DE19627232A1

DE19627232A1 - Defined enzyme mixtures for cosmetic purposes

Info

Publication number: DE19627232A1
Application number: DE1996127232
Authority: DE
Inventors: Heinz Dr Einig; Josef Johna; Lothar Rasthofer; Hans-Ulrich Dr Wekel; Wolfgang Dr Zahn
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1996-07-05
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 1998-01-08
Also published as: AU3438297A; WO1998001108A1

Abstract

The invention concerns the use of mixtures of at least two enzymes selected from the group comprsing high-purity collagenase HP, collagenase AZ, elastase and clostridiopeptidase A for cosmetic purposes.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung definierter Mischungen von Enzymen aus Clostridium histolyticum für kosmetische Zwecke.The present invention relates to the use of defined Mixtures of enzymes from Clostridium histolyticum for cosmetic purposes.

Für die Wundbehandlung sind Kollagenase-enthaltende Arzneimittel seit vielen Jahren eingesetzt. Bei diesen Salben erfolgt jedoch eine Applikation auf stark beschädigte Haut z. B. bei Verbrennung swunden und Ulcera verschiedener Genese. Dort kann Kollagenase nekrotisches Gewebe, das an Kollagen gebunden ist, abspalten und so durch Wundreinigung zur Wundheilung beitragen. In der kosmetischen Behandlung liegen hingegen keine offenen Wunden vor, sondern nahezu intakte Haut, die mit einem Wirkstoff gepflegt werden soll. Intakte Haut besitzt eine Epidermis, die aus Keratin besteht, das von Kollagenase nicht angegriffen wird.Medicines containing collagenase are used for wound treatment used for many years. However, with these ointments an application on badly damaged skin e.g. B. in combustion wounds and ulcers of various origins. There can be collagenase Cleave necrotic tissue bound to collagen and thus contribute to wound healing through wound cleaning. In the cosmetic treatment, however, there are no open wounds, but almost intact skin that is cared for with an active ingredient shall be. Intact skin has an epidermis made from keratin exists that is not attacked by collagenase.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Mischungen aus mindestens zwei Enzymen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einerseits Kollagenase HP und/oder Kollagenase AZ und anderer seits aus Elastase und/oder Clostripain, für kosmetische Zwecke sowie Kosmetika, die diese Mischungen enthalten.The invention relates to the use of mixtures of at least two enzymes selected from the group consisting of on the one hand collagenase HP and / or collagenase AZ and others partly made of elastase and / or clostripain, for cosmetic purposes as well as cosmetics containing these mixtures.

Elastase und/oder Clostripain müssen in der Mischung vorhanden sein, da diese Enzyme mit der Epidermis reagieren können. Kollagenase HP besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 20 U/mg, vorzugsweise mindestens 50 U/mg im Test nach Graßmann und Nordwig (1) mit dem synthetischen Hexapeptid Z-Gly-Pro- Gly-Gly-Pro-Ala als Substrat. Besonders bevorzugt wird eine Kollagenase HP mit einer Aktivität von 70-146 U/mg verwendet.Elastase and / or clostripain must be present in the mixture because these enzymes can react with the epidermis. Collagenase HP has a specific activity of at least 20 U / mg, preferably at least 50 U / mg in the Graßmann test and Nordwig (1) with the synthetic hexapeptide Z-Gly-Pro Gly-Gly-Pro-Ala as a substrate. One is particularly preferred Collagenase HP with an activity of 70-146 U / mg was used.

Kollagenase AZ besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 10 U/mg, vorzugsweise mindestens 30 U/mg im Test nach Mandl et al. (2) unter Verwendung von Azokoll als Substrat. Besonders bevorzugt wird eine Kollagenase AZ mit einer Aktivität von 60-82 U/mg verwendet.Collagenase AZ has a specific activity of at least 10 U / mg, preferably at least 30 U / mg in the Mandl test et al. (2) using azocoll as substrate. Especially a collagenase AZ with an activity of 60-82 U / mg used.

Elastase besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 2 U/mg, vorzugsweise mindestens 5 U/mg im Test mit Elastin aus dem Nackenband des Rindes als Substrat. Besonders bevorzugt wird eine Elastase mit einer Aktivität von 15-20 U/mg verwendet. Elastase has a specific activity of at least 2 U / mg, preferably at least 5 U / mg in the test with elastin the neck band of the cattle as a substrate. Is particularly preferred an elastase with an activity of 15-20 U / mg was used.

Clostripain besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 10 U/mg, vorzugsweise von 25 U/ml im von Emöd et al. (4) be schriebenen Test, der mit dem synthetischen Substrat α-N-Benzoyl- L-arginin-ethylester nach vorheriger 3-stündiger Aktivierung der Clostripain-Lösung mit einer 2 mM 1,4-Dithioerythrit-Lösung durchgeführt wird. Besonders bevorzugt wird ein Clostripain mit einer Aktivität von 60-90 U/mg verwendet.Clostripain has a specific activity of at least 10 U / mg, preferably 25 U / ml in the Emöd et al. (4) be wrote test, which with the synthetic substrate α-N-benzoyl L-arginine ethyl ester after 3 hours of activation the clostripain solution with a 2 mM 1,4-dithioerythritol solution is carried out. A clostripain is particularly preferred an activity of 60-90 U / mg used.

Reinheitskriterium für die verwendeten Enzyme ist ihre jeweilige spezifische Aktivität und ihr Einheitlichkeitsnachweis in den für diesen Zweck üblicherweise verwendeten elektrophoretischen Methoden (SDS-Gel-Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung und Elektrophorese auf Agarosegel). Die spezifische Aktivität der gereinigten Enzyme erreicht bis zu 100-fach höhere Werte im Ver gleich zum Ausgangsmaterial.The purity criterion for the enzymes used is their respective specific activity and its uniformity proof in the electrophoretic commonly used for this purpose Methods (SDS gel electrophoresis, isoelectric focusing and Electrophoresis on agarose gel). The specific activity of the purified enzymes reach up to 100 times higher values in the ver right to the source material.

Für die Herstellung der Mischungen werden gereinigte Enzyme mit den folgenden spezifischen Aktivitäten eingesetzt: Kollagenase HP mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 20 U/mg, Elastase mit mindestens 2 U/mg, Kollagenase AZ mit mindestens 10 U/mg und Clostripain mit mindestens 10 U/mg.Purified enzymes are used for the preparation of the mixtures the following specific activities: Collagenase HP with a specific activity of at least 20 U / mg, elastase with at least 2 U / mg, collagenase AZ with at least 10 U / mg and Clostripain with at least 10 U / mg.

Die Mischungen zeichnen sich dadurch aus, daß sie, aufgrund ihrer definierten Zusammensetzung aus synergistisch wirkenden kollagenolytischen, sowie elastinoloytischen und proteolytischen Enzymen, für kosmetische Zwecke besonders geeignet sind.The mixtures are characterized in that, owing to their defined composition of synergistic collagenolytic, elastinolytic and proteolytic Enzymes are particularly suitable for cosmetic purposes.

Bei einer Zweierkombination von Elastase und Kollagenase HP soll 1 g einer kosmetischen Präparation (z. B. 1 g Creme) mindestens 0,02 Units Kollagenase HP enthalten und die Höchstmenge soll unter der im pharmazeutischen Bereich niedrigsten Dosis von 0,6 Units/g liegen, vorzugsweise zwischen 0,06 und 0,3 Units/g im Präparat. Die Elastase soll in der Zweierkombination zwischen 0,01 und 0,2 Units/g, vorzugsweise zwischen 0,02 und 0,1 Units/g Präparat enthalten sein.In a two-way combination of elastase and collagenase HP should 1 g of a cosmetic preparation (e.g. 1 g cream) at least Contain 0.02 units of collagenase HP and the maximum amount should below the lowest dose in the pharmaceutical sector of 0.6 units / g, preferably between 0.06 and 0.3 units / g in the preparation. The elastase is said to be in the combination of two between 0.01 and 0.2 units / g, preferably between 0.02 and 0.1 units / g Preparation included.

Bei einer Zweierkombination von Elastase und Kollagenase AZ soll die Dosierung von Elastase wie vorstehend beschrieben erfolgen, die Dosierung von Kollagenase AZ soll zwischen 0,02 und 0,6, vorzugsweise zwischen 0,06 und 0,3 Units/g Präparat liegen.In a two-way combination of elastase and collagenase AZ should the dosing of elastase is carried out as described above, the dosage of collagenase AZ should be between 0.02 and 0.6, preferably between 0.06 and 0.3 units / g of preparation.

Bei einer Zweierkombination von Kollagenase HP und Clostripain soll die Dosierung der Kollagenase HP wie in der Zweierkombi nation mit Elastase liegen. Die Menge an Clostripain soll darin zwischen 0,1 und 1,2 U/g Präparat, vorzugsweise zwischen 0,04 und 0,5 U/g Präparat liegen. In a two-way combination of collagenase HP and clostripain the dosage of the collagenase HP should be the same as in a two-person combination nation with elastase. The amount of clostripain is said to be in it between 0.1 and 1.2 U / g preparation, preferably between 0.04 and 0.5 U / g preparation.

Bei einer Kombination von Kollagenase AZ und Clostripain liegt die Dosierung der Kollagenase AZ wie in der oben beschriebenen Kombination mit Elastase und die Dosierung von Clostripain wie im voranstehenden Absatz in der Kombination mit Kollagenase HP angegeben vor.With a combination of collagenase AZ and clostripain the dosage of collagenase AZ as described in the above Combination with elastase and the dosage of clostripain as in preceding paragraph in combination with collagenase HP stated before.

Die beste Zweierkombination mit dem höchsten kosmetischen Pflegeergebnis ist die Kombination aus Kollagenase HP und Elastase.The best combination of two with the highest cosmetic Care result is the combination of collagenase HP and Elastase.

Wird Kollagenase HP in einer Dreierkombination eingesetzt, so liegen die eingesetzten Mengen an Kollagenase HP und Kollagenase AZ wie oben beschrieben, und die eingesetzte Menge an Clostripain liegt zwischen 0,01 und 1,2, vorzugsweise 0,04 bis 0,5 Units/g Präparat.If collagenase HP is used in a combination of three, the amounts of collagenase HP and Collagenase AZ as described above, and the amount used Clostripain is between 0.01 and 1.2, preferably 0.04 up to 0.5 units / g preparation.

Eine besonders günstige Kombination für eine Creme liegt vor, wenn in diese zwischen 0,02 bis 0,2 Units Kollagenase HP, 0,01 bis 0,3 Units Elastase und 0,06 und 0,3 Units Kollagenase AZ pro g eines kosmetischen Präparates eingearbeitet sind.A particularly favorable combination for a cream is available if in this between 0.02 to 0.2 units of collagenase HP, 0.01 up to 0.3 units elastase and 0.06 and 0.3 units collagenase AZ pro g of a cosmetic preparation are incorporated.

Weitere Dreierkombinationen sind Kollagenase HP + Elastase + Clostripain.Other combinations of three are collagenase HP + elastase + Clostripain.

Einen mehr reinigenden Effekt auf die Haut kann man erzielen, wenn die beiden Enzyme Elastase und Clostripain möglichst hoch dosiert sind. Der hautglättende Effekt ist durch höhere Anteile der beiden Kollagenasen zu erreichen, jedoch nicht ohne das Vor handensein von Elastase und/oder Clostripain.You can achieve a more cleansing effect on the skin, if the two enzymes elastase and clostripain are as high as possible are dosed. The skin-smoothing effect is due to higher proportions of the two collagenases, but not without the foregoing presence of elastase and / or clostripain.

Ausgesprochen günstige Effekte der Hautglättung und des Peelings erreicht man mit einer Viererkombination. Die Dosierung der einzelnen Enzyme liegt bei Kollagenase HP zwischen 0,02 bis 0,6 Units/g, bei Kollagenase AZ zwischen 0,02 bis 0,6 Units/g, bei Elastase zwischen 0,01 bis 0,3 Units/g und bei Clostripain zwischen 0,01 und 0,6 Units/g in der kosmetischen Formulierung.Extremely beneficial effects of skin smoothing and peeling can be achieved with a combination of four. The dosage of the individual enzymes in collagenase HP is between 0.02 to 0.6 units / g, with collagenase AZ between 0.02 to 0.6 units / g, for elastase between 0.01 and 0.3 units / g and for clostripain between 0.01 and 0.6 units / g in the cosmetic formulation.

Für die Anwendung der Enzyme in der Hautpflege kann es günstig sein, den Formulierungen Vitamin E und/oder α-Bisabolol hinzu zufügen.It can be beneficial for the use of the enzymes in skin care be added to the formulations vitamin E and / or α-bisabolol inflict.

Die oben aufgeführten Kombinationen können in viele kosmetische Präparationen eingearbeitet werden. Diese reicht von einfachen Suspensionen in Öl oder Fetten, in Wasser in Öl- bzw. Öl in Wasser-Emulsionen bis zu liposomenähnlichen Formulierungen, Gesichtsmasken und Zweikomponentencremes, die beim Zusammenführen eine Öl in Wasser- bzw. Wasser in Öl-Emulsion bilden.The combinations listed above can be used in many cosmetic Preparations are incorporated. This ranges from simple Suspensions in oil or fats, in water in oil or oil in Water emulsions up to liposome-like formulations, Facial masks and two-component creams that come together form an oil in water or water in oil emulsion.

Präparation und Charakterisierung der Enzyme aus Clostridium histolyticumPreparation and characterization of the enzymes from Clostridium histolyticum 1. Kollagenase HP1. Collagenase HP a. Herstellunga. Manufacturing Fraktionierte Proteinfällung mit AmmoniumsulfatFractional protein precipitation with ammonium sulfate

Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchgeführt.All enzyme purification operations were at 4-8 ° C carried out.

200 g Rohkollagenase wurden in 3 l Wasser gelöst und in die erhaltene Lösung zunächst 680 g pulverisiertes Ammoniumsulfat eingetragen. Der ausgefallene Protein niederschlag Al wurde durch Zentrifugation abgetrennt; zum Überstand wurden weitere 420 g Ammoniumsulfat gegeben. Die hierbei ausgefällte Proteinfraktion A2 wurde abgeschleudert, der Niederschlag in 1 l Wasser gelöst und gegen Wasser dialysiert. Danach wurde über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10000 Da) auf etwa 100 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde dann lyophilisiert. Die so gewonnene se pulverförmige Protein fraktion A2 enthielt Kollagenase HP und Kollagenase AZ als Hauptkomponenten.200 g of raw collagenase were dissolved in 3 l of water and first pulverized 680 g into the solution obtained Ammonium sulfate entered. The failed protein Precipitation Al was separated by centrifugation; a further 420 g of ammonium sulfate were added to the supernatant given. The precipitated protein fraction A2 became centrifuged, the precipitate dissolved in 1 l of water and dialyzed against water. After that, a Ultrafiltration membrane (cut-off limit 10000 Da) concentrated about 100 ml. The concentrate was then lyophilized. The resulting powdered protein Fraction A2 contained collagenase HP and collagenase AZ as main components.

Chromatographische Trennung von HP und Kollagenase AZ mittels Metallchelat-AffinitätschromatographieChromatographic separation of HP and collagenase AZ using metal chelate affinity chromatography

Die chromatographische Trennung von Kollagenase HP und Kollagenase AZ erfolgte an Zn²⁺-beladener Chelating Se pharose 6B. Dazu wurde dieses Material in einer Schicht höhe von 70 cm in eine Säule (5 × 100 cm) gepackt und mit Startpuffer (500 mM Natriumacetat + 20 mM Calciumacetat, pH 8,0) äquilibriert. Dann wurden ca. 1,2 g der Protein fraktion A2, gelöst in 15 ml Startpuffer, dessen pH-Wert mit TRIS [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan] auf 8,4 korrigiert worden war, auf die Säule aufgetragen und mit Startpuffer verschiedene Bestandteile der Proteinfraktion A2 aus der Säule gewaschen. Bei der nachfolgenden Elution mit dem Puffer A (500 mM Natriumacetat + 20 mM Calcium acetat, mit Essigsäure auf pH 6,3 korrigiert) wurde zunächst Kollagenase AZ und dann Kollagenase HP in getrennten Fraktionen aufgefangen. Carried out the chromatographic separation of collagenase HP and collagenase AZ of Zn ²⁺ -beladener Chelating Sepharose 6B Se. For this purpose, this material was packed in a layer height of 70 cm in a column (5 × 100 cm) and equilibrated with starting buffer (500 mM sodium acetate + 20 mM calcium acetate, pH 8.0). Then about 1.2 g of the protein fraction A2, dissolved in 15 ml of starting buffer, the pH of which had been corrected to 8.4 with TRIS [tris (hydroxymethyl) aminomethane], were applied to the column and various were mixed with starting buffer Components of the protein fraction A2 washed out of the column. In the subsequent elution with buffer A (500 mM sodium acetate + 20 mM calcium acetate, corrected to pH 6.3 with acetic acid), first collagenase AZ and then collagenase HP were collected in separate fractions.

Die beiden getrennten Enzymfraktionen von Kollagenase HP und Kollagenase AZ wurden mit Hilfe einer Ultrafiltra tionsmembran (Ausschlußgrenze 10 000 Da) auf 50-100 ml konzentriert, anschließend gegen Wasser dialysiert und wieder über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10 000 Da) auf ca. 10 ml konzentriert.The two separate enzyme fractions from collagenase HP and collagenase AZ were determined using an ultrafiltra tion membrane (cut-off limit 10,000 Da) to 50-100 ml concentrated, then dialyzed against water and again over an ultrafiltration membrane (exclusion limit 10,000 Da) concentrated to approx. 10 ml.

Feinreinigung von Kollagenase HPFine cleaning of collagenase HP

Die Feinreinigung von Kollagenase AZ wurde an dem Anionenaustauscher Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) und unter Zuhilfenahme des FPLC-Gerätes der Fa. Pharmacia durch geführt. Dazu wurde auf die Säule, die mit Puffer D (20 mM Calcium-acetat, pH 7,2) äquilibriert worden war, ein Gemisch aus 1 ml Puffer D und 1 ml der Kollagenase AZ enthaltenden Fraktion (aus der oben beschriebenen Metall chelat-Affinitätschromatographie) aufgetragen.The fine purification of collagenase AZ was carried out on the Anion exchanger Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) and below With the help of the FPLC device from Pharmacia guided. For this purpose, the column was filled with buffer D (20 mM calcium acetate, pH 7.2) had been equilibrated, a mixture of 1 ml of buffer D and 1 ml of collagenase AZ containing fraction (from the metal described above chelate affinity chromatography).

Nach Waschen mit Puffer B wurde die Kollagenase HP mit dem Puffer C (20 mM TRIS/HCl + 200 mM NaCl, pH 7,5) in gereinigter Form von der Säule eluiert.After washing with buffer B, the collagenase became HP the buffer C (20 mM TRIS / HCl + 200 mM NaCl, pH 7.5) in purified form eluted from the column.

b. Eigenschaftenb. characteristics

Die Kollagenase HP erhielt ihre Bezeichnung "HP" aufgrund ihrer Eigenschaft, das Hexapeptid Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro- Ala besonders gut abzubauen. Es ist daher für einen spezifischen Nachweis der Aktivität besonders gut geeig net. Kollagenase HP ist dadurch charakterisiert, daß sie denaturierte Kollagene wie Gelatine oder Azokoll nur in geringem Maße umsetzen kann. Sie greift jedoch Rinder sehnenkollagen an und spaltet mit hohem Umsatz die unter 2b genannten synthetischen Peptide zwischen Glycin und Glycin bzw. zwischen einer beliebigen Aminosäure und Glycin.The collagenase HP got its name "HP" because of it their property, the hexapeptide Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro Ala is particularly easy to break down. It is therefore for one specific proof of activity particularly well suited net. Collagenase HP is characterized in that it denatured collagens such as gelatin or azocoll only in can implement to a small extent. However, it attacks cattle tendon collagen and cleaves the under with high turnover 2b called synthetic peptides between glycine and Glycine or between any amino acid and Glycine.

Die spezifische Aktivität der Kollagenase HP liegt bei maximal 146 U/mg im Test mit dem synthetischen Substrat Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala (5). Dies entspricht einer etwa 100-fachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial.The specific activity of collagenase HP is included maximum 146 U / mg in the test with the synthetic substrate Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala (5). This corresponds approximately to one 100-fold increase over their specific activity the source material.

Die so gereinigte Kollagenase HP bildet sowohl bei der SDS-Gel-elektrophorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande. The collagenase HP purified in this way forms in both SDS gel electrophoresis as well as isoelectric Focusing and electrophoresis on agarose gel only a single gang.

Ihr mittels SDS-Elektrophorese ermitteltes Molekular gewicht liegt bei 106 000 Da. Ihr isoelektrischer Punkt liegt bei pH 5,8-6,0.Your molecular determined by SDS electrophoresis weight is 106,000 da. Your isoelectric point is at pH 5.8-6.0.

2. Kollagenase AZ2. Collagenase AZ a. Herstellunga. Manufacturing

Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchgeführt. Die beiden ersten Reinigungsschritte von Kollagenase AZ (fraktionierte Proteinfällung und Metall chelat-Affinitätschromatographie) sind unter 1. beschrie ben.All enzyme purification operations were at 4-8 ° C carried out. The first two cleaning steps from Collagenase AZ (fractional protein precipitation and metal chelate affinity chromatography) are described under 1 ben.

Feinreinigung von Kollagenase AZFine cleaning of collagenase AZ

Nach Waschen mit Puffer D wurde die Kollagenase AZ mit dem Puffer E (20 mM Calciumacetat, pH 5,0) von der Säule eluiert.After washing with buffer D, the collagenase AZ was added buffer E (20 mM calcium acetate, pH 5.0) from the column eluted.

b. Eigenschaftenb. characteristics

Die Kollagenase AZ erhielt ihre Bezeichnung "AZ" aufgrund ihrer Eigenschaft, das Substrat Azokoll besonders gut abzubauen. Sie ist dadurch charakterisiert, daß sie denaturierte Kollagene wie Gelatine oder Azokoll, aber auch Rindersehnenkollagen gut umsetzt. Sie vermag jedoch kleine synthetische Peptide wie 2-Furanacryloyl-Leu-Gly- Pro-Ala, 4-Phenyl-azobenzyloxy-carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro- Arg und Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala nicht anzugreifen.The collagenase AZ received its name "AZ" on the basis of their property, the substrate Azokoll particularly well dismantle. It is characterized in that it denatured collagens such as gelatin or azocoll, however Bovine tendon collagen is also well implemented. However, it can small synthetic peptides such as 2-furanacryloyl-Leu-Gly- Pro-Ala, 4-phenyl-azobenzyloxy-carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro Arg and Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala do not attack.

Die spezifische Aktivität der Kollagenase AZ liegt bei maximal 82 U/mg in dem von Mandl et al. (2) entwickelten Test unter Verwendung von Azokoll als Substrat. Dies ent spricht einer ca. 80-fachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial. The specific activity of collagenase AZ is included a maximum of 82 U / mg in that of Mandl et al. (2) developed Test using Azocoll as substrate. This ent speaks about an 80-fold increase in their specific Activity towards the starting material.

Die so gereinigte Kollagenase AZ bildet sowohl bei der SDS-Gel-elektrophorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande.The collagenase AZ purified in this way forms in both SDS gel electrophoresis as well as isoelectric Focusing and electrophoresis on agarose gel only a single gang.

Ihr mittels SDS-Gelelektrophorese ermitteltes Molekular gewicht liegt bei 111 000 Da. Ihr isoelektrischer Punkt liegt bei pH 5,9-6,1.Your molecular determined by SDS gel electrophoresis weight is 111,000 da. Your isoelectric point is at pH 5.9-6.1.

3. Elastase3. Elastase a. Herstellunga. Manufacturing

Der erste Reinigungsschritt von Elastase erfolgte durch Proteinfällung mit Ammoniumsulfat, wie unter 1.a. beschrieben.The first step of cleaning Elastase was done by protein precipitation with ammonium sulfate, as in 1.a. described.

Der Proteinniederschlag A1 wird in 1 l Wasser gelöst, über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10 000 Da) auf etwa 170 ml eingeengt und gegen eine 0,1 mM Calciumacetat-Lösung dialysiert. Anschließend wurde die Enzymlösung erneut über eine Ultrafiltrations membran (Ausschlußgrenze 10 000 Da) auf ca. 50 ml konzen triert und dann lyophilisiert.The protein deposit A1 is dissolved in 1 l of water, over an ultrafiltration membrane (exclusion limit 10,000 Da) concentrated to about 170 ml and against one 0.1 mM calcium acetate solution dialyzed. Subsequently the enzyme solution was again subjected to ultrafiltration Concentrate membrane (cut-off limit 10,000 Da) to approx. 50 ml and then lyophilized.

Die Feinreinigung erfolgte durch Gelchromatographie an SEPHADEX G100 oder G200 (Pharmacia).The fine purification was carried out by gel chromatography SEPHADEX G100 or G200 (Pharmacia).

b. Eigenschaftenb. characteristics

Die Elastase ist dadurch charakterisiert, daß sie Elastin mit hohem Umsatz abbauen kann. Ihre spezifische Aktivität (s. 3.c.) lag bei 18 U/mg. Dies entspricht einer ca. 80-fachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial.The elastase is characterized in that it is elastin can break down with high sales. Your specific activity (see 3.c.) was 18 U / mg. This corresponds to one about 80-fold increase in their specific activity versus the source material.

Die so gereinigte Elastase bildet sowohl bei der SDS-Gelelektrophorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande.The elastase thus purified forms both in the SDS gel electrophoresis as well as isoelectric Focusing and electrophoresis on agarose gel only a single gang.

Das mittels SDS-Elektrophorese ermittelte Molekular gewicht der Elastase liegt bei 35 000 Da. The molecular determined by SDS electrophoresis the weight of the elastase is 35,000 Da.

c. Aktivitätsbestimmungc. Activity determination

Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte mit Hilfe des Substrates Elastin.The enzyme activity was determined using the Substrate elastin.

20 mg fein pulverisiertes Elastin aus dem Nackenband des Rindes (Sigma) wurden in 0,4 ml Puffer (50 mM TRIS/HCl + 10 mM Calciumacetat, pH 7,2) 5 min im Wasserbad bei 37°C unter Schütteln vorinkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von Elastase, gelöst in 0,1 ml Puffer, gestartet und 10 min bei 37°C weiter geschüttelt (Hubhöhe 25 mm, Frequenz 150 min^-1). Anschließend wurden 3,5 ml eiskaltes Wasser zugesetzt und das nicht umgesetzte Elastin sofort über einen Filter entfernt. Die Extinktion E des Filtrates wurde spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. Als Blindwert diente der in einem gleichartig durchgeführten Versuch erhaltene Extinktionswert EB, bei dem die Elastaselösung dem Ansatz jedoch erst nach Entfernung des Elastins zugesetzt worden war. Die Extinktion EB dieses Filtrates wurde dann eben falls bei 280 nm bestimmt.20 mg of finely powdered elastin from the neck of the cattle (Sigma) were preincubated in 0.4 ml of buffer (50 mM TRIS / HCl + 10 mM calcium acetate, pH 7.2) in a water bath at 37 ° C. with shaking for 5 min. The reaction was then started by adding elastase, dissolved in 0.1 ml of buffer, and shaken for a further 10 min at 37 ° C. (lifting height 25 mm, frequency 150 min ⁻¹ ). Then 3.5 ml of ice-cold water was added and the unreacted elastin was immediately removed via a filter. The absorbance E of the filtrate was measured spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm. The extinction value EB obtained in a similar test was used as the blank value, in which the elastase solution was only added to the mixture after the elastin had been removed. The extinction EB of this filtrate was then also determined if at 280 nm.

Die Elastaseaktivität wird in Units [U] ausgedrückt. Als 1 U wird diejenige Enzymaktivität definiert, die unter den gegebenen Versuchsbedingungen 1 mg Elastin pro Minute auflöst. Die aufgelöste Menge an Elastin wurde im Filtrat des Testansatzes durch Messen der Extinktion bei 280 nm bestimmt.The elastase activity is expressed in units [U]. As 1 U is the enzyme activity defined under the given test conditions 1 mg elastin per minute dissolves. The dissolved amount of elastin was in the Filtrate the test batch by measuring the absorbance determined at 280 nm.

Die Berechnung der spezifischen Aktivität erfolgte nach folgender Formel:The specific activity was calculated according to following formula:

Der Faktor F wird ermittelt, indem 10 mg Elastin einer bestimmten Charge mit Hilfe von Elastase vollständig aufgelöst und die entsprechende Extinktionsdifferenz ΔE gemessen wird. Die Multiplikation dieses Faktors F mit der Extinktionsdifferenz ΔE ergibt die aufgelöste Milli gramm-Menge an Elastin pro ml Testansatz. The factor F is determined by adding 10 mg of elastin certain batch completely with the help of elastase resolved and the corresponding extinction difference ΔE is measured. The multiplication of this factor F by the extinction difference ΔE gives the resolved milli Gram amount of elastin per ml test batch.

4. Clostripain4. Clostripain a. Herstellunga. Manufacturing

Die Isolierung von Clostripain erfolgte nach der von Ullmann und Jakubke beschriebenen Methode (3).The isolation of clostripain was carried out according to that of Ullmann and Jakubke described method (3).

Die Bestimmung ihrer spezifischen Enzymaktivität erfolgte mit Hilfe des synthetischen Substrates a-N-Benzoyl-L- arginin-ethylester (= BAEE) nach vorheriger 3-stündiger Aktivierung der Clostripainlösung mit 2 mM 1,4-Dithio erythrit-Lösung (4). Sie lag bei ca. 83 U/mg.Their specific enzyme activity was determined with the help of the synthetic substrate a-N-benzoyl-L- arginine ethyl ester (= BAEE) after previous 3 hours Activation of the clostripain solution with 2 mM 1,4-dithio erythritol solution (4). It was around 83 U / mg.

b. Eigenschaftenb. characteristics

Die Thiolprotease Clostripain ist dadurch charakteri siert, daß sie in Polypeptidketten und in snythetisch hergestellten Substraten spezifisch hinter der Aminosäure L-Arginin spaltet. Ihr mittels SDS-Elektrophorese ermit teltes Molekulargewicht liegt bei 55 000 Da.The thiol protease clostripain is therefore characteristic that they are in polypeptide chains and in synthetic produced substrates specifically behind the amino acid L-arginine cleaves. You with SDS electrophoresis Average molecular weight is 55,000 Da.

Es empfiehlt sich, den Präparaten mit Chlostripain eine Menge von 1-2 mg/g Salbe einer Thioverbindung wie Glutathion oder Cystin hinzuzufügen, damit das Enzym besonders aktiv wird.It is recommended to use the preparations with chlostripain an amount of 1-2 mg / g ointment of a thio compound such as Add glutathione or cystine to the enzyme becomes particularly active.

AnwendungsbeispieleExamples of use Beispiel 1: leicht verteilbare SalbeExample 1: easily distributable ointment

Zusammensetzung:
Elastase: 20 Units
Kollagenase HP: 10 Units
Zinkoxid: 3 g
Cetearyloctanoat (Luvitol®EHO): 5 g
(-)-α-Bisabolol: 1 g
Eucerinum anhydricum ad: 100 g.Composition:
Elastase: 20 units
Collagenase HP: 10 units
Zinc oxide: 3 g
Cetearyl octanoate (Luvitol®EHO): 5 g
(-) - α-Bisabolol: 1 g
Eucerinum anhydricum ad: 100 g.

Herstellung:
Die Bestandteile außer den beiden Enzymen wurden bei 80°C geschmolzen und unter Rühren bis zu einer Temperatur von 40-45°C abkühlen gelassen. Bei dieser Temperatur, die beiden Enzyme zuge setzt und die Mischung intensiv bis zum Erkalten gemischt wurden. Manufacturing:
The ingredients other than the two enzymes were melted at 80 ° C and allowed to cool to a temperature of 40-45 ° C with stirring. At this temperature, the two enzymes added and the mixture was mixed intensively until it cooled.

Beispiel 2: leicht verteilbare SalbeExample 2: easily distributable ointment

Zusammensetzung:
Elastase 10 Units
Clostripain: 20 Units
Kollagenase AZ: 15 Units
Zinkoxid: 3 g
Cetearyloctoanat (Luvitol®EHO): 5 g
(-)-α-Bisabolol: 1 g
Eucerinum anhydricum ad: 100 g.Composition:
Elastase 10 units
Clostripain: 20 units
Collagenase AZ: 15 units
Zinc oxide: 3 g
Cetearyl octoanate (Luvitol®EHO): 5 g
(-) - α-Bisabolol: 1 g
Eucerinum anhydricum ad: 100 g.

Die Herstellung erfolgte analog Beispiel 1The preparation was carried out analogously to Example 1

Beispiel 3: PuderExample 3: Powder

Zusammensetzung:
Kollagenase HP: 15 Units
Kollagenase AZ: 10 Units
Elastase: 10 Units
Zinkoxid: 4 g
Titandioxid: 5 g
Magnesiumstearat: 5 g
(-)-α-Bisabolol: 1 g
Parfümöl: q.s.
Talkum ad: 100 g.Composition:
Collagenase HP: 15 units
Collagenase AZ: 10 units
Elastase: 10 units
Zinc oxide: 4 g
Titanium dioxide: 5 g
Magnesium stearate: 5 g
(-) - α-Bisabolol: 1 g
Perfume oil: qs
Talc ad: 100 g.

Die Herstellung erfolgte durch gutes und intensives Mischen der Bestandteile.The production was done by good and intensive mixing of the Components.

Beispiel 4: PuderExample 4: Powder

Analog Beispiel 3 wurde ein Puder hergestellt, welches jedoch anstelle von Clostripain 10 Units Elastase enthielt. A powder was produced analogously to Example 3, but this contained 10 units of elastase instead of clostripain.

Beispiel 5: Hautpflegendes BabyölExample 5: Skin care baby oil

Zusammensetzung:
Elastase: 10 Units
Clostripain: 15 Units
Kollagenase HP: 20 Units
Kollagenase AZ: 10 Units
Cetearyloctanoat (Luvitol®EHO): 47,9 g
Tocophorylacetat: 2,0 g
(-)-α-Bisabolol: 0,1 g
Parfümöl: q. s.
Glutathion: 1,0 g
Caprylic/Capric Triglyceride:
(Miglyol®) ad: 100 g.Composition:
Elastase: 10 units
Clostripain: 15 units
Collagenase HP: 20 units
Collagenase AZ: 10 units
Cetearyl octanoate (Luvitol®EHO): 47.9 g
Tocophoryl acetate: 2.0 g
(-) - α-Bisabolol: 0.1 g
Perfume oil: qs
Glutathione: 1.0 g
Caprylic / Capric Triglyceride:
(Miglyol®) ad: 100 g.

Herstellung:
Alle Bestandteile wurden zusammengefügt und gerührt, bis eine vollständige Lösung vorlag. Sehr feine Partikel der Enzyme lösen sich nicht. Eine Sedimentation der Partikel ist möglich, daher vor Gebrauch kurz und intensiv aufrütteln.Manufacturing:
All components were combined and stirred until a complete solution was available. Very fine particles of the enzymes do not dissolve. Particles can sediment, so shake them briefly and intensively before use.

Beispiel 6: wasserhaltige Wasser in Öl-Creme, Zweikomponenten-CremeExample 6: water-containing water in oil cream, two-component cream

Zusammensetzung Komponente A:
Elastease: 20 Units
Clostripain: 60 Units
Kollagenase HP: 80 Units
Kollagenase AZ: 40 Units
Paraffin: 20 g
Vaseline ad: 100 g.Composition component A:
Elastease: 20 units
Clostripain: 60 units
Collagenase HP: 80 units
Collagenase AZ: 40 units
Paraffin: 20 g
Vaseline ad: 100 g.

Herstellung:
Paraffin und Vaseline wurden bei 80°C geschmolzen und unter Rühren bis auf 40-45°C abgekühlt. Danach wurden auch die 4 Enzyme zuge geben und die Mischung unter intensivem Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt.Manufacturing:
Paraffin and petroleum jelly were melted at 80 ° C and cooled to 40-45 ° C with stirring. Then the 4 enzymes were added and the mixture was cooled to room temperature with vigorous stirring.

Zusammensetzung Komponente B:
Sorbitantrioleat: 1,87 g
Paraffin: 3,69 g
Cystin: 1,0 g
Polyoxyethylen-sorbitolhexaoleat: 11,87 g
Wasser: 13,02 g
Vaseline ad: 100 g. Composition component B:
Sorbitan trioleate: 1.87 g
Paraffin: 3.69 g
Cystine: 1.0 g
Polyoxyethylene sorbitol hexaoleate: 11.87 g
Water: 13.02 g
Vaseline ad: 100 g.

Herstellung:
Alle Bestandteile außer Wasser wurden auf 70°C erwärmt. Unter intensivem Rühren wurde das Wasser eingearbeitet. Unter Rühren wurde auf Raumtemperatur abgekühlt.Manufacturing:
All components except water were heated to 70 ° C. The water was incorporated with vigorous stirring. The mixture was cooled to room temperature with stirring.

Die Komponenten A und B wurden in eine Zweikammertube gefüllt. Die Tubenöffnung für die Komponente B läßt die vierfach größere Menge durch als die für die Komponente A. Über einen Adapter werden die beiden Stränge zusammengeführt und auf der Haut verrieben. Die Zweikomponentencreme eignet sich besonders, wenn sie auf feuchte Haut aufgetragen wird.Components A and B were filled in a two-chamber tube. The tube opening for component B leaves the four times larger Quantity through than that for component A. Via an adapter the two strands are brought together and on the skin rubbed. The two-component cream is particularly suitable when it is applied to damp skin.

Literaturliterature

1) Graßmann W. und Nordwig A. (1960) Hoppe-Seyler′s Z. Physiol. Chem. 322, 267-272
2) Mandl I., MacLennan J.D., Howes E.L., DeBellis R.H. und Sohler A. (1953) J. Clin. Invest. 32, 1323-29
3) Ullmann D. und Jakubke H.-D. (1994) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 375, 89-92
4) Emöd I. und Keil B. (1977) FEBS Lett. 77, 51-66
5) Nordwig A. und Strauch L. (1996) Hoppe-Seyler′s Z. Physiol. Chem. 330, 10.1) Graßmann W. and Nordwig A. (1960) Hoppe-Seyler′s Z. Physiol. Chem. 322, 267-272
2) Mandl I., MacLennan JD, Howes EL, DeBellis RH and Sohler A. (1953) J. Clin. Invest. 32, 1323-29
3) Ullmann D. and Jakubke H.-D. (1994) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 375, 89-92
4) Emöd I. and Keil B. (1977) FEBS Lett. 77, 51-66
5) Nordwig A. and Strauch L. (1996) Hoppe-Seyler′s Z. Physiol. Chem. 330, 10.

Claims

1. Verwendung von Mischungen aus mindestens zwei Enzymen, ausge wählt aus der Gruppe, bestehend aus einerseits Kollagenase HP und/oder Kollagenase AZ und andererseits aus Elastase und/oder Clostripain, für kosmetische Zwecke.1. Use of mixtures of at least two enzymes, out chooses from the group consisting of collagenase HP and / or collagenase AZ and on the other hand from elastase and / or clostripain, for cosmetic purposes.

2. Kosmetika enthaltend eine Mischung gemäß Anspruch 1.2. Cosmetics containing a mixture according to claim 1.