DE19548954A1 - Biotechnologische Herstellung von Hyaluronat enthaltenden Kulturlösungen - Google Patents
Biotechnologische Herstellung von Hyaluronat enthaltenden KulturlösungenInfo
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- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
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Description
Hyaluronsäure und ihre Salze, die Hyaluronate, sind natürlich vorkommende Biopolymere,
die aus linearen Ketten sich wiederholender Einheiten von Glucuronsäure und
N-Acetylglucosamin aufgebaut sind. Aufgrund der wasserhaltenden Eigenschaften sind
sie für die gelförmige Struktur des Bindegewebes verantwortlich. Die hyaluronathaltigen
Bindegewebsstrukturen schützen die Gewebe vor dem Eindringen von Substanzen und
Bakterien und wirken formstabilisierend. Andererseits führt die vermehrte Einlagerung von
Hyaluronat zu einer Auflockerung des Gewebes, wodurch physiologische Prozesse vor
bereitet werden. Hyaluronat ist an wichtigen biologischen Prozessen, wie Zellbeweglichkeit,
Zelldifferenzierung und Metastasenbildung beteiligt. Seine Biokompatibilität, die hohe
Viskoelastizität der Lösung, die enzymatische Abbaubarkeit und die Nichtimmunogenität
machen das Hyaluronat zu einem medizinisch wichtigen Biomaterial, das beispielweise in
der Augenheilkunde und bei Gelenkerkrankungen sowie zur Freisetzung von
Medikamenten eingesetzt wird. In kosmetischen Produkten wird Hyaluronat als
körperverträglicher wasserhaltender Zusatz verwendet. Je größer das Hyaluronatmolekül,
bzw. seine Molmasse ist, desto geeigneter ist das Hyaluronat für die genannten
Anwendungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein biotechnologisches Verfahren zur fermentativen
Gewinnung von hochmolekularer Hyaluronsäure bzw. ihrer Salze, insbesondere des
Natriumsalzes (im folgenden Text einheitlich als Hyaluronate bezeichnet). Das
erfindungsgemäß hergestellte Hyaluronat ist als wasserbindende Substanz beispielsweise
in der kosmetischen Industrie oder als Ausgangsprodukt für ein in der Medizin
anwendbares Hyaluronat oder als Reaktant bei der Herstellung pharmakologisch aktiver
Substanzen einsetzbar.
Hyaluronat wurde bis Mitte der achtziger Jahre durch Extraktion aus tierischen Geweben
gewonnen. Dann wurden biotechnologische Herstellungsverfahren eingeführt, mit denen
Nachteile der bisherigen Gewinnung umgangen werden können.
Bei der biotechnologischen Herstellung werden Hyaluronat bildende Mikroorganismen der
Gattung Streptococcus, insbesondere der Lancefieldgruppe C verwendet. So werden
überwiegend die Arten Streptococcus equi (WO 9208799 v. 29. Mai 1992, US 5071751 v.
10. Dezember 1991, JP 01225491 v. 8. September 1989, JP 63141594 v. 14. Juni 1988,
JP 63123392 v. 27. Mai 1988, EP 266578 v. 11. Mai 1988, JP 63028398 v. 6. Februar
1988, JP 62289198 v. 16. Dezember 1987, JP 62215397 v. 22. September 1987, EP
144019 v. 12. Juni 1986, EP 143393 v. 5. Juni 1986, JP 61063294 v. 1. April 1986, DE
35 31 612 v. 27. März 1986, JP 61015698 v. 23. Januar 1986) und Streptococcus equi,
subspecies Streptococcus zooepidemicus (JP 06070782 v. 15. März 1994, CS 276099 v.
15. April 1992, JP 02245193 v. 28. September 1990, JP 02058502 v. 27. Februar 1990,
US 4897349 v. 30. Januar 1990, JP 01067196 v. 13. März 1989, JP 63094988 v. 26. April
1988, JP 63012293 v. 19. Januar 1988, JP 62289197 v. 16. Dezember 1987, EP 244757
v. 11. November 1987, JP 62257901 v. 10. November 1987, JP 62051999 v. 6. März
1987, JP 62032893 v. 12. Februar 1987, JP 61219394 v. 29. September 1986, WO
8604355 v. 31. Juli 1986, DE 35 17 629 v. 28. November 1985, JP 58056692 v. 4. April
1983) eingesetzt. Daneben werden Streptococcus pyogenes (Lancefieldgruppe A) (FR
2617849 v. 13. Januar 1989, WO 8403302 v. 30. August 1984), Pasteurella-Arten (JP
02245193 v. 28. September 1990) und einige nicht näher bestimmte Streptococcus-
Stämme (JP 06098787 v. 12. April 1994, JP 06038783 v. 15. Februar 1994, JP 05276972
v. 26. Oktober 1993) angegeben.
Die für die Produktion verwendeten Stämme werden in der Regel aufgrund ihrer
Fähigkeit, unter Emers-Kultivierungsbedingungen schleimige (mukoide) Kolonien zu
bilden, vorausgewählt und in der Mehrzahl der Fälle anschließend einer Mutagenese
unterworfen, um noch leistungsfähigere Produzentenstämme zu finden bzw. die Bildung
von Toxinen und Pyrogenen und die Eigenschaft der β-Hämolyse einzuschränken bzw. zu
unterbinden. Eine entscheidende Voraussetzung für einen leistungsfähigen
Hyaluronatbildner ist das Nichtvorhandensein von extrazellulärer Hyaluronidaseaktivität.
Die in der Patentliteratur aufgeführten mikrobiellen Herstellungsverfahren von
Hyaluronsäure bzw. Hyaluronat (HS) können anhand folgender Leistungsparameter
beschrieben werden:
- - Endkonzentration an Hyaluronat (gl-1),
- - Prozeßdauer (h),
- - physiologische Produktivität (gl-1h-1),
- - Molmasse (D) des Hyaluronats und
- - Konversionsgrad von Glukose YHS/GI (%)
YHS/GI = (gebildetes Hyaluronat I verbrauchte Glukose) × 100%
In der Patentliteratur wird beispielsweise bei batch-Fermentationen eine maximale
Endkonzentration an Hyaluronat von 6,7 gl-1 angegeben (EP 244757 v. 11. November
1987); das entspricht bei der Prozeßdauer von 24 h einer durchschnittlichen Produktivität
von 0,28 gl-1h-1. Nach dem gleichen Schutzrecht wird bei kontinuierlicher Fermentation mit
einer Verdünnungsrate von 0,3 h-1 eine Hyaluronatkonzentration von 3 gl-1 und eine
Produktivität von 0,9 gl-1h¹ erreicht. Die Molmasse des Hyaluronats beträgt dabei 2,16 ×
10⁶ D. Eine maximale Produktivität für kontinuierliche Kultivierung wird mit 0,96 gl-1h-1
angegeben (JP 01067196 v. 13. März 1989).
Der Konversionsgrad liegt bei etwa 4% bis 8% mit Ausnahme folgender Schutzrechte: In
EP 244757 v. 11. November 1987 wird ein Konversionsgrad von etwa 15%, in
JP 01067196 v. 13. März 1989 von 16% angegeben.
Die Molmasse der in der Literatur beschriebenen extrazellulären Hyaluronate liegt
zwischen 0,5 × 10⁶ D und 2,5 × 10⁶ D. In WO 8604355 v. 31. Juli 1986 wird ein
Molmassebereich von 2,2 × 10⁶ D bis 3,5 × 10⁶ D angegeben.
Die Molmasse und auch die maximale Endkonzentration der batch Fermentationen ist in
einigen Fällen nicht nur von der Art des eingesetzten Stammes abhängig, sondern wird
auch durch bestimmte Zusätze zum Grundmedium positiv beeinflußt. So führt nach der
Zusatz von Laurylsulfat zu einer Erhöhung der Molmasse von 1,0 × 10⁶ D auf 2,5 × 10⁶ D
und der teilweise Ersatz von Hefeextrakt durch Ammoniumnitrat nach JP 02058502 v. 27.
Februar 1990 zu einer Erhöhung der Molmasse von 1,87 × 10⁶ D auf 2,5 × 10⁶ D. Der
Zusatz von phenolischen bzw. hydroxyaromatischen Substanzen, beispielsweise von
Tannin, bewirkt nach EP 266578 v. 11. Mai 1988 bzw. JP 01225491 v. 8.September 1989
eine Erhöhung der Endkonzentration von 2,4 gl-1 auf 6,3 gl-1 und eine Erhöhung der
Molmasse von 0,43 × 10⁶ D auf 2,5 × 10⁶ D. Die Zugabe von Glucosamin und Pyruvat
wird nach JP 62257901 v. 10. November 1987, der Zusatz von bakteriolytischem Enzym
und von Blutserum nach DE 35 31 612 v. 27. März 1986 für das Erreichen einer
Endkonzentration von 5,8 gl-1 verantwortlich gemacht.
Es ist bekannt, daß bei semikontinuierlicher bzw. kontinuierlicher Fermentationsführung
die Produktivität der Verfahren gegenüber einer Folge von batch-Fermentationen durch
das Wegfallen der für die Produktbildung uneffektiven Anwachs- und Sättigungsphase der
Einzelfermentationen sowie der Rüstzeiten zwischen den Einzelfermentationen wesentlich
erhöht wird. Ein Maß für die Wirtschaftlichkeit ist die Raum-Zeit-Ausbeute
(gl-1h-1), die über die Zeit des Gesamtprozesses einschließlich der Rüstzeiten berechnet
wird; die physiologische Raum-Zeit-Ausbeute dagegen wird unter Bezug auf die reine
Fermentationszeit berechnet.
Es ist das Ziel der Erfindung, Hyaluronsäure mit besonders hoher Molmasse - bevorzugt
in Form ihrer Salze - enthaltende Kulturflüssigkeiten biotechnologisch durch Submers
fermentation mit hoher und beliebig oft reproduzierbarer stabiler Leistung in Bezug auf die
Raum-Zeit-Ausbeute bzw. die Produktivität effektiv in einem technischen Maßstab herzu
stellen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, hyaluronathaltige
Fermentationslösungen mit besonders hoher Molmasse des Hyaluronats mittels diskon
tinuierlicher, semikontinuierlicher oder kontinuierlicher Fermentation bei reproduzierbarer
hoher und langanhaltender Produktbildung herzustellen. Diese Aufgabe wurde dadurch
gelöst, daß ein spezieller mikrobieller Bildner gesucht und ein für diesen Bildner angepaß
tes Fermentationsverfahren entwickelt wurde.
Unter 299 vorausgewählten Stämmen wurde ein Stamm erhalten, mit dem unter den
Bedingungen einer Fermentation in einem gerührten und schwach belüfteten Fermenter
bei Konstanthaltung der Azidität zwischen pH 6,4 und pH 7,6 und der Temperatur
zwischen 30°C und 40°C eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute erreicht wird. Es wurde festge
stellt, daß dieser Stamm keine Hyaluronat abbauende enzymatische Aktivität aufweist. Er
erzeugt bei einer adäquaten Fermentationsführung (fed batch) in der Kulturlösung eine
Hyaluronatkonzentration (bestimmt als Hyaluronsäure) zwischen 7 gl-1 und 9 gl-1. Die
Molmasse des Hyaluronats liegt über 2,5 × 10⁶ D, insbesondere im Bereich von 2,5 × 10⁶
D bis 9,0 × 10⁶ D (bestimmt mit HPLC). Der Konversionsgrad YHS/GI der Umwandlung von
Glukose in Hyaluronat liegt bei dem verfahrensgemäßen Vorgehen bei 4% bis 10%.
Der gefundene Stamm wurde am 06. 12. 1995 unter der Hinterlegungsnummer 10348 in
der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Braunschweig
(DSM) hinterlegt.
Das erfindungsgemäß durchgeführte Fermentationsverfahren ist insofern ungewöhnlich,
als in den bisher bekannten Herstellungsprozessen für Hyaluronat die möglichst effektive
Umwandlung der Glukose in das Hyaluronat angestrebt wurde. Der Konversionsgrad
YHS/GI des gefundenen Stammes liegt im unteren Bereich der in der Patentliteratur
angegebenen Werte (Maximalwert 15%). Der große Vorteil der hier vorgeschlagenen
Vorgehensweise, daß bei der Fermentation eine sehr große Raum-Zeit-Ausbeute sowie
eine besonders hohe Molmasse erreicht wird, wiegt die Nachteile des ungünstigeren
Konversionsgrades auf.
Die erfindungsgemäße Durchführung der Fermentation kann als fed-batch-Prozeß
erfolgen; die Erfindung erstreckt sich jedoch auch auf die Durchführung von zyklischen
fed-batch-Fermentationen und auf die Durchführung von kontinuierlichen Fermentationen
(Chemostatenprinzip). Durch die semikontinuierliche bzw. kontinuierliche Durchführung
werden unproduktive Rüstzeiten sowie die unproduktiven Phasen der Fermentation
(Start- und Sättigungsphase) mit dem Ergebnis einer höheren Raum-Zeit-Ausbeute
verkürzt.
Für die Gewährleistung der Reproduzierbarkeit der genannten Kenngrößen bei der Durch
führung des erfindungsgemäßen Fermentationsverfahrens, insbesondere der Hyaluronat-
Endkonzentration bzw. der Produktivität ist es erforderlich, daß im Fermenter zu keiner
Zeit Glukosemangel auftritt. Eine untere nicht zu unterschreitende Glukosekonzentration
von 1 gl-1 hat sich als zweckmäßig erwiesen.
Weiterhin ist für das Erreichen der genannten hohen Produktendkonzentration und der
hohen physiologischen Raum-Zeit-Ausbeute die Homogenität der Kulturlösung bezüglich
Azidität, Temperatur und Nährstoffkonzentration wesentlich. Das erfordert eine aus
reichende Durchmischung auch bei der mit der Produktkonzentration steigenden
Viskosität der Kulturlösung insbesondere zum Ende der Fermentation. Für das Erreichen
der angegebenen hohen Molmassen dürfen dagegen keine zu großen Scherkräfte durch
zu hohe Rührerdrehzahlen auftreten.
Es wurde gefunden, daß durch den Einsatz eines schiffsschraubenförmigen Rührers mit
einer Drehzahl von 200 min-1 bis 300 min bei einer Viskosität von bis zu 80 mPas
(Schergeschwindigkeit 20 s-1) am Ende einer batch-Fermentation die Mischzeit
(Kenngröße des Systems Fermenter - Rührer - Kulturmedium für die Geschwindigkeit der
Durchmischung) unter einen Wert von 10 s herabgesetzt und die Endkonzentration von
Hyaluronat um etwa 1 gl-1bis 2 gl-1 bis auf einen Wert von 9 gl-1 gesteigert wird. Dieser
Befund deutet darauf hin, daß die physiologische Leistungsgrenze des Leistungsstammes
noch nicht erreicht ist, sondern die immer geringer werdende Durchmischung der Kultur
infolge der hohen Viskosität zum begrenzenden Faktor der Biosynthese wird. Der Einsatz
des schiffsschraubenförmigen Rührers führt bei den erfindungsgemäß selektierten
Hyaluronatbildnern bei semikontinuierlicher und kontinuierlicher Fermentation ebenfalls zu
einer Erhöhung der physiologischen Raum-Zeit-Ausbeute. Als weiterer Vorteil ergibt sich,
daß bei schiffsschraubenförmigen Rührern wesentlich geringere Scherkräfte auftreten,
wodurch die Gefahr verringert wird, daß Hyaluronatmoleküle mit hoher Molmasse in
Stücken mit niedrigerer Molmasse zerschlagen werden.
Gefunden wurde auch, daß sich die Produktbildung bei fed-batch- und zyklischen fed-
batch-Fermentationen für mehrere Stunden mit konstanter Rate fortsetzt, wenn die
Azidität der Kulturlösung um 0,5 bis 0,7 pH-Einheiten auf Werte bis zu pH 7,6 erhöht wird,
nachdem die Bildungsrate ihr Maximum durchlaufen hat. Diese Erhöhung kann in einem
Schritt oder in mehreren Teilschritten erfolgen. Die Abnahme der Bildungsrate nach dem
Durchlaufen ihres Maximums ist an der Abnahme des Anstiegs des Zähigkeitsverlaufes
bzw. an der Abnahme der Laugendosierrate erkennbar.
Bei der Durchführung einer fed-batch-Fermentation unter Einhaltung aller vorgenannten
Bedingungen und unter Einsatz des schiffsschraubenförmigen Rührers wird die oben
genannte Hyaluronatendkonzentration von bis zu 9 gl-1 nach einer Fermentationszeit von
14 bis 20 Stunden erreicht.
Beim zyklischen fed-batch-Verfahren wird vor dem Beginn der Sättigungsphase der
Produktbildung ein Teil der Kulturlösung geerntet und durch neues steriles Nährmedium
ersetzt. Es wurde gefunden, daß sich bei der Ernte von 50% bis 95% (w/w) des
Fermenterinhalts nach Erreichen einer Viskosität der Kulturlösung von 30 mPas bis
70 mPas, insbesondere jedoch von 45 mPas bis 60 mPas (Schergeschwindigkeit 20 s-1)
eine hohe physiologische Raum-Zeit-Ausbeute über einen Gesamtprozeß mit 5 bis 9
Zyklen ergibt. Der Beginn der Ernte an jedem Zyklusende kann dabei über einen Zeitplan
(Erfahrungswerte für Normalfermentationen) oder über on-line-Viskositätsmessung
bestimmt werden. Die Viskositätsmessung ist jedoch zu bevorzugen, da sie
gleichbleibende Hyaluronatkonzentration der geernteten Kulturlösung über den
Gesamtprozeß gewährleistet.
Beim kontinuierlichen Fermentationsprozeß fließt nach einer Anwachsphase Kulturlösung
mit konstanter Rate ab und Nährlösung mit der gleichen Rate zu. Eine stabile
Prozeßführung und hohe Produktivität wird bei einer Verdünnungsrate von 0,2 h-1 bis 0,4
h-1 erreicht; die Hyaluronatkonzentration der geernteten Kulturlösung beträgt dabei 3 gl-1
bis 5 gl-1. Der Start des Austausches und die Regelung der Verdünnungsrate erfolgen
über die on-line-Viskositätsmessung.
Zur thermischen Inaktivierung (Abtötung der Streptokokken) wird die Kulturlösung
innerhalb von 10 bis 20 Minuten auf 78°C bis 82°C erhitzt und für 20 bis 25 Minuten auf
dieser Temperatur gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Azidität
der Kulturlösung zur Stabilisierung auf einen Wert zwischen pH 3,8 und pH 4,5 gestellt
und anschließend der chemischen Aufarbeitung zugeführt.
Ohne dadurch die Erfindung einzuschränken, soll sie in ihren Grundzügen durch Beispiele
erläutert werden:
Als Quelle für die Streptokokkenstämme der Lancefieldgruppe C dient eine
Stammsammlung, in der die Stämme in Magermilch lyophilisiert vorliegen. Die
Gruppenzugehörigkeit wird mit dem Slidex Strepto Kit (bio-M´rieux) getestet. Mit dem
Material aus der Stammsammlung wird eine Submerskultur beimpft, deren Medium auf
1 Liter aufgefüllt 30 g Todd-Hewitt-Broth (Difco) enthält. Nach 8 Stunden Kultivierung bei
37°C werden 0,1 ml dieser Kultur auf der Oberfläche eines Blutagars ausgespatelt.
Dieser enthält auf 1 Liter aufgefüllt 30,0 g Todd-Hewitt-Broth (Difco), 0,74 g Dinatri
umhydrogenphosphat Dihydrat, 0,13 g Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat, 25 g Bacto
Agar (Difco). Anhand des mukoiden Wachstums werden Hyaluronat bildende Stämme er
kannt.
Die vorausgewählten Stämme werden in einem gerührten und belüfteten Laborfermentor
mit pH-Regelung unter Standardbedingungen auf ihre Fähigkeit, Hyaluronat zu bilden,
untersucht.
Die Nährlösung der Impfkultur enthält im Liter 20,0 g Hefeextrakt (Serva oder Difco), 10 g
pankreatisches Pepton, 1,75 g Natriumacetat, 7,00 g Natriumhydrogencarbonat, 7,00 g
Dinatriumhydrogenphosphat, 5 g Natriumdihydrogenphosphat und 6 g Glukose.
Das im Fermenter eingesetzte Standardmedium enthält pro Liter 20,0 g Hefeextrakt, 12 g
Pepton, 0,03 g Magnesiumsulfat Heptahydrat, 50,0 g Glukose und 0,5 g Kaliumhydro
genphosphat. Der Ansatz ohne die Glukose mit einem Volumen von 90% des Endvolu
mens wird bei 121°C 45 Minuten autoklaviert. Die Glukose wird in wäßriger Lösung mit
einem Volumen von 10% des Endvolumens autoklaviert. Nach Vereinigung der
Lösungen wird die Azidität mit Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt.
Nach einer Kultivierungszeit der Impfkultur von 12 Stunden wird der Laborfermenter mit
5% seines Arbeitsvolumens beimpft. Die Fermentationstemperatur beträgt 34°C. Zur
Rührung wird ein 3-Ebenen-4-Blatt-Scheibenrührer eingesetzt. Die Azidität wird bei pH 6,9
bis pH 7,2 durch Titration mit 30%iger Natronlauge konstant gehalten. Gleichzeitig mit der
Natronlauge-Dosage wird mit der gleichen Rate eine Glukoselösung zugeführt, die 750 g
Glukose in 1000 ml Lösung enthält.
Die besten ausgewählten Stämme bilden innerhalb von 16 Stunden maximal 7 gl-1 bis
8 gl-1 Hyaluronat.
Die leistungsbesten ausgewählten Stämme wurden in einem Fermenter auf einem pH-
gepufferten Medium entsprechend 1.b. kultiviert. Das verwendete Medium enthielt bei
sonst gleicher Zusammensetzung als C-Substrat statt Glukose Hyaluronat. Einer dieser
Stämme zeigte unter diesen Bedingungen innerhalb von 10 Stunden kein Wachstum,
woraus geschlossen werden kann, daß keine extrazelluläre Hyaluronidasebildung
vorhanden ist. Dieser Stamm (Streptococcus equi ssp. zooepidemicus V 2541) wurde als
Produktionsstamm ausgewählt.
Der für die Stammhaltung verwendete Mischsäure-Blutagar enthält pro Liter folgende
Substrate: 30 g Todd-Hewitt-Broth (Difco), 0,74 g Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat,
0,13 g Natriumhydrogenphosphat Dihydrat, 25 g Bacto Agar (Difco) und 50,0 g
Milchsäure. Zur Herstellung dieses Spezialagars werden die Substrate mit Ausnahme des
Bacto Agar in destilliertem Wasser gelöst, dessen Volumen etwa einem Drittel des
vorgesehenen Endvolumens entspricht; die Azidität wird mit 30%iger Natronlauge auf pH
7,2 eingestellt, und mit destilliertem Wasser wird auf das halbe Endvolumen aufgefüllt.
Danach wird die Lösung über eine G5-Fritte steril filtriert. Der Bacto Agar wird in
destilliertem Wasser mit einem Volumen von 45% des Endvolumens gelöst und autokla
viert. Beide Ansätze werden im Wasserbad auf 50°C temperiert und dann unter Zugabe
von 5% heparinisiertem Pferdeblut (800 E/100 ml) - bezogen auf das Endvolumen -
gemischt. Die Mischung wird in Petrischalen zu einer Schichtdicke von etwa 3 mm
gegossen.
Der Nährboden für die erste und zweite Vorkultur enthält pro Liter 20,0 g Hefeextrakt, 10,0
g pankreatisches Pepton, 1,75 g Natriumazetat, 7,0 g Natriumhydrogencarbonat, 3,5 g
Natrium-Di-Hydrogenphosphat, 7,0 g Di-Natriumhydrogenphosphat und 6,0 g Glukose.
Die Glukose wird 20 Minuten bei 121°C autoklaviert und dem restlichen Nährboden
zugesetzt, nachdem dieser 30 Minuten bei 121°C sterilisiert wurde und beide Anteile auf
etwa 40°C abgekühlt sind.
Die erste Vorkultur mit einem Arbeitsvolumen von 50 ml wird von den Blutagar-Platten
entsprechend dem Beispiel 1c beimpft.
In der zweiten Vorkultur mit einem Arbeitsvolumen von 500 ml, die mit 50 ml der ersten
Vorkultur beimpft wird, wird das Impfmaterial für die Hauptkultur im Fermenter erzeugt.
Die Kultivierung der Vorkulturen erfolgt als Standkulturen bei 34°C über 24 Stunden oder
bei 37°C über 12 Stunden. Innerhalb dieses Zeitraumes wird die Glukose vollständig
verbraucht und eine Biomasse von etwa 0,7 gl-1 erreicht. Die erzeugte Kultur wird dann
sofort zur Beimpfung eingesetzt, aber auch eine Lagerung des Impfmaterials bei 6°C über
mehrere Tage ist ohne Nachteile möglich. Die Beimpfungsvolumina liegen bei allen
Beimpfungen zwischen 2% und 5% des Volumens der nachfolgenden Hauptkultur. Dem
Fermentervolumen entsprechend wird die erforderliche Anzahl von Vorkulturen
hergestellt.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird zur Beimpfung von Hauptkulturen mit einem
Arbeitsvolumen 300 l eine Fermenterkultur als dritte Vorkultur eingesetzt, die mit der
zweiten Vorkultur beimpft wird. Die Zusammensetzung des Nährbodens, die Sterilisation
und die Fermentationsbedingungen für diese dritte Vorkultur entsprechen den für die
Hauptkultur in Beispiel 3 angegebenen; es erfolgt jedoch keine Glukosezufütterung
während der Fermentation. Die Biomassekonzentration des so erzeugten Impfmaterials
liegt bei 3 gl-1 bis 4 gl-1.
Das Hauptkulturmedium enthält pro Liter 20,0 g Hefeextrakt, 12,0 g pankreatisches
Pepton, 0,5 g Kaliumhydrogenphosphat, 0,03 g Magnesiumsulfat Heptahydrat, 1,0 ml
Entschäumer auf Silikonbasis, 32,5 µl eines Spurenelementekonzentrates (1 M Lösung
von Co-, Fe-, Mn-, Zn-, Mg- und Cu-Salzen) und 50,0 g Glukose. Die Glukose wird
separat 20 Minuten bei 121°C autoklaviert und dem restlichen Nährboden zugegeben,
nachdem dieser 30 Minuten bei 121°C sterilisiert wurde und beide Anteile auf ca. 40°C
abgekühlt sind.
Die Fermentation erfolgt in einem gerührten und belüfteten Edelstahlfermenter mit einem
Arbeitsvolumen von 50 l bis 1000 l, der mit Meß- und Regeleinrichtungen für die
Standardgrößen Temperatur und Azidität ausgerüstet ist. Während der 14 bis 20 Stunden
dauernden Fermentation wird die Temperatur auf 34°C und die Azidität auf pH 7,0
geregelt. Die pH-Regelung erfolgt durch einen Schaltregler, der bei Unterschreitung des
pH-Sollwertes sowohl eine Laugenpumpe als auch eine Glukosepumpe einschaltet und
nach Wiedereinstellung des pH-Sollwertes ausschaltet. Zur pH-Regelung wird 45%ige
Natronlauge und für die Glukosedosage eine Lösung von 750 g Glukose auf 1 l Lösung
verwendet. Das Verhältnis der Fördervolumina Glukoselösung zu Natronlauge beträgt
1,5/1. Damit wird im Fermenter zu keinem Zeitpunkt eine Glukosekonzentration von 1,0
gl-1 unterschritten. Durch die Rührung mit einer Drehzahl von 200 min-1 bis 300 min-1 und
die Belüftung mit einer Rate von 3 bis 25 Liter pro Stunde und Liter Fermenterinhalt wird
die Kultur durchmischt. Gegen Ende der Fermentation steigt die Viskosität der Fermenta
tionslösung auf Werte von 80 mPas bis 90 mPas, gemessen mit einem Schwingungs
viskosimeter mit einer Schergeschwindigkeit von 20 s-1. Es wird eine Hyaluronatkonzen
tration von 7 gl-1 bis 8 gl-1 - beim Einsatz eines schiffsschraubenförmigen Rührers
(Beispiel 6) bis 9 gl-1 - erreicht; das entspricht einer physiologischen Produktivität von
0,35 gl-1h-1 bis 0,5 gl-1h-1. Die Molmasse des gebildeten Hyaluronats ist größer als 2,5 ×
10⁶ D; sie wurde mittels HPLC bestimmt.
Die Nährmediumzusammensetzung und die Bedingungen für die Sterilisation, Beimpfung
und Fermentation für den zyklischen fed- batch-Prozeß entsprechen den für die
fed-batch-Fermentation im Beispiel 3 beschriebenen. Das Medium für die Folgezyklen hat
die gleiche Zusammensetzung wie das Medium für den Startzyklus und wird in sterilisier
ter Form bereitgestellt. Die sterilisierte Glukoselösung wird separat zugegeben.
Als Kriterium für das Ende eines Zyklus wird in einem Ausführungsbeispiel eine feste
Zyklusdauer vorgegeben. Sie beträgt für den Startzyklus 10 bis 12 Stunden und für die
Folgezyklen 7 bis 8 Stunden. In einer anderen Ausführung wird das Erreichen einer
vorgegebenen Viskosität von 50 mPas bis 60 mPas im Fermenter verwendet; die Viskosi
tät wird dazu on line kontinuierlich mit einem Schwingungsviskosimeter mit einer Scherge
schwindigkeit von 20/s gemessen. Das Erreichen des Abbruchkriteriums wird durch eine
Ablaufsteuerung erkannt, die dann die Ernte von 70% bis 75% der Kulturlösung und
danach das Auffüllen des Fermenters mit dem frischen Nährmedium und der
Glukoselösung auslöst und kontrolliert.
Bei typischen Fermentationen mit 7 Zyklen wird bei einer Hyaluronatkonzentration im
geernteten Kulturmedium zwischen 3,5 gl-1 und 4,5 gl-1 eine physiologische Produktivität
von 0,55 gl-1h-1 bis 0,60 gl-1h-1 über 50 Stunden erreicht.
In einer weitgehend analog Beispiel 4 durchgeführten kontinuierlichen Fermentation wird
die Kulturlösung im Fermenter mit einer spezifischen Verdünnungsrate von D = 0,35 h-1
kontinuierlich durch frisches Nährmedium ersetzt. Der Zufluß des Nährmediums wird
6 Stunden nach Beimpfen des Fermenters gestartet.
In einer anderen Ausführung wird der Zufluß des frischen Nährmediums bzw. der Abfluß
der Kulturlösung gestartet, wenn die on line gemessene Viskosität der Kulturlösung einen
Wert von 20 mPas erreicht hat. Die Verdünnungsrate wird dann so geregelt, daß dieser
Viskositätswert konstant bleibt (Turbidostatprinzip).
Start und Regelung von Zu- und Abfluß erfolgen in beiden Fällen durch ein Prozeß
leitsystem.
Bei einer 42-stündigen kontinuierlichen Fermentation wird eine durchschnittliche
physiologische Raum-Zeit-Ausbeute von 0,94 gl-1 h-1 erreicht.
Bei Fermentationen nach Beispiel 3, 4 und 5 wird ein spezieller schiffsschraubenförmiger
Rührer eingesetzt, der im unteren Drittel des Fermenters angeordnet ist und die
Kulturlösung nach unten fördert. Mit diesem Rührer wird im Vergleich mit einem
herkömmlichen 2-Ebenen-4-Blatt-Rührer bei einer Drehzahl von 300 min-1 und einer
Viskosität des Kulturmediums von 80 mPas die Einschwingzeit nach einer sprungförmigen
Änderung eines Fermentationsparameters, z. B. der Temperatur, in ein Band mit der
Breite von ± 5% um den stationären Endwert auf die Hälfte verringert. Für den
schiffsschraubenförmigen Rührer läßt sich die Mischzeit angeben; sie beträgt 10 s. Bei
einer batch-Fermentation wird nach 16 Stunden eine Hyaluronatkonzentration von 8,8 gl-1
erreicht.
Bei Fermentationen nach Beispiel 3 und 4 wird nach Erreichen der maximalen
Produktbildungsrate - gemessen in einem Beispiel über die analog verlaufende
Laugendosierrate oder in einem anderen Beispiel über das Maximum des Anstiegs des
Viskositätsverlaufes - der Sollwert der pH-Regelung um 0,5 bis 0,7 pH-Einheiten erhöht.
Dadurch wird die Produktbildung über mehrere Stunden mit konstanter Rate fortgesetzt
und eine Erhöhung der physiologischen Produktivität um 0,05 gl-1h-1 erreicht. Die Berech
nung des Anstiegs und die Änderung des Sollwertes erfolgen durch ein Prozeßleitsystem.
Zur Abtötung der Streptokokken wird die Kulturlösung nach Beendigung der fed-batch-
Fermentation entsprechend Beispiel 3 im Fermenter bzw. nach der Ernte am Zyklusende
bei einer zyklischen fed-batch-Fermentation nach Beispiel 4 im Erntegefäß innerhalb von
10 bis 20 Minuten auf 78°C bis 82°C erhitzt und für 20 bis 25 Minuten auf dieser
Temperatur gehalten. Bei kontinuierlicher Fermentation nach Beispiel 5 erfolgt die
thermische Inaktivierung nach dem gleichen Temperatur-Zeit-Regime, wenn das
Erntegefäß durch die kontinuierlich entnommene Kulturlösung gefüllt ist. Nach der
Abkühlung auf Raumtemperatur wird die Kulturlösung mit verdünnter Schwefelsäure auf
eine Azidität von pH 3,8 bis pH 4,5 eingestellt und anschließend dem
Aufarbeitungsprozeß zugeführt.
Die Bestimmung der Molmasse des Hyaluronats erfolgte mit Hilfe der HPLC-Methode
(Gerät: Firma Kontron, RI-Detektor Abimed, Gilson; Säule: Pss Gel, HEMA BIO 2000,
7,5 × 300 mm; Flow: 1 ml/min NaNO₃ (isokratisch)). Die Säule wurde mit Pullulanen der
Firma Polymer Standards Service, Mainz mit den Molmassen 5,8 × 10³ D, 10,0 × 10³ D,
23,7 × 10³D, 48,0 × 10³ D, 0,100 × 10⁶D, 0,186 × 10⁶ D, 0,380 × 10⁶D und 1,66 × 10⁶ D
geeicht, wobei 1 mg/ml der Standards in Wasser, bzw. in 100 mM NaNO₃ gelöst und
20 ml auf die Säule injiziert wurden. Da keine Standards mit Molmassen über 2 × 10⁶ D
verfügbar waren, mußte die Regressionsgerade für die genannten Standards über den
Eichbereich hinaus extrapoliert werden.
Ein von der Firma Serva mit einer Molmasse von 2,0 × 10⁶ D angebotenes Hyaluronat
wurde mit der hier genannten Methode gemessen; die ermittelte Molmasse stimmte mit
dem von Serva angegebenen Wert überein.
Für das erfindungsgemäß hergestellte Hyaluronat wurde die in der folgenden Abbildung
dargestellte Molmassenverteilung mit dem Maximum bei 8 × 10⁶ D gefunden:
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure bzw. ihre Salze enthaltenden
Kulturlösungen unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung
Streptococcus, gekennzeichnet dadurch, daß als Hyaluronatbildner der Stamm
Streptococcus equi ssp. zooepidemicus V 2541 (DSM 10348) eingesetzt und in
einer fed-batch, einer semikontinuierlichen oder einer kontinuierlichen Kultur unter
Konstanthaltung der Azidität bei pH 6,4 bis pH 7,6 und der Temperatur bei 30°C bis
40°C unter Aufrechterhaltung der Glukoseversorgung fermentiert wird und daß das
in der Kulturlösung gelöste Hyaluronat Molmassen größer als 2,5 × 10⁶ D aufweist.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß während der
Hyaluronatfermentation die Glukosekonzentration den Wert von 1 gl-1 nicht unter
schreitet.
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Rührsystem des
Fermenters bei einer Drehzahl von 200 min-1 bis 300 min-1 die Submerskultur
während der Fermentation bei einer Viskosität von bis zu 80 mPas
(Schergeschwindigkeit 20 s-1) mit einer Mischzeit kleiner als 10 s durchmischt.
4. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß die fed-batch-
Fermentation nach 14 bis 20 Stunden beendet ist.
5. Verfahren nach Punkt 1,2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß während der
Fermentation nach Erreichen einer Viskosität der Kulturlösung von 30 mPas bis
70 mPas, bevorzugt jedoch 45 mPas bis 60 mPas (Schergeschwindigkeit 20 s-1),
eine Menge von 50% bis 95% (w/w) der Kulturlösung entnommen und durch eine
etwa gleiche Menge sterilen Nährmediums ersetzt wird und dieser Prozeß als
zyklische fed-batch-Fermentation mehrfach wiederholt wird.
6. Verfahren nach Punkt 1,2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Fermentation als
kontinuierliche Kultur unter Zuführung frischen sterilen Mediums mit Ver
dünnungsraten zwischen 0,2 h-1 und 0,4 h-1 erfolgt und eine Hyaluronatkonzen
tration im steady state von 3 gl-1 bis 5 gl-1 erreicht wird.
7. Verfahren nach Punkt 1, 4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß der pH-Sollwert der
Fermentation nach Erreichen der maximalen Produktbildungsrate sprunghaft in
einem Schritt oder in mehreren Teilschritten um insgesamt 0,5 pH-Einheiten bis 0,7
pH-Einheiten erhöht wird, wobei der Höchstwert von pH 7,6 nicht überschritten wird.
8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Kulturlösung nach
Fermentationsende innerhalb von 10 bis 20 Minuten auf eine Temperatur von 78°C
bis 82 °C erwärmt wird, 20 Minuten bis 25 Minuten bei dieser Temperatur verbleibt
und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt wird.
9. Verfahren nach Punkt 1 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Azidität der
Kulturlösung nach dem Erhitzen und der Abkühlung auf Raumtemperatur auf einen
Wert zwischen pH 3,8 und pH 4,5 gestellt wird.
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DE1995148954 DE19548954A1 (de) | 1995-12-28 | 1995-12-28 | Biotechnologische Herstellung von Hyaluronat enthaltenden Kulturlösungen |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1543103A1 (de) * | 2002-08-19 | 2005-06-22 | Kolon Ind. Inc. | Hyaluronsäure produzierender mikroorganismus und reinigungsverfahren für hyaluronsäure |
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1995
- 1995-12-28 DE DE1995148954 patent/DE19548954A1/de not_active Withdrawn
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