DE19618812C1 - Sensor zum Nachweis von Proteinen und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents
Sensor zum Nachweis von Proteinen und Verfahren zu dessen HerstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft einen Sensor zum Nachweis von Proteinen
nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, wie er aus der DE
44 18 926 bekannt ist und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Es gibt bislang einige etablierte analytische Verfahren um
auch Biomoleküle zu analysieren, die sich aber meist aufwendi
ger und teurer Labormethoden bedienen (HPLC, GC-MS). Eine ähn
lich preisgünstige Alternative zu der hier beschriebenen Me
thode stellen hingegen die sogenannten Immunoassays dar. Diese
basieren ebenfalls auf der Bindung eines Analyten an einen An
tikörper, benutzen aber zwangsläufig ein indirektes Verfahren
für den Nachweis dieser Bindung. Dabei wird der Probe ein ra
dioaktiv-, fluoreszenz- oder enzymmarkiertes analyt-analoges
Molekül zugesetzt, das mit dem Analyt um die Antikörperbinde
stellen konkurriert. Zur Auswertung ist damit ein Verfahren
nötig, das aus mehreren Reagenzienzuführungen, Inkubations- und
Waschgängen besteht; die Gesamtzeit pro Assay beträgt
typischerweise eine Stunde. Eine On-line-Messung ist damit
ausgeschlossen
Darüber hinaus wurden weitere Immunosensorprinzipien in der Literatur beschrieben. Nach Meinung vieler Autoren weichen sie immer noch stark von der Idealvorstellung eines preisgün stigen, genügend empfindlichen zukünftigen Immunosensors ab:
In mehreren Übersichtsartikeln wurden solche Methoden bereits aufgrund ihrer hohen Kosten (Oberflächen-Plasmonen-Resonanz, Gitterkoppler, Differentielles Interferometer) bzw. wegen ih rer niedrigen Empfindlichkeit (Potentiometrischer Immunosen sor) kritisiert, während der Immunosensor auf Oberflächenwel len (OFW)-Basis bislang favorisiert wurde.
Darüber hinaus wurden weitere Immunosensorprinzipien in der Literatur beschrieben. Nach Meinung vieler Autoren weichen sie immer noch stark von der Idealvorstellung eines preisgün stigen, genügend empfindlichen zukünftigen Immunosensors ab:
In mehreren Übersichtsartikeln wurden solche Methoden bereits aufgrund ihrer hohen Kosten (Oberflächen-Plasmonen-Resonanz, Gitterkoppler, Differentielles Interferometer) bzw. wegen ih rer niedrigen Empfindlichkeit (Potentiometrischer Immunosen sor) kritisiert, während der Immunosensor auf Oberflächenwel len (OFW)-Basis bislang favorisiert wurde.
Aus der EP 0 361 729 A2 ist ein Verfahren der e. g. Art zur
Erzeugung eines Sensors bekannt, welcher eine Schutzschicht
zur räumlichen Trennung von Substrat und wäßriger Analytlösung
aufweist. Dieser Sensor weist bei einer Arbeitsfrequenz <100
MHz Dämpfungen zwischen 30 und 40 dB auf, wodurch eine hohe
Störanfälligkeit bei starkem Rauschen verursacht wird.
Der Nachteil des in der DE 44 18 926 beschriebenen Sensors be
steht darin, daß die Herstellung einen hohen Arbeitsaufwand
bei einem hohen Gefährdungspotential erfordert und daß die
Sensoreigenschaften eine starke Streuung aufweisen.
Aufgabe der Erfindung ist es nun, einen Sensor der e. g. Art
so auszugestalten, daß eine einfache Herstellung bei guter Re
produzierbarkeit gegeben ist.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale der Pa
tentansprüche 1 und 3. Die Unteransprüche beschreiben vorteil
hafte Ausgestaltungen des Verfahrens.
Der Sensor ermöglicht die spezifische Messung der Anwesenheit
bzw. der Konzentration verschiedener Biomoleküle wie Proteine,
Enzyme sowie komplexerer Makromoleküle - Teile des Erbgutes
(DNS, RNS) oder verschiedene Krankheitserreger (z. B. Viren
oder Bakterien) - durch Direktnachweis der Bindung an spezifi
sche Antikörper in wäßrigen Lösungen. Mit dieser Methode sind
damit keine zeitaufwendige Verfahren mehr notwendig, die auf
die Konkurrenz zwischen gelabelten und ungelabelten Analyten
beruhen (indirektes Nachweisverfahren bei Immunoassays).
Bei dem Sensor handelt es sich um einen massensensitiven Sen
sor, der die bei der Sorption des Analyten verursachten
Schallgeschwindigkeitsänderung von akustischen Oberflächenwel
len (OFW) nutzt, um auf die sorbierte Masse des Analyten und
somit auf dessen Anwesenheit bzw. Konzentration in der Lösung
zurückzuschließen.
Um eine analytenspezifische Sorptionsreaktion zu erhalten,
sind selektive Beschichtungen auf dem OFW-Substrat notwendig.
Besondere Flexibilität ist hierbei dann gewährleistet, wenn
diese Beschichtungen aus immunochemisch aktiven Molekülen wie
Antikörpern oder Antigenen bestehen. Bei dem erfindungsgemäßen
Sensor handelt es sich also um einen echten Immunosensor der
seine Daten in-situ ermittelt und damit eine echte On-line-Meßmethode
für Bioanalytik ermöglicht.
Gegenüber der herkömmlichen Bioanalytik bietet der beschrie
bene Sensor eine Reihe von Vorteilen:
- - Kostengünstig: 4-10 DM pro Stück
- - Empfindlichkeit wie Bio-Assay
- - auf beliebige Biosysteme übertragbar
- - sehr gute Langzeitstabilität
Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels mit
Hilfe der Figuren näher erläutert.
Fig. 1 zeigt den Verlauf einer enzymatischen Glukosezersetzung
auf einem Sensor und die
Fig. 2 zeigt den Verlauf von Immunoreaktionen für unterschied
liche Antikörperkonzentrationen.
Die Fig. 3 zeigt den TRIMID Gehalt des Rezeptorproteins und
die Fig. 4 dessen Enzymaktivität anhand von Absorptionsspek tren.
die Fig. 4 dessen Enzymaktivität anhand von Absorptionsspek tren.
Die Fig. 5 zeigt die Rezeptoranbindung an das Polymer Polyi
mid.
Der Sensor in unserem Beispiel arbeitet auf der Basis akusti
scher Oberflächenwellen. Ein solcher Sensor wird in der DE 43
19 215 beschrieben.
Der Sensorkörper wird auf einer Seite zunächst mit einem Poly
mer, in diesem Beispiel einem aromatischen Polyimid beschich
tet. Die Beschichtung der Oberfläche des Sensorkörpers mit Po
lyimid erfolgt wie in der DE 44 18 926, S. 3, Zeilen 11 bis 55
beschrieben. Auf die polyimidiserte Sensoroberfläche werden
anschließend 10 µl des geeignet verdünnten, modifizierten Re
zeptormoleküls gegeben.
Wie in Fig. 5 zu erkennen ist, kommt es nur zur Immobilisation
von photomarkierten Enzym auf der polyimidisierten Sensorober
fläche, wenn der Wassergehalt in der Proteinmatrix niedrig ge
halten wird. Bei einem zu hohen Wassergehalt im Protein kommt
es bei Belichtung zur Reaktion des Carbens mit Wasser, so daß
die Insertierungsreaktion zwischen Polyimid und Protein in den
Hintergrund gedrängt wird und die Anbindung an die Sensorober
fläche ausbleibt. Aus diesem Grund werden die Sensoren 20-40
min in einem Vakuumtrockenschrank bei Raumtemperatur und einem
Druck < 10 mbar behandelt. Optimal ist eine 30 minütige Trock
nung bei 1 mbar. Der daraus resultierende eingetrocknete En
zymfilm wurde anschließend mit einer Quecksilberdampflampe be
lichtet. Zur Erzeugung der Triplettcarbene ist eine Belichtung
des Enzymfilms bei 348 nm und 0,7 mW/cm² für 30 min notwendig.
Zur Immobilisierung wurde mit TRIMID modifizierte Glucoseoxi
dase (T-Glucoseoxidase, T-GOD) mit einem Proteingehalt von
1.92 mg/ml verwendet. Der TRIMID-Gehalt betrug 6.5 mol TRIMID
pro mol Glucoseoxidase.
Voruntersuchungen zeigten, daß die T-GOD-Lösung nicht unver
dünnt auf dem Sensor abgeschieden werden konnte. Bei einer zu
hohen Proteinkonzentration kommt es zu hohen Eingangsdämpfun
gen und es kann keine akustische Welle beobachtet werden.
Als Ergebnis dieser Voruntersuchungen wurde die T-Glucose
oxidaselösung im Verhältnis 1 : 125 mit Phosphatpuffer (1 : 100)
verdünnt, 10 µl dieser Lösung auf den Sensor gebracht und das
Enzym, wie oben beschrieben, immobilisiert (vakuumbehandelt,
belichtet).
Mittels eines enzymatischen Assays konnte die auf der Sen
soroberfläche abgeschiedene Menge an Enzym spektroskopisch be
stimmt werden.
Zur Durchführung der Enzymaktivitätsüberprüfung sind folgende
Lösungen notwendig:
Lösung 1
53 mg 3,5-Dichlor-2-Hydroxy-Benzosulphonsäure werden in Wasser (bidest.) gelöst und mit 1 M NaOH auf pH=7 gebracht. Dann wer den 3 mg Peroxidase (Meerrettich) zugegeben und auf 10 ml mit Wasser aufgefüllt.
53 mg 3,5-Dichlor-2-Hydroxy-Benzosulphonsäure werden in Wasser (bidest.) gelöst und mit 1 M NaOH auf pH=7 gebracht. Dann wer den 3 mg Peroxidase (Meerrettich) zugegeben und auf 10 ml mit Wasser aufgefüllt.
Lösung 2
16.2 mg 4-Aminophenazon werden in 10 ml Wasser gelöst.
16.2 mg 4-Aminophenazon werden in 10 ml Wasser gelöst.
Lösung 3
1.4 g Na₂HPO₄ * 2 H₂O und 700 mg NaH₂PO₄ sowie 37.2 mg EDTA werden in 100 ml Wasser gelöst.
1.4 g Na₂HPO₄ * 2 H₂O und 700 mg NaH₂PO₄ sowie 37.2 mg EDTA werden in 100 ml Wasser gelöst.
Lösung 4
1.8-D-Glucose werden in 10 ml Wasser gelöst.
1.8-D-Glucose werden in 10 ml Wasser gelöst.
In eine Küvette werden dann
1.55 ml von Lösung 3
0.2 ml von Lösung 4
0.2 ml von Lösung 1
50 µl von Lösung 2
0.2 ml von Lösung 4
0.2 ml von Lösung 1
50 µl von Lösung 2
gegeben und nach guter Durchmischung (Vortex) der Hintergrund
bei 520 nm vermessen. Anschließend gibt man 50 µl einer ange
messen verdünnten GOD-Lösung hinzu und mißt die Absorptionsän
derung bei 520 nm (Ausbildung eines roten Farbstoffs) inner
halb der ersten Minuten. Bei hohen Glucoseoxidasekonzentratio
nen genügen 2 Minuten, bei den auf dem Sensor abgeschiedenen
Mengen an Antigen wurde 10-20 Minuten lang gemessen.
Der Extinktionskoeffizient des entstehenden Farbstoffs beträgt
13300 (M cm)-1. Damit ist es möglich die spezifische Enzymak
tivität der Glucoseoxidaselösung zu bestimmen. Diese wird in
"units/mg" angegeben, wobei eine "unit" wie folgt definiert
ist: Eine "unit" oxidiert 1 µmol -D-Glucose pro Minute bei
pH=5.1 (T=35°C).
Da zur Erzeugung von 1 mol des roten Farbstoffs 2 mol Wasser
stoffperoxid (aus der Glucosespaltung) notwendig sind, ent
spricht die gemessene Zunahme des Chromophors 0.5 units pro
Minute.
Die Zunahme der Absorption bei 520 nm ist exemplarisch für
drei verschiedene Sensoren in Fig. 1 angegeben. Daraus ergibt
sich ein Mittelwert der Steigungen von 0.0021 Absorptionsein
heiten pro Minute. Ein Vergleich mit der Enzymaktivität der T-GOD-Stammlösung
zeigt, daß diese Absorptionszunahme einer Pro
teinmasse auf dem gesamten Sensor von 18.5 ng entspricht.
Die Bestimmung der Sensorempfindlichkeit sowie der Nachweis
grenze für polyklonale Antikörper gegen Glucoseoxidase er
folgte durch Variation der Antikörpermenge im Analytstrom.
Dazu wurden die Sensoren mit T-Glucoseoxidase über die be
schriebene photoinitiierte Reaktion beschichtet und zunächst
mit Rinderserumalbumin (4 mg/ml) gespült, um die unspezifi
schen Bindungsstellen zu blockieren. Da die Sensoren im Durch
fluß mit dem Protein beprobt wurden, zeigten sie unterschied
liche Abscheidungsgeschwindigkeiten, die dann aber alle zu ei
ner (innerhalb eines Fehlerbereichs von 10%) Frequenzänderung
von 35 kHz gelangten.
Die so vorbehandelten Sensoren wurden dann einzeln mit Anti
körperlösung beprobt, wobei der Analyt - polyklonale Antikör
per gegen Glucoseoxidase - im Kreislauf über die Sensoren ge
leitet wurde. Dabei wurden jeweils unterschiedliche Antikör
permengen in 5 ml Phosphatpuffer gelöst und über die Sensoren
geleitet. Die Konzentrationsreihe, die in Auszügen in Fig. 2
dargestellt ist, beinhaltete einen Bereich von 2-200 µg/ml
Antikörper (entspricht 10-1000 µg).
Es sind verschiedene Frequenzabnahmen sowie unterschiedliche
Anfangsgeschwindigkeiten der Immunoreaktionen zu erkennen.
Die Änderung der Resonanzfrequenz des Oszillators wurde gegen
die Antikörpermenge im Analytstrom aufgetragen. Die Steigung
der Gerade gibt die Sensorempfindlichkeit wieder, die zu 58.8
Hz/µg bestimmt wurde.
Um die Korrelation zwischen Antikörpermenge und Reaktionsge
schwindigkeit zu bestimmen, wurde für jede Messung die An
fangsgeschwindigkeit der Immunoreaktion ermittelt. Aus den
Meßpunkten innerhalb der ersten Minute nach Analytzugabe
konnte durch lineare Regression die Frequenzabnahme pro
Zeiteinheit berechnet werden. Die Korrelationskoeffizienten
waren bei allen ausgewerteten Kurven deutlich größer als 0.98.
Die so ermittelten Anfangsgeschwindigkeiten korrelieren mit
der zugegebenen Antikörpermenge. Es resultiert ein deutlich
linearen Zusammenhang zwischen den beiden Größen (r = 0.9822).
Die Steigung der Regressionsgerade beträgt 4.92 Hz/(sµg).
Um die Nachweisgrenze für polyklonale Antikörper gegen Gluco
seoxidase zu bestimmen, geht man wie folgt vor.
Die Empfindlichkeit beträgt 58.8 Hz/µg, der Achsenabschnitt
wurde mit 27.1 kHz bestimmt. Mit diesen Werten kann unter Ein
bezug des dreifachen Rauschsignals der Sensoren (120 Hz), die
Nachweisgrenze für polyklonale Antikörper gegen Glucoseoxidase
zu 2 µg bzw. 13.6 pmol bestimmt. Da die jeweilige Antikörper
menge in 5 ml Phosphatpuffer eingewogen wurde, entspricht die
ser Wert einer minimal detektierbaren Konzentration von 2.7
nmol/l.
Das beschriebene Beschichtungsverfahren kann auch auf andere
Sensor- bzw. Meßprinzipien übertragen werden. Beispielsweise
können die Sensorchips des Optischen Gitterkopplers in glei
cher Weise mit modifizierten Rezeptormolekülen beschichtet
werden.
Als mögliche Rezeptormoleküle können Enzyme, Antigene und An
tikörper sowie Nukleinsäuren verwendet werden.
Ein Beispiel für eine Beschichtung ist an dem Antigen Gluco
seoxidase gezeigt, das direkt mit 3-Trifluoromethyl-3-(m-isothiocyanophenyl)-diazirin
(TRIMID) umgesetzt wurde, um so
zu einem photoreaktiven Protein zu gelangen. Den Antikörper
selbst mit TRIMID zu modifizieren ist prinzipiell ebenso mög
lich, aber kostenintensiver.
Der Syntheseweg konnte nicht direkt von dem literaturbekannten
T-BSA auf T-GOD übertragen werden, da Glucoseoxidase das Coen
zym FAD enthält, das nicht kovalent an das Enzym gebunden ist.
Durch die Umsetzung von GOD mit TRIMID bei pH 11.4 mittels In
kubation bei 50°C wurde Glucoseoxidase zwar mit TRIMID modifi
ziert, das Coenzym aber war abgetrennt, was durch das UV-Spek
trum nachgewiesen wurde. Es konnte eine Schulter bei 348 nm
(TRIMID) festgestellt werden, die FAD-Peaks bei 375 bzw. 450
nm waren nicht mehr zu erkennen.
Untersuchungen haben gezeigt, daß die Inkubation bei 50°C zur
Abtrennung des Coenzyms führt, die Behandlung des Enzyms bei
pH=11.4 diese Dissoziation jedoch nicht herbeiführt.
T-GOD wurde deshalb nach folgender Vorschrift hergestellt:
18 mg Glucoseoxidase und 1.27 g -D-Glucose wurden in 0.1 Vol-% TEA (in Wasser, pH = 11.4) gelöst und die resultierende Lösung mit reinem TEA auf einen pH von 10.4 eingestellt.
18 mg Glucoseoxidase und 1.27 g -D-Glucose wurden in 0.1 Vol-% TEA (in Wasser, pH = 11.4) gelöst und die resultierende Lösung mit reinem TEA auf einen pH von 10.4 eingestellt.
Zugabe von 170 µl TRIMID (29 µmol/l) in Chloroform
30 sec im Ultraschallbad beschallen, wobei eine milchig gelbe
Suspension entstand
2 Stunden bei 37°C im Wasserbad inkubieren
über eine Sephadex G-25-Säule in 1.5 mM NaCl, 0.05 mM Natrium phosphatpuffer (pH=7.4) chromatographieren.
2 Stunden bei 37°C im Wasserbad inkubieren
über eine Sephadex G-25-Säule in 1.5 mM NaCl, 0.05 mM Natrium phosphatpuffer (pH=7.4) chromatographieren.
Eine Bestimmung der Proteinkonzentration ist mit der Methode
nach Lowry möglich. Dazu wurde ein speziell vorbereiteter BSA-Standard
als Referenz vermessen und die Extinktionen des T-GOD
darauf bezogen.
Für diese Untersuchung war eine Stammlösung aus 0.5 ml 2%iger
CuSO₄-Lösung, 0.5 ml 2%-iger Tartratlösung und 49 ml 2%-iger
Na₂CO₃-Lösung in 0.1 M NaOH notwendig. Um die Proteinkonzen
tration der Fraktionen 12 und 13 zu bestimmen, wurden 100 µl
mit PBS (1 : 100) auf 1 ml verdünnt und 6 Proben hergestellt,
indem jeweils 10 µl, 20 µl und 30 µl auf 200 µl mit PBS
(1 : 100) verdünnt wurden (Doppelbestimmung). Zu diesen Proben
kam je 1 ml der Stammlösung hinzu, das Gemisch wurde 10 min
stehen gelassen.
Anschließend erfolgte die Zugabe von 100 µl 0.5 N Folinlösung,
die ein Extinktionsmaximum bei 578 nm erzeugt, was nach 30 min
vermessen werden konnte. Mit Hilfe des BSA-Standards konnte
anschließend die Proteinmenge von T-GOD errechnet werden; es
ergab sich eine Proteinmassenkonzentration von 4.22 mg/ml.
Der Trimidgehalt eines Proteins kann durch den Extinktionsun
terschied einer Probe vor und nach dem Belichten bei 348 nm
überprüft werden. Bei Glucoseoxidase stellt sich das Problem,
daß die FAD-Moleküle in diesem Bereich ebenfalls Licht absor
bieren, was den TRIMID-Peak überdeckt. Bei der Bestimmung des
TRIMID-Anteils in T-GOD wurde die Tatsache ausgenutzt, daß das
FAD nach einer Inkubation bei erhöhter Temperatur vom Enzym
abgetrennt wird. Da der FAD-Peak die Absorptionsbande von TRIMID
überlagert, wurde zur Detektion von TRIMID zunächst das
FAD abgetrennt, indem das Protein (jeweils 500 µl) 2 h bei 50°C
inkubiert und anschließend die Lösung über eine PD10-Säule
chromatographiert wurde. In der Enzymfraktion war danach nur
noch der Proteinpeak bei 280 nm erkennbar.
Die Proteinfraktion wurde dann in der Küvette 2mal je 10 min
belichtet und nach jeder Belichtung ein Absorptionsspektrum
aufgenommen. Man erkennt in Fig. 3 deutlich eine Veränderung
der Absorption zwischen 340 nm und 400 nm, also im Bereich der
TRIMID-Bande.
Der Gehalt an kovalent gebundenem TRIMID betrug 8 ± 2 mol TRI-
MID pro mol Glucoseoxidase.
Die enzymatische Aktivität des modifizierten Proteins konnte
spektroskopisch mittels des oben beschriebenen enzymatischen
Assays ermittelt werden. Dazu wurden 50 µl T-GOD, die 8.73 µg
Protein enthielten untersucht.
Mit dieser Methode wurde die enzymatische Aktivität der ver
wendeten Glucoseoxidaselösungen bestimmt. In Fig. 4 ist die
Kinetik der enzymatischen Katalyse der Stammlösung (GOD) sowie
die des modifizierten Enzyms (T-GOD) dargestellt.
Durch den linearen Teil der Kurve wurde mittels linearer Re
gression jeweils eine Gerade bestimmt. Diese diente als Kali
briergerade zur Detektion der enzymatischen Aktivität der je
weiligen Glucoseoxidase auf dem Sensor.
Die Bestimmung der Absorptionszunahme mittels linearer Regres
sion ergab für T-GOD einen Wert von 0.989 min-1. Mit Hilfe des
Lambert-Beer′schen Gesetzes kann daraus die spezifische En
zymaktivität der modifizierten Glucoseoxidase mit 34.92
units/mg bestimmt werden. Im Vergleich dazu besitzt die nicht
modifizierte Glucoseoxidase einen Wert von 87.59 units/mg.
Um die Anbindung von T-GOD auf einer Oberfläche und im spe
ziellen an Polyimid zu beobachten, wurde das erzeugte T-GOD
mit [¹⁴C) markiert. Dazu wurde die Glucoseoxidase zunächst re
duktiv methyliert und anschließend auf einer polyimidisierten
Oberfläche immobilisiert.
Bei der reduktiven Methylierung werden Aminofunktionen mit
Formaldehyd umgesetzt und die entstehenden Schiffschen Basen
reduziert. Diese hochspezifische Reaktion greift nur die -Ami
nogruppen der Lysineinheiten im Protein sowie den N-Terminus
in der Aminosäuresequenz an. Um eine Denaturierung durch Zer
störung der Disulfidbrücken sowie die sofortige Reduktion des
Formaldehyds zu vermeiden, wird als mildes Reduktionsmittel
Natriumcyanborhydrid verwendet, was zu N,N-Dimethylderivaten
führt. Es resultiert eine nahezu vollständige Umsetzung bei
Einsatz des sechsfachen Überschusses an Formaldehyd, bezogen
auf die Proteinmasse.
Da die reduktive Methylierung in HEPES-Puffer (pH=7.5) ab
läuft, wurde 1 ml T-GOD (4.22 mg/ml) über einer PD10-Säule um
gepuffert und die Proteinfraktion zur radioaktiven Markierung
verwendet. Dabei wurde wie folgt vorgegangen:
800 µl dieser Proteinfraktion wurden in ein lichtgeschütztes Reaktionsgefäß gebracht (Schutz der TRIMID-Gruppe) Zugabe von 6.5 µl [¹⁴C)-Formaldehyd (=200 nmol), mit einer Ra dioaktivität von 11.6 µCl Zugabe von 100 µl NaCNBH₃, (=240 mmol/l) auffüllen mit HEPES-Puffer auf 1 ml 3 h rühren bei Raumtemperatur das Produkt wurde über einer PD10-Säule chromatographiert, um überschüssiges Formaldehyd abzutrennen.
800 µl dieser Proteinfraktion wurden in ein lichtgeschütztes Reaktionsgefäß gebracht (Schutz der TRIMID-Gruppe) Zugabe von 6.5 µl [¹⁴C)-Formaldehyd (=200 nmol), mit einer Ra dioaktivität von 11.6 µCl Zugabe von 100 µl NaCNBH₃, (=240 mmol/l) auffüllen mit HEPES-Puffer auf 1 ml 3 h rühren bei Raumtemperatur das Produkt wurde über einer PD10-Säule chromatographiert, um überschüssiges Formaldehyd abzutrennen.
Die T-GOD-Fraktion des radioaktiv markierten Enzyms wurde wie
oben beschrieben auf den Proteingehalt untersucht. Es ergab
sich eine Proteinkonzentration von 0.915 mg/ml.
Um den Grad der radioaktiven Modifizierung von T-GOD zu be
stimmen, wurden jeweils 5 µl der einzelnen Fraktionen der
[¹⁴C)-T-GOD-Synthese mit 5 ml Szintillationslösung (eine Mi
schung aus 1080 ml Toluol p.a., 5.4 g 2,5-Diphenyloxazol
(PPO), 0.2 g 2,2′-p-Phenyl-bis-5-Phenyloxazol (POPOP), 920 ml
Triton und 40 ml Eisessig) vermischt (Vortex) und die -Strah
lung mit einem Szintillationszähler bestimmt.
In der Proteinfraktion wurde eine Aktivität von 2793 dpm
(dpm=decompositions per minute) gefunden. Die Korrelation die
ser Werte mit den Ergebnissen der Proteinbestimmung nach Lowry
des radioaktiv markierten Proteins ergab 597 dpm/µg Protein.
Die enzymatische Aktivität der radioaktiv markierten Protein
fraktion wurde wiederum mittels des enzymatischen Assays be
stimmt. Dazu wurden 20 µl der Proteinfraktion mit HEPES auf
200 µl verdünnt und von 50 µl dieser Lösung (= 4.6 µg) die en
zymatische Aktivität bestimmt.
Die Auswertung ergab eine Absorptionszunahme von 0.27 min-1,
was einer spezifischen Enzymaktivität von 18.19 units/mg ent
spricht. Das bedeutet, daß selbst nach zwei Modifikationen des
Proteins die enzymatische Aktivität noch vorhanden ist.
Um die Ankopplung des Proteins an eine polyimidisierte Ober
fläche zu beobachten, wurden Deckplättchen aus Glas polyimidi
siert, anschließend mit [¹⁴C]-T-GOD beschichtet und die Radio
aktivität gemessen. Die Polyimidisierung von hydrophilen Ober
flächen ist neben anderen Methoden eine wichtige Grundlage für
Immobilisationen auf akustoelektrischen Bauelementen.
Auf die polyimidisierten Glasplättchen wurden 30-50 µl des ra
dioaktiv markierten Enzyms aufgebracht, nach einer definierten
Einwirkzeit belichtet und anschließend gewaschen. Als Kon
trollexperiment wurden analog behandelte, jedoch unbelichtete
Plättchen mitgeführt.
Die Waschprozedur bestand aus fünfmaligem Spülen der Plättchen
mit einer Lösung aus 50 mM PBS, 150 mM NaCl sowie 0.02 Vol-%
TWEEN 20. Zur Bestimmung der Radioaktivität wurden die Abdeck
plättchen in die Szintillationsröhren gebracht, mit 5 ml Szin
tillationslösung bedeckt und nach kurzem Mischen (Vortex) die
-Strahlung der polyimidisierten Glasträger bestimmt. In Fig. 5
ist zu erkennen, daß die Belichtung nach 30 min Einwirken
keine Anbindung an das Polyimid bewirkt. Die Strahlung dieser
Glasplättchen liegt etwa in der gleichen Größenordnung wie die
der unbelichteten Kontrollproben. Erst nach wesentlich länge
ren Einwirkzeiten vor der Belichtung bzw. partielle Trocknung
durch Anlegen eines Vakuums, was einen völlig eingetrockneten
Proteinfilm zur Folge hatte, kommt es zur kovalenten Anbindung
des Proteins an das Polyimid, was durch die deutlich höhere
Radioaktivität der entsprechenden Glasträger zu erkennen ist.
Eine Photoimmobilisation von T-GOD auf Polyimid ist folglich
möglich, sofern nur wenig Wasser in der Proteinmatrix vorhan
den ist. Bei Anwesenheit von Wasser ist der Modifizierungsgrad
von T-GOD mit TRIMID zu gering, so daß alle durch Belichtung
erzeugten Carbene mit Wasser abreagieren und es zu keiner
meßbaren Anbindung an die Oberfläche kommt. Weiterhin zeigen
diese Untersuchungen, daß die gewählte Waschprozedur geeignet
ist, unspezifisch anhaftende Proteinmoleküle von der polyimi
disierten Oberfläche zu entfernen sowie Restradioaktivität
auszuwaschen.
Claims (3)
1. Sensor zum Nachweis von Proteinen nach dem Prinzip der
Schlüssel-Schloß Reaktion bestehend aus einem Sensorkörper,
von dem eine Oberfläche mit einer Polymerschicht überzogen
ist, wobei an die Polymerschicht die Rezeptormoleküle der
Schlüssel-Schloß Reaktion gebunden sind, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Bindung zwischen dem Polymer und den Re
zeptormolekülen durch ein photoreaktives Molekül vermittelt
wird, welches kovalent am Rezeptormolekül gebunden ist und
in eine C-H-Bindung des Polymers insertiert, wobei das
photoreaktive Molekül 3-Trifluoromethyl-3-(m-isothiocyano
phenyl)-diazirin (TRIMID) ist.
2. Verfahren zum Beschichten von Sensoren gemäß Anspruch 1 mit
Proteinen, wobei die Oberfläche des Sensors modifiziert
wird und wobei auf der Sensoroberfläche eine silanhaltige
Promoterschicht aufgebracht und daran eine Polymerschicht
angebunden wird, gekennzeichnet durch folgende Verfahrens
schritte:
- a) modifizieren der Proteine durch Anbinden von carbener zeugenden Molekülen an die Lysineinheiten der Aminosäu resequenzen der Proteine, wobei die carbenerzeugenden Moleküle TRMID sind,
- b) aufbringen der modifizierten Proteine auf die Polymer schicht,
- c) partielle Trocknung dieser Schicht und
- d) kovalente Anbindung der modifizierten Proteine an die Polymerschicht durch Einwirkung von UV-Licht.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der
Trocknungsgrad der Schicht durch anlegen von Vakuum
erreicht wird.
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