DE19531519C2 - Zur Denitrifizierung befähigter Mikroorganismus, sowie dessen Verwendung in Verbindung mit einem Verfahren zur Denitrifizierung von Wasser - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine zur biologischen Denitrifizierung in Wasser befähigte mikrobielle Starterkultur, sowie darauf aufbauend ein Verfahren zur biologischen Denitrifizierung von Wasser, insbesondere Trinkwasser.

Unter biologischer Denitrifizierung versteht man die Reduktion von Nitrat und Nitrit durch Bakterien mit obligat respiratorischem Stoffwechsel zu molekularem Stickstoff. Die zur Denitrifizierung befähigten Mikroorganismen oxidieren Substrate unter Verwendung von Nitrat (Nitratatmung) bzw. Nitrit anstelle von Sauerstoff. Die Induktion der zur Denitrifizierung notwendigen Enzyme erfolgt in der Regel durch anaerobe Bedingungen. Hohe Sauerstoffkonzentrationen reprimieren die Bildung der Enzyme.

Ein gravierendes Problem bei der Trinkwassergewinnung stellen überhöhte Konzentrationen an Nitrat im Wasser, insbesondere im Grundwasser, dar. Die Trinkwasserverordnung legt einen maximalen Grenzwert von 50 mg Nitrat pro Liter Wasser fest. Dieser Wert wird jedoch im Rohwasser vieler Wasserwerke übertroffen, so daß Gegenmaßnahmen notwendig werden.

Bei der Nitrateliminierung lassen sich biologische und physikalisch-chemische Verfahren unterscheiden. Meistens wird jedoch das nitrathaltige Rohwasser durch nitratarmes Wasser ersetzt. Dies kann durch Bohrung neuer Brunnen, Anbohrung einer tieferen Wasserschicht des alten Brunnens oder Anschluß an eine Fremdwasserversorgung geschehen.

Bei physikalischen Verfahren sind vor allem die Umkehrosmose, der Ionenaustausch und die Elektrodialyse zu erwähnen. Diesen Verfahren gemeinsam ist die Erzeugung einer konzentrierten Salzlösung und eines im Salzgehalt verringerten "Trinkwassers".

Bei biologischen Verfahren wird auf die natürlich vorhandene Fähigkeit von Mikroorganismen, Nitrat zu molekularem Stickstoff zu reduzieren (Denitrifizierung oder Nitratatmung), zurückgegriffen.

Dabei wird prinzipiell zwischen der autotrophen und der heterotrophen Denitrifizierung unterschieden, beide Verfahren werden in der Praxis eingesetzt. Vorrichtungen zur biologischen Denitrifizierung von Wasser werden im folgenden als Reaktor bezeichnet. Der Reaktor umfaßt mindestens ein Reaktionsgefäß, Zu- und Abläufe sowie Regelungsvorrichtungen.

Bei der autotrophen Denitrifizierung kommen Mikroorganismen zum Einsatz, die Kohlen­ dioxid oder eine organische Säure als Kohlenstoffquelle und Wasserstoff oder Schwefel als Elektronendonatoren verwerten können (chemoautolithotrophe Mikroorganismen).

Die für die heterotrophe Denitrifizierung eingesetzten Mikroorganismen benötigen eine organische Kohlenstoffverbindung (z. B. Ethanol oder Essigsäure) sowohl als Kohlenstoffquelle, als auch als Elektronendonator, das heißt, als Energie- und Nährstoffquelle (chemoorganotrophe Mikroorganismen).

Die konventionellen Verfahren weisen einige Nachteile auf. Der Ersatz durch nitratarmes Rohwasser führt oft zu ökologischen Problemen durch hohe Entnahmemengen in unbelasteten Gebieten (z. B. Grundwasserabsenkung). Weiterhin können hohe Kosten durch notwendige Fernleitungen oder sehr tiefe Brunnenbohrungen anfallen. Für kleinere Trinkwasserwerke ist dieser Weg oft nicht gangbar, da im Einzugsbereich unbelastete Rohgewässer nicht zur Verfügung stehen. So bleiben nur die Alternativen einer Wasser­ behandlung oder eines Anschlusses an eine Trinkwasserfernversorgung.

Beim Einsatz physikalisch-chemischer Verfahren läßt es sich nicht vermeiden, daß auch andere Ionenarten entfernt werden. Sie widersprechen deshalb der wichtigen Zielsetzung der Trinkwasseraufbereitung, die natürliche Zusammensetzung des Rohwassers für seinen Gebrauch als Trinkwasser so weit wie möglich zu erhalten. Weiterhin fallen im Vergleich zu biologischen Verfahren relativ hohe Abwassermengen (Konzentrate) an. Das Problem des Nitrats wird dabei nicht gelöst, sondern nur auf die Abwasserbeseitigung verlagert.

Einer der wichtigsten Nachteile der bisherigen biologischen Verfahren ist die unkontrollierte Besiedelung durch Mikroorganismen. Es werden keine definierten Starter­ kulturen eingesetzt, sondern das Nitrat wird durch eine undefinierte, natürliche Besiedlung des Reaktors aus Bakterien und Pilzen entfernt. Dies ist hygienisch bedenklich, da auch humanpathogene Keime, wie Pseudomonas aeruginosa, bevorzugt in diesen "Biotopen" zu finden sind.

Die bisherigen Verfahren zeichnen sich weiterhin durch einen hohen technischen Aufwand aus, so daß sie sich nur bei großen Trinkwassergewinnungswerken lohnen.

Ein entscheidender Vorteil biologischer Verfahren (autotroph oder heterotroph) ist jedoch, daß damit Nitrat selektiv aus dem Trinkwasser entfernt werden kann. Allerdings werden auch bei diesem Verfahren der pH-Wert, CO₂- und O₂-Gehalt des Wassers verändert. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß das Nitrat vollständig bis zur Stufe des gasförmigen Stickstoffs umgesetzt wird.

Für autotrophe (chemoautolithotrophe) Anlagen sind CO₂ als Kohlenstoffquelle und Wasserstoff(Explosionsgefahr!) als Energiequelle nötig. Diese Anlagen sind deshalb mit einem hohen technischen Aufwand verbunden und eignen sich bevorzugt für sehr große Durchsatzmengen.

Bei den meisten bisherigen heterotrophen Denitrifizierungsanlagen ist die Zugabe von flüssigen organischen Verbindungen notwendig. Dies führt zu einem hohen technischen Aufwand, da neben den Zudotierungseinrichtungen eine Kontrolle des Prozeßwassers notwendig ist, um eine überstöchiometrische Zugabe von organischen Kohlenstoffquellen (z. B. Ethanol, Essigsäure) zu vermeiden (Aufkeimungsgefahr, toxische Effekte).

In der DE 40 28 312 C2 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem denitrifizierende Mikroorganismen mit einem nicht herauslösbaren Substrat in einer Alginat oder Carrageenane enthaltenden Matrix immobilisiert sind. Nachteilig ist hierbei, daß ein Einschluß der Mikroorganismen in Trägersubstanzen notwendig ist. In der Zeitschrift GWF Wasser - Abwasser 134 (1), 1993, 80-84 wurde von S. Wais und R. Süßmuth ein zweistufiger Reaktor zur biologischen Denitrifizierung von Wasser vorgeschlagen, bei dem das Mischpolymerisat Poly-(3-Hydroxybuttersäure-Co-3-Hydroxyvaleriansäure) (PHB/HV) als Kohlenstoffquelle für die Mikroorganismen eingesetzt wird. Solchen Verfahren ist gemeinsam, daß sich auch unerwünschte, beispielsweise toxische Substanzen abgebende Mikroorganismen, ansiedeln.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur biologischen Denitrifizierung von Wasser zur Verfügung zu stellen, bei welchem eine Immobilisierung der Mikroorganismen nicht notwendig ist und bei dem die Besiedelung des Reaktors mit definierten, d. h. gewünschten, Mikroorganismen erfolgt. Weiterhin ist es Aufgabe dieser Erfindung, eine geeignete Starterkultur für einen Denitrifizierungsreaktor zur Verfügung zu stellen, das heißt, die Reinkultur eines zur Denitrifizierung befähigten und toxikologisch unbedenklichen Bakterienstammes.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Mikroorganismus bereitgestellt wird, der die Fähigkeit besitzt, PHB/HV als Kohlenstoffquelle und Elektronendonator zu nutzen.

Die Aufgabe wird weiter dadurch gelöst, daß nitrathaltiges Wasser über ein aus Poly-(3- Hydroxybuttersäure-Co-3-Hydroxyvaleriansäure) bestehendes Substrat geleitet wird, welches mit dem Stamm 2nIII (DSM 9387) besiedelt ist und welches diesem als Kohlenstoffquelle und Elektronendonator dient. Dabei kann das Substrat Zusatzstoffe, insbesondere Panthotenat und/oder Eisen enthalten.

Neben dem Stamm 2nIII (DSM 9387) können auch die Bakterien Paracoccus denifrificans und/oder Thiobacillus denarificans eingesetzt werden; als zusätzliche Mikroorganismen können ferner Streptomyces- und/oder Aspergillus-Arten, bevorzugt in einer separaten Reaktorstufe, eingesetzt werden.

Des weiteren wird eine Vorrichtung zur biologischen Denitrifizierung in Wasser vorgeschlagen, die von einem Reaktor ausgeht, der Poly- (3-Hydroxybuttersäure-Co-3-Hydroxyvaleriansäure) als Substrat für einen Mikroorganismus, der zur Denitrifizierung in Wasser befähigt ist, enthält. Dabei dient das Substrat als Kohlenstoffquelle und Elektronendonator für den Mikroorganismus und der Mikroorganismus ist vorzugsweise von der Art, wie er unter der Nummer DSM 9387 hinterlegt ist.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Verfahren zur Denitrifizierung in Wasser bietet gegenüber konventionellen Verfahren mehrere Vorteile. Der wesentliche Vorteil des Verfahrens besteht im Einsatz einer wohldefinierten, toxikologisch geprüften Starterkultur, die neben der Denitrifizierung zur Verwertung von PHB/HV befähigt ist. Das Verfahren eignet sich aufgrund des geringen apparativen Aufwands auch für kleine Wasserwerke.

Die Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus zusammen mit dem Substrat PHB/HV hat insbesondere den Vorteil, daß der Stamm die eingesetzte Kohlenstoffquelle PHB/HV sowohl aerob, als auch anaerob verwerten kann und dadurch einen Selektionsvorteil gegenüber vielen anderen Mikroorganismen hat.

Die Starterkultur kann sich von dem in den Festbettreaktoren eingesetzten, toxikologisch ebenfalls unbedenklichen Aufwuchsmaterialien ernähren. Dies bedeutet gegenüber in den Reaktor eingetragenen, nicht zur PHB/HV-Verwertung befähigten Mikroorganismen einen Selektionsvorteil, so daß eine Verdrängung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen durch Kontaminanten erschwert ist. Insbesondere unter anaeroben Bedingungen ist die Fähigkeit zur PHB/HV-Verwertung nur bei sehr wenigen Mikroorganismen zu finden, eine Verdrängung des erfindungsgemäßen Bakterienstammes ist also schon allein von daher sehr unwahrscheinlich.

Durch den Einsatz einer definierten Starterkultur eröffnet sich außerdem die Möglichkeit einer gezielten Leistungssteigerung der eingesetzten Mikroorganismen, vergleichbar z. B. der Leistungssteigerung bei der Penizillinproduktion. Da eine definierte Population die genaue Ermittlung ihrer Ansprüche bezüglich notwendiger Zusatzstoffe (z. B. Phosphat, Spurenelemente usw.) ermöglicht, ist eine weitere technische Vereinfachung durch das Einbetten dieser Stoffe in das PHB/HV-Granulat möglich.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird durch eine anlagentechnische Trennung der Sauerstoffzehrung von der Denitrifizierung die Nutzung der ersten Stufe zum cometabolen Abbau weiterer Problemsubstanzen, z. B. Atrazin, ermöglicht. Dadurch ist es auch möglich, die verschiedenen Abbauprozesse getrennt zu optimieren.

Der Einsatz einer definierten, toxikologisch unbedenklichen Starterkultur vermindert die hygienischen Probleme in der Trinkwasseraufbereitung. Da durch den Einsatz der definierten Starterkultur gezielte Leistungssteigerungen erreicht werden können, ist eine Verbesserung der Raum/Zeitausbeute der eingesetzten Reaktoren zu erzielen. Dies führt zu Kostensenkungen und einer besseren Trinkwasserqualität.

Da die eingesetzten Reaktoren mit PHB/HV-Granulat gefüllt sind, das als Aufwuchsmaterial, Kohlenstoffquelle und Elektronendonator für die definierte Starterkultur dient, entfällt die bei anderen heterotrophen Verfahren notwendige Zugabe von organischen Kohlenstoffquellen. Durch das Entfallen einer Zudotierung von Kohlenstoffquellen, ist das Verfahren technisch wesentlich einfacher aufgebaut als die bisher bekannten Anlagen, wodurch die Anlagenkosten erheblich geringer sind.

Das Nitratproblem tritt vor allem in ländlichen Regionen mit geringem Trinkwasser­ verbrauch auf. Da die bisherigen Anlagen zur Nitrateliminierung bei geringen Wassermengen nicht rentabel sind, müssen viele Einzel- und Kleintrinkwasserversorgungsanlagen ihre Brunnen schließen und das Trinkwasser aus entfernten Regionen beziehen. Dies führt zu höheren Kosten und ökologischen Problemen (Bau von Wasserleitungen und Grundwassersenkung in diesen Regionen). Durch den Einsatz der technisch einfach konzipierten Anlage können Schließungen von Trinkwassergewinnungsanlagen vermieden werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Fig. 1-6 näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 schematischer Aufbau der Denitrifizierungsanlage mit optionaler Pestizideliminierung (gestrichelt).

Fig. 2 Abhängigkeit der Nitrat- und Nitritreduktion der Starterkultur vom pH-Wert: Nitratabbau (in mg N-NO₃⁻/l) und Nitritbildung (in mg N-NO₂⁻/l) nach 4 h im resting cells-Versuch (30°C; anaerob). Die Nitratausgangskonzentration betrug 67,7 mg N-NO₃⁻/l.

Fig. 3 Anteil der PHB/HV-verwertenden Kolonien im von PHB/HV-Granulat abgelösten Biofilm der im Rezirkulationsbetrieb gefahrenen Anlage.

Fig. 4 Sauerstoffzehrung der ersten (aeroben) Reaktorstufe der im Durchflußbetrieb gefahrenen Anlage.

Fig. 5 Denitrifizierungsleistung der zweiten (anaeroben) Reaktorstufe der im Durchfluß­ betrieb gefahrenen Anlage.

Fig. 6 Nitrat- und Nitritkonzentration in einer kontinuierlichen Kultur im Anaerobierzelt. Inokulum: Pseudomonas spec. 2nIII und nach 220h Paracoccus denifrificans. Die Zahlen bedeuten (in mg/l): 1: N-Nitrat-Zulauf; 2: N-Nitrat- Ablauf; 3: N-Nitrit-Ablauf.

Der Festbettreaktor (siehe Fig. 1) enthält als Füllmaterial ein biotechnologisch produziertes Biopolymer, PHB/HV, in Granulatform. Das Granulat dient gleichzeitig als Aufwuchsmatrix, Kohlenstoffquelle und Elektronendonator für eine speziell zu diesem Zweck aus Brunnenwasser bei 10°C isolierte Starterkultur. Diese ist sowohl zur heterotrophen Denitrifizierung als auch zur PHB/HV-Verwertung infolge extrazellulärer Hydrolyse befähigt. Die Kultur bildet um das Granulat 7 einen Biofilm 8. Das zu denitrifizierende Wasser (Rohwasser) wird zunächst in den Denitrifizierungsreaktor 6, der das PHB/HV-Granulat 5 enthält, geleitet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Rohwasser vor oder nach der Denitrifizierung einer Pestizideliminierung 4 unterzogen. Nach der Denitrifizierung durchläuft das Wasser einen oder mehrere Filter, bevorzugt einen Sandfilter 3, bevor es einem Mischbehälter 2 zugeleitet wird, indem es mit Rohwasser vermischt werden kann. Anschließend kann eine Sauerstoffzuführung und eine UV-Bestrahlung erfolgen, bevor das Wasser dann in das Leitungsnetz 1 gespeist wird.

Um die zur Denitrifizierung notwendigen anaeroben Verhältnisse zu schaffen, kann zur mikrobiellen Sauerstoffzehrung ein eigener Festbettreaktor vor den Denitrifizierungsreaktor geschaltet werden. Dadurch kann, entsprechend einem Baukastenprinzip, dieses Reaktorvolumen zur aeroben Eliminierung weiterer Schadstoffe genutzt werden.

Um in dem Denitrifizierungsreaktor möglichst schnell optimale Verhältnisse zu schaffen, wird er mit einer speziellen Starterkultur angeimpft. Eine Starterkultur ist eine aufgrund spezifischer Eigenschaften selektierte Kultur, die zur Animpfung von Anlagen zur biologischen Stoffumwandlung eingesetzt wird.

Die anfangs eingesetzte Starterkultur (2nIIIM) läßt sich in einen Hauptstamm (2nIII) und zwei Begleitstämme (2nII/21 und 2nII/22) auftrennen. Nur die Hauptpopulation 2nIII, welche am 25.8.1994 bei der DSM in Braunschweig hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer DSM 9387 erhielt, ist zur Denitrifizierung und PHB/HV- Verwertung befähigt und wird zum Animpfen der Festbettreaktoren als Starterkultur eingesetzt. Eine Stabilisierung der Hauptpopulation 2nIII kann erreicht werden, indem andere Stämme als Begleitstämme der Kultur beigefügt werden. Somit ist eine Beimpfung des Festbettreaktors auch mit einer Mischkultur möglich. Da die Hauptpopulation die eingesetzte Kohlenstoffquelle PHB/HV sowohl aerob als auch anaerob verwerten kann, hat sie einen Selektionsvorteil gegenüber vielen anderen Mikroorganismen.

Die Beimpfung des Festbettreaktors kann sowohl mit einer Flüssigkultur als auch mit bereits bewachsenem PHB/HV-Granulat erfolgen. Innerhalb kurzer Zeit bildet sich ein Biofilm an der Oberfläche des gesamten eingesetzten PHB/HV-Granulats, wie im Rasterelektronenmikroskop nachgewiesen werden konnte. Der Biofilm besteht aus den Zellen der Starterkultur, die in eine Exopolysaccharidmatrix eingebettet sind.

Die wichtigsten Eigenschaften der Starterkultur 2nIII sind in Tabelle 1 aufgeführt. Sie zeigen, daß die Starterkultur zur Gattung der Pseudomonaden gehört. Die Kombination der Eigenschaften macht deutlich, daß es sich um eine noch nicht beschriebene Spezies handelt.

Es ist bekannt, daß der PHB/HV-Abbau in 2 Stufen vor sich geht. Zuerst wird ein Exoenzym ausgeschieden. Das Polymer wird in Oligomere gespalten, die dann von den Zellen aufgenommen werden. In der Zelle erfolgt die vollständige Hydrolyse. Die Monomere werden über Acetyl-CoA in den Stoffwechsel eingeschleust. Dieses wird entweder zum Aufbau von Zellbestandteilen eingesetzt oder alternativ zur Energiegewinnung im Citratzyklus zu CO₂ und H₂O oxidiert. Somit wird das eingesetzte Biopolymer schließlich vollständig mineralisiert oder zu Biomasse umgewandelt.

PHB-Homopolymer und PHB/HV-Copolymere werden vom Stamm 2nIII sowohl aerob als auch anaerob verwertet. Die Starterkultur 2nIII kann von diesen Verbindungen als einziger Kohlenstoffquelle leben. Mischpolymere werden von der Starterkultur schneller besiedelt und führen auch zu besseren Resultaten in der Denitrifizierung. Homopolymer, das ausschließlich aus 3-Hydroxyvaleriansäure-Bausteinen besteht, wird nicht verwertet.

Zum Nachweis der Eignung des Polymers als Substrat für die Mikroorganismen wurde ein Vergleich mit verschiedenen Monomeren durchgeführt. Es wurden verschiedene Carbonsäuren, Hydroxycarbonsäuren und Ketone als Kohlenstoffquellen (9,4 mmol/l) eingesetzt. Die Medien enthielten außerdem 1 g Nitrat/l, Spurenelemente und Phosphatpuffer. Als Referenzsubstanz diente 3-Hydroxybutyrat. Da 3-Hydroxyvaleriat als weiteres Monomer der PHB/HV-Copolymere nicht verfügbar war, wurden 2- Hydroxyvaleriat, sowie 2- und 4-Ketovaleriat als C5-Verbindungen mit vergleichbarer Struktur eingesetzt (siehe Tabelle 2).

Tabelle 1

Die wichtigsten physiologischen und biochemischen Eigenschaften der Starterkultur 2nIII

Bei der aeroben Verwertung von C4-Hydroxycarbonsäuren durch den Stamm 2nIII spielt die Stellung der OH-Gruppe eine entscheidende Rolle. Wenn die OH-Gruppe am C-Atom 2 sitzt, findet kaum Wachstum statt, wohingegen 3-Hydroxybuttersäure (3-HBS) und 4- HBS zu schnellem Wachstum fuhren, 4-HBS allerdings erst nach einer langen Anlaufphase (lag-Phase). 2-Ketobuttersäure führt ebenfalls nur zu minimalem Wachstum.

Alle getesteten C5-Verbindungen führten zu Wachstum des Stammes 2nIII bei aerober Inkubation. Die unsubstituierte Carbonsäure wurde dabei am schnellsten verwertet und auch 2-Hydroxyvaleriansäure führte zu einer ähnlich hohen Wachstumsrate. Bei den Ketoverbindungen verlief das Wachstum schleppender. Nur mit 2-Ketovaleriansäure als Kohlenstoffquelle erreichte 2nIII eine ähnliche Wachstumsrate wie mit 2- Hydroxyvaleriansäure, allerdings mit deutlich längerer lag-Phase.

Carbonsäuren mit mehr als 5 C-Atomen werden vom Stamm 2nIII nicht mehr verwertet. Auch bei 2-Hydroxyoctansäure, der einzigen Hydroxycarbonsäure mit mehr als 5 C- Atomen, die getestet wurde, trat im Versuchszeitraum kein Wachstum mehr auf.

Unter anaeroben Bedingungen führt von den C4-Verbindungen ebenfalls nur 3-HBS zu deutlichem Wachstum des Stammes 2nIII, in Ansätzen mit 2-HBS und 2-Ketobuttersäure war nur minimales Wachstum zu beobachten. Mit 4-HBS als Kohlenstoffquelle war überhaupt kein Wachstum feststellbar.

Valeriansäure und 2-Hydroxyvaleriansäure werden in den anaeroben Ansätzen vom Stamm 2nIII mit der gleichen Geschwindigkeit abgebaut, während der Organismus mit den anderen getesteten C5-Verbindungen nur minimales Wachstum zeigt.

Die Wachstumsraten µ des Stammes 2nIII mit den verwendeten Kohlenstoffquellen wurden aus photometrisch ermittelten Daten berechnet (Tabelle 2).

Acetat als C2-Verbindung führt aerob und anaerob zu schnellerem Wachstum als 3-HBS. Bei Pyruvat (C3) ist dies nur aerob der Fall. Die niedrigeren µ-Werte in den anaeroben Ansätzen sind auf die geringere Energieausbeute der Nitratatmung, verglichen mit der aeroben Atmung, zurückzuführen.

Der Einsatz von unterschiedlichen Nitratmengen (50-3000 mg NO₃⁻/l) übte keinen Einfluß auf die Wachstumsraten aus, wohingegen bei Zugabe von Ammonium eine Hemmung des anaeroben Wachstums eintrat.

Das Wachstum der Starterkultur 2nIII ist vom Phosphatgehalt des Mediums abhängig. Ab 10 mg PO₄^3-/l wird die maximale Wachstumsrate erreicht. Auch der pH-Wert übt einen starken Einfluß auf das Wachstum aus. Im pH-Bereich von 6,0-8,5 nimmt die Wachstumsrate mit steigendem pH-Wert kontinuierlich zu. Wachstum und Nitrateliminierung der Starterkultur stehen im Zusammenhang mit der Art des Substrats, d. h. der eingesetzten PHB/HV-Charge. Tabelle 3 zeigt die Abhängigkeit der Denitrifizierungsaktivität von den eingesetzten PHB/HV-Substraten.

Tabelle 2

Charakterisierung der Starterkultur 2nIII durch die spezifischen Wachstumsraten µ bei aerobem bzw. anaerobem Wachstum mit verschiedenen löslichen C-Quellen (30°C)

Tabelle 3

Die Abhängigkeit der Starterkultur in Batch-Versuchen von verschiedenen PHB/HV-Substraten (Denitrifizierungen nach 69 Stunden bei 30°C)

Es konnte kein Einfluß der Phosphatkonzentration auf die Nitrat- und Nitritreduktion der untersuchten Starterkultur nachgewiesen werden.

Die Starterkultur 2nIII zeigt für die Nitrat- und Nitritreduktion eine Abhängigkeit vom pH-Wert. Das pH-Optimum der mikrobiellen Denitrifizierung liegt je nach Organismus und Zustand der Kultur zwischen pH 7,0 und 8,2. Im sauren Bereich besteht die Gefahr der Anreicherung von NO bzw. N₂O, die unter diesen Bedingungen nicht mehr weiter reduziert werden (siehe Fig. 2).

Das Wachstum der Starterkultur wird auch vom Nitritgehalt beeinflußt. In Flüssigkulturen ist eine Wachstumshemmung ab 100 mg NO₂⁻/l Ausgangskonzentration im 3-HBS- Minimalmedium festzustellen. Dieser Hemmeffekt äußert sich nicht in einem Absinken der Wachstumsrate, sondern in einer verlängerten Initialphase (=lag-Phase).

Zugabe von Calciumpantothenat (10 µg/l) und/oder Eisen (10 mg/l als Eisensulfat) zum Wachstumsmedium bewirkt eine Erhöhung der Wachstumsrate, ein früheres Einsetzen der Nitritverwertung und eine höhere Denitrifizierungsrate. L-Methionin oder Kobalt führen zu einer Wachstumshemmung.

Stoffe, die die Nitrat- bzw. Nitritreduktion fördern (Spurenelemente und Vitamine), lassen sich in PHB/HV einschließen. Dieses so gewonnene Granulat wird mit normalem Granulat nach Bedarf der Zusatzstoffe gemischt. So stehen mit dem Abbau des Granulats die Zusatzstoffe zur Verfügung.

Die Starterkultur 2nIII wurde in zwei verschiedenen Betriebsarten erprobt. Zuerst wurde ein einstufiger Rezirkulationsreaktor über einen Zeitraum von 6 Monaten betrieben. In diesem Reaktor konnte die prinzipielle Eignung der Starterkultur zur Denitrifizierung von Rohwässern mit einer Temperatur von ca. 10°C gezeigt werden. Über einen Zeitraum von 4 Monaten wurden mikrobiologische Untersuchungen auf eine Besiedlung mit Fremdkeimen durchgeführt. Hierbei wurde insbesondere nach coliformen Keimen und nach fluoreszierenden Pseudomonaden gesucht. Sowohl im Ablauf des Bioreaktors, als auch im Biofilm wurden weder fluoreszierende Pseudomonaden noch coliforme Keime gefunden.

Die zweite Erprobung der Starterkultur erfolgte in einem zweistufigen Festbettreaktor ebenfalls bei 10°C. Hierbei wurde Wert auf eine Reaktorkonfiguration gelegt, die den späteren Einsatzbedingungen möglichst nahe kommt. Deshalb wurden die Festbettreaktoren im Durchflußbetrieb gefahren. Die Anlage wurde über einen Zeitraum von vier Monaten kontinuierlich betrieben. Bei diesem Versuch konnte nachgewiesen werden, daß sowohl die Sauerstoffzehrung im ersten Festbettreaktor als auch die Denitrifizierung unter anaeroben Bedingungen im zweiten Festbettreaktor durchführbar ist. Es fand bereits in der ersten Reaktorstufe Denitrifizierung statt. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die erste Reaktorstufe im Bereich des Auslaufs bereits anaerobe Bedingungen aufweist. Abbau- und Stoffwechselprodukte des PHB/HV-Abbaus (Acetat und 3-HBS) konnten im Prozeßwasser nicht nachgewiesen werden.

Der unregelmäßige Kurvenverlauf in den Leistungsdiagrammen (Fig. 4 und Fig. 5) ist durch den Laborcharakter der Anlage bedingt (gegendruckabhängige Pumpen, fehlende Steuerung). Dies führt zu wechselnden Flußraten und somit zu wechselnden Raumbelastungen des Reaktors.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird zusätzlich zur Starterkultur 2nIII das Bakterium Paracoccus denitrificans zugegeben. Paracoccus denitrificans ist zwar nicht in der Lage, PHB zu hydrolysieren, führt aber überraschenderweise in Kombination mit der Kultur 2nIII zu einer starken Erhöhung der Denitrifizierungsrate. Dabei kommt es zu einer erheblichen Verringerung der Nitritbildung (Fig. 6).

In einer weiteren Ausführungsform wird zusätzlich das Bakterium Thiobacillus denitrificans zugesetzt. Auch dieses Bakterium kann PHB nicht hydrolisieren, besitzt aber die Fähigkeit zu denitrifizieren. Da es andere Kohlenstoffquellen als PHB nutzt, hilft es mit, eine eventuelle Sekundärverkeimung des Wassers zu vermeiden. Darüberhinaus ist dieses Bakterium in der Lage, Schwefelwasserstoff, der z. B. bei Pumpenausfall entstehen könnte, zu Sulfat zu oxidieren, und trägt damit zur Reaktorsicherheit bei.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren in mindestens zwei Stufen durchgeführt, wobei eine Stufe, bevorzugt die in Fließrichtung letzte Stufe, der Denitrifizierung dient und eine oder mehrere vorangehende Stufen dem Abbau anderer Schadstoffe, insbesondere Pestiziden dient.

Die für die Denitrifizierung notwendige Sauerstoffzehrung kann zwar von der Starterkultur 2nIII selbst durchgeführt werden, jedoch besteht grundsätzlich auch die Möglichkeit, dafür andere Kulturen einzusetzen, bevorzugt in einer vorgeschalteten Reaktorstufe. Angestrebt wird dabei, daß neben der Sauerstoffzehrung weitere Problemstoffe, wie z. B. polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe, organische Chlorverbindungen oder Pflanzenschutzmittel, insbesondere Herbizide des s-Triazintyps, mit eliminiert werden. Bekannte Herbizide dieser Klasse sind z. B. Atrazin (Ausbringung in Deutschland seit 1991 verboten), Simazin oder Terbutylazin (Atrazinnachfolger), die weit verbreitet vor allem im Maisanbau eingesetzt wurden und werden. Wie bereits für die Denitrifizierung beschrieben wurde, sollte eine Starterkultur entwickelt werden. Dabei wurde angestrebt, Mikroorganismen zu isolieren, die Atrazin vollständig zu Kohlendioxid und Ammoniak mineralisieren können.

Aus Böden, die über Jahre mit Atrazin behandelt worden waren, wurden Mikroorganismen isoliert, die in der Lage sind, s-Triazine abzubauen und daneben auch in der Lage sind, PHB/HV zu verwerten. Zur Isolierung wurden Nährplatten verwendet, die PHB/HV, Nitrat und Atrazin als Kohlenstoff, beziehungsweise Stickstoffquellen enthielten. PHB/HV-Hydrolyse und Atrazinabbau zeigten Bakterien der Familie Streptomyces und Pilze der Gattung Aspergillus.

Im Rahmen von toxikologischen Untersuchungen wurde die Starterkultur 2nIII im Tierversuch auf ihre subchronische und akute Toxizität untersucht. Die Starterkultur wurde dazu in Flüssigkultur mit dem Monomer 3-HBS als Kohlenstoffquelle angezogen.

Zur Untersuchung von subchronischen Effekten wurden an Sprague-Dawley-Ratten, die in Tabelle 4 angeführten Bakteriensuspensionen verwendet. Mittels einer Schlundsonde wurde täglich 1 ml der entsprechenden Bakteriensuspension oral appliziert. Während der 1. Sondierungsphase über 6 Tage wurde eine Suspension vorher abgetöteter Bakterien appliziert. Bei der 2. Sondierungsphase, die nach einer einwöchigen Pause an den gleichen Tieren erfolgte, wurden lebende Bakterien über einen Zeitraum von 7 Tagen verabreicht.

Tabelle 4

Konzentration der Bakteriensuspensionen bei oraler Applikation (d = deionisiert)

Es zeigten sich bei oraler Applikation keine toxischen Effekte. Die Allgemeinentwicklung und der Futter- und Wasserverbrauch der Untersuchungsgruppen wiesen keine signifikanten Unterschiede auf.

Um die akute Toxizität festzustellen, wurden den Versuchstieren daraufhin die in Tabelle 5 angeführten Bakteriensuspensionen, nach einer einwöchigen Pause intraperitoneal appliziert. Es zeigten sich keine toxischen Effekte, die Tiere wiesen ein gutes Allgemeinbefinden auf. Deshalb wurde einer Versuchsgruppe nochmals eine noch höher konzentrierte Bakteriensuspension appliziert, ohne jedoch einen Effekt zu zeigen. Zwei Wochen nach der letzten i. p. Injektion wurden die Tiere getötet und seziert. Die Gewichte von Herz, Thymus, Lunge, Leber, Magen, Dünndarm, Coecum, Dickdarm, Nieren, Milz und Hoden bzw. Uteri wurden bestimmt. Die Untersuchungsgruppen zeigten dabei in den Organgewichten keine signifikanten Unterschiede. Auch makroskopisch erkennbare Effekte konnten an den Organen nicht beobachtet werden.

Tabelle 5

Konzentration der Bakteriensuspensionen bei intraperitonealer Applikation

Im Rahmen toxikologischer Untersuchungen von PHB/HV wurde geprüft, ob durch die eingesetzte Starterkultur 2nIII toxikologisch relevante Umsetzungen am eingesetzten PHB/HV stattfinden. Es wurden dazu Fütterungsversuche über 60 Tage mit Sprague- Dawley-Ratten durchgeführt. Granulat aus PHB/HV mit 22% Hydroxyvaleriatanteil, das in Batch-Versuchen benutzt worden war, wurde nach Entfernung der Biomasse fein gemahlen und dem Futter in einer Konzentration von 5% zugesetzt. Als Kontrolle diente unbewachsenes PHB/HV-Granulat mit 22% Hydroxyvaleriatanteil.

Die Allgemeinentwicklung der Tiere zeigte in den 60 Tagen bei den Untersuchungsgruppen keine Unterschiede. Nach Versuchsende wurden die Gewichte von Herz, Thymus, Lunge, Leber, Magen, Dünndarm, Coecum, Dickdarm, Nieren, Milz und Hoden bzw. Uteri bestimmt. Die Organgewichte wiesen keine signifikanten Unterschiede auf. Makroskopische Veränderungen waren nicht zu beobachten.

Claims (5)

1. Pseudomonas spec. Stamm 2nIII (DSM 9387).

2. Verfahren zur biologischen Denitrifizierung von Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß nitrathaltiges Wasser über ein aus Poly-(3-Hydroxybuttersäure-Co-3-Hydroxy­ valeriansäure) bestehendes Substrat geleitet wird, welches mit dem Stamm 2nIII (DSM 9387) besiedelt ist und welches diesem Stamm als Kohlenstoffquelle und Elektronendonator dient.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Zusatzstoffe enthält, insbesondere Pantothenat und/oder Eisen.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß neben dem Stamm 2nIII (DSM 9387) die Bakterien Paracoccus denitrificans und/oder Thiobacillus denitrificans eingesetzt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als zusätzliche Mikroorganismen Streptomyces- und/oder Aspergillus-Arten, bevorzugt in einer separaten Reaktorstufe, eingesetzt werden.