DE19530412A1 - Selbst deletierende retrovirale Vektoren für die Gentherapie - Google Patents

Selbst deletierende retrovirale Vektoren für die Gentherapie

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Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Retroviren, die eine für eine sequenzspezifische Re­ kombinase kodierende DNA-Sequenz und mindestens eine für die Rekombinase spezifische Targetsequenz enthalten. Diese Retroviren können eine komplette Transkriptionseinheit in das Genom von eukaryonten Zellen so einführen, daß nach Integration sämtliche nicht unmittelbar zur Transkriptionseinheit gehö­ renden viralen und nicht-viralen Sequenzen eliminiert werden. Lediglich eine Transkriptionseinheit, bestehend aus natürlichen oder synthetischen Promo­ tor/Enhancer Sequenzen, Protein kodierender Sequenz und Polyadenylierungssi­ gnal verbleibt im Genom. Damit werden gängige, mit konventionellen retrovira­ len Vektoren assoziierte Probleme, wie Abschaltung der Genexpression, Aktivie­ rung von Protoonkogenen, Mobilisierung durch endogene Retroviren und Ent­ wicklung einer Immunantwort vermieden.
Hintergrund der Erfindung
Retroviren sind RNA-Viren, die nach Eindringen in die Zelle zu doppel­ strängiger DNA umgeschrieben werden. Das RNA Genom wird an beiden Enden von kurzen, repetitiven (R) und 5′ bzw. 3′ Ende spezifischen Kontrollsequenzen (U3 und U5) flankiert. Zwischen den Kontrollregionen befinden sich kodierende Sequenzen für virale Strukturproteine (gag und env) und Enzyme (pol Protease, reverse Transkriptase und Integrase).
Unmittelbar nach Infektion wird in der Targetzelle durch viruseigene re­ verse Transkriptase die virale RNA in DNA konvertiert. Die DNA Synthese wird durch die Bindung von zellulärer tRNA an komplementäre Sequenzen im Retro­ virusgenom eingeleitet. Die Bindungsstelle befindet sich unmittelbar 3′ von der U5 Region und heißt -primer binding site- (PBS) (Fig. 1). Durch die reverse Transkription werden die terminalen Sequenzen U3 und U5 dupliziert, und das retrovirale Genom zwischen zwei identische Kontrollregionen, den -long terminal repeats- (LTR), plaziert. Die LTR-flankierten DNA Moleküle integrieren als -Proviren- in das Genom. Proviren werden zusammen mit der zellulären DNA repliziert und als zelluläre Gene transkribiert. Die Transkription initiiert in der mit Promotor/Enhancer Sequenzen versehenen U3-Region des 5′ LTR und termi­ niert in der R-Region des 3′ LTR. Genomische Transkripte werden aus dem Nukleus ins Zytoplasma transportiert und dort entweder in Viruspartikel ver­ packt oder zu gag und pol Proteinen translatiert. Zusätzlich wird eine Fraktion der genomischen RNA zu env-mRNA gespliced.
Retroviren können zu Gentransfer-Vektoren adaptiert werden. Bis auf be­ stimmte LTR-Kontrollsequenzen, der PBS und spezifischer Verpackungssignale kann nahezu das gesamte retrovirale Genom deletiert werden, ohne daß es zu wesentlichen Einschränkungen der Replikation kommt. Voraussetzung dafür ist die Präsenz der für reverse Transkription, Integration und Partikelbildung not­ wendigen Proteine. Typische Zellen dieser Art sind die sog. Helferzellen, die ein komplettes retrovirales Genom exprimieren. In diesen Zellen werden die Tran­ skripte rekombinanter Retrovirus-Vektoren präferentiell zu Viruspartikeln ver­ packt, weil, anders als in den Vektoren, die spezifischen Verpackungssignale -Ψ- aus dem Helfervirusgenom deletiert wurden.
Konventionelle retrovirale Vektoren werden in über 80% der genehmigten Gentherapie-Protokolle benutzt. Allerdings ist dies mit potentiellen Problemen und Gefahren verbunden, die sich wie folgt zusammenfassen lassen: (i) Abschal­ tung von Expression transduzierter Gene durch Methylierung oder Bindung von Repressormolekülen (1, 4, 7); (ii) zufällige Integration an verschiedenen Orten des Genoms und gelegentliches Stimulieren einer malignen Transformation durch aktivierende Insertion oberhalb von Protoonkogenen (12, 13); (iii) Mobili­ sierung der Vektoren durch Rekombination mit endogenen Retroviren (2, 5, 9) und (iv) Auslösung einer Immunantwort gegen virale und nicht-virale Antigene mit Elimination der transduzierten Zellen (11).
Zusammenfassung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Retroviren zu konstruieren, die eine komplette Transkriptionseinheit in das Genom von eukaryonten Zellen so einführen, daß nach Integration sämtliche nicht unmittelbar zur Transkriptions­ einheit gehörenden viralen und nicht-viralen Sequenzen eliminiert werden. Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäßen Vektoren gelöst, die eine für eine se­ quenzspezifische Rekombinase kodierende Sequenz und mindestens eine für die Rekombinase spezifische Targetsequenz enthalten. Diese können Cre Rekombi­ nase und loxP oder Flp-Rekombinase und frt sein. Anders als bei konventionellen Retroviren, bleibt bei den Retroviren der Erfindung die typische provirale Archi­ tektur -LTR-Strukturgene-LTR nicht erhalten.
Die Retroviren enthalten vorzugsweise in der U3 oder U5 Region eine aus Promotor, Protein-kodierender Sequenz und Polyadenylierungssequenz zusam­ mengesetzte Transkriptionseinheit. Ebenfalls vorzugsweise in der U3 oder U5 Region befinden sich die natürlichen oder synthetischen Targetsequenzen eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems. Derartige Targetsequenzen werden von einer sequenzspezifischen Rekombinase erkannt, gebunden und rekombi­ niert. Dadurch werden DNA Fragmente, die sich zwischen zwei gleichgerichteten Targetsequenzen befinden, zusammen mit einer der beiden Targetsequenzen de­ letiert (Fig. 2).
In den Retroviren der Erfindung befinden sich die Targetsequenzen bevor­ zugt in der U3 oder U5 Region und werden zusammen mit diesen während der Replikation dupliziert. Dadurch gelangt das retrovirale Genom zwischen zwei gleichgerichtete Targetsequenzen und wird in Gegenwart von Rekombinase dele­ tiert. Im Genom verbleibt hauptsächlich eine Kopie der transduzierten Tran­ skriptionseinheit. Die Rekombinase kann entweder als Protein, oder als DNA in einem Expressionsplasmid den Zellen zusätzlich hinzugefügt werden, oder befin­ det sich vorzugsweise als Protein-kodierende Sequenz auf dem Provirus selbst (Fig. 3, 4). Deren Position ist bevorzugt zwischen den beiden Targetsequenzen und außerhalb der Kontrollregionen. Die Expresssion der Rekombinase wird vor­ zugsweise von einem zweiten natürlichen oder synthetischen Promotor kontrol­ liert. Ein Polyadenylierungssignal wird vorzugsweise in der R Region des 3′ LTRs gefunden. Bei umgekehrter transkriptioneller Orientierung in Relation zu dem Provirus wird eine cryptische oder eine zusätzliche natürliche oder synthetische Polyadenylierungssequenz in umgekehrter Orientierung genutzt.
Die Viren der Erfindung sind vorzugsweise enhancer/und oder promotor­ los. Die Erfindung betrifft demnach ebenfalls Retroviren die weiterhin einen viralen Promotor und/oder Enhancer umfassen.
Die Viren der Erfindung sind vorzugsweise zur Transduktion von Thera­ piegenen in Säugerzellen gedacht, können aber auch zur Bearbeitung wissen­ schaftlicher Fragestellungen genutzt werden.
Die Viren der Erfindung können potentiell auch schädliche Sequenzen enthalten, sofern diese nach Integration zeitgerecht deletiert werden. Eine poten­ tielle Applikation ist demnach die Anpassung pathogener Viren (z. B. HIV, HTLV1) für die somatische Gentherapie, weil deren hohe Transduktionseffizien­ zen getrennt von deren Pathogenität genutzt werden können.
Weiterhin betrifft die Erfindung Säugetierzellen, deren Genom minde­ stens eine mit den Viren der Erfindung eingeführte sequenzspezifische Targetse­ quenz, die loxP oder frt sein kann, und mindestens eine Protein-kodierende Se­ quenz enthalten. Diese Zellen enthalten im wesentlichen kein provirales Genom.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Transduktion von cDNA Sequenzen in das Genom von Säugerzellen, das im wesentlichen die Transfektion von Vepackungszellinien mit den Retroviren der Erfindung, die Se­ lektion virusproduziernder Klone, die Infektion von Säugerzellen und die Ex­ pression der sequenzspeziflschen Rekombinase mit assozierter Deletion der Re­ kombinase-enthaltenden Transkriptionseinheit umfaßt.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Der Begriff "Retrovirus" umfaßt jeden RNA Virus, der sich über DNA Zwi­ schenmoleküle repliziert. Dazu gehören auch Viren, die nur zusammen mit ande­ ren Viren, (z. B. Helferviren) replizieren, oder Retroviren mit Deletionen und Mu­ tationen.
Der Begriff "Kontrollregion" umfaßt die LTR Region bestehend aus U3, R und U5.
Der Begriff "Transkriptionseinheit" umfaßt einen natürlichen oder synthe­ tischen Promotor, eine Protein-kodierende Sequenz und ein Polyadenylierungssi­ gnal.
Der Begriff "Promotor" kann, aber muß nicht einen Enhancer einschließen.
Der Begriff "Protein-kodierende Sequenz" bezieht sich auf eine DNA Se­ quenz, deren Polypeptidprodukt therapeutisch wirksam ist, oder den Metabolis­ mus der Zelle auf irgendeine Weise beeinflußt. Der Begriff umfaßt ebenfalls Se­ quenzen, die allgemein als "Selektionsmarker" bekannt sind.
Der Begriff "Targetsequenz" bezieht sich auf natürliche oder synthetische Sequenzen, die von einer Rekombinase spezifisch erkannt werden. Beispiele hier­ für sind die loxP Sequenzen aus dem P1 Coliphagen (8, 16, 17) und die frt Se­ quenzen aus S. cerevisiae (3, 6, 14).
Der Begriff "Rekombinase" umschreibt ein natürliches oder synthetisches Enzym, das spezifische Targetsequenzen erkennt, schneidet und miteinander re­ kombiniert. Beispiele hierfür sind die Cre-Rekombinase aus dem P1 Coliphagen (17) und die Flp Rekombinase aus S. cerevisiae (3).
Die vorliegende Erfindung involviert deletierbare Retroviren, die vorzüg­ lich als Vehikel für Gene im Rahmen der somatischen Gentherapie eingesetzt werden sollen.
Fig. 5 zeigt zwei bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Der eine Vektor enthält eine komplette Transkriptionseinheit bestehend aus Promotor (pgk=Phosphoglyceratkinase-Promotor), Protein-kodierender Sequenz (tkneo; HSV-Thymidinkinase-Neomycintransferase Fusionsgen) und Polyadenylie­ rungssignal (R-Region) in der U3 Region. Der Vektor enthält außerdem eine spezi­ fische Targetsequenz -loxP- zwischen pgk und tkneo. Der zweite Vektor enthält darüber hinaus eine weitere, Rekombinase-exprimierende Transkriptionseinheit (MCCre; MC = HSV. Thymidinkinase Promotor mit Polyoma large T Enhancer) zwischen den LTRs.
Zusammen mit der U3 Region wird pgk-lx-tkneo dupliziert, so daß das provirale Genom zusammen mit MCCre zwischen zwei loxP Sequenzen gelangt. Diese Sequenzen werden bei Expression von Cre eliminiert. Im Genom verbleibt hauptsächlich eine pgk-lx-tkneo Transkriptionseinheit (Fig. 5).
Im dargestellten Beispiel befindet sich die Targetsequenz innerhalb der Transkriptionseinheit in der U3 Region. Diese Konstellation ist nicht zwangsläu­ fig. Die Targetsequenz kann auch außerhalb der Transkriptionseinheit in der U3 oder U5 Region liegen. Gleichfalls kann die Transkriptionseinheit in der U5 Re­ gion liegen. Schließlich muß die Rekombinase nicht zwangsläufig vom gleichen Provirusmolekül synthetisiert werden und kann in Form von Protein oder expri­ mierender DNA separat hinzugefügt werden.
Beispiel I
Zum Nachweis der Deletierbarkeit von Targetsequenz-flankierten Provi­ russequenzen wurde eine Transkriptionseinheit pgk-loxP-tkneo in die U3 Region eines enhancerlosen Moloney Murine Leukemia Virus kloniert (Fig. 4).
Plasmide und Kionierung
Aufbau der pgk-lox-tkneo-Kassette:
Ein loxP-Sequenz enthaltendes EcoRI-PstI Fragment von pGEM30 (8) wurde in pBluescript II KS+ (Strategene) subkloniert (pBSlox). In die BamHI- XbaI-Schnittstellen des resultierenden Plasmids wurde anschließend der pgk- Promotor als BglII-XbaI-Fragment aus pPGK/Cat (19) eingefügt (pBSpgklox). Die für das HSV-Tk/Neomycin-Phosphotransferase-Fusionsgen kodierende Sequenz wurde als NheI-Fragment aus pggU3tkneo ((18) , Friedel & von Melchner, nicht veröffentlicht) ausgeschnitten und nach Füllen der Überhänge als blunt-end- Fragment in die EcoRV Schnittstelle von pBSpgklox eingesetzt. Die so aufge­ baute pgk-lox-tkneo-Kassette kann als XhoI-Fragment aus pBSpgkloxtkneo aus­ geschnitten werden.
Konstruktion der MCCre-Kassette:
Der MC-Promotor und die kodierenden Sequenzen für Cre wurden mittels eines partiellen Verdaus durch MluI aus pMCCre (8) ausgeschnitten und nach Auffüllen der Überhänge als blunt-end Fragment in die EcoRV-Schnittstelle von pBluescript II KS+ subkloniert (pBSMCCre). Aus diesem Plasmid kann die MC- Cre Kassette ohne Polyadenylierungssignal als XhoI-Fragment ausgeschnitten werden.
Konstruktion der retroviralen Vektoren:
Die proviralen Sequenzen von pBabe/puro (10) wurden durch diejenigen des SacI-Fragments von pggU3en(-) (20) ersetzt. Es resultiert ein Plasmid mit proviralen Sequenzen, in denen der Enhancer des 3′-LTR deletiert ist und das einzelne Klonierungsschnittstellen nach gag (BamHI, XhoI) und im 3′-LTR (NheI) aufweist (pBU3). In die NheI-Schnittstelle wurde nach Auffüllen der Überhänge die pgk-lox-tkneo-Kassette (XhoI-Fragment aus pBSpgkloxtkneo) in­ seriert = pU3lxtkneo. Anschließend wurde die MCCre-Transkriptionseinheit als XhoI-Fragment aus pBSMCCre in die XhoI-Schnittstelle des resultierenden Plasmids eingesetzt = pU3lxtkneoMCCre.
Viren und Zellen
BOCS23 (15) und NIH3T3 Zellen wurden in DMEM (Gibco) mit 10% FCS gezüch­ tet. 20 µg der Plasmide pU3pgklxtkneo oder pU3pgklxtkneoMCCre wurden in jeweils 4 × 10⁵ BOCS23 Zellen wie früher beschrieben transfiziert (19). Zellfreie Überstände wurden nach 48 stündiger Inkubation gewonnen und zur Infektion von 1 × 10⁵ NIH3T3 Zellen benutzt. Provirus exprimierende Klone wurden nach 10-tägiger Selektion in 400 µg/ml G418 (Gibco) isoliert. In einem weiteren Ansatz wurden 20 µg pMCCre zusammen mit 1 µg pBABE/Puro in zwei U3pgklxtkneo exprimierende NIH3T3-Klone transfiziert. Puromycin-resistente Zellpopulatio­ nen wurden nach 10-tägiger Selektion in 2 µg/ml Puromycin isoliert.
Southern blot Hybridisierung
Genomische DNA aus Retrovirusvektor-infizierten und MCCre transfizier­ ten Klonen wurde mit den Enzymen Xba1/Nde1 oder Hind III geschnitten. Nach Fraktionierung auf 1% (w/v) Agarosegelen wurde die DNA auf Hybond-Plus (Amersham) Membranen transferiert und mit ³²P-markierten Neo-Sonden wie früher beschrieben hybridisiert (20).
Ergebnisse
Die Expressionskassette pgklxtkneo wurde in die Nhe 1 Schnittstelle der U3 Region eines enhancerlosen Moloney murine leukemia virus Vektor kloniert (Fig. 5). Der enstandene Retrovirus-Vektor -pU3pgklxTkneo- wurde transient in der Helferzellinie -BOSC23- verpackt. NIH3T3 Zellen wurden mit hochtitri­ gen, helfervirusfreien BOCS23 Überständen infiziert. Provirus-exprimierende Klone wurden in G418 isoliert und mit den Expressionsplasmiden pMCCre und pBABE/Puro transfiziert. DNA aus Puromycin-resistenten und aus entsprechen­ den nicht-transfizierten Ursprungsklonen wurde auf Southern Blots analysiert. Fig. 6 zeigt, daß als Folge einer Cre vermittelten Deletion loxP flankierter Se­ quenzen, die Provirus-enthaltenden NdeI/XbaI Restriktionsfragmente insgesamt kleiner werden. Entsprechend sind die loxP flankierten proviralen Sequenzen auf Hind III Restriktionsfragmenten nur noch bedingt nachweisbar (Fig. 6).
Die Ergebnisse besagen, daß (i) die Extrasequenzen in der U3-Region ein­ schließlich loxP die Virusreplikation nicht behindern; (ii) die duplizierten loxP Sequenzen von Cre Rekombinase erkannt und rekombiniert werden und dabei, (iii) die zwischen loxP Elementen liegenden viralen und nicht-viralen Sequenzen deletiert werden.
Beispiel II
Zur Beantwortung der Frage ob die Cre/loxP vermittelte Rekombination auch dann funktioniert, wenn sich Cre kodierende und loxP Sequenzen auf dem gleichen Molekül befinden, wurde die MCCre Kassette zwischen die beiden LTRs des U3pgklxTkneo Vektors kloniert (Fig. 7). Das erhaltene Plasmid -pU3pgkIxTkneoMCCre- wurde zur Retrovirusproduktion in BOCS23 Zellen, wie in Beispiel 1 beschrieben, transfiziert. U3pgklxTkneoMCCre exprimierende NIH3T3 Zellen wurden nach Infektion als Klone in G418 isoliert, und deren In­ tegrationen auf Southern Blots analysiert: Die Untersuchung der U3pgklxTkneo und U3pgklxTkneoMCCre Integrationen in mehreren unabhängigen Klonen er­ gab, daß bei vergleichbarer Anzahl von Proviren die Intensität der konstanten (und im Falle einer Rekombination verschwindenden) Hind III Fragmente in MCCre exprimierenden Klonen 5-10-fach reduziert wird (Fig. 7). Dies bedeutet, daß aus einer signifikanten Fraktion der U3pgklxTkneoMCCre Proviren die loxP flankierten Sequenzen einschließlich MCCre deletiert wurden.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1: Schematische Darstellung eines konventionellen Retrovirus und dessen integrierte Form (Provirus).
Fig. 2: Funktionelle Darstellung eines sequenzspezifischen Rekombinationssy­ stems.
Fig. 3 und 4: Schematische Darstellung der Retroviren der Erfindung und der nach Integration stattfindenden Rekombination. P = Promotor; Ts = Targetsequenz; PKS = Protein-kodierende Sequenz; Rec = Rekombinase.
Fig. 5: Struktur der retroviralen Vektoren U3pgklxtkneo und U3pgklxtkneoMCCre.
Fig. 6: Southern Blots von U3pgklxtkneo exprimierenden Klonen vor und nach MCCre Transfektion. Die DNA der ersten 6 Bahnen wurde mit den nicht im Pro­ virus schneidenen Enzymen Nde I und Xba I verdaut. Die restlichen DNAs wur­ den mit dem in den LTRs schneidenden Enzym Hinf III verdaut. - = ohne Cre; + = mit Cre.
Fig. 7: Southern Blots von U3pgklxtkneo und U3pgklxtkneoMCCre exprimie­ renden Klonen. Die Intensitätsabnahme der konstanten Hind III Fragmente in U3pgklxtkneoMCCre Klonen wird beim Vergleich der 4.7 kb (A= U3pgklxtkneo) und 6 kb (B=U3pgklxtkneoMCCre ) Banden erkennbar. Die variablen Banden entsprechen der Anzahl der Integrationen.
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Claims (13)

1. Retrovirale DNA, umfassend mindestens eine der DNA zugrundeliegenden Re­ trovirus fremden, für eine Rekombinase kodierende DNA-Sequenz und minde­ stens eine für die Rekombinase spezifische Targetsequenz.
2. Retrovirale DNA nach Anspruch 1, bei der die Rekombinase Cre ist und die Targetsequenz loxP.
3. Retrovirale DNA nach Anspruch 1, bei der die Rekombinase Flp ist und die Targetsequenz frt ist.
4. Retrovirale DNA nach Anspruch 1 bis 3, bei der sich die Targetsequenzen in der U3- und/oder U5 -Region befindet.
5. Retrovirale DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiterhin eine Transkrip­ tionseinheit umfassend.
6. Retrovirale DNA nach Anspruch 5, bei der sich die Transkriptionseinheit in der U3- oder U5-Region befindet.
7. Retrovirale DNA nach Ansprüchen 1-6, weiterhin einen viralen Promotor um­ fassend.
8. Retrovirale DNA nach Ansprüchen 1-7, weiterhin einen viralen Enhancer um­ fassend.
9. Säugetierzelle, deren Genom mindestens eine Targetsequenz nach Anspruch 1 und mindestens eine Protein-kodierende Sequenz umfaßt, aber im wesentlichen kein provirales Genom enthält.
10. Säugetierzelle nach Anspruch 9, bei der die Targetsequenz loxP ist.
11. Säugetierzelle nach Anspruch 9, bei der die Targetsequenz frt ist.
12. Verfahren zur Transduktion von cDNA Sequenzen in das Genom von Säuge­ tierzellen, umfassen die Schritte:
  • - Konstruktion der retroviralen DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 8 nach an sich bekannten Verfahren,
  • - Transfektion in Verpackungszellinien,
  • - Selektion virusproduzierender Klone
  • - Infektion der Säugetierzellen,
  • - Expression der Rekombinase,
  • - Rekombination zwischen zwei Targetsequenzen, wobei gleichzeitig eine Deletion von der Rekombinase-enthaltenden Transkriptionseinheit und im wesentlichen aller proviraler Sequenzen stattfindet.
13. Verfahren nach Anspruch 12 umfassen weiterhin die Schritte:
  • - Konstruktion der retroviralen DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 8 nach an sich bekannten Verfahren,
  • - Infektion der Säugetierzellen,
  • - Expression der Rekombinase,
  • - Rekombination zwischen zwei Targetsequenzen, wobei gleichzeitig eine Deletion von der Rekombinase-enthaltenden Transkriptionseinheit und im wesentlichen aller proviraler Sequenzen stattfindet.
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