DE19545920A1

DE19545920A1 - Use of bioptic material for in vitro diagnosis of, e.g. allergies

Info

Publication number: DE19545920A1
Application number: DE1995145920
Authority: DE
Inventors: Martin Dr Raithel; Hans-Juergen Prof Dr D Reimann
Original assignee: REIMANN HANS JUERGEN PROF DR D
Current assignee: SPEZIALLABOR FUER HUMAN-ANALYTIK AIT GMBH, 19057 S
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 1997-06-12

Abstract

Use of vital bioptic material for the in vitro diagnosis of allergic and immunological disease, is new. Also claimed is an incubation medium to preserve the vitality of the bioptic material in vitro, comprising Hanks and PIPES/RPMI solution together with 10-40 mM Hepes buffer, 0.5-2.0% foetal calf serum and 0.1-0.5% human serum albumin.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von aus Pa tienten gewonnenem bioptischen Material zur in-vitro Diagnose allergischer und immunologischer Erkrankungen, sowie ein Inku bationsmedium, das der Aufrechterhaltung der Vitalität des bi optischen Materials dient.The present invention relates to the use of Pa obtained bioptic material for in-vitro diagnosis allergic and immunological diseases, as well as an inku bationsmedium, which the maintenance of the vitality of the bi optical material.

Eine vorrangige Aufgabe des menschlichen Immunsystems ist es, körpereigene und körperfremde Substanzen zu unterscheiden und gegebenenfalls die Zerstörung der körperfremden Substanzen ein zuleiten.A primary task of the human immune system is differentiate between body-own and foreign substances and if necessary, the destruction of foreign substances forward.

Die fortschreitende Entwicklung immunologischer Methoden hat in der Vergangenheit immer neue diagnostische und therapeutische Möglichkeiten eröffnet. So nutzt man beispielsweise hochspezi fische monoklonale Antikörper als Detektoren für pathogene Vi ren, Bakterien und Parasiten oder zum Aufspühren pathologischer zellulärer Veränderungen. In jüngster Zeit wurde außerdem fest gestellt, daß zahlreiche chronische Erkrankungen auf eine pa thologische Reaktion des Immunsystems zurückzuführen sind. Bei den sogenannten Autoimmunkrankheiten wie der Myasthenie, der chronischen Polyarthritis oder auch dem juvenilen Diabetes richtet sich die Immunantwort gegen körpereigene Zellen und Substanzen. Als pathologisch sind auch die Fälle einzuordnen, bei denen der Körper infolge des Kontakts mit einer körperfrem den Substanz eine übermäßige Immunantwort auslöst. Diese, als Allergien bezeichneten Überempfindlichkeiten gegenüber an sich harmlosen Stoffen, können Haut- und Schleimhautschwellungen am ganzen Körper oder in schwerwiegenden Fällen lebensbedrohliche Reaktionen in Verbindung mit einem anaphylaktischen Schock aus lösen.The progressive development of immunological methods has in the past always new diagnostic and therapeutic Opportunities opened up. For example, you use highly spec fish monoclonal antibodies as detectors for pathogenic Vi bacteria, and parasites or to track down pathological cellular changes. Recently it has also been stuck posed that numerous chronic diseases on a pa theological response of the immune system. At the so-called autoimmune diseases such as myasthenia, the chronic polyarthritis or juvenile diabetes the immune response is directed against the body's own cells and Substances. The cases are also classified as pathological, in which the body as a result of contact with a foreign body the substance triggers an excessive immune response. This, as Allergies referred to hypersensitivity to itself harmless substances, skin and mucous membrane swellings on whole body or life-threatening in serious cases Reactions associated with anaphylactic shock to solve.

Die Aufklärung der individuellen immunologischen Funktionsab läufe, insbesondere die Diagnose der spezifischen Reaktion des einzelnen Patienten auf bestimmte Allergene stellt eine gerade in jüngster Zeit immer wichtiger werdende Aufgabe der Medizin dar. Clarification of individual immunological functions runs, especially the diagnosis of the specific reaction of the individual patients on certain allergens just puts one Recently, medicine has become an increasingly important task represents.

Für den Nachweis allergischer Reaktionen sind eine Vielzahl un terschiedlichster Verfahren bekannt:There are a large number of Various processes known:

So werden beispielsweise nach Operationen und bei endoskopi schen Untersuchungen routinemäßig Gewebeproben entnommen. Nach ihrer Entnahme werden die Gewebeproben nicht mehr mit Nährstof fen versorgt und sterben schnell ab. Mit geeigneten Färbemetho den und immunhistologischen Markierungsverfahren lassen sich aus morphologischen Veränderungen bzw. aus dem Nachweis be stimmter Antikörper Rückschlüsse auf gewisse allergische Reak tionen ziehen. Diese pathohistologischen Verfahren lassen je doch keine Rückschlüsse auf die Stoffe zu, die eine allergische Sofortreaktion (eine sogenannte Typ-1-Reaktion) auslösen. Ebenso sind keine Aussagen über die aktuelle Funktion der Im munzellen möglich.For example, after surgeries and endoscopies tests are routinely taken from tissue samples. After When they are removed, the tissue samples no longer contain nutrients fen supplies and die quickly. With a suitable coloring method and immunohistological labeling methods can be from morphological changes or from the evidence be certain antibody conclusions about certain allergic reak pull. These pathohistological methods can be but no conclusions about the substances that are allergic Initiate an immediate reaction (a so-called type 1 reaction). Likewise, no statements about the current function of the Im mun cells possible.

Zur Diagnose dieser Typ-1-Allergien werden heute im wesentli chen drei verschiedene Testmethoden eingesetzt:To diagnose these type 1 allergies are today mainly three different test methods are used:

Am weitesten verbreitet sind die sogenannten Hauttestverfahren. Dabei werden Extrakte verdächtiger Allergene entweder in die Haut eingekratzt, eingestochen oder werden auf die Haut gelegt. Die lokal stimulierte allergische Reaktion äußerst sich dann als Rötung und Anschwellen der betroffenen Hautpartie.The most common are the so-called skin test procedures. Extracts of suspicious allergens are either in the Skin scratched, stabbed or placed on the skin. The locally stimulated allergic reaction then manifests itself as redness and swelling of the affected skin area.

Bei allergischen Reaktionen des Soforttyps ist Immunglobulin E (IgE) als Antikörper beteiligt. Dies macht man sich bei den Bluttestverfahren zunutze, bei denen mit Hilfe von radioimmuno logischen oder immunenzymatischen Verfahren die Menge des IgE im Blut bestimmt wird. Diese Verfahren erlauben nicht nur die Bestimmung der Gesamtmenge von IgE im Blut, sondern lassen auch die Bestimmung allergenspezifischer Immunglobuline zu.In the case of allergic reactions of the immediate type, immunoglobulin E (IgE) involved as an antibody. You do this with the Take advantage of blood test procedures using radioimmuno logical or immuno-enzymatic procedures the amount of IgE is determined in the blood. These procedures don't just allow that Determine the total amount of IgE in the blood, but also leave it the determination of allergen-specific immunoglobulins.

Bei der dritten Methode schließlich handelt es sich um soge nannte spezifische Provokationsmaßnahmen, bei denen man die Allergene direkt mit der Schleimhaut des Patienten (beispiels weise der Nasen- oder Darmschleimhaut) in Kontakt bringt und die Reaktion beobachtet. Finally, the third method is so-called called specific provocation measures in which the Allergens directly with the patient's mucosa (e.g. the nasal or intestinal mucosa) and observed the reaction.

Ein entscheidender Nachteil aller drei Verfahren ist jedoch die Tatsache, daß der Patient dem Allergen ausgesetzt werden muß. Dies kann einerseits zu einer unerwünschten, erneuten Sensibi lisierung führen und andererseits in Einzelfällen sogar schwer wiegende Reaktionen, wie einen anaphylaktischen Schock auslö sen.However, a major disadvantage of all three methods is that The fact that the patient must be exposed to the allergen. On the one hand, this can lead to an undesirable, renewed sensitivity lead and, on the other hand, even difficult in individual cases weighing reactions, such as triggering an anaphylactic shock sen.

Es besteht daher ein dringendes Bedürfnis nach einem Test für Typ-1-Allergien (Soforttyp), der einerseits eine zuverlässige Diagnose der Reaktion auf ein spezifisches Allergen erlaubt und der andererseits nicht dazu führt, daß der Patient bei der Un tersuchung mit den Allergenen in Kontakt gebracht wird. Das Testverfahren soll dabei nicht nur zur Diagnose allergischer Erkrankungen anwendbar sein, sondern soll sich für die Unter suchung einer Vielzahl anderer immunologischer Funktionsabläufe eignen. Hierzu gehören insbesondere das Studium entzündlicher Prozesse sowie der Regulationsmechanismen der Immunantwort.There is therefore an urgent need for a test for Type 1 allergies (immediate type), on the one hand a reliable Diagnosis of the reaction to a specific allergen allowed and which on the other hand does not lead to the patient at the Un is brought into contact with the allergens. The Test procedures should not only be used to diagnose allergies Diseases are applicable, but should be for the sub search for a variety of other immunological functional processes own. This includes in particular the study of inflammatory Processes and the regulatory mechanisms of the immune response.

Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, vitales bioptisches Materi al zur in-vitro Diagnose allergischer und immunologischer Er krankungen zu verwenden.According to the invention, vital bioptic material is proposed al for the in-vitro diagnosis of allergic and immunological Er to use diseases.

Bevorzugt handelt es sich bei dem bioptischen Material um Haut- oder Schleimhautproben, insbesondere um Schleimhautpartikel aus dem Magen-Darm-Trakt des Patienten. Es können allerdings belie bige Haut- oder Schleimhautproben verwendet werden. Diese kön nen insbesondere mittels einer Biopsie beispielsweise der Haut, der Lungen-, der Darm- oder der Magenschleimhaut gewonnen wer den.The bioptic material is preferably Skin or mucous membrane samples, especially around mucous membrane particles the patient's gastrointestinal tract. However, it can bige skin or mucous membrane samples are used. These can in particular by means of a biopsy, for example of the skin, the pulmonary, intestinal or gastric mucosa the.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß so komplexe Funk tionsabläufe wie allergische oder immunologische Reaktionen auch in-vitro stimuliert werden können.Surprisingly, it was found that such complex radio processes such as allergic or immunological reactions can also be stimulated in vitro.

Die erfindungsgemäße Verwendung des bioptischen Materials be sitzt gegenüber der herkömmlich durchgeführten Biopsie den Vor teil, daß die Gewebeprobe nach der Entnahme aus dem Körper des Patienten am Leben gehalten wird, z. B. indem man sie in einem Inkubator mit einem Inkubationsmedium perfundiert. Neben den üblicherweise durchgeführten Tests auf morphologische und pat hophysiologische Veränderungen lassen sich mit den erfindungs gemäß verwendeten Gewebeproben auch funktionelle physiologische und immunologische Tests durchführen und es können Schädigungen und Krankheiten ermittelt werden, die sich nicht unmittelbar in morphologischen Veränderungen des Gewebes äußern. Die diagno stischen Möglichkeiten der Biopsie werden so vorteilhaft erwei tert. Im Vergleich zu herkömmlichen Allergietests wird deut lich, daß mit der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verwendung von vitalem bioptischem Material Allergietests ohne eine Ge fährdung des Patienten möglich sind.The use of the bioptic material according to the invention sits in front of the conventional biopsy part that the tissue sample after removal from the body of the Patient is kept alive, e.g. B. by placing them in one Incubator perfused with an incubation medium. In addition to the commonly performed tests for morphological and pat hophysiological changes can be made with the invention also functional physiological according to tissue samples used and perform immunological tests and there may be damage and diseases are identified that are not directly in express morphological changes in the tissue. The diagno tical possibilities of the biopsy are thus advantageously shown tert. In comparison to conventional allergy tests is clear Lich that with the use proposed according to the invention of vital bioptic material allergy tests without a ge risk to the patient.

Das vitale bioptische Material ist insbesondere zur in-vitro- Diagnose allergischer Reaktionen verwendbar. Man macht sich dabei entweder zunutze, daß Allergien des Soforttyps mit einer verstärkten Produktion von Immunglobulin E einhergehen, oder daß während des "Allergieanfalls" in der Schleimhaut sogenannte Mediatoren (Botenstoffe) ausgeschüttet werden, welche die ei gentlichen Symptome des Allergieanfalls auslösen. Der entspre chende Test ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man das bioptische Material, unmittelbar nachdem man es dem Pa tienten entnommen hat, in ein temperiertes, sauerstoffhaltiges Inkubationsmedium legt, man mindestens ein Allergen zu dem Inkubationsmedium zwecks Stimulation des bioptischen Materials gibt und man die Ausschüttung von Immunglobulin E (IgE) oder eines Mediators nach einer bestimmten Einwirkungszeit des Al lergens im Inkubationsmedium qualitativ und/oder quantitativ bestimmt. Die nachgewiesenen Konzentrationen von IgE oder eines Mediators werden einer Negativkontrolle, d. h. einer Spon tanfreisetzung ohne Allergenstimulation gegenübergestellt.The vital bioptic material is particularly suitable for in vitro Diagnosis of allergic reactions can be used. You make yourself either take advantage of allergies of the immediate type with a increased production of immunoglobulin E, or that during the "allergy attack" in the mucous membrane Mediators (messenger substances) are distributed, which the egg trigger the symptoms of the allergy attack. The correspond The test according to the invention is characterized in that the bioptic material immediately after giving it to the Pa has taken patients into a tempered, oxygen-containing Incubation medium, at least one allergen is added to the Incubation medium to stimulate the bioptic material and there is the release of immunoglobulin E (IgE) or of a mediator after a certain exposure time of the Al lergens qualitatively and / or quantitatively in the incubation medium certainly. The detected concentrations of IgE or one Mediators are subjected to a negative control, i.e. H. a spon Tan release without allergen stimulation compared.

Vorteilhaft bestimmt man außerdem den Gesamtgehalt an Mediator im Probengewebe. Dazu homogenisiert man das bioptische Material zusammen mit einer bestimmten Menge Wasser in einem Homogeni sierröhrchen mechanisch, entnimmt festgelegte Aliquote des Ho mogenats aus dem Homogenisierröhrchen, zentrifugiert diese Ali quote und bestimmt in den resultierenden Überständen den jewei ligen Mediator quantitativ. Gegebenenfalls spült man das Homo genisierröhrchen, um auch die an den Wänden des Röhrchens haf tenden Mediatorreste erfassen zu können. Hierzu füllt man das Röhrchen wieder mit der gleichen Wassermenge, homogenisiert wieder mechanisch und entnimmt mengenmäßig die gleichen Ali quote an Lösung aus dem Homogenisierröhrchen. Man zentrifugiert die Aliquote und bestimmt schließlich in den Überständen den jeweiligen Mediator quantitativ. Bevorzugt führt man diesen Spülvorgang des Homogenisierröhrchen mit anschließender Bestim mung der Mediatormenge mindestens zweimal durch, wobei der zweite Spülvorgang mit einer Proteinlösung, insbesondere dem Inkubationsmedium, durchgeführt wird. Aus der Addition der Wer te erhält man dann den Gesamtgehalt an Mediator im Probengewe be.It is also advantageous to determine the total mediator content in the sample tissue. For this, the bioptic material is homogenized together with a certain amount of water in a homogeneity mechanical tube, takes fixed aliquots of the Ho mogenats from the homogenization tube, centrifuge this Ali quote and determines the respective in the resulting supernatants league mediator quantitative. If necessary, flush the homo Genizierröhrchen, around the haf on the walls of the tube tendency to capture mediator remnants. To do this, fill that Tubes again with the same amount of water, homogenized again mechanically and takes the same Ali in quantity Quotation of solution from the homogenizing tube. One centrifuges the aliquot and finally determines that in the supernatants respective mediator quantitative. This is preferred Rinsing process of the homogenizing tube with subsequent determination the mediator amount at least twice, the second rinsing with a protein solution, especially the Incubation medium. From the addition of who The total mediator content in the sample is then obtained be.

Bei den Mediatoren kann es sich um verschiedene, bei allergi schen Reaktionen ausgeschüttete Mediatoren handeln, für die an sich bekannte Nachweisverfahren existieren. Bevorzugte unter suchte Mediatoren sind Histamin, Tryptase, ECP (Eosinophil ca tionic protein), MPO (Myeloperoxidase), DAO (Diaminoxidase), TPS (Tissue polypeptide specific antigen), Interleukine, Pro staglandine oder Zytokine. Der Mediatornachweis kann beispiels weise über ein Radio-Immuno-Assay oder einen ELISA-Test erfol gen. Entsprechende Testverfahren sind kommerziell erhältlich.The mediators can be different, allergy distributed mediators act for whom known detection methods exist. Preferred under Mediators sought are histamine, tryptase, ECP (eosinophil approx tionic protein), MPO (myeloperoxidase), DAO (diamine oxidase), TPS (Tissue polypeptide specific antigen), Interleukine, Pro staglandins or cytokines. The mediator certificate can, for example via a radio immunoassay or an ELISA test Appropriate test methods are commercially available.

Zur Aufrechterhaltung der vollen funktionellen Vitalität des bioptischen Materials wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, ein Inkubationsmedium nach Hanks und PIPES/RPMI in modifizierter Form zu verwenden.To maintain the full functional vitality of the According to the invention, bioptic material is proposed Hanks and PIPES / RPMI modified incubation medium Shape to use.

Die Hanks(PIPES/RPMI)-Lösung ist kommerziell erhältlich und be sitzt im hier bevorzugten Fall einen pH von 6,0 und sollte kein Glycerin, kein Phenolrot, kein MgSO₄×7H₂O und kein CaCl₂× 2H₂O enthalten.The Hanks (PIPES / RPMI) solution is commercially available and be sits in the preferred case a pH of 6.0 and should not Glycerin, no phenol red, no MgSO₄ × 7H₂O and no CaCl₂ × 2H₂O included.

Bei einem bevorzugten Inkubationsmedium enthält die Hanks-Lö sung aber zusätzlich 10 bis 40mM Hepes Puffer, 0,5 bis 2% fetales Kälberserum und 0,1-0,5% Humanalbumin. Besonders bevor zugt sind dabei 25mM Hepes Puffer, 1,0% fetales Kälberserum und 0,3% Humanalbumin. Im letzteren FAll entspricht dies beispiels weise 12,5 ml Hepes Puffer, 5 ml fetales Kälberserum und 1,5 g Humanalbumin auf 500ml Hanks-Lösung.In a preferred incubation medium, the Hanks-Lö contains solution but additionally 10 to 40mM Hepes buffer, 0.5 to 2% fetal calf serum and 0.1-0.5% human albumin. Especially before 25mM Hepes buffer, 1.0% fetal calf serum and 0.3% human albumin. In the latter case, this corresponds for example wise 12.5 ml Hepes buffer, 5 ml fetal calf serum and 1.5 g Human albumin in 500ml Hanks solution.

Das neuartige Inkubationsmedium zeichnet sich durch ein hohe Sauerstoffbindungsfähigkeit und eine sehr gute pH-Konstanz wäh rend der Begasung mit Sauerstoff aus und besitzt einen hohen Nährwert für das bioptische Material. Das Inkubationsmedium übt keinerlei toxische Wirkung auf das Gewebe aus.The novel incubation medium is characterized by a high level Oxygen binding ability and a very good pH constancy gassing with oxygen and has a high Nutritional value for the bioptic material. The incubation medium practices no toxic effects on the tissue.

Um möglichst aussagekräftige Resultate zu erhalten, wird das Inkubationsmedium etwa auf Körpertemperatur temperiert, d. h. die Temperatur liegt im Bereich von 37°C. Das Inkubationsmedium wird bevorzugt so mit Sauerstoff begast, daß sich ein Sauer stoff-Partialdruck (po₂) im Bereich von 85 bis 120 mmHg ein stellt. Der Sauerstoff kann aus einer Sauerstoffflasche in das Inkubationsmedium eingeperlt werden, bei einer einfacheren Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Umgebungs luft mit Hilfe einer Pumpe, gegebenenfalls über einen Steril filter, durch das Inkubationsmedium geleitet. Der pH des Inku bationsmediums wird vorteilhaft im Bereich von 7,4 gewählt. Mit der erfindungsgemäßen Verwendung von bioptischem Material sind zahlreiche Vorteile verbunden. Als wichtigster Vorteil ist zu nennen, daß die vollständige immunologische bzw. allergolo gische Diagnostik in-vitro stattfindet, d. h. der Patient wird bei der Diagnose nicht mehr mit potentiell schädlichen Substan zen belastet. Die einzige Unannehmlichkeit für den Patienten besteht darin, daß eine Schleimhautgewebeprobe entnommen werden muß. Derartige Biopsien werden heutzutage jedoch routinemäßig durchgeführt und sind für den Patienten völlig ungefährlich. Im Gegensatz zu Haut- und Bluttests findet die Stimulation mit dem Allergen in dem Gewebe statt, in dem auch im Körper der aller gische Anfall ausgelöst wird. Die Durchführung der Diagnose in vitro ermöglicht die Einhaltung standartisierter, von Untersu chung zu Untersuchung gleichbleibender Bedingungen und vermei det so Fehlerquellen, die bei Untersuchungen am menschlichen Körper notwendigerweise auftreten. Gleichzeitig können auch Untersuchungen hinsichtlich der Wirkung bestimmter Medikamente, die man beispielsweise dem Inkubationsmedium zugeben kann, durchgeführt werden.In order to get the most meaningful results possible, this will be Incubation medium tempered to about body temperature, d. H. the temperature is in the range of 37 ° C. The incubation medium is preferably gassed with oxygen so that an acid partial pressure (po₂) in the range of 85 to 120 mmHg poses. The oxygen can flow from an oxygen cylinder into the Incubation medium can be bubbled in with a simpler Carrying out the method according to the invention becomes ambient air with the help of a pump, if necessary via a sterile filter, passed through the incubation medium. The pH of the Inku bationsmediums is advantageously chosen in the range of 7.4. With the use of bioptic material according to the invention there are numerous advantages. The main advantage is to mention that the complete immunological or allergolo diagnostic in vitro takes place, d. H. the patient will at diagnosis no longer with potentially harmful substance zen burdened. The only inconvenience to the patient consists in taking a tissue sample got to. Such biopsies are becoming routine nowadays performed and are completely harmless to the patient. in the Contrary to skin and blood tests, the stimulation takes place with the Allergens take place in the tissue in which also in the body of all seizure is triggered. Carrying out the diagnosis in vitro enables compliance with standardized, by Untersu to investigate constant conditions and avoid detects sources of error that occur during investigations on human Body necessarily occur. At the same time, too Studies of the effects of certain medications, which can be added to the incubation medium, for example, be performed.

Ein typischer Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in den beigefügten Zeichnungen dargestellt.A typical sequence of the method according to the invention is shown in the accompanying drawings.

Dabei zeigt:It shows:

Fig. 1 schematisch die Entnahme einer Gewebeprobe aus einer Schleimhaut eines Patienten; Fig. 1 schematically shows the removal of a tissue sample from a mucous membrane of a patient;

Fig. 2 die inkubierte Gewebeprobe in einem temperierten Bad; Figure 2 is the incubated tissue sample in a constant temperature bath.

Fig. 3 das Homogenat aus Gewebeprobe und Inkubationsmedium; und Fig. 3, the homogenate of tissue sample and the incubation medium; and

Fig. 4 eine histologische Untersuchung des nicht homogeni sierten bioptischen Materials. Fig. 4 is a histological examination of the non-homogenized bioptic material.

In Fig. 1 ist der Darmabschnitt 10 eines Patienten schematisch dargestellt. Inwandig ist der Darmabschnitt 10 mit einer Schleimhautschicht 12 bedeckt. Ein Endoskop 20 wird in den Darm eingeführt und unter optischer Kontrolle wird über einen Greif arm 22 des Endoskops eine bioptische Probe 14 der Darmschleim haut 12 entnommen. Dabei ist im allgemeinen keine Anästhesie rung des Patienten erforderlich.The intestinal section 10 of a patient is shown schematically in FIG. 1. The wall 10 of the intestine is covered with a layer of mucous membrane 12 . An endoscope 20 is inserted into the intestine and, under optical control, a bioptical sample 14 of the intestinal mucosa 12 is removed via a gripper arm 22 of the endoscope. No patient anesthesia is generally required.

Eine bioptische Probe hat typischerweise eine Größe von 2-5 mm und ein Frischgewicht zwischen 2 und 150 mg.A bioptic sample is typically 2-5 in size mm and a fresh weight between 2 and 150 mg.

Wie in Fig. 2 dargestellt wird die bioptische Probe 14 unmit telbar nach der Entnahme in einen vorbereiteten Inkubator 30, einen sogenannten Mukosaoxygenator gegeben, wo sie mit einem sauerstoffhaltigen Inkubationsmedium 16 versorgt wird. Als Nährlösung wird ein Hanks- und PIPES/RPMI-modifiziertes Inkuba tionsmedium verwendet. Etwa 4 ml Inkubationsmedium 16 befinden sich in einem Inkubationsröhrchen 31. Die Sauerstoffversorgung erfolgt über eine Sauerstoffleitung 32, die mit einer am Ende angebrachten Fritte oder Feinnadeldüse in dem Inkubationsmedium endet. Der Sauerstoffgehalt des Inkubationsmediums wird über eine Sauerstoffelektrode 33 bestimmt und bevorzugt im Bereich von 85 bis 120 mmHg über Regulierschrauben eingestellt. Der pH der Lösung wird im Bereich von 7,4 gewählt und über eine in das Inkubationsmedium 16 eintauchende pH-Elektrode 34 kontrolliert. Das Inkubationsröhrchen 31 taucht in das Wasser 38 eines Tempe rierbades 37 ein. Die Temperatur des Wasserbades ist auf 37°C eingestellt und wird mittels eines Thermometers 39 überwacht. Das Thermometer 39 kann Teil eines Thermostaten sein, wobei zusätzliche (nicht dargestellte) Heiz- bzw. Kühlelemente vor gesehen sein können, die die gewählte Wassertemperatur von 37°C konstant halten.As shown in Fig. 2, the bioptic sample 14 is immediately after removal in a prepared incubator 30 , a so-called mucosa oxygenator, where it is supplied with an oxygen-containing incubation medium 16 . A Hanks and PIPES / RPMI modified incubation medium is used as the nutrient solution. About 4 ml of incubation medium 16 are in an incubation tube 31 . The oxygen supply takes place via an oxygen line 32 , which ends in the incubation medium with a frit or fine needle nozzle attached to the end. The oxygen content of the incubation medium is determined via an oxygen electrode 33 and is preferably set in the range from 85 to 120 mmHg using regulating screws. The pH of the solution is selected in the range from 7.4 and is controlled via a pH electrode 34 immersed in the incubation medium 16 . The incubation tube 31 is immersed in the water 38 of a temperature bath 37 . The temperature of the water bath is set to 37 ° C and is monitored by a thermometer 39 . The thermometer 39 can be part of a thermostat, additional (not shown) heating or cooling elements can be seen before, which keep the selected water temperature of 37 ° C constant.

Die bioptische Probe 14 wird anschließend mit einem Allergen stimuliert. Das Allergen kann in fester, flüssiger oder gasför miger Form dem Inkubationsmedium 16 zugegeben werden. Es kann aber auch schon vor Einbringen der bioptische Probe 14 in dem Medium 16 vorhanden sein.The bioptic sample 14 is then stimulated with an allergen. The allergen can be added to the incubation medium 16 in solid, liquid or gaseous form. However, it can also be present in the medium 16 before the bioptic sample 14 is introduced.

Im allgemeinen wird der im Inkubationsmedium aufsteigenden Sau erstoff für eine gute Durchmischung und eine homogene Vertei lung des Allergens sorgen. Gegebenenfalls kann jedoch auch ein Miniaturrührfisch 35 am Boden des Röhrchens 31 vorgesehen sein, der von einem außerhalb des Temperierbades angeordneten Magne trührer angetrieben wird.In general, the oxygen rising in the incubation medium will ensure thorough mixing and a homogeneous distribution of the allergen. Optionally, however, a miniature stirring fish 35 can be provided at the bottom of the tube 31 , which is driven by a magnetic stirrer arranged outside the temperature bath.

Es wird deutlich, daß mit dem erfindungsgemäßen Inkubationsver fahren eine allergische Reaktion einer vitalen bioptische Probe 14 hervorgerufen werden kann, ohne daß dabei nachteilige Effek te für den Patienten auftreten können. Ist bereits bekannt, daß ein spezifischer Stoff allergieauslösend wirkt, so kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch der therapeutische Einfluß bestimmter Medikamente untersucht werden. Beispielsweise kann man dem Inkubationsmedium Antihistaminika oder DNCG (das Dina triumsalz der Chromogylcinsäure) zugeben, um so den Einfluß bzw. die Wirksamkeit dieser Medikamente bei Stimulation durch das Allergen in-vitro beurteilen zu können.It is clear that with the incubation method according to the invention, an allergic reaction of a vital bioptic sample 14 can be caused without adverse effects for the patient. If it is already known that a specific substance has an allergy-causing effect, the method according to the invention can also be used to investigate the therapeutic influence of certain medications. For example, one can add antihistamines or DNCG (the dinitium salt of chromogylcinic acid) to the incubation medium in order to be able to assess the influence or effectiveness of these drugs when stimulated by the allergen in vitro.

Nach einer bestimmten Inkubationszeit (üblicherweise nach etwa 240 min) wird die Konzentration des ausgeschütteten Mediators im Inkubationsmedium 16 bestimmt. Ein gewisser Anteil an Media torsubstanzen verbleibt jedoch auch im Gewebe 14 selbst. Zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Mediator wird die bioptische Probe 14 mechanisch oder mittels Ultraschall homogenisiert. Bei der Homogenisierung kann auch eine enzymatische Behandlung der bioptische Probe erfolgen.After a certain incubation time (usually after about 240 min), the concentration of the released mediator in the incubation medium 16 is determined. A certain proportion of media gate substances also remains in the tissue 14 itself. To determine the total content of mediator, the bioptic sample 14 is homogenized mechanically or by means of ultrasound. In the homogenization, an enzymatic treatment of the bioptic sample can also be carried out.

Dazu wird die bioptische Probe aus dem Inkubationsmedium genom men und zunächst auf -72°C abgekühlt, um alle Stoffwechselvor gänge und die einsetzende Abbauprozesse zu unterbinden.For this purpose, the bioptic sample is genomized from the incubation medium men and initially cooled to -72 ° C to pre-metabolism to prevent gears and the onset of dismantling processes.

Eine 5minütige mechanische Homogenisierung einer bioptische Probe mit 2 bis 150 mg Frischgewicht zusammen mit 1500 µl bide stilliertem Wasser bei 1500 Umdrehungen/min liefert beispiels weise 1400 µl Homogenat. Etwa 100 µl gehen erfahrungsgemäß bei spielsweise als Spritzer an Wänden und Deckel des Homogenisier gefäßes verloren. Dieser Verlust kann jedoch durch das unten beschriebene Spülen des Homogenisiergefäßes größtenteils wie dergewonnen werden. Das in dem Röhrchen 31 befindliche Homoge nat 15 ist in Fig. 3 dargestellt und kann beispielsweise in Aliquote 18 zur weiteren Auswertung aufgeteilt werden. Dabei haben sich, ausgehend von den 1400 µl Homogenat folgende Mengen als vorteilhaft herausgestellt: 100 µl Homogenat unter Zugabe von weiteren 100 µl 8%iger Perchlorsäure für die Histaminbe stimmung, 400 µl Homogenat für die Bestimmung von Tryptase, ECP und MPO und schließlich 900 µl für die Bestimmung von DAO, TPS und der Zytokine. Die Aliquote werden anschließend bei 4°C und 7500 Umdrehungen/min für 10 min zentrifugiert. Im Überstand wird die Konzentration der Mediatoren gemessen.A 5-minute mechanical homogenization of a bioptic sample with a fresh weight of 2 to 150 mg together with 1500 µl bide still water at 1500 revolutions / min provides, for example, 1400 µl homogenate. Experience has shown that around 100 µl is lost, for example, as a splash on the walls and lid of the homogenizing vessel. However, this loss can be largely recovered by flushing the homogenizer as described below. The Homoge nat 15 located in the tube 31 is shown in Fig. 3 and can for example be divided into aliquots 18 for further evaluation. Based on the 1400 µl homogenate, the following quantities turned out to be advantageous: 100 µl homogenate with the addition of a further 100 µl 8% perchloric acid for histamine determination, 400 µl homogenate for the determination of tryptase, ECP and MPO and finally 900 µl for the determination of DAO, TPS and the cytokines. The aliquots are then centrifuged at 4 ° C. and 7500 revolutions / min for 10 min. The concentration of the mediators is measured in the supernatant.

Bei den üblicherweise verwendeten Homogenisiergefäßen handelt es sich um Behälter aus Polytetrafluoretylen (Teflon®), an de ren Wänden Mediatorenreste oder ganze Zellen und Zellklumpen des Homogenats haften bleiben können. Durch zweimaliges Spülen ist es möglich, auch diese Reste auszuwerten. Zunächst werden wieder 1500 µl bidestilliertes Wasser in das Homogenisiergefäß gefüllt, aus dem zuvor das Homogenat entnommen wurde. Der me chanische Homogenator wird diesmal für 3 Minuten bei 1500 Um drehungen pro Minute betätigt. Die aus dem Gefäß entnehmbaren 1400 µl Spüllösung werden in die oben bereits beschrieben Ali quote zur Bestimmung der einzelnen Mediatoren aufgeteilt. Die Aliquote werden bei bei 4°C und 7500 Umdrehungen/min für 10 min zentrifugiert. Wieder wird im Überstand die Konzentration der Mediatoren gemessen. Der gleiche Spülvorgang des Gefäßes wird noch einmal wiederholt, wobei diesmal 1500 µl einer geeignete Proteinlösung, beispielsweise das Inkubationsmedium selbst, als Spüllösung verwendet werden.The homogenizing vessels usually used are it is containers made of polytetrafluoroethylene (Teflon®), de walls of mediators or whole cells and clumps of cells of the homogenate can stick. By rinsing twice it is possible to evaluate these residues as well. First of all again 1500 µl of double-distilled water in the homogenization vessel filled, from which the homogenate was previously removed. The me This time, the chanic homogenizer is at 1500 um for 3 minutes rotations per minute. The ones that can be removed from the vessel 1400 µl rinsing solution are in the Ali already described above split to determine the individual mediators. The Aliquots are at 4 ° C and 7500 rpm for 10 min centrifuged. Again the concentration of Mediators measured. The same rinsing of the vessel is done repeated again, this time 1500 µl of a suitable one Protein solution, for example the incubation medium itself, as Rinsing solution can be used.

Während das bidestillierte Wasser ein Aufplatzen der Zellen aufgrund des osmotischen Drucks bewirkt, ist das Inkubations medium vor allem zum Ablösen der Zellfragmente und Mediatorreste von den Wänden der meist aus Teflon® bestehenden Homogenisier gefäße geeignet.During the bidistilled water the cells burst open due to the osmotic pressure, this is incubation medium especially for detaching the cell fragments and mediator residues from the walls of the homogenizer, which mostly consists of Teflon® suitable for vessels.

Falls das spezifische Allergen eine allergische Reaktion ausge löst hat, erwartet man in dem Inkubationsmedium bzw. im Homoge nat eine erhöhte Konzentration von IgE oder von Mediatoren wie Histamin, Interleukine, Prostaglandine oder Zytokine.If the specific allergen produces an allergic reaction dissolves, one expects in the incubation medium or in the Homoge nat an increased concentration of IgE or mediators like Histamine, interleukins, prostaglandins or cytokines.

Zur IgE-Bestimmung werden hauptsächlich die spezifischen Anti gene selbst bzw. Anti-IgE-Antikörper eingesetzt. Der bei der Reaktion von IgE mit dem Antigen bzw. dem Anti-IgE-Antikörper entstehende Immunkomplex führt dann wie in vivo zur Allergier aktion bzw. zur Reaktion der Immunzelle.The specific anti gene itself or anti-IgE antibodies used. The one at the Reaction of IgE with the antigen or the anti-IgE antibody The resulting immune complex then leads to allergy, as in vivo action or for the reaction of the immune cell.

Alternativ können auch, wie in Fig. 4 dargestellt, konventio nelle pathologische bzw. immunhistologische Untersuchungen am Präparat durchgeführt werden.Alternatively, as shown in FIG. 4, conventional pathological or immunohistological examinations can also be carried out on the preparation.

Routinemäßig werden 5 bis 15 Proben bei einer Endoskopie ent nommen und getestet.5 to 15 samples are routinely performed on endoscopy taken and tested.

Es ist auch möglich den gesamten Test in einem Kontrollexperi ment durchzuführen, wobei jedoch keine Allergenstimulation stattfindet. Die dabei erhältlichen Konzentrationen der Media toren sind ein Maß für deren Spontanfreisetzung.It is also possible to run the entire test in one control experiment ment, but no allergen stimulation takes place. The available concentrations of the media gates are a measure of their spontaneous release.

Claims

1. Verwendung von vitalem bioptischem Material zur in-vitro Diagnose allergischer und immunologischer Erkrankungen.1. Use of vital bioptic material for in vitro Diagnosis of allergic and immunological diseases.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bioptische Material aus Haut- oder Schleimhautpartikeln besteht.2. Use according to claim 1, characterized in that the bioptic material consists of skin or mucous membrane particles.

3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
man das bioptische Material, unmittelbar nachdem man es dem Patienten entnommen hat, in ein temperiertes, sauerstoffhaltiges Inkubationsmedium legt;
man mindestens ein Allergen zu dem Inkubationsmedium zwecks Stimulation des bioptischen Materials gibt und
man die Ausschüttung von Immunglobulin E (IgE) oder eines Mediators nach einer bestimmten Einwirkungszeit des Allergens im Inkubationsmedium qualitativ und/oder quantitativ bestimmt.3. Use according to one of claims 1 or 2, characterized in that
the bioptic material is placed in a temperature-controlled, oxygen-containing incubation medium immediately after it has been removed from the patient;
at least one allergen is added to the incubation medium for the purpose of stimulating the bioptic material and
the release of immunoglobulin E (IgE) or a mediator is determined qualitatively and / or quantitatively after a certain exposure time of the allergen in the incubation medium.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem den Gesamtgehalt an Mediator im Probengewebe bestimmt.4. Use according to claim 3, characterized in that one also determined the total mediator content in the sample tissue.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das bioptische Material zusammen mit einer bestimmten Menge Wasser zur Bestimmung des Gesamtgehalt an Mediator in einem Homogenisierröhrchen mechanisch homogenisiert, man festgelegte Aliquote des Homogenats aus dem Homogenisierröhrchen entnimmt, man diese Aliquote zentrifugiert und in den resultierenden Überständen den jeweiligen Mediator quantitativ bestimmt, und daß man gegebenenfalls das Homogenisierröhrchen spült, indem man das Röhrchen wieder mit der gleichen Wassermenge füllt, man wieder mechanisch homogenisiert und die gleichen Aliquote an Lösung aus dem Homogenisierröhrchen entnimmt, man die Aliquote zentrifugiert und man in den Überständen den jeweiligen Mediator quantitativ bestimmt. 5. Use according to claim 4, characterized in that one the bioptic material together with a certain amount Water to determine the total mediator content in one Homogenizing tubes mechanically homogenized, one fixed Takes aliquots of the homogenate from the homogenizing tube, these aliquots are centrifuged and in the resulting Supernatants quantified the respective mediator, and that optionally rinsing the homogenization tube by the Fill the tube with the same amount of water again mechanically homogenized and the same aliquots of solution removed from the homogenizing tube, the aliquots are centrifuged and the respective mediator in the supernatants is quantitative certainly.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Homogenisierröhrchen mindestens zweimal spült und die Mediatormenge bestimmt, wobei der zweite Spülvorgang mit einer Proteinlösung, insbesondere dem Inkubationsmedium durchgeführt wird.6. Use according to claim 5, characterized in that one rinsing the homogenization tube at least twice and the Mediator quantity determined, the second rinsing process with a Protein solution, especially the incubation medium becomes.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Mediatoren um Histamin, Tryptase, ECP, MPO, DAO, TPS, Interleukine, Prostaglandine oder Zytokine handelt.7. Use according to one of claims 3 to 6, characterized characterized that the mediators are histamine, Tryptase, ECP, MPO, DAO, TPS, interleukins, prostaglandins or Cytokines.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in einem Inkubationsmedium nach Hanks und PIPES/RPMI in modifizierter Form.8. Use according to one of claims 1 to 7 in one Hanks and PIPES / RPMI modified incubation medium Shape.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hanks-Lösung einen Zusatz enthält bestehend aus:
10-40mM Hepes Puffer,
0,5-2% fetales Kälberserum und
0,1-0,5% Humanalbumin.9. Use according to claim 8, characterized in that the Hanks solution contains an additive consisting of:
10-40mM Hepes buffer,
0.5-2% fetal calf serum and
0.1-0.5% human albumin.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Hanks-Lösungszusatz aus
25mM Hepes Puffer,
1,0% fetales Kälberserum und
0,3% Humanalbumin
besteht.10. Use according to claim 9, characterized in that the Hanks solution additive
25mM Hepes buffer,
1.0% fetal calf serum and
0.3% human albumin
consists.

11. Inkubationsmedium zur Aufrechterhaltung der Vitalität von bioptischem Material in-vitro, bestehend aus einer Lösung nach Hanks und PIPES/RPMI mit einem Zusatz aus:
10-40mM Hepes Puffer,
0,5-2% fetales Kälberserum und
0,1-0,5% Humanalbumin. 11. Incubation medium for maintaining the vitality of bioptic material in vitro, consisting of a solution according to Hanks and PIPES / RPMI with an addition of:
10-40mM Hepes buffer,
0.5-2% fetal calf serum and
0.1-0.5% human albumin.

12. Inkubationsmedium nach Anspruch 11, wobei der Zusatz aus
25mM Hepes Puffer,
1,0% fetales Kälberserum und
0,3% Humanalbumin
besteht.12. Incubation medium according to claim 11, wherein the addition of
25mM Hepes buffer,
1.0% fetal calf serum and
0.3% human albumin
consists.