DE19604336B4

DE19604336B4 - Device for photostimulation with a microscope

Info

Publication number: DE19604336B4
Application number: DE1996104336
Authority: DE
Inventors: Hans-Ulrich Dodt
Original assignee: Dodt Hans-Ulrich Dr
Current assignee: Dodt Hans-Ulrich Dr
Priority date: 1996-02-07
Filing date: 1996-02-07
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2016-02-08
Also published as: DE19604336A1

Abstract

Mikroskop,
– mit einer Auflichtbeleuchtung zur Photostimulation einer zu untersuchenden Probe
– und einer Durchlichtbeleuchtung zur Beobachtung der angeregten Probe im Durchlicht,
dadurch gekennzeichnet, dass
– in eine Pupillenebene des Auflichtstrahlengangs eine Zentralblende eingebracht ist, die den Zentralbereich des Auflichtstrahlengangs ausblendet und damit das Anregungslicht hohlkegelartig in die Fokusebene fokussiert und Streulicht innerhalb des Beleuchtungshohlkegels vermindert.Microscope,
- With incident light for photostimulation of a sample to be examined
And transmitted light illumination for observing the excited sample in transmitted light,
characterized in that
- A central aperture is introduced into a pupil plane of the incident light beam path, which fades out the central region of the incident light beam path and thus focuses the excitation light like a hollow cone into the focus plane and reduces stray light within the hollow illumination cone.

Description

Das Infrarotmikroskop erlaubt die Sichtbarmachung von Nervenzellen in vitalen Hirnschnitten von Ratten unter dem Mikroskop. Wenn verestertes Glutamat in die Badlösung gegeben wird, kann die Esterbindung durch UV-Beleuchtung lokal gespalten werden und einzelne Nervenzellen werden so chemisch gereizt. Dies wird erreicht (1), indem UV-Licht von einer intensiven Lichtquelle (z.B. Laser oder Hochdrucklampe) über eine dünne Quarzfaser 1 übertragen wird. Das Ende der Quarzfaser wird in einer Bildebene 2 des Epifluoreszenzstrahlenganges 3 positioniert. Dieses Ende wird in die Objektebene 4 stark verkleinert abgebildet, so dass große Bereiche selektiv stimuliert werden können. Eine besonders interessante Ausführungsform (2) der Erfindung stellt die Einfügung einer Zwischenabbildung dar. Durch Einfügung einer Zentralblende 1 in eine Abbildung der Pupillenebene wird das Präparat nur von einem Hohlkegel von UV-Licht durchstrahlt (3). Dadurch werden hohe Beleuchtungsstärken nur in der Fokusebene 1 erreicht, und nur dort Glutamat freigesetzt. Die Zentralbereiche 2 des bei konventioneller Beleuchtung entstehenden Lichtkegels werden nicht durchstrahlt.The infrared microscope enables the visualization of nerve cells in vital brain sections of rats under the microscope. If esterified glutamate is added to the bath solution, the ester bond can be broken down locally by UV lighting and individual nerve cells are thus chemically stimulated. This is achieved ( 1 ) by UV light from an intense light source (e.g. laser or high pressure lamp) over a thin quartz fiber 1 is transmitted. The end of the quartz fiber is in an image plane 2 of the epifluorescence beam path 3 positioned. This end is in the object level 4 depicted in a greatly reduced size so that large areas can be selectively stimulated. A particularly interesting embodiment ( 2 ) of the invention represents the insertion of an intermediate image. By inserting a central aperture 1 In a picture of the pupil plane, the specimen is only irradiated by a hollow cone of UV light ( 3 ). As a result, high illuminance levels are only in the focal plane 1 reached, and only there released glutamate. The central areas 2 the cone of light created with conventional lighting is not illuminated.

Bei Beleuchtung größerer Flächen mit flächenhaften Lichtquellen kann dieses Prinzip auch zur Verbesserung der Tiefendis krimination in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden, da Objekte außerhalb der Fokusebene kein Streulicht mehr abgeben.When illuminating larger areas with areal Light sources can also use this principle to improve depth discrimination be used in fluorescence microscopy since objects are outside no longer give off stray light at the focal plane.

Wird als Lichtquelle ein durchstimmbarer Farbstofflaser verwandt, so kann mit Licht verschiedener genau definierter Wellenlängen stimuliert werden. Wirksame Substanzen können mit verschiedenen chemischen Gruppen verestert werden, so dass die verschiedenen Esterbindungen mit spezifischen Wellenlängen selektiv aufgebrochen werden.Becomes a tunable dye laser as a light source related, can be stimulated with light of different precisely defined wavelengths become. Effective substances can are esterified with different chemical groups so that the different ester bonds with specific wavelengths selective be broken up.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Photostimulation von neuronalem Gewebe mit einem Mikroskop.The present invention relates on a device for photostimulation of neuronal tissue with a microscope.

Stand der TechnikState of the art

Photostimulation von neuronalem Gewebe durch Spaltung von verestertem Glutamat mit ultraviolettem (UV-)Licht wurde beschrieben.Photostimulation of neuronal tissue by Cleavage of esterified glutamate with ultraviolet (UV) light has been described.

Darüber hinaus ist aus der Druckschrift US 4,148,552 ein Mikroskop mit einer Auflichtanregung des zu untersuchenden Objektes über eine erste Lichtquelle und mit einer Durchlichtbeobachtung des Objektes über eine zweite Lichtquelle bekannt, wobei ein halbdurchlässig ausgebildeter Spiegel die beiden Beleuchtungsstrahlengänge zusammenführt.It is also from the publication US 4,148,552 a microscope with incident light excitation of the object to be examined via a first light source and with transmitted light observation of the object via a second light source is known, a semi-transparent mirror bringing the two illumination beam paths together.

Die Druckschrift DE 32 30 504 C3 offenbart ein Mikroskop mit einer Auflicht-Photostimulation oder wahlweise mit einer Durchlichtbeobachtung.The publication DE 32 30 504 C3 discloses a microscope with reflected light photo stimulation or optionally with transmitted light observation.

Aus der Druckschrift DE 195 14 358 A1 ist eine Kontrastvorrichtung für ein Mikroskop bekannt, bei der neuronales Gewebe zur Kontrastverbesserung mit einem spitz zulaufenden Ausschnitt eines Lichtkegelmantels in Form eines Lichtschwertes beleuchtet wird, und die Druckschrift WO 94/22001 A1 offenbart ein Flusscytomer, bei dem das vom registrierenden Objektiv aufgenommene Anregungslicht durch eine Zentralblende ausgeblendet wird, so dass dieses Objektiv nur die Fluoreszenz- und Streulicht enthaltende Randstrahlung aufnimmt.From the publication DE 195 14 358 A1 a contrast device for a microscope is known in which neural tissue is illuminated in the form of a lightsaber in the form of a lightsaber in order to improve contrast with a tapering section of a light cone jacket, and the publication WO 94/22001 A1 discloses a flow cytomer in which the excitation light picked up by the registering lens is masked out by a central diaphragm, so that this lens only receives the edge radiation containing fluorescence and scattered light.

Nachteile des Standes der TechnikDisadvantages of the State of the art

Die Auflösung der Systeme in der Z-Achse war bisher sehr gering.The resolution of the systems in the Z axis was so far very little.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, für die Anregung der zu untersuchenden Probe eine verbesserte Tiefendiskrimination zu gewährleisten.The object of the present invention is for the excitation of the sample to be examined an improved depth discrimination to ensure.

Vorteile der ErfindungAdvantages of invention

Die Erfindung erlaubt gezielte Photostimulation von Zellen, die mit dem Verfahren der Infrarotvideomikroskopie in dicken Objekten sichtbar gemacht wurden.The invention allows targeted photo stimulation of cells using the method of infrared video microscopy in thick objects have been made visible.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.The object of the invention is achieved by a Device according to claim 1. Advantageous embodiments are in the subclaims characterized.

Die Erfindung nimmt Bezug auf die begleitenden Zeichnungen, in welchen The invention relates to accompanying drawings, in which

1 eine schematische Ansicht des Strahlenganges einer Ausführungsform der Erfindung zeigt, 1 1 shows a schematic view of the beam path of an embodiment of the invention,

2 eine schematische Ansicht des Strahlenganges einer Ausführungsform der Erfindung zeigt, mit Zwischenabbildung zum Einfügen einer Zentralblende. 2 shows a schematic view of the beam path of an embodiment of the invention, with intermediate image for inserting a central aperture.

3 den Strahlengang in dicken Objekten zeigt, bei Verwendung einer Zentralblende in einer Pupillenebene des Auflichtstrahlenganges. 3 shows the beam path in thick objects when using a central diaphragm in a pupil plane of the incident light beam path.

Claims

Mikroskop, – mit einer Auflichtbeleuchtung zur Photostimulation einer zu untersuchenden Probe – und einer Durchlichtbeleuchtung zur Beobachtung der angeregten Probe im Durchlicht, dadurch gekennzeichnet, dass – in eine Pupillenebene des Auflichtstrahlengangs eine Zentralblende eingebracht ist, die den Zentralbereich des Auflichtstrahlengangs ausblendet und damit das Anregungslicht hohlkegelartig in die Fokusebene fokussiert und Streulicht innerhalb des Beleuchtungshohlkegels vermindert.Microscope, - with reflected light for photostimulation of a sample to be examined - and transmitted light illumination for observing the excited sample in transmitted light, characterized that - A central aperture is introduced into a pupil plane of the incident light beam path, which fades out the central region of the incident light beam path and thus focuses the excitation light like a hollow cone into the focus plane and reduces stray light within the hollow illumination cone.

Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge der anregenden Auflichtbeleuchtung im Ultravioletten und die Wellenlänge der Durchlichtbeleuchtung im Infraroten liegt.Microscope according to claim 1, characterized in that the wavelength the stimulating reflected light in the ultraviolet and the wavelength of the Transmitted light illumination is in the infrared.

Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus neuronalem Gewebe besteht und eingelagerte Ester-Gemische aufweist, die durch die Auflichtbeleuchtung spaltbar sind.Microscope according to claim 1 or 2, characterized in that the sample consists of neuronal tissue and embedded ester mixtures has that can be split by the reflected light.

Mikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Auflichtbeleuchtung aus einem durchstimmbaren Farbstofflaser besteht, der unterschiedliche, eingelagerte Ester selektiv spaltet.Microscope according to claim 3, characterized in that the Reflected light consists of a tunable dye laser, which selectively cleaves the different, embedded esters.