Zum Nachweis von Proteinen in Serum- oder Urinproben für medizinisch
diagnostische Zwecke werden häufig wegen besonders guter Spezifität und Sensiti
vität Immunoassays eingesetzt. Dazu bedarf es neben einem oder zwei spezifi
schen Antikörpern eines Kalibrators, der als Vergleichsmaßstab zur Quantifi
zierung der Patientenproben benutzt wird. Besonders für automatisierte Assays in
großen Analyselaboratorien ist die Lagerung der Kalibratoren bei 4°C für mehrere
Wochen bis Monate wünschenswert. Diese Anforderungen an die Stabilität der
Kalibratorformulierung können je nach Analyt Schwierigkeiten bereiten, wenn z. B.
die Löslichkeit unter physiologischen Salz- und pH-Bedingungen nicht gewähr
leistet ist. Als Beispiel seien hier Troponin I und Troponin T genannt, die nur in
denaturierenden Lösungen (6 M Harnstoff, 0.01 M Dithiothreitol) hinreichend
stabil und löslich sind. Mit dieser denaturierenden Formulierung kann jedoch kein
Immunoassay etabliert werden, da die Antikörper unter dieser Behandlung leiden.
Das Probenvolumen generell zu reduzieren ist i.d.R. nicht möglich, da ein
Nachweis des Analyten bis in niedrige Konzentrationsbereiche (z. B. < 1 ng/ml)
ein möglichst großes Probenvolumen bedingt.For the detection of proteins in serum or urine samples for medical purposes
diagnostic purposes are often due to particularly good specificity and sensitivity
vity immunoassays used. This requires one or two specifics
antibodies of a calibrator, which is used as a comparison standard for quantification
ornamentation of patient samples is used. Especially for automated assays in
large analysis laboratories is storing the calibrators at 4 ° C for several
Weeks to months desirable. These stability requirements
Depending on the analyte, calibrator formulations can cause difficulties if e.g. B.
does not guarantee solubility under physiological salt and pH conditions
is accomplished. Examples include Troponin I and Troponin T, which are only available in
denaturing solutions (6 M urea, 0.01 M dithiothreitol) are sufficient
are stable and soluble. With this denaturing formulation, however, no one can
Immunoassay should be established because the antibodies suffer from this treatment.
Generally, the sample volume should be reduced. not possible because a
Detection of the analyte down to low concentration ranges (e.g. <1 ng / ml)
requires the largest possible sample volume.
Es ist bekannt, daß Proteine in Lösung wenig stabil sind und daß sie enthaltende
Reagenzien häufig in gefriergetrockneter Form vertrieben werden, mit einem
Lösungsmittel geeigneter Zusammensetzung, in dem sie vor der Verwendung von
dem Benutzer aufgelöst werden müssen. Wenn man die auf diese Weise erhaltenen
Lösungen bei 4°C aufbewahrt, kann man sie während mehrerer Tage benutzen,
selbst wenn die tägliche Bestimmung eine gewisse Veränderung der Konzentration
des Reagenz zeigt. So werden im allgemeinen - und es wird auch im Fall von
Troponin I und Troponin T empfohlen - die ausgehend von dem gefrierge
trockneten Material erhaltenen Vergleichslösungen für längere Lagerung in Ein
heitsdosisform einzufrieren. Dieses Verfahren ist zeit- und kostenaufwendig und
kann durch die im folgenden beschriebene Erfindung vermieden werden.It is known that proteins are not very stable in solution and that they contain
Reagents are commonly sold in a freeze-dried form
Solvent of suitable composition in which it is used before
must be resolved to the user. If you get those obtained in this way
Solutions stored at 4 ° C can be used for several days,
even if the daily determination is some change in concentration
of the reagent shows. So in general - and it will in the case of
Troponin I and Troponin T recommended - the starting from the freezer
dried material obtained comparison solutions for longer storage in one
freeze dose form. This process is time consuming and costly
can be avoided by the invention described below.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines
Immunoassays, bei dem der Kalibrator in denaturierende Lösung vorliegt und
somit sehr gute Stabilität hat. Dafür wird die Kalibration nach einem anderen
Versuchsschema durchgeführt, bei dem das Kalibratorvolumen so weit reduziert
wird, daß die denaturierenden Agenzien im Gesamttest stark verdünnt werden. Sie
stören dann bei der Durchführung des Immunoassays nicht. Damit die Standard
kurve bei dieser Art der Kalibration vergleichbar mit der ursprünglich gewonnenen
ist, wird die Konzentration des Kalibrators entsprechend erhöht. Ein Volumenaus
gleich kann über Zugabe einer geeigneten Menge wäßriger Lösung erfolgen.The present invention relates to a method for performing a
Immunoassays in which the calibrator is present in denaturing solution and
thus has very good stability. For this, the calibration is done after another
Test scheme carried out in which the calibrator volume is reduced so far
is that the denaturing agents are greatly diluted in the overall test. she
then do not interfere with the implementation of the immunoassay. So the standard
curve with this type of calibration comparable to that originally obtained
the concentration of the calibrator is increased accordingly. A volume out
the same can be done by adding a suitable amount of aqueous solution.
Unter denaturierenden Agenzien sind Chemikalien zu verstehen, die dazu geeignet
sind Biomoleküle wie z. B. Proteine in ihrer Struktur so zu verändern, daß sie ihre
eigentliche Funktion nicht mehr erfüllen können. Dabei handelt es sich z. B. um
Puffersubstanzen mit unphysiologischen pH-Werten, um Lösungen unphysiolo
gisch hoher oder niedriger Ionenstärke, um Detergenzien wie z. B. Natrium
dodecylsulfat (SDS) oder Triton X100, um chaotrope Salze wie z. B. Guanidinium
hydrochlorid oder Harnstoff, um organische Lösungsmittel wie z. B. Ethanol oder
Dimethylsulfoxid (DMSO) oder um S-reaktive Agenzien wie z. B. β-Mercapto
ethanol oder Dithiothreitol (DTT).
Denaturing agents are chemicals that are suitable for this purpose
are biomolecules such as B. change proteins in their structure so that their
can no longer perform the actual function. It is e.g. B. um
Buffer substances with unphysiological pH values to unphysiolo solutions
high or low ionic strength to detergents such. B. sodium
dodecyl sulfate (SDS) or Triton X100 to generate chaotropic salts such as B. guanidinium
hydrochloride or urea to organic solvents such. B. ethanol or
Dimethyl sulfoxide (DMSO) or to S-reactive agents such. B. β-mercapto
ethanol or dithiothreitol (DTT).
BeispieleExamples
Beispiel 1example 1
Ein Sandwich Immunoassay für den Analyten humanes cardiales Troponin I wurde
durchgeführt auf dem automatisierten Analyser Immuno I (Bayer Diagnostics).
Die Troponin I Präparationen, die als Kalibratoren eingesetzt werden sollen sind in
folgender Lösung über einen langen Zeitraum von mindestens 20 Monaten stabil:
6 M Harnstoff, 0.1 mM Dithiothreitol, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH = 8.0.
Das Probenvolumen für Patientenproben beträgt normalerweise 65 µl. Mit dieser
Lösung ist die Kalibration eines Immunoassays nicht möglich. Für die Kalibration
wurde das Kalibratorvolumen auf 10 und 3,5 µl reduziert. Gleichzeitig wurde die
Konzentration um einen Faktor 6,5 bzw. 20 erhöht. Anhand der gewonnenen
Standardkurve wurde die Konzentration des Analyten in Patientenproben bestimmt.A sandwich immunoassay for the analyte human cardiac troponin I was carried out on the automated analyzer Immuno I (Bayer Diagnostics). The Troponin I preparations that are to be used as calibrators are stable in the following solution over a long period of at least 20 months:
6 M urea, 0.1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH = 8.0. The sample volume for patient samples is normally 65 µl. The calibration of an immunoassay is not possible with this solution. For the calibration, the calibrator volume was reduced to 10 and 3.5 µl. At the same time, the concentration was increased by a factor of 6.5 and 20, respectively. The concentration of the analyte in patient samples was determined on the basis of the standard curve obtained.
Beispiel 2Example 2
Ein Sandwich Immunoassay für den Analyten humanes kardiales Troponin I wurde
durchgeführt auf dem automatisierten Analyser Immuno I (Bayer Diagnostics).
Die Troponin I Präparationen wurden in Ethanol oder DMSO verdünnt, um als
Standardkurve zu dienen. Das Volumen für die Kalibration wurde von 65 µl auf
3.5 µl erniedrigt. Diese kleine Menge an Lösungsmittel beeinflußte den Ablauf des
Immunoassays nicht sehr stark, so daß geringe Modifikationen der
Assay-Konfiguration ausreichen, um die erhaltene Kurve als Standardkurve zu benutzen.A sandwich immunoassay for the human cardiac troponin I analyte was developed
performed on the automated analyzer Immuno I (Bayer Diagnostics).
The Troponin I preparations were diluted in ethanol or DMSO to make up
Standard curve to serve. The volume for the calibration was increased from 65 µl
3.5 µl reduced. This small amount of solvent affected the course of the
Immunoassays are not very strong, so slight modifications of the
Assay configuration is sufficient to use the curve obtained as a standard curve.