DE19603649A1

DE19603649A1 - Recombinant expression of S-layer proteins

Info

Publication number: DE19603649A1
Application number: DE19603649A
Authority: DE
Inventors: Werner Lubitz; Uwe Sleytr; Beatrix Kuen; Michaela Truppe; Stefan Howorka; Stepanka Resch; Gerhard Schroll; Margit Sara
Original assignee: SLEYTR UWE PROF DR WIEN AT
Current assignee: LUBITZ, WERNER, PROF. DR., KLOSTERNEUBURG, AT
Priority date: 1996-02-01
Filing date: 1996-02-01
Publication date: 1997-08-07
Also published as: NZ331300A; JP4077878B2; DE59712554D1; US20040265936A1; ATE316138T1; AU713999B2; US6777202B2; CA2245584C; JP2000503850A; EP0882129B1; AU1720397A; US20020168728A1; CA2245584A1; EP0882129A1; WO1997028263A1; CN1213402A

Abstract

The invention concerns processess for the recombinant preparation of S-layer proteins in gram-negative host cells. In addition, the nucleotide sequence of a new S-layer gene and a process for preparation of modified S-layer proteins is disclosed.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur rekombinanten Herstellung von S-Layer-Proteinen und modifizierten S-Layer- Proteinen in gram-negativen Wirtszellen.The present invention relates to recombinant methods Production of S-layer proteins and modified S-layer Proteins in gram-negative host cells.

Kristalline bakterielle Zelloberflächenlayer (S-Layer) bilden in vielen Eubakterien und den allermeisten Archaebakterien die äußerste Zellwandkomponente (Sleytr et al. (1988), Crystalline Bacterial Cell Surface Layers, Springer Verlag Berlin; Messner und Sleytr, Adv. Mikrob. Physiol. 33 (1992), 213-275). Die mei sten der gegenwärtig bekannten S-Layer-Proteine sind aus iden tischen Proteinen bzw. Glykoproteinen zusammengesetzt, die scheinbare Molekulargewichte im Bereich von 40 000 bis 220 000 aufweisen. Die Komponenten von S-Layern sind selbst-assemblie rend und die meisten Gitter haben eine schräge (p2), quadra tische (p4) oder hexagonale (p6) Symmetrie. Die Funktionen von bakteriellen S-Layern sind immer noch nicht vollständig be kannt, aber aufgrund ihrer Lokalisierung an der Zelloberfläche dürften die porösen kristallinen S-Layer hauptsächlich als Schutzhüllen, Molekularsiebe oder zur Förderung der Zelladhä sion und Oberflächenerkennung dienen.Form crystalline bacterial cell surface layers (S-layer) in many eubacteria and the vast majority of archaebacteria outermost cell wall component (Sleytr et al. (1988), Crystalline Bacterial Cell Surface Layers, Springer Verlag Berlin; Messner and Sleytr, Adv. Mikrob. Physiol. 33: 213-275 (1992). The mei Most of the currently known S-layer proteins are from iden table proteins or glycoproteins composed, the apparent molecular weights in the range of 40,000 to 220,000 exhibit. The components of S-Layers are self-assembling rend and most grids have an oblique (p2), quadra tables (p4) or hexagonal (p6) symmetry. The functions of bacterial S-layers are still not completely knows, but because of their location on the cell surface the porous crystalline S-layers mainly as Protective covers, molecular sieves or to promote cell adhesion sion and surface recognition.

Genetische Daten und Sequenzinformationen sind für verschie dene S-Layer-Gene aus Mikroorganismen bekannt. Eine Übersicht findet sich bei Peyret et al., Mol. Mikrobiol. 9 (1993), 97-109. Auf diese Daten wird ausdrücklich Bezug genommen. Die Sequenz des für das S-Layer-Protein von B.stearothermophilus PV72 kodierenden Gens sbsA und ein Verfahren zu dessen Klonierung sind bei Kuen et al. (Gene 145 (1994), 115-120) angegeben.Genetic data and sequence information are different S-layer genes known from microorganisms. An overview can be found in Peyret et al., Mol. Mikrobiol. 9: 97-109 (1993). Reference is expressly made to this data. The sequence for the S-layer protein from B.stearothermophilus PV72 coding gene sbsA and a method for its cloning are in Kuen et al. (Gene 145 (1994), 115-120).

B.stearothermophilus PV72 ist ein gram-positives Bakterium, das mit einem hexagonal angeordneten S-Layer bedeckt ist. Die Hauptkomponente des S-Layer ist ein 128 kd-Protein, bei dem es sich um das häufigste Protein in der Zelle mit einem Anteil von ungefähr 15% bezüglich der gesamten Proteinbestandteile handelt. Es sind verschiedene Stämme von B.stearothermophilus charakterisiert worden, die hinsichtlich des Typs von S-Layer- Gitter, dem Molekulargewicht und der Glykosilierung der S- Layer-Komponenten unterschiedlich sind (Messner und Sleytr (1992), supra).B.stearothermophilus PV72 is a gram-positive bacterium, that is covered with a hexagonal S-layer. The The main component of the S-Layer is a 128 kd protein, in which it is the most common protein in the cell with a share about 15% of the total protein components acts. There are different strains of B.stearothermophilus characterized in terms of the type of S-layer Lattice, molecular weight and glycosylation of the S- Layer components are different (Messner and Sleytr (1992), supra).

Die deutsche Patentanmeldung P 44 25 527.6 offenbart den Si gnalpeptid-kodierenden Abschnitt des S-Layer-Gens aus B.stea rothermophilus und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Die Spalt stelle zwischen dem Signalpeptid und dem reifen Pro tein befindet sich zwischen Position 30 und 31 der Aminosäure sequenz. Die Signalpeptid-kodierende Nukleinsäure kann opera tiv mit einer Protein-kodierenden Nukleinsäure verknüpft wer den und zur rekombinanten Herstellung von Proteinen in einem Verfahren verwendet werden, bei dem man eine transformierte Wirtszelle bereitstellt, die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die zu einer Expression der Nukleinsäure und zu einer Erzeugung und Sekretion des davon kodierten Polypeptids führen, und das resultierende Polypeptid aus dem Kulturmedium gewinnt. Als Wirtszellen werden vorzugsweise prokaryontische Organismen, insbesondere gram-positive Organismen der Gattung Bacillus genannt.The German patent application P 44 25 527.6 discloses the Si Signal peptide-coding section of the S-layer gene from B.stea rothermophilus and the amino acid sequence derived from it. The gap is between the signal peptide and the mature pro tein is between positions 30 and 31 of the amino acid sequence. The signal peptide-encoding nucleic acid can be opera tiv linked to a protein-encoding nucleic acid and for the recombinant production of proteins in one Process used in which a transformed Provides host cell, the host cell under conditions cultivated, which lead to expression of the nucleic acid and generation and secretion of the polypeptide encoded thereby lead, and the resulting polypeptide from the culture medium wins. Prokaryotic cells are preferred as host cells Organisms, especially gram-positive organisms of the genus Called Bacillus.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die rekombinante Herstellung von S-Layer-Proteinen nicht nur in gram-positiven prokaryontischen Wirtszellen, sondern auch in gram-negativen prokaryontischen Wirtszellen möglich ist. Dabei bildet sich das S-Layer-Protein im Inneren der Wirtszelle nicht in Form von ungeordneten Einschlußkörpern, sondern unerwarteterweise in Form von geordneten monomolekularen Schichten.Surprisingly, it was found that the recombinant Production of S-layer proteins not only in gram-positive ones prokaryotic host cells, but also in gram-negative prokaryotic host cells is possible. It forms the S-layer protein inside the host cell is not in shape of disorderly inclusion bodies, but unexpectedly in the form of ordered monomolecular layers.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Ver fahren zur rekombinanten Herstellung von S-Layer-Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) eine gram-negative proka ryontische Wirtszelle bereitstellt, die transformiert ist mit einer für ein S-Layer-Protein kodierenden Nukleinsäure, ausge wählt aus (i) einer Nukleinsäure, welche die von Position 1 bis 3684 in SEQ ID NO. 1 gezeigte Nukleotidsequenz gegebenen falls ohne den Signalpeptid-kodierenden Abschnitt umfaßt, (ii) einer Nukleinsäure, welche eine der Nukleinsäure aus (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz umfaßt, und (iii) einer Nukleinsäure, welche eine mit den Nukleinsäuren aus (i) oder/und (ii) unter strin genten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt; (b) die Wirtszelle unter solchen Bedingungen kultiviert, die zu einer Expression der Nukleinsäure und zu einer Erzeugung des davon kodierten Polypeptids führen und (c) das resultie rende Polypeptid aus der Wirtszelle gewinnt.An object of the present invention is thus a method for the recombinant production of S-layer proteins, characterized in that (a) a gram-negative prokyonotic host cell is provided which is transformed with a coding for an S-layer protein Nucleic acid selected from (i) a nucleic acid which has the position 1 to 3684 in SEQ ID NO. 1 shown nucleotide sequence optionally without the signal peptide coding section, (ii) a nucleic acid which comprises a nucleotide sequence corresponding to the nucleic acid from (i) in the context of the degeneracy of the genetic code, and (iii) a nucleic acid which is one with the nucleic acids nucleotide sequence hybridizing from (i) or / and (ii) under strict conditions; (b) cultivating the host cell under conditions which lead to expression of the nucleic acid and generation of the polypeptide encoded thereby and (c) the resulting polypeptide is obtained from the host cell.

Unter dem Begriff "stringente Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man, daß eine Hybridisierung auch nach waschen bei 55°C, vorzugsweise 60°C, in einem wäß rigen Niedrigsalz-Puffer (z. B. 0,2 xSSC) noch auftritt (s. auch Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning. A. Laboratory Manual).Under the term "stringent hybridization" in the sense of present invention is understood to be a hybridization even after washing at 55 ° C, preferably 60 ° C, in an aq low salt buffer (e.g. 0.2 xSSC) still occurs (see also Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A. Laboratory Manual).

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in gram-negativen prokary ontischen Wirtszellen durchgeführt. Dabei wird überraschender weise im Zellinneren eine geordnete S-Layer-Proteinstruktur erhalten. Vorzugsweise werden als Wirtszellen Enterobakterien, insbesondere E. coli, verwendet. Besonders bevorzugt ist der E. coli-Stamm pop2125, der am 31.01.1996 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschero der weg 1b, D 38124 Braunschweig unter dem Aktenzeichen DSM 10509 hinterlegt wurde.The method according to the invention is in gram-negative prokary ontic host cells. This will be more surprising have an ordered S-layer protein structure inside the cell receive. Enterobacteria are preferably used as host cells, in particular E. coli used. The is particularly preferred E. coli strain pop2125, which on January 31, 1996 at the German Collection of microorganisms and cell cultures GmbH, Maschero der weg 1b, D 38124 Braunschweig under the file number DSM 10509 was deposited.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Gewinnung rekom binanter S-Layer-Proteine eingesetzt werden. Hierzu verwendet man eine für das S-Layer-Protein kodierende Nukleinsäure, die eine oder mehrere Insertionen enthält, die für Peptid- oder Polypeptidsequenzen kodieren. Diese Insertionen können einer seits nur für Peptide mit wenigen Aminosäuren, z. B. 1-25 Ami nosäuren, kodieren. Andererseits können die Insertionen auch für größere Polypeptide von z. B. bis zu 1000 Aminosäuren und vorzugsweise bis zu 500 Aminosäuren kodieren, ohne daß die Fähigkeit des S-Layer-Proteins zur Ausbildung einer korrekt gefalteten Struktur verlorengeht. Neben den Insertionen kann das rekombinante S-Layer-Protein auch Aminosäuresubstitutio nen, insbesondere Substitutionen einzelner Aminosäuren im Bereich der Insertionsorte sowie gegebenenfalls Deletionen einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von bis zu 30 Aminosäuren aufweisen.The method according to the invention can also be used for extraction binary S-layer proteins are used. Used for this a nucleic acid coding for the S-layer protein, the contains one or more insertions for peptide or Encode polypeptide sequences. These insertions can be one on the one hand only for peptides with few amino acids, e.g. B. 1-25 Ami encode. On the other hand, the insertions can also for larger polypeptides from e.g. B. up to 1000 amino acids and preferably encode up to 500 amino acids without the Ability of the S-layer protein to form a correctly folded structure is lost. In addition to the insertions the recombinant S-layer protein also amino acid substitution NEN, especially substitutions of individual amino acids in the The area of the insertion sites and any deletions single amino acids or short amino acid sections from to to have 30 amino acids.

Als insertionsstellen für Polypeptid-kodierende Sequenzen bevorzugt sind Bereiche zwischen den Positionen 1-1200 und 2200-3000 der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Nukleotidsequenz. Be sonders bevorzugte insertionsstellen sind die NruI-Schnitt stelle an Position 582, die PvuII-Schnittstelle an Position 878, die SnaB-I-Schnittstelle an Position 917, die PvuII- Schnittstelle an Position 2504 und die PvuII-Schnittstelle an Position 2649. Die Insertion einer für Streptavidin kodieren den Nukleinsäuresequenz konnte bereits in die NruI-Schnitt stelle an Position 581 gezeigt werden.As insertion sites for polypeptide coding sequences ranges between positions 1-1200 and 2200-3000 of the in SEQ ID NO. 1 shown nucleotide sequence. Be the particularly preferred insertion sites are the NruI section position 582, the PvuII interface position 878, the SnaB-I interface at position 917, the PvuII Interface at position 2504 and the PvuII interface Position 2649. Code the insertion of one for streptavidin the nucleic acid sequence could already be cut into the NruI be shown at position 581.

Die Peptid- oder Polypeptid-kodierenden Insertionen werden vorzugsweise ausgewählt aus Nukleotidsequenzen, die für Cy steinreste, Bereiche mit mehreren geladenen Aminosäuren, z. B. Arg, Lys, Asp oder Glu, oder Tyr-Resten, DNA-bindende Epitope, antigene, allergene oder immunogene Epitope, metallbindende Epitope, Streptavidin, Enzyme, Cytokine oder Antikörper-bin dende Proteine kodieren.The peptide or polypeptide encoding insertions preferably selected from nucleotide sequences which are suitable for Cy Stone residues, areas with several charged amino acids, e.g. B. Arg, Lys, Asp or Glu, or Tyr residues, DNA-binding epitopes, antigenic, allergenic or immunogenic epitopes, metal binding Epitopes, streptavidin, enzymes, cytokines or antibody-bin encoding proteins.

Ein besonders bevorzugtes Beispiel für eine Insertion in die für das S-Layer-Protein kodierende Nukleinsäure ist eine für Streptavidin kodierende Nukleotidsequenz. Auf diese weise können universelle Trägermoleküle erhalten werden, die zur Ankopplung von biotinylierten Reagenzien und zum Nachweis in immunologischen oder Hybridisierungstestverfahren geeignet sind. A particularly preferred example of an insertion in the nucleic acid encoding the S-layer protein is one for Streptavidin-encoding nucleotide sequence. In this way can be obtained universal carrier molecules that are used for Coupling of biotinylated reagents and for detection in immunological or hybridization test methods are suitable are.

Ein weiteres bevorzugtes Beispiel für Insertionen sind anti gene, allergene oder immunogene Epitope, z. B. Epitope aus pathogenen Mikroorganismen, wie etwa Bakterien, Pilzen, Para siten etc. und Viren, oder Epitope aus Pflanzen oder Epitope gegen körpereigene Substanzen, z. B. Cytokine, sowie gegen Toxine, insbesondere Endotoxine. Besonders bevorzugte Bei spiele für immunogene Epitope sind Epitope aus Herpesviren, wie etwa Herpesvirus 6 oder Pseudorabiesvirus (Lomniczi et al., J. Virol. 49 (1984), 970-979), insbesondere Epitope aus den Genen gB, gC oder/und gD, oder Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV), insbesondere Epitope aus den Genabschnitten, die für VP1, VP2 oder/und VP3 kodieren. Die immunogenen Epitope können so ausgewählt werden, daß sie die Erzeugung einer Antikörper vermittelten Immunreaktion fördern oder/und die Erzeugung einer zellulären Immunreaktion, z. B. durch Stimulation von T- Zellen, fördern. Beispiele für geeignete allergene Epitope sind Birkenpollenallergene, z. B. Bet v I (Ebner et al., J. Immunol. 150 (1993) 1047-1054). weiterhin besonders bevorzugt sind antigene Epitope, die in der Lage sind, aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten körpereigene oder körperfremde Substanzen wie etwa Cytokine oder Toxine zu binden und her auszufiltrieren. Derartige Epitope können Bestandteile von Cytokin- oder Toxinrezeptoren oder von Antikörpern gegen Cyto kine oder Toxine umfassen.Another preferred example of insertions are anti gene, allergenic or immunogenic epitopes, e.g. B. epitopes pathogenic microorganisms, such as bacteria, fungi, para sites etc. and viruses, or epitopes from plants or epitopes against the body's own substances, e.g. B. cytokines, as well as against Toxins, especially endotoxins. Particularly preferred case games for immunogenic epitopes are epitopes from herpes viruses, such as herpes virus 6 or pseudorabies virus (Lomniczi et al., J. Virol. 49 (1984), 970-979), especially epitopes the genes gB, gC or / and gD, or foot and mouth disease virus (FMDV), especially epitopes from the gene segments that are responsible for Code VP1, VP2 or / and VP3. The immunogenic epitopes can be selected to generate an antibody promote mediated immune response and / or generation a cellular immune response, e.g. B. by stimulating T- Cells. Examples of suitable allergenic epitopes are birch pollen allergens, e.g. B. Bet v I (Ebner et al., J. Immunol. 150 (1993) 1047-1054). still particularly preferred are antigenic epitopes that are able to from serum or other body fluids, body-own or foreign Bind and produce substances such as cytokines or toxins to filter out. Such epitopes can be components of Cytokine or toxin receptors or of antibodies against Cyto include kine or toxins.

Andererseits können die Insertionen auch für Enzyme kodieren. Bevorzugte Beispiele sind Enzyme zur Synthese von Polyhydroxy buttersäure, z. B. PHB-Synthase. Durch Einbau von PHB-Syhthase in den S-Layer kann bei Zufuhr des Substrats Hydroxybutter säure unter geeigneten Bedingungen eine molekulare Spinndüse entstehen. Ein weiteres bevorzugtes Beispiel für ein Enzym ist bakterielle Luciferase. Hier kann bei Zufuhr des Enzymsubstra tes, eines Aldehyds, und in Anwesenheit von O₂ ein molekularer Laser erhalten werden.On the other hand, the inserts can also code for enzymes. Preferred examples are enzymes for the synthesis of polyhydroxy butyric acid, e.g. B. PHB synthase. By installing PHB-Syhthase Hydroxybutter can be added to the S-Layer when the substrate is fed acid a molecular spinneret under suitable conditions arise. Another preferred example of an enzyme is bacterial luciferase. Here, when the enzyme substra tes, an aldehyde, and a molecular in the presence of O₂ Lasers can be obtained.

Ebenfalls bevorzugt sind Insertionen, die für Cytokine, wie etwa Interleukine, Interferone oder Tumornekrosefaktoren ko dieren. Diese Moleküle können beispielsweise in Kombination mit immunogenen Epitopen zur Herstellung von Vakzinen verwen det werden.Also preferred are insertions for cytokines such as such as interleukins, interferons or tumor necrosis factors dieren. These molecules can be used in combination, for example use with immunogenic epitopes for the production of vaccines be det.

Schließlich sind auch Insertionen bevorzugt, die für Antikör per-bindende Proteine, wie etwa Protein-A oder Protein-G oder für DNA- oder/und metallbindende Epitope, wie etwa Leucin- Zipper, Zinkfinger etc. kodieren.Finally, insertions for antibody are also preferred per-binding proteins such as Protein-A or Protein-G or for DNA and / or metal binding epitopes, such as leucine Code the zipper, zinc finger, etc.

Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die für das S-Layer-Protein kodierende Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit einer für ein Signalpeptid von gram-positiven Bakterien kodierenden Nukleinsäure verwendet, d. h. 5′-seitig von der S-Layer-Protein-kodierenden Nukleinsäure ist die Si gnalpeptid-kodierende Nukleinsäure angeordnet. Überraschender weise wurde nämlich festgestellt, daß die Anwesenheit derarti ger Signalpeptidsequenzen, die in den erfindungsgemäß verwen deten gram-negativen Wirtszellen nicht abgespalten werden, die Stabilität der S-Layer-Strukturen verbessern kann. Besonders bevorzugt umfaßt die für das Signalpeptid kodierende Nuklein säure (a) den signalpeptid-kodierenden Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleotidsequenz, (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspre chende Nukleotidsequenz oder/und (c) eine zu den Sequenzen aus (a) oder/und (b) mindestens 80% und insbesondere mindestens 90% homologe Nukleotidsequenz.Preferably, in the method according to the invention the nucleic acid encoding the S-layer protein in operative Linkage to one for a signal peptide of gram-positive Bacterial encoding nucleic acid used, d. H. 5'-sided of the S-layer protein-encoding nucleic acid is the Si Signal peptide-encoding nucleic acid arranged. More surprising wise it was found that the presence of such ger signal peptide sequences used in the invention The gram-negative host cells cannot be split off Can improve the stability of the S-layer structures. Especially preferably comprises the nucleotide coding for the signal peptide acid (a) the signal peptide coding section of the SEQ ID NO. 1 nucleotide sequence shown, (b) one of the sequence (a) in the context of the degeneration of the genetic code nucleotide sequence or / and (c) one to the sequences (a) or / and (b) at least 80% and in particular at least 90% homologous nucleotide sequence.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für ein rekombinantes S-Layer-Protein kodiert und ausgewählt ist aus (i) einer Nukleinsäure, welche die von Position 1 bis 3684 in SEQ ID NO. 1 gezeigte Nukleo tidsequenz gegebenenfalls ohne den Signalpeptid-kodierenden Abschnitt umfaßt, (ii) einer Nukleinsäure, welche eine der Nukleinsäure aus (i) im Rahmen der Degeneration des geneti schen Codes entsprechende Nukleotidsequenz umfaßt, und (iii) einer Nukleinsäure, welche eine mit den Nukleinsäuren aus (i) oder/und (ii) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.Yet another object of the present invention is a nucleic acid required for a recombinant S-layer protein is encoded and selected from (i) a nucleic acid which that from positions 1 to 3684 in SEQ ID NO. 1 nucleo shown tidsequenz possibly without the signal peptide coding Section comprises, (ii) a nucleic acid which is one of the Nucleic acid from (i) in the context of the degeneration of the geneti corresponding nucleotide sequence, and (iii) a nucleic acid which is one with the nucleic acids from (i) or / and (ii) hybridizing under stringent conditions Nucleotide sequence comprises.

In SEQ ID NO. 1 ist die kodierende Nukleotidsequenz des S-Lay er-Gens sbsA aus B.stearothermophilus einschließlich des Si gnalpeptid-kodierenden Abschnitts gezeigt. Der Signalpeptid kodierende Abschnitt reicht von Position 1-90 der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Nukleotidsequenz. Der für das reife SbsA-Poly peptid kodierende Abschnitt reicht von Position 91-3684.In SEQ ID NO. 1 is the coding nucleotide sequence of the S-Lay er gene sbsA from B.stearothermophilus including Si gnalpeptid-coding section shown. The signal peptide coding section ranges from position 1-90 of the one in SEQ ID NO. 1 shown nucleotide sequence. The one for the mature SbsA poly peptide coding section ranges from position 91-3684.

Das sbsA-Gen von B.stearothermophilus kodiert für ein Protein mit insgesamt 1228 Aminosäuren einschließlich eines N-termina len Signalpeptids mit 30 Aminosäuren (SEQ ID NO. 2). Die Spalt stelle zwischen dem Signalpeptid und dem reifen Protein befin det sich zwischen Position 30 und 31 der Aminosäuresequenz. Das Signalpeptid weist eine basische aminoterminale Domäne, gefolgt von einer hydrophoben Domäne, auf.The B.stearothermophilus sbsA gene codes for a protein with a total of 1228 amino acids including an N-termina len signal peptide with 30 amino acids (SEQ ID NO. 2). The gap between the signal peptide and the mature protein is between positions 30 and 31 of the amino acid sequence. The signal peptide has a basic amino terminal domain, followed by a hydrophobic domain.

Sequenzvergleiche mit anderen Signalpeptiden zeigen eine ge wisse Homologie zu Signalpeptiden von extrazellulären Protei nen in Bazillen, wie etwa alkalische Phosphatase und neutrale Phosphatase von B. amyloliquefaciens (Vasantha et al., J. Bacte riol. 159 (1984), 811-819) sowie mit den Signalpeptiden für das B.sphaericus-Gen 125 (Bowditch et al., J. Bacteriol. 171 (1989), 4178-4188) und das OWP-Gen von B. brevis (Tsuboi et al., J. Bac teriol. 168 (1986), 365-373).Sequence comparisons with other signal peptides show a ge know homology to signal peptides from extracellular protein in bacilli such as alkaline phosphatase and neutral B. amyloliquefaciens phosphatase (Vasantha et al., J. Bacte riol. 159 (1984), 811-819) and with the signal peptides for the B. Spaericus gene 125 (Bowditch et al., J. Bacteriol. 171 (1989), 4178-4188) and the B. brevis OWP gene (Tsuboi et al., J. Bac teriol. 168: 365-373 (1986)).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfin dungsgemäßen Nukleinsäure enthält. Der Vektor ist vorzugsweise in Prokaryonten replizierbar. Besonders bevorzugt ist der Vektor ein prokaryontisches Plasmid.Another object of the present invention is a recombinant vector containing at least one copy of an invented contains nucleic acid according to the invention. The vector is preferred replicable in prokaryotes. The is particularly preferred Vector a prokaryotic plasmid.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäure oder einem rekom binanten Vektor gemäß vorliegender Erfindung transformiert ist. Vorzugsweise ist die Zelle ein gram-negativer prokaryon tischer Organismus und am meisten bevorzugt eine E. coli-Zelle. Verfahren zur Transformation von Zellen mit Nukleinsäuren sind allgemeiner Stand der Technik (siehe Sambrook et al., supra) und brauchen daher nicht erläutert zu werden.Yet another object of the present invention is a host cell with a nucleic acid or a recom Binary vector transformed according to the present invention is. The cell is preferably a gram-negative prokaryon table organism and most preferably an E. coli cell. Methods of transforming cells with nucleic acids are general state of the art (see Sambrook et al., supra) and therefore do not need to be explained.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes S-Layer-Protein, das innerhalb der in SEQ ID NO. 2 gezeigten Aminosäuresequenz mindestens eine Peptid oder/und Polypeptidinsertion enthält. Bevorzugte Beispiele für Peptid- und Polypeptidinsertionen wurden bereits erläutert.Yet another object of the present invention is a recombinant S-layer protein that is within the sequence shown in SEQ ID NO. 2 amino acid sequence shown at least one peptide or / and contains polypeptide insertion. Preferred examples of Peptide and polypeptide insertions have already been explained.

Aus erfindungsgemäßen rekombinanten S-Layer-Proteinmolekülen kann eine rekombinante S-Layer-Struktur assembliert werden, die als Untereinheit mindestens ein erfindungsgemäßes rekom binantes S-Layer-Protein enthält. Weiterhin ist bevorzugt, daß die erfindungsgemäße S-Layer-Struktur als "Verdünnungsmolekü le" auch nichtmodifizierte S-Layer-Proteine enthält. Die nichtmodifizierten S-Layer-Proteine liegen vorzugsweise in einem molaren Anteil von 10-99% bezüglich der gesamten S-Lay er-Proteine vor.From recombinant S-layer protein molecules according to the invention a recombinant S-layer structure can be assembled, which as a subunit at least one recom according to the invention contains binant S-layer protein. It is further preferred that the S-layer structure according to the invention as a "dilution molecule le "also contains unmodified S-layer proteins. The unmodified S-layer proteins are preferably in a molar proportion of 10-99% with respect to the total S-Lay he proteins.

Die erfindungsgemäße S-Layer-Struktur kann mehrere kovalent oder durch Affinitätsbindung miteinander verknüpfte Schichten umfassen. Kovalente Verknüpfungen können beispielsweise durch Insertionen von Cysteinresten und einer anschließenden Aus bildung von Cystinbrücken eingeführt werden. Verknüpfungen durch Affinitätsbindung umfassen beispielsweise Antikörper- Antigen-, Antikörper-Protein A- bzw. -Protein G- oder Strepta vidin-Biotin-Wechselwirkungen.The S-layer structure according to the invention can be several covalent or layers linked together by affinity binding include. Covalent linkages can, for example, by Insertions of cysteine residues and a subsequent removal formation of cystine bridges are introduced. connections by affinity binding include, for example, Antigen, antibody protein A or protein G or strepta vidin-biotin interactions.

S-Layer-Strukturen, die rekombinante S-Layer-Proteine enthal ten, können gegebenenfalls auch in trägergebundener Form her gestellt werden. Hierzu kann die Reassemblierung der S-Layer- Struktur aus einzelnen Einheiten in Gegenwart eines Peptido glycanträgers erfolgen, wobei beispielsweise Peptidoglycan schichten erzeugt werden, die auf einer oder auf beiden Seiten mit einer S-Layer-Struktur überzogen sind. Eine andere Mög lichkeit zur Herstellung trägergebundener S-Layer-Strukturen besteht darin, eine S-Layer-Schicht an einer Grenzfläche zwi schen zwei Medien, z. B. wasser/Luft, zu erzeugen und diese Schicht auf einer Festphase, z. B. einer Filtermembran, zu immobilisieren (vgl. z. B. Pum und Sleytr (1994), Thin Solid Films 244, 882-886; Küpcü et al. (1995), Biochim. Biophys. Acta 1235, 263-269).S-layer structures that contain recombinant S-layer proteins ten, can optionally also be in carrier-bound form be put. For this, the reassembly of the S-layer Single unit structure in the presence of a peptido Glycan carrier take place, for example peptidoglycan layers are created on one or both sides are covered with an S-layer structure. Another possibility possibility of producing carrier-bound S-layer structures consists of an S-layer layer at an interface between two media, e.g. B. water / air to generate and this Layer on a solid phase, e.g. B. a filter membrane immobilize (see e.g. Pum and Sleytr (1994), Thin Solid Films 244, 882-886; Küpcü et al. (1995), Biochim. Biophys. Acta 1235, 263-269).

Die erfindungsgemäßen rekombinanten S-Layer-Proteine und S- Layer-Strukturen sind für eine Vielzahl von Anwendungen ge eignet. Besonders bevorzugt ist die Verwendung als Vakzin oder Adjuvans, wobei man rekombinante S-Layer-Proteine verwendet, die immunogene Epitope von Pathogenen und/oder körpereigene immunstimulierende Polypeptide, wie etwa Cytokine, enthalten. Bei dieser Anwendung ist nicht unbedingt eine Reinigung der rekombinanten S-Layer-Proteine erforderlich. Statt dessen kann beispielsweise die Verwendung in Kombination mit einem Bakte rienghost erfolgen, der ggf. in seiner Membran zusätzliche immunogene Epitope enthält.The recombinant S-layer proteins and S- Layer structures are suitable for a large number of applications is suitable. Use as a vaccine or is particularly preferred Adjuvant using recombinant S-layer proteins the immunogenic epitopes of pathogens and / or the body's own immunostimulating polypeptides such as cytokines. This application does not necessarily require cleaning the recombinant S-layer proteins required. Instead, can for example the use in combination with a bacterium rienghost, which may be additional in its membrane contains immunogenic epitopes.

Die Herstellung geeigneter "Bakterienghosts" ist beispiels weise in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP91/00967 beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird. Dort werden modifizierte Bakterien offenbart, erhältlich durch Transforma tion eines gram-negativen Bakteriums mit dem Gen eines lytisch wirkenden Membranproteins aus Bakteriophagen, mit dem Gen eines lytisch wirkenden Toxin-Freisetzungsproteins oder mit Genen, die Teilsequenzen davon, die für lytische Proteine kodieren, enthalten, Kultivierung des Bakteriums, Expression dieses Lyse-Gens und Isolierung des resultierenden Bakte rienghosts aus dem Kulturmedium.The production of suitable "bacterial ghosts" is an example as in the international patent application PCT / EP91 / 00967 to which reference is hereby made. There will be modified bacteria disclosed, obtainable by Transforma tion of a gram-negative bacterium with the gene of a lytic acting membrane protein from bacteriophages, with the gene a lytic toxin release protein or with Genes, the partial sequences of which are for lytic proteins encode, contain, cultivation of the bacterium, expression this lysis gene and isolation of the resulting bacterium rienghosts from the culture medium.

An die Membran dieser Bakterien kann, wie im europäischen Patent 0 516 655 beschrieben, ein rekombinantes Protein gebun den sein, das durch Expression einer rekombinanten DNA in diesen gram-negativen Bakterien erhältlich ist. Diese rekom binante DNA umfaßt eine erste DNA-Sequenz, welche für eine hydrophobe, nicht lytisch wirkende membranintegrierende Pro teindomäne, die eine α-helikale Struktur besitzt und aus 14-20 Aminosäuren besteht, die N- und C-terminal von je 2-30 belie bigen Aminosäuren flankiert sein können, kodiert. Mit dieser ersten DNA-Sequenz in operativer Verknüpfung befindet sich eine zweite DNA-Sequenz, die für ein gewünschtes rekombinantes Protein kodiert. Weiterhin enthält das gram-negative Bakterium eine dritte DNA-Sequenz, die unter einer von den ersten und zweiten DNA-Sequezen getrennten Kontrolle steht und für ein lytisch wirkende s Membranprotein aus Bakteriophagen oder ein lytisch wirkendes Toxin-Freisetzungsprotein oder für deren lytisch wirkende Teile kodiert. Durch Expression und Lyse derartiger rekombinanter, gram-negativer Bakterien werden sog. "Bakterienghosts" erhalten, die eine intakte Oberflächenstruk tur mit an die Oberfläche gebundenen immunogenen Epitopen enthalten.The membrane of these bacteria can, as in European Patent 0 516 655 describes a recombinant protein be the one that is expressed by expression of a recombinant DNA in these gram-negative bacteria is available. This recom binante DNA comprises a first DNA sequence, which for a hydrophobic, non-lytic membrane integrating Pro Teeindomain, which has an α-helical structure and from 14-20 Amino acids exist, the N- and C-terminal of 2-30 each can be flanked, encoded. With this first DNA sequence is in operative linkage a second DNA sequence necessary for a desired recombinant Encodes protein. It also contains the gram-negative bacterium a third DNA sequence, which is one of the first and second DNA sequence is separate control and for one lysing membrane protein from bacteriophages or a lytically acting toxin release protein or for their coded parts. Through expression and lysis Such recombinant, gram-negative bacteria are so-called. "Bacteria ghosts" obtained that have an intact surface structure with immunogenic epitopes bound to the surface contain.

Bei Kombination dieser Baktienghosts mit erfindungsgemäßen rekombinanten S-Layern können Vakzine und Adjuvantien erzeugt werden, die besonders vorteilhafte Eigenschaften aufweisen.When combining these bacteria ghosts with the invention recombinant S-layers can generate vaccines and adjuvants be that have particularly advantageous properties.

Es wurde festgestellt, daß das gram-positive Bakterium B.stearothermophilus PV72 neben SbsA noch ein weiteres S-Lay er-Protein enthält, das in der Folge als SbsB bezeichnet wird. (Sara und Sleytr (1994), J. Bacteriol. 176, 7182-7189). Durch Amplifikation unter Verwendung geeigneter Nukleinsäureprimer konnte das sbsB-Gen isoliert und charakterisiert werden. In SEQ ID NO. 5 ist die kodierende Nukleotidsequenz des S-Layer- Gens sbsB aus B.stearothermophilus einschließlich des Signal peptid-kodierenden Abschnitts, der von Position 1-93 der Nuk leinsäuresequenz reicht, gezeigt. In SEQ ID NO. 6 ist die davon abgeleitete Aminosäuresequenz gezeigt. Das sbsB-Gen kodiert für ein Protein mit insgesamt 921 Aminosäuren einschließlich eines N-terminalen Signalpeptids mit 31 Aminosäuren. It was found that the gram-positive bacterium B.stearothermophilus PV72 has another S-Lay in addition to SbsA er protein, which is hereinafter referred to as SbsB. (Sara and Sleytr (1994) J. Bacteriol. 176, 7182-7189). By Amplification using suitable nucleic acid primers the sbsB gene could be isolated and characterized. In SEQ ID NO. 5 is the coding nucleotide sequence of the S-layer B.stearothermophilus sbsB gene including the signal peptide coding section, which is from position 1-93 of the nuc flax acid sequence is sufficient. In SEQ ID NO. 6 is the one of them deduced amino acid sequence shown. The sbsB gene encodes for a protein with a total of 921 amino acids including of an N-terminal signal peptide with 31 amino acids.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine Nu kleinsäure, die für ein S-Layer-Protein kodiert und ausgewählt ist ausAn object of the present invention is thus a nu Small acid that codes for an S-layer protein and selected is over

(i) einer Nukleinsäure, welche die von Position 1 bis 2763 in SEQ ID No. 5 gezeigte Nukleotidsequenz gege benenfalls ohne den Signalpeptid-kodierenden Ab schnitt umfaßt,(i) a nucleic acid which corresponds to that from position 1 to 2763 in SEQ ID No. 5 shown nucleotide sequence also without the signal peptide-encoding Ab cut includes,
(ii) einer Nukleinsäure, welche eine der Nukleinsäure aus (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz umfaßt, und(ii) a nucleic acid which is one of the nucleic acid (i) as part of the degeneration of the genetic code corresponding nucleotide sequence comprises, and
(iii) einer Nukleinsäure, welche eine mit den Nukleinsäu ren aus (i) oder/und (ii) unter stringenten Bedin gungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.(iii) a nucleic acid which is one with the nucleic acid from (i) or / and (ii) under stringent conditions hybridizing nucleotide sequence.

Ebenso wie beim sbsA-Gen kann auch beim sbsB-Gen innerhalb des für das S-Layer-Protein kodierenden Bereichs mindestens eine für ein Peptid oder Polypeptid kodierende Nukleinsäureinser tion eingefügt werden. Bezüglich bevorzugter Beispiele für Insertionen im sbsB-Gen wird auf die zuvor gemachten Ausfüh rungen hinsichtlich des sbsA-Gens verwiesen.As with the sbsA gene, the sbsB gene can also be used within the at least one for the region encoding the S-layer protein nucleic acid encoding a peptide or polypeptide tion are inserted. Regarding preferred examples of Insertions in the sbsB gene are based on the previously made with regard to the sbsA gene.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Kopie eines sbsB-Gens gegebe nenfalls mit Insertion enthält. Dieser Vektor kann in Eukary onten, Prokaryonten oder in Eukaryonten und Prokaryonten re plizierbar sein. Er kann in ein das Genom der Wirtszelle inte grierbarer Vektor oder ein Vektor sein, der extrachromosomal vorliegt. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Vektor ein Plasmid, insbesondere ein prokaryontisches Plasmid.Yet another object of the present invention is a vector that gives at least one copy of an sbsB gene if necessary with insertion. This vector can be found in Eukary onts, prokaryotes or in eukaryotes and prokaryotes right be pliable. It can integrate into the genome of the host cell garish vector or a vector that is extrachromosomal is present. The vector according to the invention is preferably a Plasmid, especially a prokaryotic plasmid.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit einem sbsB-Gen transformiert ist, wobei das sbsB-Gen gegebenenfalls eine Insertion enthalten kann. Die Wirtszelle kann sowohl eine eukaryontische als auch eine prokaryontische Zelle sein. Vorzugsweise ist die Zelle ein prokaryontischer Organismus. Sowohl gram-positive Organis men, z. B. Organismen der Gattung Bacillus, als auch gram-nega tive Organismen, wie etwa Enterobakterien, insbesondere E. co li, sind bevorzugt. Verfahren zur Transformation von eukaryon tischen und prokaryontischen Zellen mit Nukleinsäuren sind bekannt und brauchen daher nicht ausführlich erläutert werden.Yet another object of the present invention is a host cell transformed with an sbsB gene, the sbsB gene optionally containing an insertion can. The host cell can be both eukaryotic and be a prokaryotic cell. Preferably the cell a prokaryotic organism. Both grief-positive organ men, e.g. B. organisms of the genus Bacillus, as well as gram-nega active organisms, such as enterobacteria, in particular E. co li, are preferred. Procedure for transforming eukaryon table and prokaryotic cells with nucleic acids known and therefore do not need to be explained in detail.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein SbsB-Protein, d. h. ein S-Layer-Protein, das von einer Nukleinsäure, wie vorstehend definiert kodiert ist. Besonders bevorzugt sind rekombinante SbsB-Proteine, die eine oder mehrere Peptid oder/und Polypeptidinsertionen innerhalb der sbsB-Sequenz enthalten. Besonders bevorzugt weist der SbsB-Anteil eines erfindungsgemäßen Polypeptids eine Homologie von mindestens 80% und insbesondere mindestens 90% zu der in SEQ ID NO. 6 gezeigten Aminosäuresequenz auf.The present invention further relates to an SbsB protein, d. H. an S-layer protein derived from a nucleic acid like is encoded as defined above. Are particularly preferred recombinant SbsB proteins containing one or more peptides or / and polypeptide insertions within the sbsB sequence contain. The SbsB portion particularly preferably has one polypeptide according to the invention has a homology of at least 80% and in particular at least 90% to that in SEQ ID NO. 6 shown amino acid sequence.

Auch aus den rekombinanten SbsB-S-Layer-Proteinmolekülen kann eine rekombinante S-Layer-Struktur entsprechend der rekombi nanten SbsA-S-Layer-Struktur assembliert werden. In dieser Struktur liegen die nichtmodifizierten S-Layerproteine vor zugsweise in einem molaren Anteil von 10-99% bezüglich der gesamten S-Layer-Proteine vor.Also from the recombinant SbsB-S-layer protein molecules a recombinant S-layer structure corresponding to the recombi named SbsA-S layer structure can be assembled. In this The structure of the unmodified S-layer proteins is available preferably in a molar proportion of 10-99% with respect to the entire S-layer proteins.

Auch die Anwendungen der erfindungsgemäßen rekombinanten sbsB- S-Layer-Proteine und S-Layer-Strukturen entsprechen den vor stehend für SbsA genannten Anwendungen. Insbesondere ist dabei die Verwendung als Vakzin oder Adjuvans bemerkenswert.The applications of the recombinant sbsB- S-layer proteins and S-layer structures correspond to the above standing for applications called SbsA. In particular is there its use as a vaccine or adjuvant is remarkable.

Rekombinante S-Layer-Proteine sind erhältlich durch ein Ver fahren, bei dem manRecombinant S-layer proteins are available from Ver drive where one

(a) eine Wirtszelle bereitstellt, die eine für ein S-Layer- Protein kodierende Nukleinsäure enthält, die innerhalb des für das S-Layer-Protein kodierenden Bereichs eine Peptid- oder Polypeptid-kodierende Insertion enthält,(a) provides a host cell that is one for an S-layer Contains protein encoding nucleic acid within of the region coding for the S-layer protein Contains a peptide or polypeptide coding insert,
(b) die Wirtszelle unter solchen Bedingungen kultiviert, die zu einer Expression der Nukleinsäure und zu einer Erzeu gung des davon kodierten Polypeptids führen, und (b) cultivating the host cell under such conditions that to expression of the nucleic acid and to an ore lead of the polypeptide encoded thereby, and
(c) das resultierende Polypeptid aus der Wirtszelle oder dem Kulturmedium gewinnt.(c) the resulting polypeptide from the host cell or the Culture medium wins.

In einer ersten bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird ein rekombinantes sbsA-S-Layer-Protein hergestellt, d. h. die für das rekombinante S-Layer-Protein kodierende Nuklein säure wird ausgewählt ausIn a first preferred embodiment of this method a recombinant sbsA-S-layer protein is produced, i. H. the nucleotide coding for the recombinant S-layer protein acid is selected from

(i) einer Nukleinsäure, welche die von Position 1 bis 3684 in SEQ ID No. 1 gezeigte Nukleotidsequenz gege benenfalls ohne den Signalpeptid-kodierenden Ab schnitt umfaßt,(i) a nucleic acid which corresponds to that from position 1 to 3684 in SEQ ID No. 1 shown nucleotide sequence also without the signal peptide-encoding Ab cut includes,
(ii) einer Nukleinsäure, welche eine der Nukleinsäure aus (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz umfaßt, und(ii) a nucleic acid which is one of the nucleic acid (i) as part of the degeneration of the genetic code corresponding nucleotide sequence comprises, and
(iii) einer Nukleinsäure, welche eine mit den Nukleinsäu ren aus (i) oder/und (ii) unter stringenten Bedin gungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.(iii) a nucleic acid which is one with the nucleic acid from (i) or / and (ii) under stringent conditions hybridizing nucleotide sequence.

In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird ein rekom binantes SbsB-S-Layer-Protein hergestellt, d. h. die für das rekombinante S-Layer-Protein kodierende Nukleinsäure wird ausgewählt ausIn a second preferred embodiment, a recom Binary SbsB-S-layer protein produced, d. H. the for that recombinant S-layer protein encoding nucleic acid selected from

Neben den rekombinanten SbsA und SbsB-S-Layer-Proteinen aus B.stearothermophilus können jedoch auch rekombinante S-Layer- Proteine aus anderen Organismen (vgl. z. B. Peyret et al., (1993), supra) hergestellt werden. In addition to the recombinant SbsA and SbsB-S-layer proteins B.stearothermophilus can also recombinant S-layer Proteins from other organisms (see e.g. Peyret et al., (1993), supra).

Die Herstellung der rekombinanten S-Layer-Proteine kann einer seits in einer heterologen Wirtszelle erfolgen, d. h. in einer Wirtszelle, die ursprünglich kein S-Layer-Gen enthält. Bei spiele für solche heterologen Wirtszellen sind gram-negative prokaryontische Organismen, wie etwa E. coli.The production of the recombinant S-layer proteins can be one partly in a heterologous host cell, d. H. in a Host cell that originally does not contain an S-layer gene. At games for such heterologous host cells are gram-negative prokaryotic organisms such as E. coli.

Oft ist jedoch die Herstellung der rekombinanten S-Layer-Pro teine in homologen Wirtszellen bevorzugt, d. h. in Wirtszellen, die ursprünglich ein natürliches S-Layer-Gen enthalten. In einer Ausführungsform dieser homologen Expression wird das rekombinante S-Layer-Gen in die Wirtszelle so eingeführt, daß die Wirtszelle noch in der Lage ist, ein weiteres S-Layer-Gen zu exprimieren, das für ein nichtmodifiziertes S-Layer-Protein kodiert. Vorzugsweise ist das nichtmodifizierte S-Layer-Pro tein in der Lage, eine mit dem rekombinanten S-Layer-Protein kompatible S-Layer-Struktur auszubilden. Ein Beispiel für diese Ausführungsform der homologen Expression ist eine B.stearothermophilus PV72 Zelle, welche intakte natürliche sbsA- oder/und sbsB-Gene enthält, und die mit einem Plasmid transformiert ist, welches ein rekombinantes S-Layer-Gen ent hält.Often, however, is the production of the recombinant S-Layer Pro preferred in homologous host cells, i. H. in host cells, that originally contain a natural S-layer gene. In An embodiment of this homologous expression is the recombinant S-layer gene introduced into the host cell so that the host cell is still capable of another S-layer gene to express that for an unmodified S-layer protein encoded. The non-modified S-Layer Pro is preferred tein is able to do one with the recombinant S-layer protein to develop a compatible S-layer structure. An example for this embodiment of homologous expression is one B.stearothermophilus PV72 cell, which is intact natural contains sbsA or / and sbsB genes, and those with a plasmid is transformed, which ent a recombinant S-layer gene holds.

In einer zweiten Ausführungsform kann die homologe Expression in einer Wirtszelle erfolgen, in der das ursprünglich vorhan dene intakte S-Layer-Gen inaktiviert wurde. Folglich wird in dieser Ausführungsform in der Wirtszelle kein weiteres S-Lay er-Gen mehr exprimiert, das für ein nichtmodifiziertes S-Lay er-Protein kodiert, welches in der Lage ist, eine mit dem rekombinanten S-Layer-Protein kompatible S-Layer-Struktur auszubilden. Ein spezifisches Beispiel für eine derartige Wirtszelle ist eine B.stearothermophilus PV72 Zelle, in deren Genom z. B. durch homologe Rekombination ein für ein rekombi nantes S-Layer-Protein kodierendes Gen eingeführt wurde, wel ches das ursprüngliche S-Layer-Gen ersetzt. Ein weiterer Bei spiel für eine derartige Wirtszelle ist eine B. stearothermo philus-Zelle, in der das native S-Layer-Gen z. B. durch orts spezifische Mutagenese oder/und homologe Rekombination inakti viert wurde und die mit einem ein rekombinantes S-Layer-Gen enthaltenden Vektor transformiert ist.In a second embodiment, the homologous expression in a host cell in which this originally existed whose intact S-layer gene has been deactivated. Consequently, in this embodiment in the host cell no further S-Lay er gene more expressed that for an unmodified S-Lay he encodes protein that is able to match one with the recombinant S-layer protein compatible S-layer structure to train. A specific example of one Host cell is a B.stearothermophilus PV72 cell, in its Genome e.g. B. by homologous recombination for a recombi gene called S-layer protein was introduced, wel ches replaced the original S-layer gene. Another case B. stearothermo is a game for such a host cell philus cell in which the native S-layer gene z. B. by location specific mutagenesis and / or homologous recombination inactiv was fourth and with a recombinant S-layer gene containing vector is transformed.

Bei der homologen Expression rekombinanter S-Layer-Gene werden als Wirtszellen üblicherweise gram-positive prokaryontische Organismen verwendet. Besonders bevorzugt als Wirtszelle ist B.stearothermophilus PV72, der bei hoher Temperatur in einem definierten synthetischen Medium (Schuster et al., (1995), Biotechnol. and Bioeng. 48: 66-77) kultiviert werden kann.In the homologous expression of recombinant S-layer genes as host cells usually gram-positive prokaryotic Organisms used. Is particularly preferred as the host cell B.stearothermophilus PV72, which at a high temperature in one defined synthetic medium (Schuster et al., (1995), Biotechnol. and Bioeng. 48: 66-77) can be cultivated.

Weiterhin wird die vorliegende Erfindung durch die nachfolgen den Beispiele und Figuren erläutert. Es zeigen:
SEQ ID NO. 1 die vollständige Nukleotidsequenz des kodieren den Abschnitts des S-Layer-Gens sbsA von B. stearothermophilus;
SEQ ID NO. 2 die davon abgeleitete Aminosäuresequenz;
SEQ ID NO. 3 die Nukleotidsequenz des Primers T5-X;
SEQ ID NO. 4 die Nukleotidsequenz des Primers E;
SEQ ID NO. 5 die vollständige Nukleotidsequenz des kodieren den Abschnitts des S-Layer-Gens sbsB von B. stearothermophilus;
SEQ ID NO. 6 die davon abgeleitete Aminosäuresequenz;
SEQ ID NO. 7 die Nukleotidsequenz eines Teilfragments des Streptavidingens;
SEQ ID NO. 8 die Nukleotidsequenz des Primers NIS 2AG;
SEQ ID NO. 9 die Nukleotidsequenz des Primers LIS C3;Furthermore, the present invention is explained by the following examples and figures. Show it:
SEQ ID NO. 1 the complete nucleotide sequence of the coding section of the S-layer gene sbsA from B. stearothermophilus;
SEQ ID NO. 2 the amino acid sequence derived therefrom;
SEQ ID NO. 3 the nucleotide sequence of the primer T5-X;
SEQ ID NO. 4 the nucleotide sequence of primer E;
SEQ ID NO. 5 shows the complete nucleotide sequence of the coding section of the S-layer gene sbsB from B. stearothermophilus;
SEQ ID NO. 6 the amino acid sequence derived therefrom;
SEQ ID NO. 7 shows the nucleotide sequence of a partial fragment of streptavidin;
SEQ ID NO. 8 the nucleotide sequence of the primer NIS 2 AG;
SEQ ID NO. 9 the nucleotide sequence of the primer LIS C3;

Fig. 1 eine schematische Darstellung des zur Herstel lung des rekombinanten Vektors pBK4 verwendeten sbsA PCR-Fragments; Figure 1 is a schematic representation of the sbsA PCR fragment used to manufacture the recombinant vector pBK4.

Fig. 2 eine schematische Darstellung von Peptidinser tionen in die Aminosäuresequenz des SbsA S-Lay er-Proteins und Fig. 2 is a schematic representation of peptide insertions in the amino acid sequence of the SbsA S-Layer protein and

Fig. 3 eine schematische Darstellung von Aminosäure substitutionen und -insertionen in rekombinan ten S-Layer-Proteinen. Fig. 3 is a schematic representation of amino acid substitutions and insertions in recombinant S-layer proteins.

BEISPIELEEXAMPLES 1. Bakterienstämme, Medien und Plasmide1. Bacterial strains, media and plasmids

Gram-positive Bakterien des Stammes Bacillus stearothermophi lus PV72 wurden bei 58°C in SVIII-Medium (Bartelmus und Per schak, Z. Zuckerind. 7 (1957), 276-281) kultiviert. Bakterien des Stammes E. coli pop2135 (endA, thi, hsdR, malT, cI857, λpR, malPQ) wurden in LB-Medium kultiviert (Sambrook et al., (1989), supra). Zur Selektion von Transformanten wurde Ampi cillin in einer Endkonzentration von 100 µg/ml dem Medium zugegeben. Das Plasmid pPLcAT10 (λpL, bla, colE1) (Stanssens et al., Gene 36 (1985), 211-223) wurde als Klonierungsvektor verwendet.Gram-positive bacteria from the Bacillus stearothermophi strain lus PV72 were at 58 ° C in SVIII medium (Bartelmus and Per schak, Z. Sugar Ind. 7 (1957), 276-281). bacteria of the strain E. coli pop2135 (endA, thi, hsdR, malT, cI857, λpR, malPQ) were cultivated in LB medium (Sambrook et al., (1989), supra). For the selection of transformants, Ampi cillin in a final concentration of 100 µg / ml the medium admitted. The plasmid pPLcAT10 (λpL, bla, colE1) (Stanssens et al., Gene 36 (1985), 211-223) was used as the cloning vector used.

2. Manipulation von DNA-Fragmenten2. Manipulation of DNA fragments

Restriktionsanalyse von DNA, Agarosegelelektrophorese und Klonierung von DNA-Fragmenten wurden nach den bei Sambrook et al. (1989), supra, beschriebenen Standardmethoden durchge führt.Restriction analysis of DNA, agarose gel electrophoresis and DNA fragments were cloned according to the method described in Sambrook et al. (1989), supra, described standard methods leads.

Die Transformation von kompetenten Zellen erfolgte durch Elek troporation unter Verwendung eines Bio-Rad Genepulsers (Bio- Rad Laboratories, Richmond, Kalif., USA) nach Protokollen des Herstellers.Competent cells were transformed by Elek troporation using a Bio-Rad gene pulser (bio- Rad Laboratories, Richmond, Calif., USA) according to protocols from the Manufacturer.

Plasmid-DNA wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (Nu cleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523) isoliert. Chromosomale DNA wurde gemäß der bei Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (1987), New York, John Wiley) beschriebenen Verfahren isoliert.Plasmid DNA was prepared using the method of Birnboim and Doly (Nu cleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523). Chromosomal DNA was obtained according to the method described in Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (1987), New York, John Wiley) Procedure isolated.

Restriktionsendonukleasen und andere Enzyme wurden von Boeh ringer Mannheim, New England Biolabs oder Stratagene bezogen und gemäß den Vorschriften der Hersteller eingesetzt. Restriction endonucleases and other enzymes were developed by Boeh ringer Mannheim, New England Biolabs or Stratagene and used according to the manufacturer's instructions.

3. DNA-Sequenzierung3. DNA sequencing

Die DNA-Sequenzen der 5′- und 3′-Regionen (einschließlich des für die Signalsequenz kodierenden Bereichs) des Gens sbsA im Vektor pPLcAT10 wurde nach der Dideoxykettenterminationsme thode von Sanger et al. bestimmt. Die zur Sequenzierung ver wendeten Primer wurden auf Basis der bereits publizierten sbsA-Sequenz (Kuen et al., Gene 145 (1994), 115-120) konstru iert.The DNA sequences of the 5 'and 3' regions (including the for the signal sequence coding region) of the gene sbsA im Vector pPLcAT10 was generated after the dideoxy chain termination measurement Sanger et al. certainly. The ver primers used were based on those already published sbsA sequence (Kuen et al., Gene 145 (1994), 115-120) construct iert.

4. PCR-Amplifikation von sbsA4. PCR amplification of sbsA

Die PCR-Amplifikation des sbsA-Gens erfolgte in einem Reak tionsvolumen von 100 µl, in dem 200 µM Deoxynukleotide, 1U Pfu-Polymerase (Stratagene), 1x Pfu-Reaktionspuffer, jeweils 0.5 µM Oligonukleotidprimer und 100 ng genomischer DNA aus B.stearothermophilus als Matrize vorhanden waren. Die Amplifi kation wurde über 30 Zyklen in einem Thermocycler (Biomed Thermocycler 60) durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einem Denaturierungsschritt von 1,5 min bei 95°C, einem Annealing schritt von 1 min bei 56°C und 1 min bei 50°C sowie einem Extensionsschritt von 2 min bei 72°C.The PCR amplification of the sbsA gene was carried out in a reak tion volume of 100 µl in which 200 µM deoxynucleotides, 1U Pfu polymerase (Stratagene), 1x Pfu reaction buffer, each 0.5 µM oligonucleotide primer and 100 ng genomic DNA B.stearothermophilus were present as a matrix. The amplifi cation was over 30 cycles in a thermal cycler (Biomed Thermocycler 60) performed. Each cycle consisted of one Denaturation step of 1.5 min at 95 ° C, an annealing step of 1 min at 56 ° C and 1 min at 50 ° C as well as one Extension step of 2 min at 72 ° C.

Als Primer wurden der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO. 3 angegebene Primer T5-X, der den 5′-Bereich von sbsA flankiert und eine XbaI-Stelle enthält, sowie der im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 4 gezeigte Primer E verwendet, der die 20 Nukleotide stromabwärts gelegene Region des Transkriptionsterminators der sbsA-Sequenz flankiert und eine BamHI-Stelle enthält.The primer used in the sequence listing as SEQ ID NO. 3rd specified primer T5-X, which flanks the 5 'region of sbsA and contains an XbaI site, as well as that in the sequence listing in SEQ ID NO. 4 shown primer E uses the 20 nucleotides downstream region of the transcription terminator of the flanked sbsA sequence and contains a BamHI site.

Die PCR-amplifizierten Produkte wurden auf einem 0.8% Agarose gel elektrophoretisch aufgetrennt und zur Klonierung unter Verwendung des Systems von Gene Clean (BIO101 La Jolla, Ka lif., USA) zur Klonierung gereinigt. The PCR-amplified products were on a 0.8% agarose gel separated electrophoretically and for cloning under Using the Gene Clean system (BIO101 La Jolla, Ka lif., USA) for cloning.

5. Klonierung des sbsA-Gens in den Vektor pPLcAT105. Cloning of the sbsA gene in the vector pPLcAT10

Das durch PCR gewonnene sbsA-Gen mit einer Länge von 3,79 kb wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI gespalten. Das resultierende Xbai-BamHI-Fragment wurde in die entsprechenden Restriktionsstellen des Vektors pPLcAT10 kloniert, so daß das sbsA-Gen unter transkriptioneller Kon trolle des stromaufwärts gelegenen pL-Promotors war. Das ATG- Startkodon der sbsA-Sequenz wurde durch die Klonierungsprozedur rekonstruiert. Die klonierte sbsA-Sequenz enthielt die N-ter minale Signalsequenz von sbsA und endete 20 nt nach dem Trans kriptionsterminator. Nach Ligation der Vektor-DNA mit dem sbsA-Fragment wurde der E. coli-Stamm pop2135 durch Elektro transformation transformiert. Die resultierenden Klone wurden einer DNA-Restriktionsanalyse unterzogen. Ein positiver Klon wurde sequenziert, um die korrekten Sequenzübergänge an den 5′- und 3′-Enden zu verifizieren. Dieser Klon wurde als pBK4 bezeichnet.The PCR-derived sbsA gene with a length of 3.79 kb was purified and with the restriction endonucleases XbaI and BamHI split. The resulting Xbai-BamHI fragment was into the corresponding restriction sites of the vector pPLcAT10 cloned so that the sbsA gene under transcriptional Kon trolls of the upstream pL promoter. The ATG The start codon of the sbsA sequence was through the cloning procedure reconstructed. The cloned sbsA sequence contained the Nth minimal signal sequence of sbsA and ended 20 nt after the trans description terminator. After ligation of the vector DNA with the sbsA fragment became the E. coli strain pop2135 by electro transformation transforms. The resulting clones were subjected to a DNA restriction analysis. A positive clone was sequenced to ensure the correct sequence transitions to the Verify 5'- and 3'-ends. This clone was named pBK4 designated.

Eine schematische Darstellung des 3,79 kb XbaI sbsA-Fragments und seine Lokalisierung in der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids pBK4 ist in Fig. 1 dargestellt (Abkürzungen: tT: Transkriptionsterminator; ori: Ursprung der DNA-Replikation; amp: Ampicillinresistenzgen).A schematic representation of the 3.79 kb XbaI sbsA fragment and its localization in the multiple cloning site of the plasmid pBK4 is shown in FIG. 1 (abbreviations: tT: transcription terminator; ori: origin of the DNA replication; amp: ampicillin resistance gene).

6. Rekombinante Expression des sbsA-Gens in E. coli6. Recombinant expression of the sbsA gene in E. coli

E. coli pop2135/pBK4-Zellen wurden bei 28°C bis zum Erreichen einer optischen Dichte OD₆₀₀ von 0,3 kultiviert. Dann wurde die Expression von sbsA durch Erhöhung der Kultivierungstemperatur von 28°C auf 42°C induziert. 1,5 ml Aliquots wurden vor bzw. 1, 2, 3 und 5 Stunden nach Induktion der sbsA-Expression ent nommen. Als Kontrollen wurden E. coli pop2135/pPLcAT10 (kulti viert unter den gleichen Bedingungen) und B.stearothermophilus PV72 verwendet. E. coli pop2135 / pBK4 cells were at 28 ° C until reached cultivated an optical density OD 0,3 of 0.3. Then the Expression of sbsA by increasing the cultivation temperature induced from 28 ° C to 42 ° C. 1.5 ml aliquots were 1, 2, 3 and 5 hours after induction of sbsA expression ent taken. E. coli pop2135 / pPLcAT10 (cult fourth under the same conditions) and B.stearothermophilus PV72 used.

Kulturüberstände und Zellextrakte aus allen Proben wurden auf die Expression des S-Layer-Proteins durch SDS-PAGE und We stern-Immunoblotting untersucht.Culture supernatants and cell extracts from all samples were analyzed the expression of the S-layer protein by SDS-PAGE and We stern immunoblotting examined.

In Extrakten aus mit pBK4 transformierten E. coli-Zellen wurde eine zusätzliche starke Proteinbande mit dem gleichen Moleku largewicht wie das Wildtyp-SbsA-Protein gefunden. Es wurden keine Abbauprodukte von SbsA selbst in einem Zeitraum bis zu 5 Stunden nach der Induktion der Expression gefunden. Dies läßt vermuten, daß das S-Layer-Protein sbsA in E. coli stabil ist und nicht durch Proteasen abgebaut wird.Extracts from E. coli cells transformed with pBK4 were used an additional strong protein band with the same molecule Lar weight found as the wild-type SbsA protein. There were no degradation products from SbsA even in a period up to 5 Found hours after induction of expression. This leaves suspect that the S-layer protein sbsA is stable in E. coli and is not degraded by proteases.

Es wurde eine densitometrische Bestimmung der relativen Menge an SbsA-Protein durchgeführt. Zu einem Zeitpunkt von 4 Stunden nach der Induktion lag das sbsA-Protein in einem Anteil von ca. 16% bezüglich des gesamten zellulären Proteins vor.A densitometric determination of the relative amount was made performed on SbsA protein. At a time of 4 hours after induction, the sbsA protein was in a proportion of about 16% of the total cellular protein.

Das in E. coli erzeugte SbsA-Protein wanderte im SDS-Gel etwas langsamer als das natürliche SbsA-Protein aus B.stearothermo philus. Versuche zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäurese quenz des SbsA-Proteins durch Edman-Abbau schlugen aufgrund einer Blockierung des N-Terminus fehl. Dies läßt vermuten, daß die Signalsequenz in E. coli nicht abgespalten wurde.The SbsA protein produced in E. coli migrated somewhat in the SDS gel slower than the natural SbsA protein from B.stearothermo philus. Attempts to determine the N-terminal amino acid sequence of SbsA protein due to Edman degradation was due to blocking of the N-terminus fails. This suggests that the signal sequence in E. coli was not cleaved.

Auch eine Western Blot-Analyse von Gesamtzellextrakten und Kulturüberständen von E. coli/pBK4 ergab nur eine einzige sbsA- spezifische Proteinbande mit einem etwas höheren Molekularge wicht als das Wildtyp-SbsA-Protein aus stearothermophilus.Also a Western blot analysis of whole cell extracts and Culture supernatants from E. coli / pBK4 gave only a single sbsA specific protein band with a somewhat higher molecular weight important than the wild-type SbsA protein from stearothermophilus.

Für den Western Blot wurden die Proteine auf eine Nitrozel lulosemembran transferiert und mit einem polyklonalen Antise rum gegen SbsA aus Kaninchen inkubiert. Die Herstellung dieses Antiserums ist bei Egelseer et al. (J. Bacteriol. 177 (1995), 1444-1451) beschrieben. Zum Nachweis gebundener SbsA-spezifi scher Antikörper wurde ein Konjugat aus Ziegen-Anti-Kaninchen- IgG und alkalischer Phosphatase verwendet. For the Western blot, the proteins were put on a nitrozel transferred cellulose membrane and with a polyclonal antise incubated against rabbit SbsA. The making of this Antiserums is described in Egelseer et al. (J. Bacteriol. 177 (1995), 1444-1451). For the detection of bound SbsA-specific anti-rabbit conjugate IgG and alkaline phosphatase used.

Aus Überständen von mit pBK4 transformierten E. coli-Zellen konnte auch nach Induktion der sbsA-Gen-Expression kein SbsA- Protein nachgewiesen werden. Daraus ist ersichtlich, daß SbsA nicht in das umgebende Medium exportiert wird.From supernatants from E. coli cells transformed with pBK4 even after induction of sbsA gene expression, no SbsA Protein can be detected. It can be seen from this that SbsA is not exported to the surrounding medium.

7. Lokalisierung und Organisation des S-Laver-Proteins SbsA im Cytoplasma von E. coli7. Localization and organization of the S-Laver protein SbsA in E. coli cytoplasm

Zellen aus E. coli pop2135/pBK4, die aus Kulturen mit 1, 2, 3 und 5 Stunden nach Induktion der S-Layer-Proteinexpression geerntet wurden, wurden auf die intrazelluläre Organisation von sbsA untersucht. Nichtinduzierte, bei 28°C kultivierte Zellen und Zellen von B.stearothermophilus PV72 wurden als Kontrollen untersucht.E. coli pop2135 / pBK4 cells derived from cultures with 1, 2, 3 and 5 hours after induction of S-layer protein expression were harvested on the intracellular organization examined by sbsA. Not induced, cultivated at 28 ° C B.stearothermophilus PV72 cells and cells were identified as Controls examined.

Hierzu wurden gesamte Zellen beider Organismen fixiert und in Spurrharz nach der Methode von Messner et al. (Int. J. Syst. Bac teriol. 34 (1984), 202-210) fixiert und eingebettet. Anschlie ßend wurden ultradünne Schnitte der eingebetteten Präparate hergestellt und mit Uranylacetat angefärbt.For this purpose entire cells of both organisms were fixed and in Rurr resin according to the method of Messner et al. (Int. J. Syst. Bac teriol. 34 (1984), 202-210) fixed and embedded. Then Ultrathin sections of the embedded specimens were eating made and stained with uranyl acetate.

Das Cytoplasma von nichtinduzierten E. coli-Zellen zeigte die typische granuläre Struktur, die sich auch bei einer Zunahme der OD der Suspensionen nicht änderte. Längsschnitte von E. co li-Zellen, die 1 Stunde nach Induktion der S-Layer-Protein expression geerntet wurden, zeigten parallele, blattartige Strukturen im Cytoplasma. Aus Querschnitten wurde ersichtlich, daß diese Strukturen eine konzentrische Anordnung zeigten.The cytoplasm of uninduced E. coli cells showed that typical granular structure, which also changes with an increase the OD of the suspensions did not change. Longitudinal sections by E. co li cells 1 hour after induction of the S-layer protein expression harvested showed parallel, leaf-like Structures in the cytoplasm. Cross sections showed that these structures showed a concentric arrangement.

Der Anteil blattartiger Strukturen zeigte einen deutlichen Anstieg zwischen 1 und 2 Stunden nach Induktion der sbsA-Ex pression und blieb danach im wesentlichen konstant.The proportion of leaf-like structures showed a clear one Rise between 1 and 2 hours after induction of sbsA-Ex pression and remained essentially constant thereafter.

Das in E. coli rekombinant hergestellte sbsA-Protein konnte auch durch Immunogoldmarkierung mit SbsA-spezifischen Antikör pern nachgewiesen werden. Auch mit dieser Nachweismethode wurde eine geordnete Struktur des rekombinant hergestellten SbsA- Proteins gefunden.The sbsA protein recombinantly produced in E. coli could also by immunogold labeling with SbsA-specific antibody pern can be detected. Also with this detection method was an ordered structure of the recombinantly produced SbsA protein found.

Aus diesen morphologischen Daten war klar ersichtlich, daß das SbsA-Protein sich nicht zu unregelmäßigen Einschlußkörpern aggregierte, sondern monomolekulare S-Layer-Kristalle bildete. Eine bemerkenswerte Eigenschaft der in E. coli assemblierten SbsA-S-Layer-Schichten war die konzentrische Anordnung in definierten Abständen. Das Vorhandensein der Signalsequenz störte die korrekte Assemblierung nicht.From this morphological data it was clearly evident that the SbsA protein does not become irregular inclusion bodies aggregated, but formed monomolecular S-layer crystals. A remarkable property of those assembled in E. coli SbsA-S layer layers was the concentric arrangement in defined intervals. The presence of the signal sequence did not interfere with the correct assembly.

8. Herstellung von rekombinanten sbsA-S-Layer-Genen8. Production of recombinant sbsA-S-layer genes

Für die ortsspezifische Insertionsmutagenese des sbsA-Gens wurde eine modifizierte Kanamycinkassette (1,3 kb) verwendet, die durch Spaltung des Plasmids pwJC3 (erhalten von W.T. McAl lister, New York) durch SmaI isoliert wurde. Die Kassette wurde in fünf verschiedene glattendige Restriktionsstellen des sbsA-Gens ligiert, nämlich in die NruI-Stelle an Position bp 582 (pSL582), in die SnaBI-Stelle an bp 917 (pSL917) und in jede der PvuII-Stellen an Position bp 878 (pSL878), bp 2504 (pSL2504) und bp 2649 (pSL2649). Nach Selektion von Kanamycin resistenten Klonen wurde die Kassette aus der Insertionsstelle durch Spaltung mit ApaI, gefolgt von einer Religation des S- Layer-Plasmids pBK4, entfernt. Durch die Herausschneide- und Religationsprozedur blieb eine Insertion von 6 bp CCCGGG zu rück. Das System dieser Linkerinsertion ist schematisch in Fig. 2 dargestellt.A modified kanamycin cassette (1.3 kb) was used for site-specific insertion mutagenesis of the sbsA gene, which was isolated by cleavage of the plasmid pwJC3 (obtained from WT McAlister, New York) by SmaI. The cassette was ligated into five different blunt-ended restriction sites of the sbsA gene, namely the NruI site at position bp 582 (pSL582), the SnaBI site at bp 917 (pSL917) and each of the PvuII sites at position bp 878 (pSL878), bp 2504 (pSL2504) and bp 2649 (pSL2649). After selection of kanamycin-resistant clones, the cassette was removed from the insertion site by cleavage with ApaI, followed by religation of the S-layer plasmid pBK4. An insertion of 6 bp CCCGGG remained due to the cutting out and religation procedure. The system of this linker insertion is shown schematically in FIG. 2.

Die resultierenden rekombinanten S-Layer-Gene kodieren für modifizierte, um 2 Aminosäuren verlängerte sbsA-Proteine.The resulting recombinant S-layer genes code for modified sbsA proteins extended by 2 amino acids.

Die konkreten Änderungen in der Primärstruktur der sbsA-Pro teine sind in Fig. 3 gezeigt. Im Klon pSL582 führte die Inser tion zur Einfügung von Glycin und Prolin zwischen den Amino säuren 194 und 195 am N-Terminus des SbsA-Proteins. Die Amino säuren Alanin und Arginin wurden im Klon pSL917 zwischen die Aminosäuren 306 und 307 eingefügt. Im Klon pSL2649 wurde eine Insertion von Glycin und Prolin zwischen die Aminosäuren an den Positionen 883 und 884 eingefügt. Eine Insertion von Ala nin und Prolin zwischen den Aminosäuren 293 und 294 wurde im Klon pSL878 erhalten. Weiterhin wurde das Alanin an Position 293 durch Glycin ausgetauscht. Im Klon pSL2504 wurden die Aminosäuren Alanin und Prolin zwischen die Aminosäuren 835 und 836 eingeführt und das Alanin an Position 835 durch Glycin ersetzt.The concrete changes in the primary structure of the sbsA proteins are shown in FIG. 3. In clone pSL582, the insertion resulted in the insertion of glycine and proline between amino acids 194 and 195 at the N-terminus of the SbsA protein. The amino acids alanine and arginine were inserted in the clone pSL917 between amino acids 306 and 307. In clone pSL2649, an insertion of glycine and proline was inserted between the amino acids at positions 883 and 884. An insertion of alain and proline between amino acids 293 and 294 was obtained in clone pSL878. Furthermore, the alanine at position 293 was replaced by glycine. In the clone pSL2504, the amino acids alanine and proline were introduced between amino acids 835 and 836 and the alanine at position 835 was replaced by glycine.

Alle durch Insertionsmutagenese erhaltenen Klone behielten ihre Fähigkeit zur Synthese des S-Layer-Proteins.All clones obtained by insertion mutagenesis were retained their ability to synthesize the S-layer protein.

Um die Fähigkeit der modifizierten Proteine zur Assemblierung in S-Layer-Strukturen nachzuweisen, wurden gemäß der unter Punkt 7. beschriebenen Prozedur ultradünne Längsschnitte von gesamten Zellen, die 4h unter induktiven Bedingungen kulti viert worden waren, hergestellt. Es wurde gefunden, daß das Cytoplasma aller 5 Klone mit parallelen, blattartigen Struktu ren gefüllt ist, welche der Krümmung der Zellpole folgen. Es gab keine morphologischen Unterschiede des Zytoplasma bei den 5 untersuchten verschiedenen Klonen. Es wurden genau die glei chen blattartigen Strukturen wie bei der Assemblierung des Wildtyp-SbsA-Protein in E. coli (Punkt 7.) festgestellt.To the ability of the modified proteins to assemble in S-layer structures were determined according to the under Point 7 procedure described ultra-thin longitudinal sections of entire cells that cultivated 4h under inductive conditions fourth had been made. It was found that the Cytoplasm of all 5 clones with a parallel, leaf-like structure filled which follow the curvature of the cell poles. It there were no morphological differences in the cytoplasm 5 examined different clones. It was exactly the same Chen leaf-like structures as in the assembly of the Wild-type SbsA protein found in E. coli (point 7.).

Auf analoge Weise wurde ein mit ApaI-Linkern versehenes DNA- Fragment (SEQ ID NO. 7) in die Schnittstelle an Position 581 integriert, das für ein Teilfragment von Streptavidin kodiert.In an analogous manner, a DNA provided with ApaI linkers was Fragment (SEQ ID NO.7) into the interface at position 581 integrated, which codes for a fragment of streptavidin.

9. Isolierung und Charakterisierung des sbsB-Gens9. Isolation and characterization of the sbsB gene

Als Grundlage für die Isolierung des sbsB-Gens diente die Aminosäuresequenz des N-Terminus sowie die Sequenz von 3 in ternen Peptiden des SbsB-Proteins. Von diesen Peptidsequenzen ausgehend wurden degenerierte Oligonukleotidprimer konstruiert und für die PCR eingesetzt. Auf diese weise wurde ein 1076 bp langes PCR-Fragment aus der chromosomalen DNA von B.stearo thermophilus amplifiziert, kloniert und sequenziert (entspre chend Position 100-1176 der in SEQ ID NO. 5 gezeigten Sequenz).The amino acid sequence of the N-terminus and the sequence of 3 in ternary peptides of the SbsB protein served as the basis for the isolation of the sbsB gene. Starting from these peptide sequences, degenerate oligonucleotide primers were constructed and used for the PCR. In this way, a 1076 bp PCR fragment from the chromosomal DNA of B.stearo thermophilus was amplified, cloned and sequenced (corresponding to position 100-1176 of the sequence shown in SEQ ID NO. 5 ).

Für die Amplifikation der 5′- und 3′-seitigen Abschnitte des sbsB-Gens wurde die Methode der inversen PCR angewendet und mit Hilfe verschiedener Primerkombinationen schrittweise über lappende DNA-Fragmente erhalten und sequenziert.For the amplification of the 5'- and 3'-sided sections of the sbsB gene, the inverse PCR method was used and step by step using different primer combinations Lapping DNA fragments obtained and sequenced.

Zur Amplifizierung des vollständigen sbsB-Gens wurden als Primer der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO. 8 angegebene Primer NIS 2AG, der den 5′-Bereich von sbsB enthält, sowie der im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 9 angegebene Primer LIS C3 verwendet, der den 3′-Bereich von sbsB enthält.To amplify the complete sbsB gene, as Primer of the SEQ ID NO. 8 specified Primer NIS 2AG, which contains the 5′-region of sbsB, and the in the sequence listing in SEQ ID NO. 9 specified primers LIS C3 used, which contains the 3 'range of sbsB.

Das auf diese weise erhaltene PCR-Fragment, welches die in SEQ ID NO. 5 gezeigte Nukleotidsequenz mit 5′- und 3′-BamHI-Re striktionsschnittstellen enthält, wurde wie im Beispiel 5 be schrieben in den Vektor pPLcAT10 kloniert, in dem die Expres sion unter Kontrolle des Lambda PL-Promotors erfolgte.The PCR fragment obtained in this way, which the in SEQ ID NO. 5 shown nucleotide sequence with 5'- and 3'-BamHI-Re contains restriction interfaces, was as in Example 5 be wrote cloned in the vector pPLcAT10 in which the expresses sion under the control of the Lambda PL promoter.

Weiterhin wurde das sbsB-PCR-Fragment mit 5′seitiger EcoRI- und 3′seitiger BamHI-Schnittstelle in den Vektor pUC18 klo niert, in dem die Expression unter Kontrolle des lac-Promotors erfolgte.Furthermore, the sbsB-PCR fragment with 5 'sided EcoRI and 3 ' sided BamHI interface was cloned into the vector pUC18, in which the expression was carried out under the control of the lac promoter.

Der Nachweis der sbsB-Expression erfolgte wie in den Beispie len 6 und 7 beschrieben durch SDS-Gelelektrophorese und Elek tronenmikroskopie. The detection of the sbsB expression was carried out as in the examples len 6 and 7 described by SDS gel electrophoresis and elec tron microscopy.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von S-Layer-Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine gram-negative prokaryontische Wirtszelle bereitstellt, die transformiert ist mit einer für ein S-Layer-Protein kodierenden Nukleinsäure, ausge wählt aus
- (i) einer Nukleinsäure, welche die von Position 1 bis Position 3684 in SEQ ID NO. 1 gezeigte Nu kleotidsequenz gegebenenfalls ohne den Signal peptid-kodierenden Abschnitt umfaßt,
- (ii) einer Nukleinsäure, welche eine der Nuklein säure aus (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidse quenz umfaßt, und
- (iii) einer Nukleinsäure, welche eine mit den Nukleinsäuren aus (i) oder/und (ii) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleo tidsequenz umfaßt;
(b) die Wirtszelle unter solchen Bedingungen kultiviert, die zu einer Expression der Nukleinsäure und zu ei ner Erzeugung des davon kodierten Polypeptids führen und
(c) das resultierende Polypeptid aus der Wirtszelle ge winnt.

1. A method for producing S-layer proteins, characterized in that

(a) provides a gram-negative prokaryotic host cell that is transformed with a nucleic acid coding for an S-layer protein, selected
- (i) a nucleic acid which contains the position 1 to position 3684 in SEQ ID NO. 1 comprises nucleotide sequence shown, optionally without the signal peptide-coding section,
- (ii) a nucleic acid which comprises a nucleotide sequence corresponding to the nucleic acid from (i) in the context of the degeneration of the genetic code, and
- (iii) a nucleic acid which comprises a nucleotide sequence which hybridizes with the nucleic acids from (i) or / and (ii) under stringent conditions;
(b) cultivating the host cell under conditions which lead to expression of the nucleic acid and generation of the polypeptide encoded thereby and
(c) the resulting polypeptide is recovered from the host cell.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine E. coli-Wirtszelle verwendet.2. The method according to claim 1, characterized, that an E. coli host cell is used.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polypeptid in Form einer assemblierten S- Layer-Struktur aus dem Inneren der Wirtszelle gewinnt. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that the polypeptide in the form of an assembled S- Layer structure from inside the host cell wins.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die für das S-Layer-Protein kodierende Nukleinsäure eine oder mehrere Insertionen enthält, die für Peptid- oder Polypeptidsequenzen kodieren.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized, that the nucleic acid coding for the S-layer protein contains one or more insertions suitable for peptide or encode polypeptide sequences.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertionen ausgewählt werden aus Nukleotidse quenzen, die für Cysteinreste, Bereiche mit mehreren geladenen Aminosäuren oder Tyr-Resten, DNA-bindende Epi tope, metallbindende Epitope, immunogene Epitope, aller gene Epitope, antigene Epitope, Streptavidin, Enzyme, Cytokine oder Antikörper-bindende Proteine kodieren.5. The method according to claim 4, characterized, that the insertions are selected from nucleotides sequences for cysteine residues, areas with several charged amino acids or Tyr residues, DNA binding Epi tope, metal binding epitopes, immunogenic epitopes, all gene epitopes, antigenic epitopes, streptavidin, enzymes, Encode cytokines or antibody-binding proteins.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertionen für Streptavidin kodieren.6. The method according to claim 5, characterized, that the inserts code for streptavidin.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertionen für immunogene Epitope aus Herpesvi ren, insbesondere Herpesvirus 6 oder FMDV, kodieren.7. The method according to claim 5, characterized, that the insertions for immunogenic epitopes from Herpesvi ren, in particular herpes virus 6 or FMDV, code.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertionen für Enzyme, wie etwa Polyhydroxybut tersäuresynthase oder bakterielle Luciferase, kodieren.8. The method according to claim 5, characterized, that the insertions for enzymes such as polyhydroxybut tersäuresynthase or bacterial luciferase, encode.

9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertionen für Cytokine, wie etwa Interleukine, Interferone oder Tumornekrosefaktoren, kodieren.9. The method according to claim 5, characterized, that the inserts for cytokines, such as interleukins, Encode interferons or tumor necrosis factors.

10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertionen für Antikörper-bindende Proteine, wie etwa Protein A oder Protein G, kodieren.10. The method according to claim 5, characterized, that the insertions for antibody binding proteins, such as such as protein A or protein G.

11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertionen für antigene Epitope kodieren, die an Cytokine oder Endotoxine binden.11. The method according to claim 5, characterized, that the inserts code for antigenic epitopes that target Bind cytokines or endotoxins.

12. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertionen für metallbindende Epitope kodieren.12. The method according to claim 5, characterized, that the inserts code for metal binding epitopes.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß 5′-seitig der für das S-Layer-Protein kodierenden Nukleinsäure in operativer Verknüpfung eine für ein gram positives Signalpeptid kodierende Nukleinsäure angeordnet ist.13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized, that 5 'side of the coding for the S-layer protein Nucleic acid in operative linkage one for a gram nucleic acid encoding positive signal peptide is.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Signalpeptid kodierende Nukleinsäure

(a) den Signalpeptid-kodierenden Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder/und
(c) eine zu den Sequenzen aus (a) oder/und (b) minde stens 80% homologe Nukleotidsequenz umfaßt.

14. The method according to claim 13, characterized in that the nucleic acid coding for the signal peptide

(a) the signal peptide coding portion of the sequence shown in SEQ ID NO. 1 nucleotide sequence shown,
(b) a nucleotide sequence corresponding to the sequence from (a) in the context of the degeneration of the genetic code or / and
(c) a nucleotide sequence which is at least 80% homologous to the sequences from (a) or / and (b).

15. Nukleinsäure, die für ein rekombinantes S-Layer-Protein kodiert und ausgewählt ist aus

(i) einer Nukleinsäure, welche die von Position 1 bis 3684 in SEQ ID NO. 1 gezeigte Nukleotidsequenz gege benenfalls ohne den Signalpeptid-kodierenden Ab schnitt umfaßt,
(ii) einer Nukleinsäure, welche eine der Nukleinsäure aus (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz umfaßt, und
(iii) einer Nukleinsäure, welche eine mit den Nukleinsäu ren aus (i) oder/und (ii) unter stringenten Bedin gungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt,

15. Nucleic acid encoding and selected for a recombinant S-layer protein

(i) a nucleic acid which contains the position 1 to 3684 in SEQ ID NO. 1 optionally includes the nucleotide sequence shown without the signal peptide coding section,
(ii) a nucleic acid which comprises a nucleotide sequence corresponding to the nucleic acid from (i) in the context of the degeneration of the genetic code, and
(iii) a nucleic acid which comprises a nucleotide sequence which hybridizes with the nucleic acids from (i) or / and (ii) under stringent conditions,

wobei die Nukleinsäure innerhalb des für das S-Layer- Protein kodierenden Bereichs mindestens eine Peptid- oder Polypeptid-kodierende Insertion enthält.where the nucleic acid within the for the S-layer Protein coding region at least one peptide or Includes polypeptide coding insert.

16. Nukleinsäure nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertionsstelle an Position 582, 878, 917, 2504 oder/und 2649 der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidse quenz lokalisiert ist.16. Nucleic acid according to claim 15, characterized, that the insertion site at position 582, 878, 917, 2504 or / and 2649 of SEQ ID No. 1 shown nucleotides quenz is localized.

17. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach Anspruch 15 oder 16 enthält.17.Vector, characterized, that he after at least one copy of a nucleic acid Claim 15 or 16 contains.

18. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 15 oder 16 oder einem Vektor nach Anspruch 17 transformiert ist.18th cell, characterized, that with a nucleic acid according to claim 15 or 16 or a vector is transformed according to claim 17.

19. Zelle nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine gram-negative prokaryontische Zelle, ins besondere eine E. coli-Zelle ist.19. Cell according to claim 18, characterized, that it is a gram-negative prokaryotic cell, ins is particularly an E. coli cell.

20. Rekombinantes S-Layer-Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nukleinsäure nach Anspruch 15 oder 16 kodiert ist. 20. recombinant S-layer protein, characterized, that it is from a nucleic acid according to claim 15 or 16 is encoded.

21. Rekombinante S-Layer-Struktur, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Untereinheit mindestens ein Protein nach Anspruch 20 enthält.21. recombinant S-layer structure, characterized, that they have at least one protein as a subunit Claim 20 contains.

22. S-Layer-Struktur nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin als Untereinheit mindestens ein nicht modifiziertes S-Layer-Protein enthält.22. S-layer structure according to claim 21, characterized, that they continue not as a subunit at least one contains modified S-layer protein.

23. S-Layer-Struktur nach- Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie mehrere kovalent oder durch Affinitätsbindung miteinander verknüpfte Schichten umfaßt.23. S-layer structure according to claim 21 or 22, characterized, that they are multiple covalent or by affinity binding interconnected layers.

24. Verwendung eines S-Layer-Proteins nach Anspruch 20 oder einer S-Layer-Struktur nach einem der Ansprüche 21 bis 23 als Vakzin oder Adjuvans.24. Use of an S-layer protein according to claim 20 or an S-layer structure according to one of claims 21 to 23 as a vaccine or adjuvant.

25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Vakzin oder Adjuvans weiterhin einen Bakterien ghost umfaßt, der gegebenenfalls in seiner Membran weitere immunogene Epitope enthält.25. Use according to claim 24, characterized, that the vaccine or adjuvant is still a bacteria includes ghost, possibly in its membrane further contains immunogenic epitopes.

26. Nukleinsäure, die für ein S-Layer-Protein kodiert und ausgewählt ist aus

(i) einer Nukleinsäure, welche die von Position 1 bis 2763 in SEQ ID No. 5 gezeigte Nukleotidsequenz gege benenfalls ohne den Signalpeptid-kodierenden Ab schnitt umfaßt,
(ii) einer Nukleinsäure, welche eine der Nukleinsäure aus (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz umfaßt, und
(iii) einer Nukleinsäure, welche eine mit den Nukleinsäu ren aus (i) oder/und (ii) unter stringenten Bedin gungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.

26. Nucleic acid that encodes and is selected for an S-layer protein

(i) a nucleic acid which corresponds to that from position 1 to 2763 in SEQ ID No. 5 optionally includes the nucleotide sequence shown without the signal peptide coding section,
(ii) a nucleic acid which comprises a nucleotide sequence corresponding to the nucleic acid from (i) in the context of the degeneration of the genetic code, and
(iii) a nucleic acid which comprises a nucleotide sequence which hybridizes with the nucleic acids from (i) or / and (ii) under stringent conditions.

27. Nukleinsäure nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie innerhalb das für das S-Layer-Protein kodierenden Bereichs mindestens eine Peptid- oder Polypeptid-kodie rende Insertion enthält.27. The nucleic acid according to claim 26, characterized, that they are within the coding for the S-layer protein Range at least one peptide or polypeptide code containing insertion.

28. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach Anspruch 26 oder 27 enthält.28.Vector, characterized, that he after at least one copy of a nucleic acid Claim 26 or 27 contains.

29. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 26 oder 27 oder einem Vektor nach Anspruch 28 transformiert ist.29th cell, characterized, that with a nucleic acid according to claim 26 or 27 or a vector is transformed according to claim 28.

30. S-Layer-Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nukleinsäure nach Anspruch 27 kodiert ist.30. S-layer protein, characterized, that it encodes a nucleic acid according to claim 27 is.

31. Rekombinante S-Layer-Struktur, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Untereinheit mindestens ein rekombinantes S- Layer-Protein enthält, das von einer Nukleinsäure nach Anspruch 27 kodiert ist.31. recombinant S-layer structure, characterized, that as a subunit they have at least one recombinant S- Layer protein contains that after a nucleic acid Claim 27 is encoded.

32. Verwendung eines S-Layer-Proteins nach Anspruch 30 oder einer S-Layer-Struktur nach Anspruch 31 als Vakzin oder Adjuvans.32. Use of an S-layer protein according to claim 30 or an S-layer structure according to claim 31 as a vaccine or Adjuvant.

33. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten S-Layer-Pro teinen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine Wirtszelle bereitstellt, die eine für ein S- Layer-Protein kodierende Nukleinsäure enthält, die innerhalb des für das S-Layer-Protein kodierenden Bereichs eine Peptid- oder Polypeptid-kodierende Insertion enthält,
(b) die Wirtszelle unter solchen Bedingungen kultiviert, die zu einer Expression der Nukleinsäure und zu ei ner Erzeugung des davon kodierten Polypeptids füh ren, und
(c) das resultierende Polypeptid aus der Wirtszelle oder dem Kulturmedium gewinnt.

33. Process for the production of recombinant S-layer proteins, characterized in that

(a) provides a host cell which contains a nucleic acid coding for an S-layer protein which contains a peptide or polypeptide-coding insert within the region coding for the S-layer protein,
(b) culturing the host cell under conditions which lead to expression of the nucleic acid and generation of the polypeptide encoded thereby, and
(c) the resulting polypeptide is recovered from the host cell or culture medium.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die für das rekombinante S-Layer-Protein kodierende Nukleinsäure ausgewählt wird aus

(i) einer Nukleinsäure, welche die von Position 1 bis 3684 in SEQ ID NO. 1 gezeigte Nukleotidsequenz gege benenfalls ohne den Signalpeptid-kodierenden Ab schnitt umfaßt,
(ii) einer Nukleinsäure, welche eine der Nukleinsäure aus (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz umfaßt, und
(iii) einer Nukleinsäure, welche eine mit den Nukleinsäu ren aus (i) oder/und (ii) unter stringenten Bedin gungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.

34. The method according to claim 33, characterized in that the nucleic acid coding for the recombinant S-layer protein is selected from

(i) a nucleic acid which contains the position 1 to 3684 in SEQ ID NO. 1 optionally includes the nucleotide sequence shown without the signal peptide coding section,
(ii) a nucleic acid which comprises a nucleotide sequence corresponding to the nucleic acid from (i) in the context of the degeneration of the genetic code, and
(iii) a nucleic acid which comprises a nucleotide sequence which hybridizes with the nucleic acids from (i) or / and (ii) under stringent conditions.

35. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die für das rekombinante S-Layer-Protein kodierende Nukleinsäure ausgewählt wird aus

35. The method according to claim 33, characterized in that the nucleic acid coding for the recombinant S-layer protein is selected from

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-35, dadurch gekennzeichnet, daß in der Wirtszelle ein weiteres S-Layer-Gen exprimiert wird, das für ein nichtmodifiziertes S-Layer-Protein kodiert.36. The method according to any one of claims 33-35, characterized, that another S-layer gene is expressed in the host cell for an unmodified S-layer protein encoded.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtmodifizierte S-Layer-Protein in der Lage ist, eine mit dem rekombinanten S-Layer-Protein kompa tible S-Layer-Struktur auszubilden.37. The method according to claim 36, characterized, that the unmodified S-layer protein is capable of is one with the recombinant S-layer protein to develop a flexible S-layer structure.

38. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-35, dadurch gekennzeichnet, daß in der Wirtszelle kein weiteres S-Layer-Gen expri miert wird, das für ein nichtmodifiziertes S-Layer-Pro tein kodiert, welches in der Lage ist, eine mit dem re kombinanten S-Layer-Protein kompatible S-Layer-Struktur auszubilden.38. The method according to any one of claims 33-35, characterized, that no further S-layer gene expri in the host cell that is for an unmodified S-layer pro encoded, which is able to match one with the right combined S-layer protein compatible S-layer structure to train.

39. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-38, dadurch gekennzeichnet, daß man eine prokaryontische Wirtszelle verwendet.39. The method according to any one of claims 33-38, characterized, that a prokaryotic host cell is used.

40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß man eine gram-positive Wirtszelle verwendet.40. The method according to claim 39, characterized, that a gram-positive host cell is used.

41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß man B.stearothermophilus verwendet.41. The method according to claim 40, characterized, that B.stearothermophilus is used.