DE19507456A1 - Continuous culture of aerobic microorganisms at high cell density - Google Patents
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Abstract
Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Durch führung biotechnologischer Prozesse unter Kultivierung aerober Organismen in hoher Zelldichte im Durchlaufver fahren in einem Zyklonreaktor mit einem Zyklondurchmes ser : Einlaufdurchmesser-Verhältnis < 10, dem am oberen Ende tangential flüssiges Medium mit einer Beschleuni gungskennziffer (Zentrifugalbeschleunigung/Erdbeschleunigung) bis zu 25 zugeführt wird, in das sauerstoffhaltiges Gas gemischt ist und/oder dem sauerstoffhaltiges Gas über die Man telfläche des Reaktors zugeführt wird und das vom unte ren Ende des Reaktors entnommen und über einen äußeren Rezyklierungsumlauf auf Prozeßbedingungen gebracht wird, während vom oberen Ende des Reaktors akkumulier tes Gas entfernt wird, wobei mit einem Leistungseintrag im Kreislauf von 4-40 kW/m³ gearbeitet wird, sowie eine dafür geeignete Anordnung.The invention relates to a method for through management of biotechnological processes under cultivation aerobic organisms in high cell density in the continuous flow run in a cyclone reactor with a cyclone diameter ser: inlet diameter ratio <10, that at the top End tangentially liquid medium with an acceleration supply code (Centrifugal acceleration / gravitational acceleration) up to 25 is fed, mixed into the oxygen-containing gas and / or the oxygen-containing gas via the man Tel area of the reactor is supplied and that from the bottom Ren end of the reactor removed and an outer Recycling circulation brought to process conditions will accumulate while from the top of the reactor tes gas is removed, with a power input is worked in a cycle of 4-40 kW / m³, as well a suitable arrangement.
Biotechnologische Prozesse, insbesondere Fermentations prozesse, die unter Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellen ablaufen, bedürfen insbesondere bei Arbeit mit hohen Zelldichten einer intensiven Sauerstoffzu fuhr.Biotechnological processes, especially fermentation processes involving the cultivation of microorganisms or cells expire, especially at work with high cell densities to an intensive oxygen drove.
Es sind daher bereits unterschiedliche Techniken zur Steigerung des Sauerstoffeintragsvermögens für Fermen tationsprozesse bekannt, die einzeln oder in Kombina tion angewandt werden können:There are therefore already different techniques for Increasing the oxygen input capacity for fermen tion processes known individually or in combination tion can be applied:
- 1. Eine Vergrößerung des treibenden Konzentrationsge fälles durch Erhöhung des Sauerstoffpartialdrucks im Reaktor mit möglichst großem hydrostatischen Druck ("Turmbiologie"), durch Reaktionen unter höheren Drücken ("Druckfermentation") und durch Begasung mit sauerstoffangereicherter Luft bis hin zum Einsatz von reinem Sauerstoff.1. An increase in the driving concentration cases by increasing the oxygen partial pressure in the Reactor with the greatest possible hydrostatic pressure ("Tower biology"), through reactions among higher ones Press ("pressure fermentation") and by gassing with oxygen-enriched air up to the use of pure oxygen.
- 2. Eine Vergrößerung der volumenspezifischen Stoffaus tauschfläche a durch möglichst feine Dispergierung der Gasphase im gesamten Reaktor unter Vermeidung von Koaleszenz ("Spaltinjektoren", "Radialstromdüsen" mit Leitblechen).2. An increase in the volume-specific substance exchange area a by dispersing the Gas phase in the entire reactor while avoiding Coalescence ("gap injectors", "radial flow nozzles" with Baffles).
- 3. Eine Verringerung des Stofftransportwiderstands auf der Flüssigkeitsseite 1/kL durch Erhöhung des Energie eintrags (z. B. "Strahlschlaufenreaktoren").3. A reduction in the mass transfer resistance on the liquid side 1 / k L by increasing the energy input (eg "jet loop reactors").
- 4. Höchste Sauerstoffeintragsraten werden im Zentrifu galreaktor erreicht: Hierbei wird eine dampfsterili sierbare Siebzentrifuge als Reaktor eingesetzt (H. Voit, A. Mersmann, Chem. Ing. Techn. 61, 5 (1989) S. 416-417). Bei 50facher Erdbeschleunigung lassen sich im Zentrifugalbioreaktor bei der Begasung mit Luft Sau erstoffeintragsraten von bis zu 100 g/(l*h) verwirkli chen (Newtonsche Medien, kLa = 10 h-1). Dies ist neben der Intensivierung des Phasenkontakts (kL-Erhöhung) und der Feindispergierung der Gasblasen (a-Erhöhung) auf die lokale Erhöhung des Sauerstoffpartialdrucks (Erhöhung des treibenden Konzentrationsgefälles) im Zentrifugalfeld zurückzuführen.4. Highest oxygen input rates are achieved in the centrifuge reactor: Here, a steam-sterilizable sieve centrifuge is used as the reactor (H. Voit, A. Mersmann, Chem. Ing. Techn. 61, 5 (1989) pp. 416-417). At 50 times the gravitational acceleration, oxygen entry rates of up to 100 g / (l * h) can be achieved in the centrifugal bioreactor when gassed with air (Newtonian media, k L a = 10 h -1 ). In addition to the intensification of the phase contact (k L increase ) and the fine dispersion of the gas bubbles (a increase), this can be attributed to the local increase in the oxygen partial pressure (increase in the driving concentration gradient) in the centrifugal field.
Bekannt ist auch bereits ein Zyklon-Säulenreaktor (P.S.S. Dawson, Biotechnol. & Bioeng. Symp. No. 4 (1974) 809-819), bei dem eine Zyklon-Säule in einen Kreislauf für das flüssige Medium eingeschaltet ist, das am Säulenkopf tangential zugeführt wird und sich schraubenartig als "bewegter" Film längs der Säulenwand abwärts bewegt unter lebhaftem Gasaustausch mit dem am Reaktorboden zugeführten Gas.A cyclone column reactor is also already known (P.S.S. Dawson, Biotechnol. & Bioeng. Symp. No. 4 (1974) 809-819), in which a cyclone column in one Circuit for the liquid medium is switched on, which is fed tangentially to the column head and itself screw-like as a "moving" film along the column wall moved downward with lively gas exchange with the am Gas supplied to the reactor bottom.
Diese bereits längere Zeit bekannte Zyklonsäulentechnik wurde von J.D. Sheppard u. a. (J. Chem. Tech. Biotech nol. 59 (1994) 83-89) aufgegriffen und in einer Scale- up Version von 75 l Kapazität des Reaktors untersucht. Bei der Scale-up Einheit wurde die Säule verkürzt und dafür mit Luftinjektion in einem starb vergrößerten Kreislauf an zumindest zwei Stellen unter Erhöhung der Rotationsgeschwindigkeit der Förderpumpe gesorgt. Auf diese Weise wurde eine mit dem Zyklonsäulenreaktor ver gleichbare Fermentationsleistung erreicht, die als ähn lich zum herkömmlichen Rührkesselreaktor bezeichnet wird.This cyclone column technology, which has been known for a long time was developed by J.D. Sheppard et al. a. (J. Chem. Tech. Biotech nol. 59 (1994) 83-89) picked up and in a scale up version of 75 l capacity of the reactor examined. In the scale-up unit, the column was shortened and for that with air injection in one died enlarged Circulation in at least two places while increasing the Rotation speed of the feed pump ensured. On in this way, one with the cyclone column reactor comparable fermentation performance achieved that as similar Lich referred to the conventional stirred tank reactor becomes.
Eine höhere Effizienz scheint der von H.Voit et al. (s. o.) beschriebene Zentrifugalreaktor zu besitzen, der in der DE 39 05 609 A1 in Verbindung mit einem Zyklon entschäumer näher beschrieben wird.A higher efficiency seems to be that of H.Voit et al. to have (see above) described centrifugal reactor, the in DE 39 05 609 A1 in connection with a cyclone defoamer is described in more detail.
Eine für biotechnologische Prozesse brauchbare Verfah rensweise mit einem im Kreislauf betriebenen Zyklonre aktor der eingangs spezifizierten erfindungsgemäßen Art ist mithin bislang nicht in Betracht gezogen worden.A method that can be used for biotechnological processes alternatively with a cyclone operated in a cycle Actuator of the type according to the invention specified at the beginning has so far not been considered.
Gemäß der Erfindung wird durch intensiven Tangen tialeintrag in den Zyklonreaktor bei relativ niedrigem Durchmesserverhältnis von Zyklon zu Zykloneinlauf mit Beschleunigungskennziffern bis zu 25 (insbesondere 2-25) gearbeitet unter Verwendung von Verdrängerpum pen wie Drehkolbenpumpen Exzenterschneckenpumpen, Sine-Pumpen oder Taumelscheibenpumpen oder auch Peristaltikpumpen und Doppelmembranpumpen unter Erzie lung von Sauerstofftransportkoeffizienten KLa bis zu 3000 h-1 (bei Gasinjektion im Umlauf) bzw. bis 25 000 h-1 (bei Gaszufuhr über den Zyklonmantel).According to the invention is worked by intensive tangential entry into the cyclone reactor with a relatively low diameter ratio of cyclone to cyclone inlet with acceleration indicators up to 25 (in particular 2-25) using displacement pumps such as rotary lobe pumps, eccentric screw pumps, sine pumps or swash plate pumps or also peristaltic pumps and double mist pumps with the formation of oxygen transport coefficients K La up to 3000 h -1 (with gas injection in circulation) or up to 25 000 h -1 (with gas supply via the cyclone jacket).
Durch die Anordnung eines Prallkörpers im unteren Be reich wird die Ausbildung des Sekundärwirbels geför dert, so daß insgesamt die volumenspezifische Be gasungsmenge verringert werden kann, was zur Einsparung von Energie und Milderung von Schaum- und Abgasproblemen führt.By arranging an impact body in the lower loading the formation of the secondary vertebra is richly promoted changes, so that the volume-specific Be Gassing amount can be reduced, which saves of energy and mitigation of foam and Leads to exhaust gas problems.
Besonders zweckmäßig ist ein Prallkörper in Form eines Tellers, der ggf. gleichzeitig - allein oder ergänzend - als Gasverteiler bzw. Begasungseinrichtung wirken kann oder in Form eines mit der Spitze nach unten weisenden Kegels, der auch ggf. - mit poröser Basis - dem Gasein trag dienen kann.An impact body in the form of a is particularly expedient Tellers, if necessary at the same time - alone or in addition - can act as a gas distributor or fumigation device or in the form of a tip pointing downwards Cone, which may also - with a porous base - gas can serve.
Der erfindungsgemäße Zyklonreaktor kann jedoch auch ohne Prallkörper im unteren Bereich vorgesehen werden, wobei dann erhöhte Gasanteile in den Rezyklierungskreis gelangen können, was bisweilen für die ausreichende Sauerstoffver sorgung empfindlicher Zellsysteme auch im Rezyklierungs kreis erwünscht sein kann. However, the cyclone reactor according to the invention can also be used without Impact bodies are provided in the lower area, whereby then increased gas fractions get into the recycling circuit can, what sometimes for the sufficient oxygen ver care of sensitive cell systems also in recycling circle may be desired.
Auch bei erhöhtem Gaseintrag über den Prallkörper oder über einen perforierten Zylindermantel des Zyklons kann ein Teil des zugeführten Gases in den Kreislauf gedrückt werden. Hierdurch wird auch bei hohen Zelldichten eine Sauerstoffversorgung im Kreislauf sichergestellt, da die Speicherkapazität der Flüssigphase für Sauerstoff sehr be grenzt ist. Eine genaue Quantifizierung ist nicht möglich, da die Stoffdaten gas/flüssig den Umlauf-Gasanteil wesent lich beeinflussen.Even with increased gas entry through the impact body or A perforated cylinder jacket of the cyclone can be used Part of the supplied gas is pressed into the circuit become. As a result, even at high cell densities Oxygen supply in the circuit ensured because the Storage capacity of the liquid phase for oxygen be very is bordered. An exact quantification is not possible since the gas / liquid material data is essential for the circulating gas content influence.
Besonders zweckmäßig ist die Einbeziehung einer Mikro filtration in den Rezyklierungskreis zur Steigerung der Zelldichten, wobei z. B. mit Röhrenmodulen gearbeitet wer den kann und die Überströmgeschwindigkeit dem Tangential einlauf in den Zyklonreaktor angepaßt ist.It is particularly useful to include a microphone filtration in the recycling circle to increase the Cell densities, e.g. B. worked with tube modules that can and the overflow velocity the tangential inlet into the cyclone reactor is adapted.
Alle Meßsonden für Temperatur, pH-Wert, pO₂, Trübung etc. sowie alle Zu- und Abläufe der Flüssigphasen (Substrate, Korrekturmittel, Produkt) werden vorzugs weise im Umlauf installiert, um das Strömungsfeld im Zyklonreaktor nicht zu stören.All probes for temperature, pH, pO₂, turbidity etc. as well as all inflows and outflows of the liquid phases (Substrates, correction agents, product) are preferred installed in circulation around the flow field in the Cyclone reactor not to interfere.
Eine Anordnung zur Durchführung biotechnologischer Pro zesse gemäß der Erfindung unter Kultivierung aerober Organismen in hoher Zelldichte ist gekennzeichnet durch einen Kulturflüssigkeitskreislauf mit Elementen zur Re gelung der Prozeßbedingungen für einen als Zyklon aus gebildeten, in den Kreislauf integrierten Reaktor mit Gasentnahme am Kopf und Flüssigkeitsentnahme am Boden, dessen oberer Tangential-Einlauf mit einer im Kreislauf vorgesehenen Pumpe für einen Leistungseintrag für Beschleunigungskennziffern (zEinlauf) bis zu 25 (Zentrifugalbeschleunigung/Erdbeschleunigung) in Verbin dung steht und vor dessen unterem Ende ein Prallkörper zur Unterstützung des Sekundärwirbels angeordnet sein kann und durch Mittel zur Begasung im Kreislauf vor dem Tan gentialeinlauf zum Zyklonreaktor und/oder über perforierte Gasverteilerflächen im Reaktor.An arrangement for carrying out biotechnological processes according to the invention with the cultivation of aerobic organisms in high cell density is characterized by a culture liquid circuit with elements for regulating the process conditions for a reactor formed as a cyclone and integrated in the circuit with gas removal from the head and liquid removal from the bottom, whose upper tangential inlet is connected to a pump provided in the circuit for a power input for acceleration indicators (z inlet ) up to 25 (centrifugal acceleration / gravitational acceleration) and in front of whose lower end an impact body for supporting the secondary vertebra can be arranged and by means of Fumigation in the circuit before the tangential inlet to the cyclone reactor and / or via perforated gas distributor surfaces in the reactor.
Anwendungsgebiete für die erfindungsgemäße Technik
sind:
die Bioverfahrenstechnik zur effektiven Herstellung mi
krobieller niedermolekularer Metabolite (z. B. organi
sche Säuren, Aminosäuren, Vitamine) sowie Exoenzymen
(z. B. Proteasen, Amylasen) und zur effektiven Herstel
lung rekombinanter Proteine in Hochzelldichte-Fermenta
tionen;
die biotechnologische Forschung zur Kultivierung hoher
Zelldichten unter definierten, nicht sauerstofflimi
tierten Bedingungen.Areas of application for the technology according to the invention are:
bio-process engineering for the effective production of microbial low-molecular metabolites (e.g. organic acids, amino acids, vitamins) as well as exoenzymes (e.g. proteases, amylases) and for the effective production of recombinant proteins in high-cell density fermentations;
biotechnological research for the cultivation of high cell densities under defined, non-oxygen-limited conditions.
Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen sowie aus der nachfolgenden Be schreibung von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen, die schematisch vier Varianten einer erfindungsgemäßen Anordnung wiederge ben.Further special features of the invention result from the patent claims and from the following Be description of exemplary embodiments with reference to the attached drawings, which are schematically four Variants of an arrangement according to the invention ben.
Gemäß Fig. 1 ist ein Zyklonreaktor 1 mit unterem (hohlen) Prallkegel 2 in einen Kulturflüssigkeitsumlauf einbezo gen, der vom unteren Ende 3 des Zyklons abzweigend über eine Pumpe 4 geleitet wird, mit einem Auslaß für zell haltige Flüssigkeit 5 sowie einer Mikrofiltration 6, insbesondere in Form von Rohrmodulen zur Abgabe von Filtrat über 7, während bei 8 insbesondere ergänzendes Kulturmedium eingespeist werden kann. Mit 9 ist eine Gasinjektion angedeutet für die Gaszufuhr über 10. Das daraufhin erzielte Flüssigkeitsgasgemisch tritt bei 11 tangential in den Zyklonreaktor ein, in dem sich ein Flüssigkeitsspiegel, etwa wie angedeutet, ausbildet. Das oberhalb desselben akkumulierte Gas tritt bei 12 über ein Tauchrohr 13 aus dem Reaktor aus. Dieses Tauchrohr kann mit (nicht dargestellten) Schaumzerstörerelementen unterhalb des Gasauslasses versehen sein, etwa in, Form von Dreiecken, die in den Gasraum hineinragen. Die Gasinjektion kann auch zwischen Pumpe und Filter Vorgesehen sein.Referring to FIG. 1, a cyclone reactor 1 with bottom (hollow) baffle cone 2 in a culture fluid circulation is einbezo gene of the cyclone is passed branching off via a pump 4 from the lower end 3, with an outlet for cell-containing fluid 5 and a microfiltration 6, in particular in the form of tube modules for the delivery of filtrate over 7, while at 8 in particular supplementary culture medium can be fed. With 9 a gas injection is indicated for the gas supply over 10 . The liquid gas mixture then obtained enters the cyclone reactor tangentially at 11 , in which a liquid level is formed, as indicated, for example. The gas accumulated above the same exits the reactor at 12 via a dip tube 13 . This immersion tube can be provided with (not shown) foam destroyer elements below the gas outlet, for example in the form of triangles, which protrude into the gas space. Gas injection can also be provided between the pump and filter.
Fig. 2 und 3 zeigen Varianten zu der soeben erläuterten Ausführungsform, bei denen die Begasung, wie angedeutet, über die porös ausgebildete Zyklonwand bzw. die poröse Basis des Prallkegels erfolgt. Fig. 2 and 3 show variants of the just explained embodiment in which takes place the fumigation, as indicated, on the porous formed cyclone wall and the porous base of the baffle cone.
Gemäß Fig. 4 ist die Flüssigkeitsentnahme aus dem Zy klonreaktor abgewandelt, und zwar wird flüssiges Kul turmedium aus dem Zyklonreaktor über ein Tauchrohr 14 vom geschlossenen Boden des Zyklonreaktors 1 entnommen, das durch den Prallkegel 2 und das Tauchrohr 13 zur Gasentnahme hindurchgeführt ist.According to FIG. 4, the fluid removal from the Zy is modified klonreaktor, namely liquid Kul is turmedium from the cyclone reactor via a dip tube 14 from the closed bottom of the cyclone reactor 1 taken constituted by the baffle cone 2 and the dip tube 13 is passed to gas sampling.
Dieser Zyklon-Reaktor besitzt einen Innendurchmesser von 70 mm und eine zylindrische Länge von 190 mm. Der Einlauf-Durchmesser beträgt 9 mm. Der Prallkegel (Winkel in der Kegelspitze 130°) vor dem Unterlauf hat einen Durchmesser von 62 mm, so daß über einen Ringspalt von 4 mm der gasfreie Unterlauf in das Axialrohr nach oben abgesaugt werden kann (Fig. 4), Die Durchmesserreduzierung vom zylindrischen Teil des Zyklon-Reaktors zum Zentralrohr (Innendurchmesser 9 mm) erfolgt über eine Länge von 10 mm. Das Tauchrohr am Kopf des Zyklon-Reaktors zur Entnahme der Gasphase ist 5 mm eingetaucht und hat einen Innendurchmesser von 30 mm. Die Gasentnahme aus dem nach oben abgeschlossenen Tauchrohr erfolgt seitlich mit einem Rohrdurchmesser von 9 mm. Durch den Deckel des Tauchrohrs ist zentral das Saugrohr des Unterlaufs durchgeführt. Der gesamte Zyklon-Reaktor ist aus Glas gefertigt.This cyclone reactor has an inside diameter of 70 mm and a cylindrical length of 190 mm. The inlet diameter is 9 mm. The impact cone (angle in the cone tip 130 °) in front of the underflow has a diameter of 62 mm, so that the gas-free underflow can be sucked upwards into the axial tube via an annular gap of 4 mm ( Fig. 4), the diameter reduction from the cylindrical part of the cyclone reactor to the central tube (inner diameter 9 mm) takes place over a length of 10 mm. The immersion tube at the head of the cyclone reactor for withdrawing the gas phase is immersed 5 mm and has an inner diameter of 30 mm. The gas is withdrawn from the top of the immersion tube with a tube diameter of 9 mm. The suction pipe of the underflow is carried out centrally through the cover of the immersion pipe. The entire cyclone reactor is made of glass.
Direkt neben dem Tauchrohr ist eine SCHOTT GL Verschraubung angebracht, die zur Aufnahme einer kontinuierlichen Niveausonde (potentiometrisches Meßprinzip) dient, um das Flüssigphasen-Volumen im Zyklon-Reaktor einzustellen (Arbeitsvolumen 800 ml).A SCHOTT GL screw connection is attached directly next to the immersion tube for receiving a continuous level probe (potentiometric measuring principle) is used to adjust the liquid phase volume in the cyclone reactor (Working volume 800 ml).
Alle anderen Meßsonden (Temperatur pH, pO₂, Trübung), sowie alle Zu- und Abläufe der Flüssigphasen (Substrat, Korrekturmittel, zellhaltiger Ablauf) sind im Umlauf integriert.All other measuring probes (temperature pH, pO₂, turbidity), as well as all feed and Processes of the liquid phases (substrate, correction agent, cell-containing process) are in the Integrated circulation.
Auf der Druckseite der Umlaufpumpe (Filtron - Sinus - Pumpe) ist ein Mikrofiltrationsmodul (keramisches Rohrmodul mit 19 Kanälen, Kanaldurchmesser 2,7 mm, Austauschfläche 0,14 m²) installiert. Danach erfolgt der Lufteintrag über ein Sinterrohr, bevor der Umlaufstrom über einen Wärmetauscher wieder tangential in den Zyklon-Reaktor eingespeist wird. Damit ergibt sich ein Gesamt-Arbeitsvolumen von 1,5 l.On the pressure side of the circulation pump (Filtron - Sinus - Pump) is a Microfiltration module (ceramic tube module with 19 channels, channel diameter 2.7 mm, exchange area 0.14 m²) installed. Then the air is introduced via a Sintered tube before the circulation flow tangentially in again via a heat exchanger the cyclone reactor is fed. This results in a total work volume of 1.5 l.
Der kLa-Wert wurde nach der stationären Methode mit Medium ohne Zellen bestimmt, indem der in den Zyklon-Reaktor eingetragene Sauerstoff extern in einem Stripper mit Stickstoff wieder entfernt wurde (Stickstoffdesorptionsmethode).The k L a value was determined using the stationary method with medium without cells, by removing the oxygen introduced into the cyclone reactor externally in a stripper using nitrogen (nitrogen desorption method).
Bei verschiedenen Beschleunigungskennziffern z und unterschiedlichen volumetrischen Gaseintragsraten wurde der kLa-Wert bestimmt. Die Flüssigvolumenströme wurden zwischen 400 und 700 l/h variert, die Luftvolumenströme zwischen 50 und 300 l/h. Die Ergebnisse lassen sich mit einem Potenzansatz korrelieren:The k L a value was determined using different acceleration parameters z and different volumetric gas entry rates. The liquid volume flows were varied between 400 and 700 l / h, the air volume flows between 50 and 300 l / h. The results can be correlated with a potency approach:
kLa = c * (P/V)a * (Gasstrom)b k L a = c * (P / V) a * (gas flow) b
c = 1.3865, a = 0.5995, b = 0.4387
Es sind kLa-Werte bis 3000 l/h bzw. Sauerstoffeintragsraten bis 21 g/(l*h)
gemessen worden.c = 1.3865, a = 0.5995, b = 0.4387
K L a values up to 3000 l / h or oxygen input rates up to 21 g / (l * h) were measured.
Zur Vorkultivierung werden 1000 ml Schüttelkolben mit 4 Schikanen und einem Arbeitsvolumen von 200 m verwendet. Die Medienbestandteile werden 30 min bei 121°C autoklaviert (Zusammensetzung des Nährmediums: Tabelle 1). Nach Abkühlung auf Umgebungstemperatur wird mit 1 ml Organismensuspension aus der Stammhaltung angeimpft. Es folgt eine 24 stündige Inkubierung bei 30°C.For pre-cultivation, 1000 ml shake flasks with 4 baffles and one Working volume of 200 m used. The media components are at 30 min 121 ° C autoclaved (composition of the nutrient medium: Table 1). To Cooling to ambient temperature is carried out with 1 ml organism suspension Root position vaccinated. This is followed by a 24 hour incubation at 30 ° C.
Das Zyklon-Reaktor-System wird chemisch sterilisiert. Dazu wird Dimethyldicarbonat 1 : 1000 mit Wasser verdünnt und anschließend in das Reaktorsystem gepumpt. Bei 20°C ist nach ca. 20 Minuten der Wirkstoff in Kohlendioxid und Methanol zerfallen. Nach der chemischen Sterilisierung des Reaktorsystems wird das übriggebliebene Wasser durch sterilisiertes Nährmedium verdrängt. Die Zusammensetzung des Nährmediums zur kontinuierlichen Kultivierung ist Tabelle 1 zu entnehmen. Salze und Glucose sind getrennt zu autoklavieren (30 min, 121°C). Vitamine und Aminosäure werden im Anschluß sterilfiltriert zugegeben.The cyclone reactor system is chemically sterilized. This is dimethyl dicarbonate Diluted 1: 1000 with water and then pumped into the reactor system. At After 20 minutes the active ingredient has broken down into carbon dioxide and methanol at 20 ° C. After chemical sterilization of the reactor system, what remains is Water displaced by sterilized nutrient medium. The composition of the Culture medium for continuous cultivation is shown in Table 1. Salts and glucose must be autoclaved separately (30 min, 121 ° C). Vitamins and Amino acids are then added under sterile filtration.
Zum Starten der Reaktion werden 200 m inkubierte Vorkultur in den Zyklon-Reaktor mit einem Gesamtvolumen von 1.5 l gepumpt. Zur Adaption der Mikroorganismen an das synthetische Hauptkulturmedium folgt ein 12 stündiger Batchbetrieb des Zyklon- Reaktors. In dieser Zeit erhöht sich die Zellmassekonzentration von 3 auf 15 g Biotrockenmasse/l.To start the reaction, 200 m of incubated preculture are placed in the cyclone reactor pumped with a total volume of 1.5 l. To adapt the microorganisms the synthetic main culture medium follows a 12 hour batch operation of the cyclone Reactor. During this time, the cell mass concentration increases from 3 to 15 g Organic dry matter / l.
Der Volumenstrom der Umlaufpumpe wird konstant auf 500 l/h eingestellt. Das entspricht einer Strömungsgeschwindigkeit v der Flüssigkeit am tangentialen Einlauf des Zyklon-Reaktors von 2 m/s. The volume flow of the circulation pump is constantly set to 500 l / h. The corresponds to a flow velocity v of the liquid at the tangential inlet of the cyclone reactor of 2 m / s.
Die Beschleunigungskennziffer zEinlauf (Zentrifugalbeschleunigung/
Erdbeschleunigung) wird wie folgt berechnet:
zEinlauf = 2*v²/(D*g)
wobei v = Leerrohrgeschwindigkeit am Einlauf (m/s)
D = Innendurchmesser des Zyklons (m)
g = Erdbeschleunigung (9.81 m/s²).The acceleration index z inlet (centrifugal acceleration / gravitational acceleration) is calculated as follows:
z inlet = 2 * v² / (D * g)
where v = empty pipe speed at the inlet (m / s)
D = inner diameter of the cyclone (m)
g = gravitational acceleration (9.81 m / s²).
Damit ist die Beschleunigungskennziffer zEinlauf = 11.7.This means that the acceleration index z inlet = 11.7.
Die Zuluftmenge wird auf 400 l/h eingestellt. Damit ergibt sich ein volumenspezifischer Energieeintrag (Leistungseintrag der Umlaufpumpe und kinetische Energie des Gaseintrags) von knapp 10 kW/m³. Über den Wärmetauscher im Umlauf wird durch einen Thermostaten mit externer Temperaturegelung die Temperatur im Zyklon-Reaktor-System auf 30°C eingestellt. Der PH-Wert wird durch Zugabe des Korrekturmittels (4N NaOH) auf 7,0 geregelt.The supply air volume is set to 400 l / h. This results in a volume-specific energy input (power input of the circulation pump and kinetic energy of the gas input) of just under 10 kW / m³. Via the heat exchanger in circulation is a thermostat with external temperature control Temperature in the cyclone reactor system set to 30 ° C. The pH is determined by Addition of the correction agent (4N NaOH) regulated to 7.0.
Bei einer Biotrockenmassekonzentration von 15 g/l kann auf kontinuierlichen Betrieb umgestellt werden. Der Zulauf wird auf 300 ml/h eingestellt. Bei einem Gesamtvolumen des Reaktorsystems von 1,5 l entspricht das einer mittleren Verweilzeit des Nährmediums von 5 h im Reaktorsystem. Durch die im Umlauf integrierte Mikrofiltrationseinheit kann dem System ein zellfreier Flüssigkeitsstrom entnommen werden. Damit kann die mittlere Verweilzeit der Mikroorganismen im System von der Verweilzeit des Nährmediums entkoppelt werden.With a dry biomass concentration of 15 g / l, continuous operation is possible be converted. The feed is adjusted to 300 ml / h. At a The total volume of the reactor system of 1.5 l corresponds to that of an average one Culture medium dwell time of 5 h in the reactor system. By circulating Integrated microfiltration unit can give the system a cell-free liquid flow be removed. The mean residence time of the microorganisms in the System are decoupled from the residence time of the nutrient medium.
Es wird ein Verweilzeitfaktor F von 5 eingestellt (Der Verweilzeitfaktor F stellt das Verhältnis zwischen der Verweilzeit der Mikroorganismen und der Verweilzeit des Nährmediums dar). Ein Verweilzeitfaktor F von 5 bedeutet, das sich die Zellmasse (der Biokatalysator) 5mal länger im Zyklon-Reaktor-System befindet als das Nährmedium. Bei einem Zulaufvolumenstrom von 300 ml/h ist dies durch die Entnahme eines zellhaltigen Bleedstroms von 60 ml/h und eines zellfreien Filtratstroms von 240 ml/h zu erreichen. Der Filtratstrom stellt sich bei fester Vorgabe des Bleedstroms über die Füllstandsregelung ein. A residence time factor F of 5 is set (the residence time factor F represents this Relationship between the residence time of the microorganisms and the residence time of the Nutrient medium). A residence time factor F of 5 means that the cell mass (the biocatalyst) is 5 times longer in the cyclone reactor system than that Nutrient medium. With an inlet volume flow of 300 ml / h, this is due to the Extraction of a cell-containing bleed flow of 60 ml / h and a cell-free one To achieve filtrate flow of 240 ml / h. The filtrate flow is fixed Specification of the bleed current via the level control.
Nach 3 Zellmasse-Verweilzeiten (75 h) wird im Fließgleichgewicht eine Zellmassekonzentration von 60 g BTM/l im Zyklon-Reaktor erreicht. Als pO₂ wird bei dieser Zelldichte ein Wert von 6% Luftsättigung an der Meßstelle im Umlauf gemessen.After 3 cell mass dwell times (75 h) one becomes in steady state Cell mass concentration of 60 g BTM / l in the cyclone reactor reached. As pO₂ at this cell density has a value of 6% air saturation at the measuring point in circulation measured.
Zur biochemischen Kontrolle einer im gesamten Zyklon-Reaktor-System ausreichenden Sauerstoffversorgung wurde das Fermentationsmedium auf das Gärendprodukt Laktat untersucht, das nur gebildet wird, wenn nicht genügend Sauerstoff vorhanden ist. Im untersuchten Betriebsbereich konnte keine Laktatbildung festgestellt werden.For biochemical control in the entire cyclone reactor system Adequate oxygen supply was applied to the fermentation medium Fermentation product lactate examined, which is only formed if not enough Oxygen is present. In the operating area examined, none Lactate formation can be determined.
Gegenüber dem herkömmlichen Rührkesselverfahren kann durch den Einsatz des Zyklon-Reaktors die Zellmassekonzentration im Reaktor um den Faktor 3 gesteigert werden, ohne das es zu unerwünschten Sauerstofflimitierungen kommt. Bei unveränderter zellmassenspezifischer Reaktionsgeschwindigkeit der Aminosäurebildung läßt sich damit die volumetrische Produktivität ("Raum-Zeit- Ausbeute") ebenfalls gegenüber dem kontinuierlichen Rührkesselverfahren um den Faktor 3 steigern.Compared to the conventional stirred tank process, the use of Cyclone reactor the cell mass concentration in the reactor increased by a factor of 3 without causing undesirable oxygen limitations. At unchanged cell mass specific reaction rate of Amino acid formation can be used to determine volumetric productivity ("space-time Yield ") also compared to the continuous stirred tank process Increase factor 3.
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