 Minuten mit einer Amidoschwarz-Lösung angefärbt, die Folie wird hierzu mit der Lösung inkubiert. Die Färbelösung (I_stain) besteht aus:
The feasibility of this method is independent of whether the sample is genuinely dissolved in the physical sense or is available as an aggregate up to whole cells. Between 5 and 50 μl of the sample are dropped onto cellulose acetate, which hangs freely in a filter holder (see FIG. 1 for this) or alternatively is placed in multi-well dishes, and then air-dried. The proteins are stained with an amido black solution for 10 minutes, for this purpose the film is incubated with the solution. The staining solution (I _stain ) consists of:

• - 0,5% (w/v) Amidoschwarz 10B- 0.5% (w / v) amido black 10B
• - 45% (v/v) Methanol- 45% (v / v) methanol
• - 45% (v/v) Wasser- 45% (v / v) water
• - 10% (v/v) Eisessig- 10% (v / v) glacial acetic acid

Nach der Färbung wird die Zelluloseacetatfolie 3 mal für jeweils 5 Minuten in der folgenden Lösung (I_wash) gewaschen:
After staining, the cellulose acetate film is washed 3 times for 5 minutes each in the following solution (I _wash ):

• - 47,5% (v/v) Methanol- 47.5% (v / v) methanol
• - 47,5% (v/v) Wasser- 47.5% (v / v) water
• - 5% (v/v) Eisessig- 5% (v / v) glacial acetic acid

Die Zelluloseacetatfolie wird anschließend wieder getrocknet, die den einzelnen Proben entsprechenden Streifen ausgeschnitten (dieser Schritt ist in Multi-Well-Schalen nicht nötig) und in 0,500-5,0 ml (je nach Probe frei wählbar) einer Auflöselösung für 15 Minuten bei 50°C oder auch bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter Schütteln solubilisiert. Die Auflöselösung (I_diss) besteht aus:The cellulose acetate film is then dried again, the strips corresponding to the individual samples are cut out (this step is not necessary in multi-well dishes) and in 0.500-5.0 ml (freely selectable depending on the sample) of a dissolving solution for 15 minutes at 50 ° C or solubilized at room temperature for 30 minutes with shaking. The dissolution solution (I _diss ) consists of:

• - 80% (v/v)Ameisensäure- 80% (v / v) formic acid
• - 10% (v/v) Eisessig- 10% (v / v) glacial acetic acid
• - 10% (w/v) Trichloressigsäure- 10% (w / v) trichloroacetic acid

Hierbei wird die gesamte Zelluloseacetatfolie einschließlich des noch gebundenen Farbstoffes aufgelöst und die Extinktion der resultierenden Lösung bei 620 nm (bzw. 670, vgl. Spektrum in Fig. 2) gegen den Reagenzien-Leerwert gemessen.Here, the entire cellulose acetate film, including the still bound dye, is dissolved and the extinction of the resulting solution at 620 nm (or 670, see spectrum in FIG. 2) is measured against the reagent blank.

B) MikromethodeB) Micro method

Die obengenannte Methode kann ebenfalls für Proteinbestimmungen auf Mikrotiterplatten (96-Well) angewendet werden, wobei die Messung in diesem Fall mit Hilfe eines ELISA-Photometers erfolgt.The above method can also be used for Protein determinations on microtiter plates (96-well) be applied, the measurement in this case using an ELISA photometer.

Hierzu werden runde Zelluloseacetatstücke (5,5 mm Durchmesser) in die einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatte(n) eingelegt und jeweils 1-2 µl der Probe aufgetropft. Alle nachfolgenden Schritte erfolgen wie bei der Makromethode, werden jedoch direkt in der Mikrotiterplatte durchgeführt. Alle Schritte können in diesem Fall auch maschinell mit Hilfe eines automatischen ELISA-Prozessors durchgeführt werden. Dies eröffnet die Möglichkeit, große Probenzahlen automatisch zu erfassen.Round cellulose acetate pieces (5.5 mm Diameter) in the individual wells of the Microtiter plate (s) inserted and 1-2 µl of the sample dripped on. All subsequent steps are the same as for the Macro method, however, are directly in the microtiter plate carried out. In this case, all steps can also be done  mechanically with the help of an automatic ELISA processor be performed. This opens up great opportunities Automatically record sample numbers.

Kurzbeschreibung der beiliegenden ZeichnungenBrief description of the attached drawings

Fig. 1 ist eine schematische Seitenansicht der Filterhalterung; Fig. 1 is a schematic side view of the filter holder;

Fig. 2 zeigt das Spektrum von Amidoschwarz 10B in einer sauren Auflöselösung I_diss beziehungsweise der alkalischen Elutionslösung II_elut. Bei 620 nm liegt ein isosbestischer Punkt, das heißt hier sind Werte direkt vergleichbar, die nach einer der beiden Methoden erhalten wurden. Die maximale Absorption der sauren Probe liegt aber bei 672 nm und ist höher als die einer ebenso konzentrierten alkalischen Probe. FIG. 2 shows the spectrum of amido black 10B in an acid dissolving solution I _diss or the alkaline elution _solution II _elut . There is an isosbestic point at 620 nm, which means that values that were obtained by one of the two methods can be compared directly. However, the maximum absorption of the acidic sample is 672 nm and is higher than that of an equally concentrated alkaline sample.

Fig. 3 zeigt die Steigung der jeweiligen Regressionsgeraden, die in verschiedenen Pufferlösungen und mittels der Zelluloseacetat-/Auflöse-Methode für Rinderserumalbumin (BSA; 0; 0,125; 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 und 4,00 mg/ml) erhalten wurden. Die Steigungen nehmen mit zunehmender Denaturierungskraft der jeweiligen Pufferlösung zu, was einer erhöhten Zugänglichkeit der im nativ gefalteten Protein verborgenen Aminogruppen entspricht (Pp-Pro­ benpuffer, Bb-Bromphenolblau, PBS-Phos­ phatgepufferte isotone Kochsalzlösung). Fig. 3 shows the slope of the respective regression straight line in various buffer solutions and by means of cellulose acetate / dissolution method for bovine serum albumin (BSA; 0; 0,125; 0.25; 0.50; 1.00; 2.00 and 4, 00 mg / ml) were obtained. The slopes increase with increasing denaturing power of the respective buffer solution, which corresponds to an increased accessibility of the amino groups hidden in the natively folded protein (PP sample buffer, Bb-bromophenol blue, PBS phosphate-buffered isotonic saline solution).

Fig. 4 zeigt die Anwendung der Amidoschwarzmethode zur Bestimmung von Proteinen in suspendierten Kulturen von Hybridoma-Zellen. Die Zellsuspension wurden auf Zelluloseacetat aufgetropft und der Proteingehalt nach der Makromethode bestimmt. Fig. 4 shows the application of the amido black method for the determination of proteins in suspended cultures of hybridoma cells. The cell suspension was dropped onto cellulose acetate and the protein content was determined by the macromethod.

Fig. 5a ist ein Photo einer Mikrotiterplatte, das nach der Behandlung entsprechend dem erfindungsgemäßen Auflöse-Verfahren aufgenommen wurde. Figure 5a is a photo of a microtiter plate taken after treatment according to the dissolution method of the invention.

Fig. 5b zeigt die zahlenmäßigen Resultate der Auswertung solcher Mikro-Bestimmungen. Die gezeigte Regressionsgerade stammt aus einem Experiment, in dem 2 µl-Proben von BSA (0,125-4 mg/ml wie oben) in Bromphenolblau-haltigem Elektrophorese- Probenpuffer eingesetzt wurden. Die Zelluloseacetat-Stücke wurden hier in 200 µl der Lösung I_diss aufgelöst. Man beachte, daß die Steigung der Regressionsgeraden sich von der unter gleichen Pufferbedingungen bei der Makromethode erhaltenen (vergleiche Fig. 6) unterscheidet, da die Schichtdicke bei der photometrischen Auswertung nicht vergleichbar ist. Fig. 5b shows the numerical results of the evaluation of such micro-regulations. The regression line shown comes from an experiment in which 2 μl samples of BSA (0.125-4 mg / ml as above) in bromophenol blue-containing electrophoresis sample buffer were used. The cellulose acetate pieces were dissolved here in 200 ul of the solution I _diss . It should be noted that the slope of the regression line differs from that obtained under the same buffer conditions in the macro method (see FIG. 6), since the layer thickness cannot be compared in the photometric evaluation.

Fig. 6 zeigt einen Vergleich zwischen Zelluloseacetat und Nitrozellulose als Trägermaterialien einerseits sowie dem Auflöse- beziehungsweise dem Elutionsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens andererseits. Fig. 6 shows a comparison between cellulose acetate and nitrocellulose as the carrier material on the one hand and the pulping or the elution step of the method according to the invention on the other hand.

Standardverdünnungsreihen von BSA (0,125-4 mg/ml, wie oben, in Bromphenolblau- haltigem Elektrophorese-Pro­ benpuffer) wurde jeweils vierfach eingesetzt. Der besseren Unterscheidbarkeit halber sind die einzelnen Meßpunkte nicht separat eingezeichnet. Die Quadrate der Korrelationskoeffizienten der Regressionsgeraden (r²) sind: 0,999 (Zell. ac./Aufl), 0,993 (Zell. ac./Elut.), 0,998 (Nitrozell./Elut.) beziehungsweise 0,997 (Nitrozell./Aufl.). Wir weisen besonders daraufhin, daß Steigungen von Regressionsgeraden in diesem Fall die Empfindlichkeit der jeweiligen Bestimmungsmethode widerspiegeln.
Inlet: Das Inlet zeigt Zelluloseacetat (CA) und Nitrozellulose (NC), auf die jeweils 10 ml Proteinlösung aufgetropft und mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wurden. Auf NC liegt eine Agglomeration der Proteine vor.Standard dilution series of BSA (0.125-4 mg / ml, as above, in bromophenol blue-containing electrophoresis sample buffer) were used four times each. For the sake of better differentiability, the individual measuring points are not shown separately. The squares of the correlation coefficients of the regression line (r ² ) are: 0.999 (cell ac / el), 0.993 (cell ac / el), 0.998 (nitro cell / el) and 0.997 (nitro / el) respectively . We would like to point out in particular that slopes of regression lines in this case reflect the sensitivity of the respective determination method.
Inlet: The inlet shows cellulose acetate (CA) and nitrocellulose (NC), onto which 10 ml of protein solution were dropped and determined using the method according to the invention. There is an agglomeration of the proteins on NC.

Fig. 7 zeigt die Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur quantitativen Auswertung von Western Blots. Fig. 7 shows the suitability of the method for quantitative evaluation of Western blots.

• a) Gesamtextrakte von Endothelzell-Kulturen (5, 10 und 20 µg Gesamtprotein) wurden parallel auf 2 separaten Gelen mittels Polyacrylamid-Gel­ lektrophorese aufgetrennt. Während das eine Gel direkt mit Coomassie Blue gefärbt und die Tiefe der Färbung (entspricht in etwa dem Proteingehalt, klassische Methode) bildanalytisch ausgewertet wurde, wobei die Proteine aus dem anderen Gel mittels Elektrotransfer auf Nitrozellulose transferiert und das Gel erst danach gefärbt, also das im Gel verbliebene Protein über Coomassie Blue ausgewertet. Der Vergleich der Steigungen zeigt eine Transferrate von etwa 50%, wobei die Korrelationskoeffizienten (r²) sehr schlecht sind.a) Total extracts from endothelial cell cultures (5, 10 and 20 µg total protein) were separated in parallel on 2 separate gels using polyacrylamide gel electrophoresis. While one gel was stained directly with Coomassie Blue and the depth of the staining (roughly corresponds to the protein content, classic method) was evaluated by image analysis, whereby the proteins from the other gel were transferred to nitrocellulose by means of electrotransfer and the gel was only stained afterwards, i.e. in the Gel remaining protein evaluated via Coomassie Blue. The comparison of the slopes shows a transfer rate of approximately 50%, the correlation coefficients (r ² ) being very poor.
• b) Hier wurde das in dem beschriebenen Experiment auf Nitrozellulose übertragene Protein mit Hilfe von Amidoschwarz und der sauren Auflöselösung bestimmt (untere Linie). Separat wurde die ursprünglich auf das Gel aufgebrachte Proteinmenge nach demselben Verfahren bestimmt (obere Linie). Die errechnete Transferrate ist mit 58% ähnlich wie in (a), die Korrelation und damit die Genauigkeit der erhaltenen Bestimmung jedoch wesentlich verbessert.b) Here was that in the experiment described Nitrocellulose transferred protein using Amido black and the acidic dissolving solution determined (bottom line). The was originally on separately the amount of protein applied after the gel Process determined (top line). The calculated one At 58%, transfer rate is similar to that in (a) Correlation and thus the accuracy of the However, the determination obtained is essential improved.

Fig. 8 zeigt die Möglichkeit, den Proteingehalt adhärenter Zellkulturen verschiedener Zelldichte direkt in Zellkulturschalen (hier eine 24-Loch-Platte, Firma Falcon) mit Hilfe des Auflöseverfahrens zu bestimmen. Die spektrophotometrischen Daten zeigen eine äußerst hohe Korrelation zwischen der Anzahl der Zellen und den enthaltenen Extinktionen. Fig. 8 shows the possibility of the protein content of adherent cell cultures of different cell density directly in cell culture dishes (a 24-well plate, Falcon company) to determine with the aid of the dissolving process. The spectrophotometric data show an extremely high correlation between the number of cells and the extinctions contained.

Fig. 9 zeigt die Anwendung der erfindungsgemäßen Methode auf ganze Gewebeschnitte. FIG. 9, the application of the method according to the invention is to whole tissue sections.

• a) zeigt die Bestimmung des Proteingehalts von Kryostat-Schnitten Formaldehyd-fixierter Rattenlebern, die auf Glas-Deckgläsern immobilisiert wurden. Die mit Hilfe des Auflöseverfahrens erhaltenen Extinktionen weisen eine sehr hohe Korrelation zur jeweiligen Anzahl der Schnitte auf. a) shows the determination of the protein content of Cryostat sections formaldehyde-fixed Rat livers on glass coverslips were immobilized. With the help of Extinction obtained a very high correlation to the respective number the cuts on.  
• b) zeigt die Korrelation zwischen der Anzahl der Schnitte und der mittels Bildanalyse erhaltenen Fläche.b) shows the correlation between the number of Sections and the one obtained by means of image analysis Surface.
• c) zeigt die Standadisierbarkeit der Methode. Hier wurde BSA (in PBS) auf entsprechende Glas-Deck­ gläser aufgebracht und entsprechend bestimmt.c) shows the standardization of the method. Here became BSA (in PBS) on appropriate glass deck glasses applied and determined accordingly.

Fig. 10 zeigt die Proteinbestimmung mit Amidoschwarz auf Biomaterialien (e-PTFE, Titan, Edelstahl, VA) auf die definierte Proteinmengen aufgetropft, getrocknet und mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wurden. Zelluloseactat (CA) wurde in diesem Fall als Referenzträgermaterial benutzt. Für alle Materialien ist der Korrelationskoeffizient < 0,993. Zu beachten bei dieser Versuchsreihe ist, daß das Volumen der Auflöselösung 0,5 ml betrug. Fig. 10 shows the protein determination with amido black to biomaterials (e-PTFE, Titanium, stainless steel, VA) applied dropwise to the defined amounts of protein, dried and were determined with the inventive method. Cellulose acetate (CA) was used as a reference carrier in this case. The correlation coefficient is <0.993 for all materials. It should be noted in this series of experiments that the volume of the dissolving solution was 0.5 ml.

I. Allgemeine VersucheI. General experiments (1) Spektren(1) spectra

Das Vorliegen eines isosbestischen Punktes der Amidoschwarz- Spektren bei 620 nm (Fig. 2) zeigt die direkte Vergleichbarkeit der bei dieser Wellenlänge erhaltenen Extinktionswerte einer sauren Auflöselösung beziehungsweise einer alkalischen Elutionslösung für Amidoschwarz und schließt damit bei dieser Wellenlänge einen pH-Effekt aus. Die maximale Extinktion der sauren Lösung (I_diss) liegt jedoch bei 672 nm und übertrifft den bei 620 nm gemessenen Wert um 27%. Dennoch wurden alle hier genannten photometrischen Extinktionen bei 620 nm gemessen, um die Vergleichbarkeit der Werte zu gewährleisten (siehe auch Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem als bisherigen Stand der Technik bekannten Verfahren nach Henkel und Bieger unter Punkt II 3 und Punkt IV 4). Es muß jedoch betont werden, daß prinzipiell eine Messung bei 672 nm die Empfindlichkeit der Bestimmung in der Lösung I_diss um etwa 25% erhöht.The presence of an isosbestic point of the amidoblack spectra at 620 nm ( FIG. 2) shows the direct comparability of the extinction values of an acidic dissolution solution or an alkaline elution solution for amidoblack obtained at this wavelength and thus excludes a pH effect at this wavelength. However, the maximum absorbance of the acidic solution (I _diss ) is 672 nm and exceeds the value measured at 620 nm by 27%. Nevertheless, all the photometric extinctions mentioned here were measured at 620 nm in order to ensure the comparability of the values (see also comparison of the method according to the invention with the method according to Henkel and Bieger known as prior art under item II 3 and item IV 4). However, it must be emphasized that in principle a measurement at 672 nm increases the sensitivity of the determination in the solution I _diss by about 25%.

(2) Eignung unterschiedlicher Proteine zur Standardisierung(2) Suitability of different proteins for standardization

Es ist bekannt, daß BSA ein geeignetes und repräsentatives Protein für die Anfärbung mit Amidoschwarz ist. Proteine mit extremen isoelektrischen Punkten lassen sich je nach der Anzahl der vorhandenen freien Aminogruppen besser oder schlechter färben. Sollten solche Proteine mittels Amidoschwarz bestimmt werden müssen, erscheint es ratsam, genau dieses oder zumindest ein ähnliches Protein zur Erstellung der Standard-Regressionsgeraden einzusetzen. Dies ist jedoch nur für sehr spezielle Proteine notwendig, nicht aber für Proteingemische. Dies gilt jedoch unabhängig von den übrigen Vorteilen des hier vorgestellten erfindungsgemäßen Verfahrens.It is known that BSA is a suitable and representative one Protein for staining with amido black. Proteins with extreme isoelectric points depending on the Number of free amino groups present better or dye worse. Should such proteins be used Amido black must be determined, it seems advisable exactly this or at least a similar protein for Use the creation of the standard regression line. This is only necessary for very special proteins, however but for protein mixtures. However, this applies regardless of the other advantages of the invention presented here Procedure.

(3) Einfluß der Lösungszusammensetzung(3) Influence of solution composition

Zur Bestimmung des Einflusses der Lösungszusammensetzung wurden Standardverdünnungsreihen von BSA in acht verschiedenen Pufferlösungen (vgl. Anhang) hergestellt. Die erhaltenen Regressionsgeraden weisen Korrelationskoeffizienten von 0,990 oder höher auf und besitzen relativ ähnliche Steigungen zwischen 2-2,8 [10. Ext. . ml/mg] (Fig. 3). Die Empfindlichkeit der Methode hängt daher nur unwesentlich von der jeweiligen Pufferzusammensetzung ab, was für eine äußerst breite Anwendbarkeit spricht. Die geringfügig unterschiedlichen Steigungen/Empfindlichkeiten sind vermutlich auf die unterschiedliche Entfaltung (Denaturierung) des BSA in den verschiedenen Lösungen zurückzuführen. Das hervorragende Abschneiden des Zelluloseacetat-/Auflöse-Verfahrens liegt unseres Erachtens an der Entfernung der meisten, wenn nicht aller, Pufferkomponenten durch das Waschen mit der Lösung I_wash, die zu gleichen Teilen Methanol und Wasser enthält, jedoch nicht sauer genug ist, um das Amidoschwarz vom Protein abzulösen.To determine the influence of the solution composition, standard dilution series of BSA were prepared in eight different buffer solutions (see appendix). The regression lines obtained have correlation coefficients of 0.990 or higher and have relatively similar gradients between 2-2.8 [10. Ext. ml / mg] ( Fig. 3). The sensitivity of the method therefore depends only insignificantly on the respective buffer composition, which speaks for an extremely wide range of uses. The slightly different gradients / sensitivities are probably due to the different development (denaturation) of the BSA in the different solutions. In our view, the excellent performance of the cellulose acetate / dissolving process is due to the removal of most, if not all, of the buffer components by washing with the solution I _wash , which contains equal parts methanol and water, but is not acidic enough to do this Detach amido black from the protein.

(4) Eignung verschiedener Trägermaterialien(4) Suitability of different carrier materials

Statt Zelluloseacetat als Trägermaterial können verschiedene andere Materialien (Festkörper gleich welcher Art, solange sie Protein adsorbieren, vom Kunststoff bis zum Metall) verwendet werden. Die einzige Voraussetzung, die hierbei gemacht werden muß, besteht darin, daß sich das jeweilige Trägermaterial nicht unter dem Einfluß der sauren Auflöselösung zersetzt. Die von uns entwickelte Auflöselösung erlaubt in Gegensatz zu der alkalischen Lösung von Henkel und Bieger eine wiederholte Bestimmung derselben Probe auf demselben Trägermaterial.Instead of cellulose acetate as a carrier material, various other materials (solids of any kind, as long as they adsorb protein, from plastic to metal) be used. The only requirement here must be done is that the respective Carrier material not under the influence of the acid Dissolution solution decomposes. The resolution solution we developed allowed in contrast to the alkaline solution from Henkel and Bender a repeated determination of the same sample the same carrier material.

Wir können zeigen, daß eine Proteinbestimmung nicht nur auf Glas und Zellkultur-Kunststoffgefäßen durchgeführt werden kann, sondern ebenso auf Gebrauchsmaterialien (wie etwa Laborhandschuhe) oder Biomaterialien (z. B. für Implantate).We can show that protein determination is not just based on Glass and cell culture plastic tubes are carried out can, but also on consumables (such as Laboratory gloves) or biomaterials (e.g. for implants).

Folgende Materialien wurden bisher getestet:
The following materials have been tested so far:

• - Plastik-Zellkulturgefäße- Plastic cell culture vessels
• - Glaskulturträger- Glass culture carrier
• - Biomaterialien:- Biomaterials:
• - e-PTFE (expanded Polytetrafluorethylen)- e-PTFE (expanded polytetrafluoroethylene)
• - Titan- Titan
• - Edelstahl (VA)- stainless steel (VA)
• - Latex-Handschuhe- latex gloves

So sind folgende Anwendungen möglich:
The following applications are possible:

• - Adsorption verschiedener Proteine an Biomaterialien, was eine einfache, kostengünstige und schnelle Prüfung der Biomaterial-Protein-Interaktion ermöglicht, z. B. zur- Adsorption of various proteins on biomaterials what a simple, inexpensive and quick test of the Biomaterial-protein interaction enables, e.g. B. for
• - quantitativen Erfassung der Vorbeschichtung von Biomaterialien mit Protein vor der Implantation- quantitative recording of the precoating of Biomaterials with protein before implantation
• - Prüfung von Oberflächeneigenschaften von Biomaterialien - Testing the surface properties of biomaterials  
• - Bestimmung der maximalen Proteinadsorptions-Kapazität- Determination of the maximum protein adsorption capacity
• - Besonders interessant ist die Bestimmung von adsorbierten Proteinen auf medizinischen Einmalartikeln wie z. B: Handschuhe, Textilgummi, Kleidung, Katheter verschiedener Anwendungsgebiete, Sauger, Darmrohre. Die Kontamination dieser Artikel ist vermutlich unter anderem Ursache allergischer Reaktionen. So wurden z. B. von Baur und Mitarbeitern in Baur, X., Chen, Z., Allmers, H., und Raul- Heimsoth, M. (1996), Deutsches Ärzteblatt 93, S. C-748 bis C-750 Allergene, bezogen auf das Gesamtprotein, unter hohem Zeitaufwand, umständlich und mit großer Ungenauigkeit bestimmt. Mit dem vorgestellten erfindungsgemäßen Verfahren ist dies wesentlich einfacher, schneller, kostengünstiger und vor allem genauer möglich. Der vorliegende Test ist zum "Screening" von Proteinkontaminationen der oben genannten Artikel bestens geeignet.- The determination of adsorbed is particularly interesting Proteins on single-use medical items such as B: Gloves, textile rubber, clothing, catheters various Areas of application, suction cups, intestinal tubes. The contamination this article is probably one of the causes allergic reactions. So z. B. from Baur and Employees in Baur, X., Chen, Z., Allmers, H., and Raul- Heimsoth, M. (1996), Deutsches Ärzteblatt 93, pp. C-748 bis C-750 allergens, based on the total protein, under high Time expenditure, cumbersome and with great imprecision certainly. With the presented inventive method this is much easier, faster, cheaper and above all possible more precisely. The present test is for "Screening" of protein contaminants of the above Article ideally suited.

Darüber hinaus sind folgende Anwendungen im Umweltschutz denkbar, z. B.
In addition, the following environmental protection applications are conceivable, e.g. B.

• - für Proteinbestimmungen in Gewässern oder Abwässern, die mit Detergenzien, Salzen, Schadstoffen oder anderem kontaminiert sind- for protein determinations in water or waste water using Detergents, salts, pollutants or other are contaminated
• - zum Nachweis von radioaktiv markiertem Protein bezogen auf die exakte Proteinmenge in ein und derselben Probe.- for the detection of radioactively labeled protein based on the exact amount of protein in the same sample.

II. Bestimmung von (physikalisch echt) gelösten bzw. suspendierten ProbenII. Determination of (physically real) dissolved or suspended samples (1) Eignung für suspendierte Proben(1) Suitability for suspended samples

Proben, in denen Protein-Aggregate, Zellfragmente, ganze Zellen oder kleine Gewebestückchen enthalten sind (z. B. Gewebehomogenate oder Suspensionskulturen) können direkt auf Zelluloseacetatfolie aufgetropft und nach der beschriebenen Makro-Auflösemethode bestimmt werden, wie es oben für (im physikalischen Sinne echte) Proteinlösungen dargestellt wurde. Ein typisches Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt, wo Hybridoma-Zellen von geringer Zelldichte verwendet wurden. Die Methode eignet sich daher sowohl zur Proteinbestimmung an suspendierten Zellen als auch zur indirekten Zellzahl-Be­ stimmung, sofern hierfür eine direkte Zählung nicht möglich ist. Der limitierende Faktor beim Umgang mit Suspensionen ist die Adhäsion größerer Zell- oder Gewebefragmente an das Zelluloseacetat. Nach unseren Beobachtungen haften kleine, flache Stückchen von maximal 2-3 mm² erheblich besser als kubische Stückchen. Gewebe sollte für diese Anwendung also so fein wie irgend möglich homogenisiert werden.Samples containing protein aggregates, cell fragments, whole cells or small pieces of tissue (e.g. tissue homogenates or suspension cultures) can be dropped directly onto cellulose acetate film and determined using the macro-dissolution method described, as described above for (in a physical sense, real ) Protein solutions was presented. A typical result is shown in Figure 4 where low cell density hybridoma cells were used. The method is therefore suitable both for protein determination on suspended cells and for indirect cell number determination, provided that a direct count is not possible for this. The limiting factor when dealing with suspensions is the adhesion of larger cell or tissue fragments to the cellulose acetate. According to our observations, small, flat pieces with a maximum of 2-3 mm ² adhere considerably better than cubic pieces. For this application, tissue should be homogenized as finely as possible.

(2) Entwicklung einer automatisierbaren Mikroversion(2) Development of an automatable micro version

Eine Mikroversion des Zelluloseacetat-Auflöseverfahrens kann auf Mikrotiterplatten durchgeführt werden, wobei das Probenvolumen auf 1-2 und dasjenige der Auflöselösung auf 100-200 µl reduziert werden kann (Fig. 5). Die Proben werden direkt in den einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatte auf kleine Zelluloseacetat-Scheiben von etwa 5,5 mm Durchmesser aufgebracht. Der gesamte weitere Vorgang läuft ebenfalls in der Mikrotiterplatte ab, wobei die verschiedenen Lösungen mit Hilfe von kommerziellen ELISA-Pipettierautomaten eingebracht beziehungsweise abgesaugt werden können. Die Auswertung ist in einem handelsüblichen ELISA-Photometer üblich. Selbst nach einer Einwirkzeit von mehreren Tagen wurde keine der getesteten Plastik-Mikrotiterplatten von der sauren Auflöselösung I_diss angegriffen.A micro version of the cellulose acetate dissolving method can be carried out on microtiter plates, the sample volume being reduced to 1-2 and that of the dissolving solution to 100-200 μl ( FIG. 5). The samples are applied directly in the individual wells of the microtiter plate to small cellulose acetate disks approximately 5.5 mm in diameter. The entire further process also takes place in the microtiter plate, the various solutions being able to be introduced or aspirated with the aid of commercial ELISA pipetting machines. The evaluation is common in a commercially available ELISA photometer. Even after a contact time of several days, none of the plastic microtiter plates tested were attacked by the acid dissolving solution I _diss .

(3) Vergleich von Zelluloseacetat und Nitrozellulose als Trägermaterial(3) Comparison of cellulose acetate and nitrocellulose as Backing material

Das erfindungsgemäße Verfahren mit Zelluloseacetat als Trägermaterial wurde mit dem als bisherigem Stand der Technik bekannten Verfahren von Henkel und Bieger, bei dem Nitrozellulose als Trägermaterial diente, verglichen. Hierzu wurden parallele Verdünnungsreihen (wie oben) von BSA in Pp+Bb angesetzt und jeweils vierfach auf beiden Trägermaterialien dem erfindungsgemäßen bzw. dem vorbekannten Verfahren unterworfen (Fig. 6).The method according to the invention with cellulose acetate as the carrier material was compared with the method of Henkel and Bieger known as prior art, in which nitrocellulose served as carrier material. For this purpose, parallel dilution series (as above) of BSA in Pp + Bb were prepared and each four times subjected to the method according to the invention or the previously known method on both carrier materials ( FIG. 6).

Während das Trägermaterial Nitrozellulose in der Handhabung relativ schwierig war, wobei der kritische Schritt das Waschen in der Lösung II_wash war, ließ sich der Zelluloseacetatträger gemäß der Erfindung in allen Verfahrensschritten und nach beiden Methoden gut handhaben.While the carrier material nitrocellulose was relatively difficult to handle, the critical step being washing in solution II _wash , the cellulose acetate carrier according to the invention was easy to handle in all process steps and by both methods.

Bei der Verwendung von Nitrozellulose war die Hintergrundfärbung stets wesentlich intensiver als bei Verwendung von Zelluloseacetat. Die Subtraktion dieses hohen Hintergrundwertes führt dazu, daß das vorbekannte Verfahren unempfindlicher und ungenauer ist als das erfindungsgemäße Verfahren bei Einsatz von Zelluloseacetat. Zudem löst sich Nitrozellulose im Auflöseschritt (I_diss) nicht auf, sondern es wird lediglich der Farbstoff abgelöst, was die Handhabung zusätzlich erschwert. Der Vergleich der in Fig. 6 gezeigten Regressionsgeraden zeigt, daß sowohl die Empfindlichkeit (entsprechende Steigung) als auch die Korrelation (0,999), insbesondere im Bereich niedriger Konzentrationen (bis 5 µg/ml), bei dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung von Zelluloseacetat und der Auflöselösung am besten sind. Wird im vorbekannten Verfahren statt Nitrozellulose Zelluloseacetat eingesetzt, wird ebenfalls die Empfindlichkeit (Steigung) verringert, da das Zelluloseacetat in der Elutionslösung II_elut zur Desintegration neigt und die resultierende Lösung trübe wird. Zwar läßt sich die Trübung durch zusätzliche Zentrifugation beseitigen, was jedoch die Empfindlichkeit nicht beeinflußt.When using nitrocellulose, the background staining was always much more intense than when using cellulose acetate. The subtraction of this high background value leads to the fact that the previously known method is less sensitive and less precise than the method according to the invention when using cellulose acetate. In addition, nitrocellulose does not dissolve in the dissolving step (I _diss ), but only the dye is detached, which makes handling even more difficult. The comparison of the regression lines shown in FIG. 6 shows that both the sensitivity (corresponding slope) and the correlation (0.999), in particular in the range of low concentrations (up to 5 μg / ml), in the method according to the invention using cellulose acetate and Dissolution solution are best. If cellulose acetate is used instead of nitrocellulose in the known method, the sensitivity (slope) is also reduced, since the cellulose acetate in elution solution II _tends to disintegrate and the resulting solution becomes cloudy. The turbidity can be eliminated by additional centrifugation, but this does not affect the sensitivity.

Zusammenfassend kann man festhalten, daß bei Verwendung von Nitrozellulose die Bestimmungen generell weniger empfindlich beziehungsweise genau sind als bei Verwendung von Zelluloseacetat. Die generell geringere Empfindlichkeit des vorbekannten Elutionsverfahrens ist vermutlich auf einen unspezifischen Verlust an Protein während des Waschens in der Lösung II_wash zurückzuführen. Zudem verteilt sich die Probenlösung beim Aufbringen auf das Trägermaterial auf Zelluloseacetat gleichmäßiger als auf Nitrozellulose, was die Gefahr mit sich bringt, daß bei höheren Proteinkonzentrationen auf Nitrozellulose schneller eine lokale Überladung des Trägermaterials eintritt (Fig. 6, Inset), verbunden mit einem entsprechenden Verlust während der Durchführung der einzelnen Schritte. Daher ist die Verwendung von Zelluloseacetat, wo immer möglich, vorzuziehen.In summary, it can be said that the determinations are generally less sensitive or precise when using nitrocellulose than when using cellulose acetate. The generally lower sensitivity of the previously known elution method is probably due to an unspecific loss of protein during washing in solution II _wash . In addition, the sample solution is distributed more evenly when applied to the carrier material on cellulose acetate than on nitrocellulose, which entails the risk that local overloading of the carrier material occurs faster with higher protein concentrations on nitrocellulose ( FIG. 6, inset), associated with a corresponding loss while performing each step. It is therefore preferable to use cellulose acetate wherever possible.

Auch bei Verwendung der Mikroversion der erfindungsgemäßen Methode ist die Verwendung von Nitrozellulose nicht empfehlenswert, da diese sich weder in der Auflöselösung I_diss noch in der Elutionslösung II_elut auflöst und somit in einem zusätzlichen Schritt manuell entfernt werden müßte, was einer Automatisierung entgegenstünde. Außerdem würde hiermit durch die gleichzeitige Entfernung nicht reproduzierbarer kleiner Mengen an Flüssigkeit, die noch an den Plättchen haften, die Genauigkeit der Bestimmung erheblich beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu löst sich bekanntlich Zelluloseacetat in der Auflöselösung vollständig auf, so daß die Mikroversion des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von Zelluloseacetat ohne weiteres automatisiert werden kann und sich damit zur gleichzeitigen Bestimmung einer Vielzahl von Proben eignet. Insbesondere wird sich dies für das Monitoring von säulenchromatographischen Trennungen eignen, bei denen eine Vielzahl von Proben anfallen und zudem oft salzreiche oder Detzergenzien-haltige Puffer verwendet werden. Zudem ist das Verfahren nicht zeitkritisch und kann nach jedem Schritt für beliebige Zeit unterbrochen werden.Even when using the micro version of the method according to the invention, the use of nitrocellulose is not recommended, since it does not dissolve neither in the dissolving solution I _diss nor in the elution _solution II and therefore would have to be removed manually in an additional step, which would _prevent automation. In addition, the simultaneous removal of non-reproducible small amounts of liquid which still adhere to the platelets would significantly impair the accuracy of the determination. In contrast to this, as is known, cellulose acetate completely dissolves in the dissolving solution, so that the micro version of the method according to the invention can be easily automated using cellulose acetate and is therefore suitable for the simultaneous determination of a large number of samples. In particular, this will be suitable for monitoring column chromatographic separations, in which a large number of samples are obtained and, in addition, buffers rich in salt or containing detergent are often used. In addition, the process is not time-critical and can be interrupted for any time after each step.

III. Bestimmung von adhärenten beziehungsweise immobilisierten ProbenIII. Determination of adherent respectively immobilized samples (1) Quantitative Auswertung von Western Blots(1) Quantitative evaluation of Western blots

Die Analyse mittels Western Blot (Elektrotransfer von Proteinen aus Gelen auf Nitrozellulose) würde sich nicht nur zur qualitativen, sondern auch zur quantitativen Bestimmung der verschiedenen Proteine eignen, sofern sich die auf der zum Elektrotransfer verwendeten Nitrozellulose noch vorhandenen Proteinmengen bestimmen lassen. Wir können zeigen, daß dies mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich ist. Es sollten mehrere unterschiedliche Konzentrationen eines Standardproteins und sofern möglich der jeweiligen Probe parallel elektrotransferiert werden, um die Transferrate bei dem jeweils individuellen Experiment und die Bindungsstärke des jeweiligen Proteins (die von dessen Hydrophobizität abhängt) berücksichtigen zu können.Analysis by Western blot (electrical transfer from Proteins from gels on nitrocellulose) would not only be for qualitative, but also for quantitative determination of the different proteins are suitable, provided that the on the Nitrocellulose still used for the electrical transfer Have the amount of protein present determined. We can show that this with the help of the inventive method is possible. There should be several different ones Concentrations of a standard protein and, if possible, the respective sample can be electrotransfered in parallel to the Transfer rate for each individual experiment and the Binding strength of the respective protein (that of its Hydrophobicity depends).

Es wurden zwei identische Polyacrylamidelektrophorese-Gele einmal direkt und dann nach dem Elektrotransfer mit Coomassie Blue gefärbt und bildanalytisch ausgewertet, was eine Transferrate von ca. 50% ergab. Die erhaltene Korrelation ist jedoch für eine exakte quantitative Auswertung zu gering (siehe Fig. 7a), das heißt die wirkliche Transferrate kann nur sehr grob ermittelt werden. Im Gegensatz dazu ergibt die Amidoschwarz-Bestimmung der auf die Nitrozellulose elektrophoretisch übertragenen Proteine verglichen mit der (direkt auf Nitrozellulose aufgebrachten) ursprünglich eingesetzten Proteinmenge eine nun exakte Transferrate von 58%, wie die Korrelation, das heißt Bestimmungsgenauigkeit zeigt (Fig. 7b). Da die Verwendung von Nitrozellulose beim Westen Blot-Verfahren aus technischen Gründen nicht zu umgehen ist, können hier prinzipiell sowohl die vorbekannte Elutionsmethode als auch das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden. Noch 0,1 µg Protein in einer einzigen Proteinbande lassen sich auf diese Art nachweisen, wofür auch nur 100 µl der Auflöselösung I_diss beziehungsweise der Elutionslösung II_elut eingesetzt werden sollten.Two identical polyacrylamide electrophoresis gels were stained directly and then after the electrotransfer with Coomassie Blue and evaluated by image analysis, which resulted in a transfer rate of approx. 50%. However, the correlation obtained is too low for an exact quantitative evaluation (see FIG. 7a), that is to say the actual transfer rate can only be determined very roughly. In contrast, the amido black determination of the proteins electrophoretically transferred to the nitrocellulose compared to the amount of protein originally used (applied directly to nitrocellulose) now gives an exact transfer rate of 58%, as shown by the correlation, i.e. the accuracy of determination ( FIG. 7b). Since the use of nitrocellulose in the west blot process cannot be avoided for technical reasons, in principle both the known elution method and the process according to the invention can be used here. A further 0.1 µg protein in a single protein band can be detected in this way, for which only 100 µl of the dissolving solution I _diss or the elution _solution II _elut should be used.

(2) Anwendung auf adhärente Zellkulturen(2) Application to adherent cell cultures

Die Bestimmung von Protein in adhärenten Zellkulturen läßt sich mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens sehr einfach durchführen, und zwar, wie unten noch näher ausgeführt wird (III.3), auch dann, wenn an denselben Zellen noch andere Bestimmungen durchgeführt werden sollen. Adhärente Zellen lassen sich, wie in Fig. 8 gezeigt, mit Amidoschwarz färben. Im gezeigten Beispiel wurden Humane umbilikale venöse Endothelzellen (HUVEC) bei verschiedenen Zelldichten und jeweils dreifach in Plastik-Kulturgefäße ausgebracht und nach 12-stündiger Adhärenzzeit mit 2% Formaldehyd fixiert, bevor die Amidoschwarz-Färbung vorgenommen wurde. Bei den beiden höchsten Zelldichten war es erforderlich, die erhaltenen Lösungen vor der spektrophotometrischen Bestimmung zu verdünnen. Entsprechende Ergebnisse wurden auch mit Zellen erhalten, die auf Glas gewachsen waren (hier nicht dargestellt). Das Verfahren läßt sich standardisieren, indem man auf entsprechende Zellkulturträger Verdünnungsreihen von Standardprotein auftrocknet (60°C, 1 Stunde) und gleichermaßen der Amidoschwarz-Färbung unterzieht. Die Ergebnisse dieser Standardisierung sind mit den für gleiche Proteinmengen auf Zelluloseacetat oder Nitrozellulose erhaltenen Werten vergleichbar. Die bezüglich der Zellzahl unterschiedlichen Werte in Fig. 4 (susp. Hybridoma-Zellen) und Fig. 7 (adh. Endothelzellen) lassen sich durch das gegenüber den Hybridoma-Zellen bedeutend größere Volumen der humanen Endothelzellen erklären (ca. 500 bzw. ca. 3000 fl).The determination of protein in adherent cell cultures can be carried out very easily with the aid of the method according to the invention, specifically, as will be explained in more detail below (III.3), even if other determinations are also to be carried out on the same cells. As shown in FIG. 8, adherent cells can be stained with amido black. In the example shown, human umbilical venous endothelial cells (HUVEC) were applied at different cell densities and each three times in plastic culture vessels and, after a 12-hour adherence period, fixed with 2% formaldehyde before the amido black staining was carried out. At the two highest cell densities, the solutions obtained had to be diluted before the spectrophotometric determination. Corresponding results were also obtained with cells that had grown on glass (not shown here). The method can be standardized by drying dilution series of standard protein on appropriate cell culture supports (60 ° C., 1 hour) and likewise subjecting them to the amido black staining. The results of this standardization are comparable to the values obtained for the same amounts of protein on cellulose acetate or nitrocellulose. The different cell numbers in FIG. 4 (susp. Hybridoma cells) and FIG. 7 (ad. Endothelial cells) can be explained by the significantly larger volume of human endothelial cells compared to the hybridoma cells (approx. 500 and approx. 3000 fl).

(3) Anwendbarkeit auf immobilisierte Gewebeschnitte(3) Applicability to immobilized tissue sections

5 µm dicke Schnitte von fixiertem oder auch nativem Gewebe (aber in keinem Fall eingebettet) wurden auf Polyornithin­ beschichteten Deckgläsern immobilisiert, eine Stunde lang bei 37°C getrocknet und anschließend entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt. Wie in Fig. 9a gezeigt ist, ergibt sich eine exzellente lineare Korrelation zwischen der jeweiligen Anzahl der Schnitte und den mit Hilfe des Auflöseverfahrens erhaltenen Extinktionen. Darüberhinaus besteht auch ein hochgradig korrelierter linearer Zusammenhang zwischen der Anzahl und den bildanalytisch ermittelten Flächen der Schnitte (Fig. 9b). Der zeitliche Verlauf der Färbung, des Auswaschens des überschüssigen beziehungsweise der Ablösung des gebundenen Farbstoffes wurde nicht näher bestimmt. Es ist anzunehmen, daß dieser Vorgang diffusionsbestimmt abläuft und damit hauptsächlich von der Intensität des Schüttelns (das heißt der Konvektion) abhängig ist. Für das dargestellte Experiment erwies sich eine Zeit von 10 Minuten pro Schritt als ausreichend. Wir möchten besonders betonen, daß für solche Untersuchungen unbedingt auf gleichmäßige Dicke und Größe der Schnitte zu achten ist, was insbesondere beim Vergleich verschiedener Gewebe problematisch sein dürfte.Sections of 5 μm thick of fixed or also native tissue (but in no case embedded) were immobilized on polyornithine-coated cover glasses, dried for one hour at 37 ° C. and then treated in accordance with the method according to the invention. As shown in FIG. 9a, there is an excellent linear correlation between the respective number of cuts and the extinctions obtained with the aid of the dissolution method. In addition, there is also a highly correlated linear relationship between the number and the areas of the sections determined by image analysis ( FIG. 9b). The time course of the coloring, the washing out of the excess or the detachment of the bound dye was not determined in more detail. It can be assumed that this process is determined by diffusion and is therefore mainly dependent on the intensity of the shaking (i.e. convection). A time of 10 minutes per step proved to be sufficient for the experiment shown. We would like to emphasize in particular that for such examinations it is essential to pay attention to the uniform thickness and size of the cuts, which should be problematic in particular when comparing different tissues.

Für alle Anwendungen der Proteinbestimmung auf Festkörper-Ober­ flächen können die Extinktionswerte standardisiert werden, indem bekannte Mengen eines Standardproteins auf der jeweiligen Oberfläche getrocknet und genauso wie die Proben behandelt werden. Fig. 9c zeigt ein Beispiel, in dem BSA (in PBS) auf Glas-Deckgläser aufgebracht, über dampfendem Formaldehyd fixiert und anschließend wie die in Fig. 9a/b beschriebenen Proben behandelt wurde. (Die Proben wurden über dampfendem Formaldehyd fixiert, da sich Protein beim Eintauchen in eine Formaldehydlösung von der Oberfläche ablöst). Die Verwendung unfixierter Proben führt zu vergleichbaren Ergebnissen (hier nicht gezeigt), woraus man folgern muß, daß die Adsorption von Amidoschwarz nicht durch die bei der Fixation erfolgende Quervernetzung der Proteine beeinträchtigt wird. Beim Eintauchen in die Amidoschwarz-Fär­ belösung tritt offensichtlich kein Verlust an Protein auf, da durch die Säure das Protein auf der Oberfläche präzipitiert wird.For all applications of protein determination on solid surfaces, the extinction values can be standardized by drying known amounts of a standard protein on the respective surface and treating them in the same way as the samples. FIG. 9c shows an example in which BSA (in PBS) was applied to glass coverslips, fixed using steaming formaldehyde and then treated like the samples described in FIG. 9a / b. (The samples were fixed over steaming formaldehyde, since protein detaches from the surface when immersed in a formaldehyde solution). The use of unfixed samples leads to comparable results (not shown here), from which it must be concluded that the adsorption of amido black is not impaired by the crosslinking of the proteins which occurs during the fixation. When immersed in the amido black staining solution, there is obviously no loss of protein, since the acid precipitates the protein on the surface.

(4) Anwendung auf Biomaterialien(4) Application to biomaterials

Proteinproben, die auf Biomaterialien (Implantate für Gelenke, Gefäßersatz, Einmalartikel in der klinischen Routine und Therapie wie z. B. Latex-Handschuhe, Katheter) immobilisiert beziehungsweise adsorbiert sind, können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden. Die Fig. 10 stellt die Ergebnisse von Messungen dar, die auf Gefäßersatzmaterial (e-PTFE) oder Gelenkimplantatmaterial (Titan, Edelstahl, VA) durchgeführt wurden, und veranschaulicht, daß auch auf verschiedenen Biomaterialien, wie sie zum Teil in der klinischen Routine eingesetzt werden, eine exakte Proteinbestimmung praktizierbar ist. Auch in dieser Testreihe machen die hohen Korrelationskoeffizienten die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des von uns entwickelten Verfahrens transparent. Desweiteren wurden Latexhandschuhe, die kommerziell erhalten wurden, auf eine eventuelle Proteinkontamination hin untersucht. Wir konnten zeigen, daß 3,4 mg Protein pro cm im Mittel auf den Handschuhen vorhanden waren.Protein samples which are immobilized or adsorbed on biomaterials (implants for joints, vascular replacement, disposable items in clinical routine and therapy such as latex gloves, catheters) can be determined using the method according to the invention. FIG. 10 shows the results of measurements made on vascular substitute material (e-PTFE) or joint implant material (titanium, stainless steel, VA) and illustrates that it can also be used on various biomaterials, some of which are used in clinical routine , an exact protein determination is practicable. In this series of tests, too, the high correlation coefficients make the accuracy and reproducibility of the method we developed transparent. Furthermore, latex gloves, which were obtained commercially, were examined for possible protein contamination. We were able to show that on average 3.4 mg of protein per cm were present on the gloves.

(5) Möglichkeit zur Doppelbestimmung an ein und derselben Probe(5) Possibility of double determination on one and the same sample

Proben, die auf Glas- (z. B. Deckgläser) oder Kunststoff-Ober­ flächen immobilisiert oder adsorbiert sind, können nach der Entfernung von gebundenem Amidoschwarz durch die Lösung I_diss einem weiteren Färbe- und Entfärbezyklus unterworfen werden, wobei im wesentlichen gleiche Ergebnisse erhalten werden, was den Schluß zuläßt, daß während des Färbens und Entfärbens kein Protein von der Oberfläche abgelöst wurde. Dies gilt auch für Proben auf Nitrozellulose, da diese sich in der Lösung I_diss nicht auflöst. Für Proben auf anderen Festkörperoberflächen erscheint es empfehlenswert, die Proben vorher zur Sicherheit über dampfenden Formaldehyd zu fixieren. Sofern jedoch aus irgendeinem Grund die alkalische Lösung II_elut zur Entfernung des gebundenen Farbstoffes verwendet wurde, wird bei einem nachfolgenden Färbe- und Entfärbezyklus ein beträchtlicher Verlust an Protein festgestellt, der sich nur durch eine teilweise Zersetzung der Probe unter den alkalischen Bedingungen, verbunden mit Desorption und eventueller Teilhydrolyse, erklären läßt. Die Verwendung der sauren Lösung I_diss gestattet folglich die nachfolgende Bestimmung auch anderer Parameter an derselben Probe. Hierbei sind eine Reihe von Anwendungen denkbar, so z. B. die Extraktion von kleinen Molekülen (wie etwa ATP) mit relativ konzentrierten Pufferlösungen und die Korrelation der hierbei erhaltenen Werte mit den für die jeweils gleiche Probe bestimmten Proteinmengen. Entsprechendes gilt für die Quantifizierung von Antigen-Antikörper-Reaktionen (wie etwa Rezeptor-Dichte-Bestimmungen) oder Enzymaktivitäten in Gewebeschnitten. Auch die Bestimmung des Einbaus oder der Bindung radioaktiver Substanzen (Beta-Strahler) sollte ohne jeglichen Quench möglich sein, da sowohl ein Farbquench durch den Farbstoff Amidoschwarz als auch ein chemischer Quench durch die stark saure Lösung I_diss nach der vollständigen Entfernung dieser beiden Komponenten ausgeschlossen werden können. Doppelbestimmungen von Proteingehalt und anderen zellbiologischen beziehungsweise biochemischen Parametern können also durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentlich genauer und aussagekräftiger gestaltet werden.Samples that are immobilized or adsorbed on glass (e.g. cover glasses) or plastic surfaces can be subjected to a further dyeing and bleaching cycle after removal of bound amido black by solution I _diss , whereby essentially the same results are obtained which leads to the conclusion that no protein was detached from the surface during the dyeing and decolorization. This also applies to samples for nitrocellulose, since this does not dissolve in solution I _diss . For samples on other solid surfaces, it seems advisable to fix the samples beforehand for safety via steaming formaldehyde. However, if for some reason alkaline solution II was _used to remove the bound dye, a subsequent loss of _{staining and staining} will result in a significant loss of protein which is only due to partial decomposition of the sample under the alkaline conditions associated with desorption and possible partial hydrolysis. The use of the acid solution I _diss consequently permits the subsequent determination of other parameters on the same sample. A number of applications are conceivable here, such as. B. the extraction of small molecules (such as ATP) with relatively concentrated buffer solutions and the correlation of the values obtained with the amounts of protein determined for the same sample. The same applies to the quantification of antigen-antibody reactions (such as receptor density determinations) or enzyme activities in tissue sections. It should also be possible to determine the incorporation or binding of radioactive substances (beta emitters) without any quench, since both color quenching using the amido black dye and chemical quenching using the strongly acidic solution I _{diss are} excluded after these two components have been completely removed can be. Duplicate determinations of protein content and other cell biological or biochemical parameters can thus be made much more precise and meaningful by using the method according to the invention.

IV. In den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Materialien und MethodenIV. Materials used in the methods of the invention and methods (1) Materialien und Geräte(1) Materials and equipment

Zelluloseacetatfolien (25 × 160 mm) wurden von der Firma Schleicher & Schüll bezogen (Nr. 480102). Nitrozellulose stammte vom selben Hersteller und wurde in Stücke von entsprechender Größe geschnitten. Phosphat-gepufferte isotone Kochsalzlösung (PBS) wurde von der Firma Seromed (Berlin) bezogen und enthält 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,15 g/l Na2HPO4 und 0,2 g/l KH2PO4 bei pH 7,4. Rinderserumalbumin (BSA) wurde von der Firma Sigma bezogen, Amidoschwarz 10B von Merck. Alle anderen Chemikalien waren von der jeweils höchsten erhältlichen Reinheit. Plastik-Mikrotiterplatten und - Zell­ kulturplatten waren von der Firma Falcon. Die Kryostatschnitte wurden mit einem Frigucut 2800 (Firma Reichert-Jung, Nußloch, Deutschland) angefertigt. Die photometrischen Analysen wurden mit einem Ultraspec 4-Photo­ meter der Firma Pharmacia durchgeführt und die Spektren mit einem Spekol VIS-Spektrophotometer der Firma Zeiss aufgenommen. Zur photometrischen Auswertung der Mikrotiterplatten diente ein Titertek Multiskan Plus MKII ELISA-Photometer der Firma Eflab (Helsinki, Finnland). Die bildanalytische Auswertung der Gele und die Flächenbestimmung der Gewebeschnitte erfolgte mit Hilfe eines Bildanalyse-Pro­ grammes (NIH-Image Version 1.52 auf einem Macintosh Computer). Suspendierte Zellen wurden in einem CASY-1 automatischen Zählgerät der Firma Schaerfe System (Reutlingen) gezählt.Cellulose acetate films (25 x 160 mm) were made by the company Covered by Schleicher & Schüll (No. 480102). Nitrocellulose came from the same manufacturer and was cut into pieces by cut the appropriate size. Phosphate-buffered isotonic Saline (PBS) was developed by Seromed (Berlin) related and contains 8 g / l NaCl, 0.2 g / l KCl, 1.15 g / l Na2HPO4 and 0.2 g / l KH2PO4 at pH 7.4. Bovine Serum Albumin (BSA) was purchased from Sigma, Amidoschwarz 10B from Merck. All other chemicals were the highest available purity. Plastic microtiter plates and cells culture plates were from the Falcon company. The Cryostat sections were made with a Frigucut 2800 (company Reichert-Jung, Nußloch, Germany). The Photometric analyzes were carried out with an Ultraspec 4-Photo  carried out by the company Pharmacia and the spectra with a Spekol VIS spectrophotometer from Zeiss added. For the photometric evaluation of the A Titertek Multiskan Plus MKII was used for microtiter plates ELISA photometer from Eflab (Helsinki, Finland). The Image analysis evaluation of the gels and the area determination the tissue sections were made using an image analysis pro grammes (NIH image version 1.52 on a Macintosh Computer). Suspended cells were in a CASY-1 automatic counting device from Schaerfe System (Reutlingen) counted.

(2) Pufferlösungen(2) buffer solutions

Die für die dargestellten Untersuchungen benötigten Stammlösungen und Verdünnungen von BSA wurden in den folgenden Puffer angesetzt: Bidestilliertes Wasser, PBS (siehe oben), 4 M Harnstoff in PBS, 1,5 M Kaliumjodid (KI) in PBS, sowie ein Probenpuffer (Pp) für die Polyacrylamid-Gel­ elektrophorese (6% (w/v) SDS, 9% (v/v) Glycerin, 10 mM Dithiothreitol und 0,187 M TrisHCl bei pH 6,9). Diesem Probenpuffer wurden, wo erwähnt, 0,02% (w/v) Bromphenolblau (Bb), und/oder 1% (v/v) TritonX-100 (Tx in Fig. 3), und/oder 1% NonidetP-40 (NP in Fig. 3) zugesetzt. Alle Proben in Pp wurden 5 Minuten auf 95°C erhitzt und bis zum Gebrauch bei 20°C aufbewahrt.The stock solutions and dilutions of BSA required for the studies presented were prepared in the following buffer: bidistilled water, PBS (see above), 4 M urea in PBS, 1.5 M potassium iodide (KI) in PBS, and a sample buffer (Pp) for polyacrylamide gel electrophoresis (6% (w / v) SDS, 9% (v / v) glycerol, 10 mM dithiothreitol and 0.187 M TrisHCl at pH 6.9). Where mentioned, this sample buffer was given 0.02% (w / v) bromophenol blue (Bb), and / or 1% (v / v) TritonX-100 (Tx in Fig. 3), and / or 1% NonidetP-40 (NP in Fig. 3) added. All samples in PP were heated to 95 ° C for 5 minutes and stored at 20 ° C until use.

(3a) Auflöseverfahren, Makromethode(3a) Dissolution method, macro method

Auf der jeweiligen Folie (Zelluloseacetat beziehungsweise Nitrozellulose) wurden Felder von 1 cm Breite mit Bleistift markiert und die Folie horizontal in einer Magnethalterung (Fig. 1) eingespannt. Die Proben, normalerweise 10 µl, wurden danach mit einer Mikroliterpipette auf die einzelnen Felder aufgebracht. Als Reagenzienleerwert dienen Felder, auf die nur der jeweilige Puffer aufgebracht wurde. Nach dem Trocknen (15 Min bei Raumtemperatur) wurden die gesamten Folien für 10 Minuten in die Färbelösung I_stain (siehe oben) getaucht. Fields 1 cm wide were marked in pencil on the respective film (cellulose acetate or nitrocellulose) and the film was clamped horizontally in a magnetic holder ( FIG. 1). The samples, usually 10 µl, were then applied to the individual fields with a microliter pipette. Fields to which only the respective buffer was applied serve as reagent blank. After drying (15 min at room temperature), the entire films were immersed in the _stain solution (see above) for 10 minutes.

Überschüssiger Farbstoff wurde durch drei Waschschritte für jeweils 5 Minuten in der Lösung I_wash (siehe oben) entfernt. Nach erneutem Trocknen für 5 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Folien in die einzelnen Probenstreifen zerschnitten und diese einzeln in 2 ml-Röhrchen (Firma Eppendorf) gegeben. In diesen erfolgte unter Schütteln das Auflösen in jeweils 1 ml der Lösung I_diss (siehe oben) über 15 Minuten bei 50°C oder auch über 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die entstehenden blauen Lösungen wurden photometrisch bei 620 bzw. 672 nm gegen den entsprechenden Reagenzienleerwert gemessen und aus den (normalerweise drei- oder vierfach angesetzten) Werten die Gleichungen für die Regressionsgeraden berechnet.Excess dye was removed by three washing steps for 5 minutes each in the solution I _wash (see above). After drying again for 5 minutes at room temperature, the films were cut into the individual sample strips and these were placed individually in 2 ml tubes (from Eppendorf). They were dissolved in 1 ml of the I _diss solution (see above) with shaking for 15 minutes at 50 ° C. or for 30 minutes at room temperature. The resulting blue solutions were measured photometrically at 620 or 672 nm against the corresponding reagent blank and the equations for the regression lines were calculated from the (usually three or four times) values.

(3b) Auflöseverfahren, Mikromethode(3b) Dissolution method, micro method

Zelluloseacetatstücke von 5,5 mm Durchmesser wurden in die einzelnen Vertiefungen von Mikrotiterplatten eingelegt und jeweils 1-2 µl Probe aufgetropft. Die weitere Behandlung erfolgte wie in der Makromethode beschrieben, lediglich mit jeweils nur 200 µl Volumen der jeweiligen Lösung pro Vertiefung. Zum Auflösen der Zelluloseacetatstücke reichen sogar nur 100 µl der Lösung I_diss aus. Die Mikrotiterplatten wurden zwischen den einzelnen Schritten mit einer doppelten Lage Parafilm abgedeckt, um ein Verdampfen der Lösungen zu vermeiden. Zum Auflösen wurden die Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert.Cellulose acetate pieces with a diameter of 5.5 mm were placed in the individual wells of microtiter plates and 1-2 .mu.l of sample were dropped on each. The further treatment was carried out as described in the macro method, only with only 200 µl volume of the respective solution per well. To dissolve the pieces of cellulose acetate, only 100 μl of the solution I _{diss are} sufficient. The microtiter plates were covered with a double layer of parafilm between the individual steps in order to avoid evaporation of the solutions. To dissolve, the plates were incubated for 30 minutes at room temperature with shaking.

(4) Elutionsverfahren(4) Elution process

Nach den Angaben bei Henkel und Bieger wurde diese Methode wie folgt durchgeführt: Färbung über 3 Minuten in Lösung II_stain (0,1% Amidoschwarz, je 45% Methanol und Wasser, 10% Eisessig), Waschen für 2 mal 3 Minuten in Wasser, danach 2 mal 3 Minuten in Lösung II_wash (90% Methanol, 2% Eisessig, 8% Wasser) und nochmals 5 Minuten in Wasser, Elution des verbliebenen Farbstoffs in Lösung II_elut (je 50% Ethanol und 50 mM NaOH, 0,1 mM EDTA), wobei in der Makromethode 1 ml Elutionslösung pro Probenstreifen eingesetzt wurde und die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt wurden.According to the information from Henkel and Bieger, this method was carried out as follows: staining for 3 minutes in solution II _stain (0.1% amido black, 45% methanol and water each, 10% glacial acetic acid), washing for 2 times 3 minutes in water, then 2 times 3 minutes in solution II _wash (90% methanol, 2% glacial acetic acid, 8% water) and again 5 minutes in water, elution of the remaining dye in solution II _elute (each 50% ethanol and 50 mM NaOH, 0.1 mM EDTA), 1 ml of elution solution per sample strip being used in the macro method and the samples being shaken for 30 minutes at room temperature.

(5) Elektrophorese und Western Blot(5) electrophoresis and western blot

Polyacrylamid-Plattengelelektrophorese, Western Blotting auf Nitrozellulose sowie Fixationsfärbung von Polyacrylamidgelen mit Coomassie Blue wurden nach in der Literatur beschriebenen Standardverfahren durchgeführt.Polyacrylamide plate gel electrophoresis, Western blotting Nitrocellulose and fixation staining of polyacrylamide gels with Coomassie Blue have been described in the literature Standard procedures performed.

(6) Zellen(6) cells

Endothelzellen aus menschlichen Nabelschnurvenen (HUVEC) wurden isoliert und auf 6 cm² großen Glasoberflächen kultiviert wie bereits beschrieben. Für das in Fig. 8 dargestellte Experiment wurden die Zellen in 2% Formaldehyd (in PBS) fixiert und danach dreimal für jeweils 10 Minuten in PBS gewaschen. Für die in Fig. 9 dargestellten Experimente wurde Rattenleber mit der gleichen Fixierlösung perfusionsfixiert, tiefgefroren und zu 5 µm dicken Kryostat- Schnitten von etwa 3 × 4 mm Größe verarbeitet, die auf Polyornithin-beschichteten Deckgläsern durch 1-stündige Inkubation bei 60°C immobilisiert wurden.Endothelial cells from human umbilical cord veins (HUVEC) were isolated and cultured on 6 cm ² glass surfaces as already described. For the experiment shown in FIG. 8, the cells were fixed in 2% formaldehyde (in PBS) and then washed three times for 10 minutes each in PBS. For the experiments shown in FIG. 9, rat liver was perfusion-fixed with the same fixing solution, deep-frozen and processed to 5 μm thick cryostat sections of approximately 3 × 4 mm in size, which were immobilized on polyornithine-coated cover glasses by incubation at 60 ° C. for 1 hour were.

Claims (12)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein, bei dem das Protein auf ein Zellulosederivat aufgebracht und mit Amidoschwarz gefärbt wird, dann der überschüssige Farbstoff entfernt wird, der an Protein gebundene Farbstoff danach gelöst wird und anschließend spektrophotometrisch quantitativ bestimmt wird, wobei das Protein auf Zelluloseacetat als Träger aufgebracht wird und nach der Einfärbung mit Amidoschwarz Zelluloseacetat und daran gebundenes gefärbtes Protein in einer Auflöselösung aufgelöst werden und dann die spektrophotometrische Bestimmung erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine saure Auflöselösung verwendet, die Ameisensäure und/oder Eisessig und/oder Trichloressigsäure enthält.1. A method for the quantitative determination of protein, in which the protein is applied to a cellulose derivative and stained with amido black, then the excess dye is removed, the dye bound to protein is then dissolved and then quantitatively determined spectrophotometrically, the protein on cellulose acetate is applied as a carrier and after staining with amido black cellulose acetate and the bound dyed protein are dissolved in a dissolving solution and then the spectrophotometric determination is carried out, characterized in that an acidic dissolving solution is used which contains formic acid and / or glacial acetic acid and / or trichloroacetic acid. 2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die saure Auflöselösung als Hauptbestandteil Ameisensäure und daneben in geringeren Mengen jeweils Eisessig und Trichloressigsäure enthält.2. Method for the quantitative determination of protein after Claim 1, characterized in that the acid Dissolving solution as the main component of formic acid and next to it in smaller quantities glacial acetic acid and Contains trichloroacetic acid. 3. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mikrobestimmung von Protein durchführt, wobei man kleine Zelluloseacetatstücke in Mikrotiterplatten einlegt und darauf eine sehr kleine Menge, vorzugsweise etwa 1 bis 2 µl einer proteinhaltigen Probenlösung auftropft und daß man auch die nachfolgenden Verfahrensschritte im Mikromaßstab in der Mikrotiterplatte durchführt.3. Method for the quantitative determination of protein after one of claims 1 to 2, characterized in that one carries out a micro determination of protein, whereby small pieces of cellulose acetate in microtiter plates and a very small amount, preferably about 1 to 2 µl of a protein-containing sample solution dripping on and that one also the following Process steps on a micro scale in the Performs microtiter plate. 4. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Proteine, die als Protein-Aggregate vorliegen quantitativ bestimmt. 4. Method for quantitative determination of protein after one of claims 1 to 3, characterized in that proteins that are present as protein aggregates quantified.   5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Protein in Zellfragmenten oder Zellen quantitativ bestimmt.5. Method for the quantitative determination of protein after one of claims 1 to 4, characterized in that to quantify protein in cell fragments or cells certainly. 6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Protein in Gewebeschnitten quantitativ bestimmt.6. Method for quantitative determination of protein after one of claims 1 to 5, characterized in that to quantify protein in tissue sections. 7. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Protein in Zellkulturen quantitativ bestimmt.7. Method for quantitative determination of protein after one of claims 1 to 6, characterized in that to quantify protein in cell cultures. 8. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Protein bestimmt, das auf einer Festkörperoberfläche immobilisiert ist.8. Method for quantitative determination of protein after one of claims 1 to 7, characterized in that protein is determined on a solid surface is immobilized. 9. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Festkörperoberfläche, auf der das Protein immobilisiert ist, einen Zellkulturträger aus Plastik oder einen Glaskulturträger verwendet.9. Method for quantitative determination of protein after Claim 8, characterized in that as Solid surface on which the protein is immobilized is a plastic cell culture carrier or one Glass culture carrier used. 10. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Protein bestimmt, das an Biomaterialien oder Gebrauchsgegenständen adsobiert ist.10. Method for quantitative determination of protein after one of claims 1 to 9, characterized in that to determine protein that is on biomaterials or Everyday objects is adsorbed. 11. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Protein in Lösungen oder Wasserproben, die mit Detergenzien, Schadstoffen oder dergleichen kontaminiert sind, bestimmt.11. Method for quantitative determination of protein after one of claims 1 to 10, characterized in that to get protein in solutions or water samples using Detergents, pollutants or the like contaminated are determined. 12. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man radioaktiv markiertes Protein bestimmt.12. Method for the quantitative determination of protein after one of claims 1 to 11, characterized in that  radioactively labeled protein is determined.