DE1947896A1

DE1947896A1 - Pharmazeutische Zubereitungen und ihre Herstellung

Info

Publication number: DE1947896A1
Application number: DE19691947896
Authority: DE
Inventors: Claudine Berrebi; Georges Manoussos
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1968-09-23
Filing date: 1969-09-22
Publication date: 1970-09-17
Also published as: FR2022185A2; CH518718A; LU56945A1; FR2022185B2; BE739193A; GB1282317A

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

8 MÜNCHEN 2. Hl LBLESTRASSE 2O

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 2, HilblestraBe 20 Ihr Zeichen Unser Zeichen Datum

22, Sep. 1969

Anwalts-Akte 18 852
Be/öch

L¹OREAL
Paris / Frankreich

"Pharmazeutische Zubereitungen und ihre Herstellung" Zusatz zu Patent ...
Patentanmeldung P. 1667907.5

Erfinder: Glaudine ßerrebi Georges Manoussos

Me vorliegende Erfindung betrifft Zubereitungen, die die Bekämpfung von Zellgewebsentzundungen, von Alterung und Entartung von Hautgeweben ermöglichen, Entzündungshemmende bzw. -verhütende Zubereitungen, insbesondere

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β (0Θ1Ι) *ä 16 20 81 leUarammei PATENTEULE München Banki Bayerisch· Vereinsbank MOnchen 453 100 Poilsrta*: MOn^hen «3 43

gegen Rheumatismus, Ödeme oder Verbrennungen,, Zubereitungen zur förderung des Heilungsvorganges bei Wunden (Vernarbung-fordernde Zubereitungen), sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel.

Die Anmelderin hat bereits vorgeschlagen, den Haarausfall und die Beborrhoea mit Hilfe von kosmetischen Zubereitungen zu bekämpfen, die als Wirkstoffe sterile Extrakte enthalten, die durch Extraktion von Hautdecke und Geweben der Nabelschnur aus Rinder- und Bchafsfötus mit Hilf e einer ionenhaltigen Lösung erhalten werden.

Für die Herstellung dieser Wirkstoffzubereitungen kann als ionenhaltige wäßrige Lösung ein Salz, eine Säure, eine Base oder weiterhin eine ionisierbare organische Verbindung, wie ein Phenol, in Wasser gelöst, verwendet werden. Die ionenhaltige wäßrige Lösung kann auch durch eine physiologische Serutnlösung gebildet werden.

Von den ionisierbaren Verbindungen, die zur Bildung der wäßrigen ionenhaltigen Lösung verwendet werden können, seien genannt:

- neutrale Balze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, in 0,1 M bis 2,5 M und vorzugsweise 0,4 M Lösung,

- saure Balze wie Kalium- oder Natriumphosphab in 0,1 W-

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BAO ORiQfNAL

Lösung und einem pH zwischen 6 und 8 oder Natrium- oder Kaliumeitrat in 0,1 M Lösung mit einem pH zwischen 3 und 5i

- Bäuren,wie Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, in 0,5 N Lösung mit einem pH von 1,5»

- Basen, wie Natriumlauge, Kaliumlauge, Ammoniak, Oalcium*- oder Bariumhydroxid, in 0,3 bis 0,5 N Lösung mit einem pH von 8 bis 9,

- organische Verbindungen, wie Harnstoff, in 6 bis 8M Lösung mit einem pH von 6 oder Phenol in 2$iger Lösung.

Nach einer Ausführungsform des Verfahrens gefriert man zuerst die Hautdecke des Fötus, zerreibt sie dann und führt ihre enzymatische Digestion in einer ionischen Lösung durch.

Eine solche Digestion kann vorteilhafterweise mit Hilfe von Enzymen aus der Gruppe der proteolytischen Enzyme, wie der Proteinase, dem Papain, den Pepsinen und dem Trypsin bewirkt werden.

Diese Digestion sollte vorzugsweise ohne Entlipoidierung bewirkt werden. Sie dient im wesentlichen dazu, die Abtrennung von Proteinsubstanzen derart hervorzurufen, daß die Mucopolysaccharide freigegeben werden, die nach der Erfindung die späteren Extrakte werden sollen_o

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ORIGINAL

Der durch die enzymatische Digestion erhaltene Brei wird danach einer Dialyse gegen destilliertes Wasser unterworfen, nachdem er vorausgehend vorzugsweise einer Zentrifugierung zum Ausscheiden der festen Teile unterworfen wurde.

Nachdem man die, die Wirkstoffe enthaltende Lösung filtriert hat, fällt man diese letzteren durch Zugabe von absolutem Alkohol und Natriumacetat' aus.

Der Niederschlag kann danach, beispielsweise durch aufeinander folgendes Waschen mit Alkohol, mit einem Gemisch von Alkohol und Äther, und mit Äther gereinigt werden und wird dann der Trocknung unterworfen.

Der so erhaltene Wirkstoff hat die Form eines weißen Pulvers, das in Wasser und physiologischen Serumlösungen löslich ist.

Nach einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens gefriert man die Hautdecke und die Nabelschnur, behandelt sie dann nach ihrer Zerkleinerung in einer ionenhaltigen Lösung, «wie einem physiologischen üerum, ohne vorausgehende Entlipoidierung.. Man zentrifugiert dann und fällt die in der überstehenden Flüssigkeit' enthaltenen wirksamen Bestandteile mit Lösungsmitteln, wie absolutem Alkohol, Aceton usw. oder mit quarternären Ammoniumderivaten, wie Cetyltrimethylammoniumbroraid oder Cetylpyridiniumchlorid aus.

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Man reinigt den Niederschlag durch Waschen mit absolutem Alkohol, dann mit einem Alkohol-Äthergemisch und erhält nach Trocknen ein weißes Pulver, das in Wasser und physiologischen Lösungen löslich ist.

Alle Phasen dieses Verfahrens werden bei einer niederen Temperatur, beispielsweise einer Temperatur von +4⁰O durchgeführt .

Das in wäßrigem Medium lösliche weiße Pulver, das nach dem oben angeführten Verfahren erhalten wurde und den Wirkstoff der Extrakte der Hautdecke darstellt, wird nachfolgend als "Mucopolysaccharide nach der Erfindung" bezeichnet .

Die vorliegende Erfindung hat eine zur lokalen Anwendung geeignete kosmetische Zubereitung, im besonderen gegen Zellgewebsentzundung, Kupferausschlag (couperose), Sonnenbzw. Gletscherbrand und Hitzblattern und zur Aktivierung der Wundheilung bzw. der Narbenbildung zum Gegenstand, wobei die Zubereitung in einem geeigneten kosmetischen Träger einen wirksamen Gehalt an Mucopolysacchariden nach der Erfindung enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die kosmetische Zubereitung nach der Erfindung zwischen 0,5 und 5 Gew.% und vorzugsweise zwischen 1,5 und 3 Gew.% Mucopolysaccharide.

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In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die zur Verwendung gegen Zellgewebsentzündungen vorgesehenen kosmetischen Zubereitungen zusätzlich Enzyme, die bekannt sind hinsichtlich ihrer Wirkung auf den Metabolismus der Lipoide und Mucopolysaccharide, wie beispielsweise Enzyme aus der Gruppe der Hyaluronidasen, Lipasen und Thiomucasen.· Diese Enzyme können in einer Konzentration von 1 bis 5 Gew.% vorhanden sein.

Die kosmetischen Zubereitungen nach der Erfindung können in der Form von Lösungen, Gelen oder Cremes dargeboten werden.

»Sie können weiterhin alle herkömmlichen kosmetischen Hilfsmittel, wie beispielsweise Farbstoffe, Parfüme und/oder Eindringmittel (Gleitschiene) enthalten.

Die vorliegende Erfindung hat in gleicher Weise ein Verfahren zur Bekämpfung von Oellulitis, Alterung und Entartung von Hautgeweben, Kupferausschlag, Sonnenbrand und Hitzblattern, zum Gegenstand, bei dem man die oben erläuterten kosmetischen Zubereitungen auf die befallenen Hautoberflächen wiederholt aufbringt und sie vorzugsweise gleichzeitig massiert.

Die vorliegende Erfindung hat ferner ein neues antirheumatisches, Entzündungs-heramendes bzw. -verhütendes, die Vernarbung-forderndes, Hautgewebe-regenerierendes Arzneimittel,

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das ebenso gegen Varikosität, Kupferausschlag und Verbrennungen wirkt, zum Gegenstand, das Mucopolysaccharide nach der Erfindung in einem geeigneten Träger enthält.

Nach einer ersten Ausführungsform ist das oben erläuterte Arzneimittel zur Verabfolgung durch intramuskuläre Injektion bestimmt und es wird in diesem Falle als wäßrige injizierbare Lösung, die die Mucopolysaccharide enthält, dargeboten.

In einer weiteren·Darbietungsform wird das erfindungsgemäße Arzneimittel zur äußeren Anwendung verabfolgt und die Mucopolysaccharide sind in diesem Falle in einem Träger, der vorzugsweise durch eine Creme oder ein Gel gebildet wird, einverleibt.

Das Arzneimittel nach der Erfindung kann in täglichen Dosen von 5 bis 200 mg Mucopolysaccharide nach der Erfindung pro kg Gewicht des behandelten Patienten verabfolgt werden.

Die therapeutischen Eigenschaften des Arzneimittels nach der Erfindung sind im wesentlichen Entzündungs-hemmende bzw. Entzündungs-verhütende, Narben-bildende und Geweberegenerierende Eigenschaften,

Die von der Anmelderin vorgenommenen Untersuchungen zeigen,

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daß die Mucopolysaccharide nach der Erfindung keinerlei Toxizität zeigen.

Weiterhin erlauben Vergleichsuntersuchungen die Feststellung, daß das Arzneimittel nach der Erfindung eine Entziindungs-hemmende bzw. Entzündungs-verhütende Wirksamkeit und im besonderen eine anti-rheumatische Wirksamkeit aufweist, die der des Cortisons ohne das Risiko schädlicher Sekundärwirkungen wesentlich überlegen ist.

Die nachfolgend angegebenen Untersuchungen zeigen die Wirksamkeit und die fehlende Toxizität des Arzneimittels nach der Erfindung.

1. - Herstellung der Mucopolysaccharidextrakte aus der Haut von Hinderfötus

Man entnimmt unter aseptisc-hen Bedingungen 174-6 g Haut eines Rinderfötus.

Die Föten, von welchen die Entnahmen vorgenommen werden, sind in· Trachtigkeitsstadien von 20 bis 120 Tagen, wobei die Föten ohne Unterschied dem einen oder anderen Geschlecht zugehören.

Sofort nach der Entnahme werden die Hautdecken bei einer Temperatur von -20°C eingefroren, dann in Gegenwart einer Salzlösung (15 ml/g) in einer U-Turrax TP 45/2-Vorrichtung

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BADORiQINAL

mit 10 000 UpM ungefähr 15 Minuten zerkleinert, wobei diese Arbeitsverfahren unter sterilen Bedingungen vorgenommen werden.

Während der gesamten Dauer des Zerkleinerns kühlt man das Ganze mit Eis und Kohlensäureschnee, um jegliches Risiko des Verderbens zu vermeiden.

Die Extraktionssalzlösung wird in diesem !Falle von 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 6,5 gebildet. Der so erhaltenen zerriebenen Masse werden zugegeben:

300 mg Papain
788 mg Cysteinchlorhydrat
18,6 mg Äthylendiamintetraessigsäure

auf 100 ml Lösung und man führt die Digestion der· Proteine 15 Stunden lang bei 65°C durch.

Während dieser Phase wird die Sterilität des Mileus durch Zugabe eines kleinen Thymolkristalls sichergestellt.

Der so erhaltene Brei wird mit Trichloressigsäure mit einer Endkonzeritration von 7,5% behandelt. Dann zentrifugiert man 30 Minuten lang den Brei in einer Jouan Typ 0 60 TS-Zentrifuge mit 45OO UpM und trennt das Überstehende ab₀

Dieses wird danach 18 Stunden lang bei 4-⁰C einer Dialyse

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gegen destilliertem Wasser unterworfen, wobei die Dialysenmembrane von einem Celluloseschlauch gebildet wird.

Das Dialysat wird nachfolgend über ein adsorbierendes Pulver filtriert, das unter der Bezeichnung "Celite" auf den Markt gebracht wird und man fällt nachfolgend das aktive" Produkt aus, indem man 2 1 absoluten Äthylalkohol unf 50 g Natrium- oder Kaliumacetat pro 1 Lösung zugibt.

Die Ausfällung wird nachfolgend durch drei aufeinander folgende Waschungen mit absolutem Alkohol, einem Alkohol-Äthergemisch und einem Äthe^gereinigt und dann der Trocknung unterworfen.

Alle die Verfahrensstufen, die soeben beschrieben wurden, werden bei einer Temperatur von maximal 4⁰C durchgeführt (ausgenommen selbstverständlich die enzymatische Digestion)

Das erhaltene aktive Produkt hat die -Form eines weißen Pulvers, das in Wasser und in. den physiologischen Serumlösungen löslich ist.

Man erhält 16 g Wirkstoff in Pulverform, das einer Ausbeute von 9}2 g pro kg Haut entspricht.

Das so erhaltene Pulver, das den Wirkstoff bildet, enthält ungefähr 26 mg Hexosamine pro g Mucopolysaccharide.

Nach einer anderen Ausführungsform kann man dasselbe Ver-

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fahren unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen durchführen, wenn man als Ausgangsmaterial 1881 g Nabelschnur von Rinderfötus verwendet.

Man erhält in diesem Falle 4·,25 g Wirkstoff in Pulverform, das 2,25 6 Wirkstoff pro kg Nabelschnur entspricht.

In diesem !alle enthält das Pulver 185 mg Hexosamine pro g Mucopolysaccharide.

2 - Herstellung der Mucopolysaccharidextrakte aus Haut und Nabelschnüren von Schafembryos

Man entnimmt die Häute und Nabelschnüre von Schafembryos ohne Rücksicht auf das Trächtigkeitsstadium und das Geschlecht. Man setzt in dieser Weise 500 g Hautdecke und 1650 g Nabelschnüre ein.

Diese unter sterilen Bedingungen entnommenen Produkte werden nachfolgend bei einer Temperatur von -20 C eingefroren, dann in einer Lösung von 15 1 balzlösung pro kg Gewebe, ohne vorausgehende Entlipoidierung, zerrieben, wobei die Lösung 9 g NaCl pro 1 Wasser enthält.

Man zentrifugiert den Brei 90 Minuten lang in einer Wifug Xl-Zentrifuge mit 9000 UpM und fällt das überstehende Produkt mit 2 1 Äthylalkohol und 50 g Natriumacetat pro 1 Lösung aus. Man läßt das Ganze 4 Tage lang bei 4-⁰C ruhen

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und sammelt die gebildete Ausfällung, die man durch aufeinander folgendes Waschen mit absolutem Alkohol, danach mit einem Gemisch von $0% Alkohol und 50% Äther und dann mit Äther allein reinigt.

Die Ausfällung wird danach einer Trocknung unterworfen, wodurch man ein weißes Pulver erhält, das in Wasser und physiologischem Serum löslich ist.

Alle diese unterschiedlichen Verfahrensphasen, die soeben beschrieben wurden,, werden bei einer Temperatur von höchstens 4⁰C vorgenommen.

Man erhält 2,20 g Wirkstoff im Falle der Entnahme von Fötushaut und 3,20 g Wirkstoff im Falle der Verwendung von Nabelschnüren.

3 - Herstellung der Mucopolysaccharid-Extrakte aus Häuten

von Kinderembryos

Man entnimmt unter aseptischen Bedingungen 150 g Haut von

4 bis 5 Monate alten Rinderembryos.

Diese Haut wird nach Einfrieren in Aceton zerrieben, dann bei -20⁰C getrocknet. Es erfolgt dann die Extraktion dieses Breis mit einer 0,14 M Natriumchloridlösung im Verhältnis von 5 ml Lösung pro g Brei, wobei man vier aufeinander

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BAD ORIGINAL

folgende Extraktionen unter denselben Bedingungen vornimmt, dann 24 Stunden bei einer Temperatur von 4 0 rührt. Man filtriert die erhaltene Lösung über Gaze, zentrifugiert dann eine Stunde lang mit einer Geschwindigkeit von 6000 UpM. Danach.gibt man eine 1,8 M Perchlorsäurelösung in Volumen entsprechend der Hälfte des SaIζextraktVolumens derart zu, daß die freien Proteine ausgefällt werden und sich in dem Überstehenden befinden. Nach 4 Minuten Stehenlassen bei 4⁰C filtriert man über einen Whatman-Filter Kr.4. Man gibt danach das so erhaltene klare FiItrat der Hälfte seines Volumens einer 5$igen Phosphowolframsäurelösung in 2 N Salzsäure zu. Man läßt eine Nacht lang ausfällen, wobei man die Temperatur von 4⁰C beibehält. Man zentrifugiert und sammelt die Ausfällung, die nacheinander dreimal mit Aceton gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet wird. Der Rückstand wird durch eine 0,1 M Natriuuibicarbonatlösung im Verhältnis von 3 rol/5 g frische Haut aufgenommen. Man gibt danach 1 mg/ 5 g frische Haut gelöstes Trypsin in 1 ml 0,001 N Salzsäure zu. Nach Zugabe eines kleinen Thymolkristalls führt man die Digestion ungefähr 18 Stunden bei 37⁰O durch.

Dann fällt man die Proteine, die sich in Kombination mit den Mucopolysacchariden befinden können, durch Zugabe von 3,1 H Trichloressigsäure mit 1 ml/g frische Haut aus. Man läßt eine Nacht bei 4⁰C ruhen und zentrifugiert dann Λ Stunde mit 4500 UpM. In dem Überstehenden fällt man die

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Mucopolysaccharide durch Zugabe von wasserfreiem Natriuinacetat (7>5 Millimol pro g Lösung) aus. Danach gibt man der Lösung das Zweifache ihres Volumens absoluten Alkohol zu und läßt eine Nacht bei 4⁰G ausflocken, zentrifugiert dann 30 Minuten bei 4-500 UpM und wäscht nacheinander die Ausfällung mit Alkohol, dann mit einem Gemisch von Alkohol und Äther, schließlich mit Äther, wonach man trocknet.

Man erhält auf diese Weise 135 mg Wirkstoff in Pulverform, entsprechend einer Ausbeute von ungefähr 0,5 g/kg frische Haut.

4 - Herstellung; der Mucopolysaccharid-Extrakte aus fiinderembr.yohäut en

Man entnimmt unter aseptischen Bedingungen Rinderembryohäute, wobei die Haut in Gegenwart von Aceton, dann von Äther fein zerrieben und danach der Brei getrocknet wird.

Man bringt dann das erhaltene Produkt in Suspension in 0,14 N Natriumchloridlösung, entsprechend 10 ml/g Trockenprodukt. Man rührt 48 Stunden lang bei 4⁰G, zentrifugiert dann 90 Minuten in der Kälte mit einer Geschwindigkeit von 9'0OO UpM. Danach wird das Überstehende gesammelt, wonach man 24 Stunden gegen fließendes Wasser dialysiert. Man destilliert unter reduziertem Druck bei 50 C, um die erhaltene Lösung auf ein Viertel des Anfangsvolumens -zu

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konzentrieren. Es erfolgt dann eine Lyophilisation, wonach man den Wirkstoff nach der Erfindung erhält.

In einer anderen Ausführungsform kann man in gleicher Weise den in der überstehenden Schicht enthaltenen Wirkstoff ausfällen, indem man eine 1#ige Getyl-Pyridiniumchloridlösung einführt und das Ganze 3 Stunden lang bei 38⁰O hält.

- Pharmacodynamische Untersuchung der Mucopolysaccharide der Erfindung

I - Wirkung auf isolierte Organe

a) Einwirkung auf den Ileum von Meerschweinchen:

-Wirkung im eigentlichen Sinne-

Die Mucopolysaccharide zeigen keinerlei Wirkung auf die glatte Faser bei Dosen von 0,025 mg bis 10 mg/70 ml.

-Wirkung gegenüber Acetylcholin-

Die Mucopolysaccharide bewirken weder Potenzieren noch Inhibieren der durch 25/Ug Acetylcholin hervorgerufenen Ileumkontraktion.

Die Versuchsdosen wechseln irn Bereich von 0,5 rog bis 5 70 ml und die Kontaktzeit zwischen 30 Sekunden und 3 Minu ten.

Die Einwirkung der Mucopolysaccharide wurde mit und ohne

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Waschung der Organe bestimmt.

-Wirkung gegenüber Histamin-

Dosen von Mucopolysacchariden im Bereich von 0,25 mg bis 40 mg weisen keinerlei Wirkung auf die durch 1/Ug Histamin hervorgerufene Ileumkontraktion auf,

b) Wirkung auf den Duodenum von Ratten:

Die Mucopolysaccharide hatten keinerlei Einwirkung auf die durch 25/Ug Acetylcholin hervorgerufene Kontraktion des Duodenums bei Ratten. Sie können jedoch eine leichte Dekontraktion nach dem Waschen hervorrufen.

II - Versuch bei lebenden Kaninchen

Untersucht wurde die Einwirkung der Mucopolysaccharide auf den Blutdruck, den Atemvorgang, das Elektrocardiogramm und die chemischen Mittler wie Adrenalin, Acetylcholin und Histamin beim Kaninchen.

Die Versuche wurden bei weißen Kaninchen beiderlei Geschlechts mit einem Durchschnittsgewicht von 3 kg.vorgenommen, die mit Hilfe einer 10#igen Urethanlösung im Verhältnis von 10 ml/kg, intravenös verabfolgt, betäubt wurden .

Der Blutdruck wird nach dem bluten Verfahren an der äußeren Karotis mit Hilfe einer Kanüle festgestellt, die

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mit einem Druckkopf und einer Registriervorrichtung versehen ist.

Die Kontrolle der Atmung erfolgt in ähnlicher Weise.

Das Elektrocardiogramm wird nach der EKG-Ableitung Dreieckschema Dp rechter Arm, linker Unterschenkel bestimmt.

Die mit Kanüle versehene äußere Vena saphena dient zu intravenösen Injektionen.

Die Mucopolysaccharidextrakte aus Nabelschnüren von Kälbern in Dosierungen von 4-, 8, 1Q, 2Q, 30, 40 und 50 mg/kg, intravenös verabfolgt, führen zu keiner Störung des normalen Druckverlaufs. Im Gegensatz dazu konnte unter der Wirkung wiederholter Dosen von Mucopolysacchariden eine Verzögerung der Atmungsamplitude beobachtet werden.,

Die Mucopolysaccharidextrakte aus Embryohaut von Kälbern, intravenös verabfolgt, führen in schwachen Dosen zu einer mäßigen und vorübergehenden hypotonischen Spitze. Bei einer Dosis von 30 mg/kg tritt eine plötzliche Hypotonie auf, deren Intensität selbst, bei größeren Dosen konstant, aber von kurzer Dauer ist.

Die Einwirkung auf die Atmung ist unterschiedlich, sie zeigt sich

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durch leichte Senkung der Amplitude bei schwachen Dosen und durch Zweiphasenwirkung bei erhöhten Dosen (50 mg/kg).

Die Mucopolysaccharidextrakte aus Embryonenhaut von Schafen weisen keine Einwirkung auf den arteriellen Druck bis zur Dosis von 1Q mg/kg auf. Bei 20 mg/kg beobachtet man eine Hypotonie von schwacher Intensität, die fortschreitend aber von ziemlich langer Dauer ist.

Man kann in gleicher Weise eine Erhöhung der Atmungsamplitude beobachten.

Bei Dosen von 10 bis 20 mg/kg haben die Mucopolysaccharide keine Wirkung auf die durch Adrenalin, Acetylcholin und Histamin verursachten Blutdruckerscheinungen.

Bei 25 nig/kg kann man bei Adrenalin eine leichte Erhöhung der hypotonischen Kurve des Adrenalins und eine Verlängerung der durch Acetylcholin verursachten Hypotonie beobachten. ·

Bei dem ElektrocandLogramm provozieren die Dosen von 10 und 20 mg/kg keine Änderung sowohl des Rhytmus als auch der Amplitude.

Bei 40 mg/kg treten gewisse Störungen auf. , Bei lokaler Anwendung der Mucopolysaccharide bei Kaninchen

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beobachtet man keine Änderung des Blutdrucks- und Atmungsablaufs.

Schließlich haben Vergleichsuntersuchungen zwischen den Mucopolysacchariden nach der Erfindung und Cortison gezeigt, daß diese keine Wirkung auf die prozentualen Zahlenwerte der Blutzellen und auf das Blutbild haben.

Bei dieser Untersuchung wurden zwei Gruppen männlicher Ratten von 250 g Körpergewicht acht Tage lang, die eine durch intraperitonale Injektion der Mucopolysaccharide nach der Erfindung mit einer Dosis von 200 mg/kg, die andere durch intraperitonale Injektion von Cortison mit derselben Dosis behandelt.

Die prozentualen Zahlenwerte und das Blutbild wurden am neunten Tag gegenüber einer Gruppe normaler Kontrollratten verglichen

Kontrolltiere Mucopolysaccharide Cortison

Blutzellen 16 500 16 520 8 600

Weiterhin ist die Verringerung der Anzahl der Eosinophilen und der Lymphocyten, wie die Erhöhung mehrkerniger Zellen

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nach der Behandlung mit Mucopolysaccharide^ gegenüber der mit Cortison bedeutet geringer ausgeprägt.

Die Mucopolysaccharide nach der Erfindung besitzen demgemäß keine oder nur geringe Sekundärwirkungen, die für ihre Verwendung schädlich sein würden.

II - Untersuchung der Wirksamkeit gegen Oellulitis der Mucopolysaccharide der Erfindung

Diese Untersuchungen wurden bei "Wistar"-Ratten vorgenommen, wobei eine gewisse Anzahl einer Ovarialexstirpation unterworfen wurden. Tatsächlich erscheint nach der Ovarialexstirpation bei Ratten eine Lipoid- und Wasserspeicherung, die der Erscheinungsform sehr analog ist, die bei Frauen vor ZellgewebsentZündungen (Oellulitis: im Französischen Schrifttum gebräuchliche Bezeichnung für verschiedene Krankheitsbilder des Gesichts, der unteren Extremitäten oder als Allgemeinzustand) auftritt. Diese Wirkung wird bei Ratten nach einer Zeitdauer im allgemeinen von 2 bis 3 Monaten nach der Ovarialexstirpation erhalten.

Der Versuch benötigt drei Gruppen von je 10 Tieren der selben Abstammung,

a) die erste Gruppe sind normale weibliche Kontrolltiere, die nicht Ovarien-exstirpiert sind,

b) die zweite Gruppe sind Ovarien-exstirpierte weibliche

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Kontrolltiere,

c) bei der dritten Gruppe wird der Wirkstoff angewendet, wobei die Ratten dieser Gruppe in gleicher Weise Ovarienexstirpiert sind.

Alle Ratten der Gruppen b) und c) wurden am gleichen Tag Ovarien-exstirpiert und bei dem hier berichteten Versuch wurde eine analoge Wirkung, wie die der Cellulitis bei allen Ratten zweieinhalb Monate nach der Ovarialexstirpation beobachtet.

Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt:

- die erste Gruppe wurde keiner Behandlung unterworfen,

- die zweite Gruppe wurde 12 Tage täglich mit 0,5 ml destilliertem Wasser pro Tier behandelt

- und die dritte Gruppe wurde in gleicher Weise täglich 12 Tage lang mit 0,5 ml Wirkstoff pro Tier behandelt, wobei der Wirkstoff eine Extraktlösung von Embryoorganen

in destilliertem Wasser war, die nach dem oben beschriebenen Herstellungsverfahren Nr. 1 erhalten wurde und deren Konzentration 2,5g Trockenextrakt/100 ml Lösung betrug.

Bei der zweiten und dritten Gruppe erfolgt die Verabfolgung auf einer Rückenfläche von ungefähr 3 cm , die vorher geschoren wurde.

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Am Tag nach der letzten Behandlung.wurden alle Batten gewogen und getötet.

Die den Anwendungsbereichen entsprechenden Hautentnahmen werden hinsichtlich Wasser- und Lipoidgewicht bestimmt, wobei.die nachfolgenden mittleren Ergebnisse erhalten wurden

Zustand der Tiere	Änderung der Ge wichte	Wasserge halt	Lipoidge- halt
nicht Ovarien- exstirpiert	+ 9g	290	136
Ovarien-exstirpiert (Kontrolle)	+ 9 g	329	156
Ovari en-exst irpiert behandelt	+ 5g	285	110

Dieser Versuch wurde mit denselben Bedingungen mit einer anderen Tiergruppe wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden bestätigt.

Im Hinblick auf die Versuchsergebnisse scheint es, daß die Aufbringung von embryonalen Orgapextrakten auf Rattenhaut eine Verringerung der Lipoidspeicherung der Hautteile und ebenso eine Verringerung ihrer Wasserretention herbeiführt.

Man kann weiterhin feststellen, daß es sich nicht um eine 0098387 2081 -23-

Dehydratisierung der Haut handelt, sondern um eine Regulierungswirkung des Wassergehalts, weil der Wassergehalt der normalen nicht behandelten und der behandelten Ovarienestirpierten Ratten erkennbar beeinander liegt.·

III - Untersuchung von. Erythemen durch ultraviolette

Strahlung

20 Kaninchen "Alinos Bouscat" mit einem Gewicht von 2,5 bis 3 kg wurden im Bereich der Brustbein-Bauchgegend zunächst auf 1/10 mm rasiert, dann 15 Minuten lang mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt, wobei die Bestrahlung mit einer Lampe von 500 Watb vorgenommen wurde, die in einem Abstand von 35 cm von der Tierhaut entfernt war und die Bestrahlung

ρ
selbst auf Flächen von 3 cm vorgenommen wurde, wobei jede Fläche durch eine Maske bestimmt wurde. Nach Ablauf von 48 Stunden nach den Bestrahlungen wendet man bei 10 Kaninchen an den durch diese Strahlungen geschädigten Stellen 2 ml Wirkstofflösung, wobei diese aus embryonalen Gewebeextrakten besteht, die nach der oben beschriebenen Herstellungsform Nr. 1 erhalten wurde, mit einer Konzentration von 2%- Trockenextrakt an.

Zur Vernarbung sind bei den mit diesen Zubereitungen behandelten Tieren 4 bis 7 Tage notwendig, während die Kontrolltiere 10 bis 15.Tage zur Narbenbildung brauchen.

Aus dem Versuch ist zu entnehmen, daß die erfindungsgemäßen 009838/2081

- 24 Wirkstoffe die Heilungszeit um ungefähr 50$ verringern.

Ähnliche Ergebnisse werden mit Zubereitungen in Salbenform erhalten, wobei diese die nachfolgenden Anteile enthalten:

Paraffinöl 30 g

Stearinsäure " 3 g

Triäthanolamin · 0,2 g

Tween 60 (Sorbitan-oxäthyliertes Mono-

stearat) ' 2g·

Arlacel 165 (selbst emulgierbares

Glycerinmonostearat) 6 g

Bactericid 0,3 g

Extrakte aus embryonalen Geweben, die nach dem oben beschriebenen Herstellungs- ' verfahren Nr. 1 erhalten wurden 1 g

Wasser auf 100 g

IV - Untersuchung der Entzündungs-hemmenden bzw. Entzündungaverhindernden Wirksamkeit der Zubereitungen der Erfindung

1 - Die Entzündungs-hemmende Wirksamkeit der Mucopolysaccharide enthaltenden Zubereitungen'der Erfindung wurde mit Hilfe eines experimentiellen Kaolinödems untersucht.

Zu diesem Zweck wurden weibliche Ratten von 150 g aus derselben Züchtung in Gruppen von jeweils 10 Tieren aufgeteilt.

Das Ödem wird durch Injektion von 0,1 ml einer sterilen

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buspension von 10$ Kaolin unter die t>ohle der linken.hinteren Pfote des Tieres provoziert.

Bei jedem Versuch dient die erste Tiergruppe als Kontrollgruppe. Der Unterschied zwischen den Gewichten der linken hinteren Pfote von jedem Tier, bei der man das Ödem provoziert hat, und der hinteren rechten Pfote, die intakt ist, dient als Maßstab der Intensität des Ödems.

Die anderen Tiergruppen werden vorbeugenden bzw. heilenden Behandlungen einerseits mittels Mucopolysacchariden nach der Erfindung und andererseits mittels Cortison unterworfen.

Diese verschiedenen Behandlungen haben eine Verringerung des in der linken hinteren Pfote des Tiers provozierten Ödems zur Folge.

Die Verringerung in % des Gewichtsunterschieds zwischen der linken hinteren Pfote und der rechten hinteren Pfote der Tiere von jeder Gruppe im Verhältnis zum Gewichtsunterschied zwischen der linken hinteren Pfote und der rechten hinteren Pfote der Kontrolltiere ermöglicht die Wirksamkeit der verschiedenen geprüften Behandlungen zu messen.

Die Entzündungs-hemmende Wirksamkeit wird 3 btunden nach der örtlichen Kaolininjektion gemessen und das Tier durch

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Ausbluten getötet. Man entfernt dann die beiden hinteren Pfoten und der Gewichtsunterschied zwischen den beiden Pfoten ist ein Maßstab für die Intensität des Ödems.

Die Behandlung mit Mucopolysacchariden der Erfindung kann zu einem.verschiedenen Zeitpunkt im Hinblick auf die Kaolininjektion erfolgen, wobei man die heilende oder vorbeugende Wirkung beobachten kann.

Die Mucopolysaccharidlösungen der Erfindung werden im Verhältnis von 1 ml/100 g Körpergewicht injiziert.

Im Falle von Hautverabfolgungen erfolgen diese mit Hilfe einer Lösung der Mucopolysaccharide, deren Konzentration 50 mg pro ml beträgt. Bei Jeder Anwendung empfängt das Tier 0,5 ml dieser Lösung.

In der Mehrzahl der Fälle war die Entzündungs-verhütende bzw. -hemmende Wirksamkeit der Mucopolysaccharide der Erfindung der des Cortisons gleichwertig.

A. Mucopolysaccharidextrakte von Kälbern

Die Mucopolysaccharide der Erfindung waren im einen Fall Extrakte von Embryonenhaut und im anderen von Nabelschnüren.

a) vorbeugende Behandlung:

Die Mucopolysaccharide werden in drei Dosen von 200 mg/kg in 24 ,Stunden vor der örtlichen Kaolininjektion verabfolgt,

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wobei die erste Dosis 24 Stunden vor der Behandlung mit Kaolin gegeben wird. Die zweite und dritte Dosis werden bzw. 1 Stunde vor dem Kaolin verabfolgt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen:

200 mg/kg -Embryonenhaut

intraperi- - Nabelschnur

tonal ' - Cortison 59$

200 mg/kg - Embryonenhaut
subcutan -Cortison

- 0,5 ml - Embryonenhaut

Hautbe- - Nabelschnur 20#

handlung

b) Heilbehandlung:

Die Tiere erhielten drei Dosen in 200 mg/kg Extrakt von Mucopolysaöchariden nach der Erfindung, eine Stunde, 18 Stunden und 23 Stunden nach der Kaolinanwendung.

Die Tiere werden 1 Stunde nach der dritten Dosis getötet. Die nachfolgenden Ergebnisse wurden erhalten:

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200 mg/kg - Embryonenhaut
subcutan - Cortison

0,5 ml Haut- - Embryonenhaut
behandlung - Cortison

B - Mucopolysaccharidextrakte von Hammel

a) Kurzzeitige vorbeugende Behandlung durch intraperitonale Injektion verschiedener Dosen.

Wie bei den vorausgehenden Untersuchungen wurde die Wirksamkeit der Mucopolysaccharide der Erfindung mit der. von Cortison verglichen und die beobachteten Ergebnisse nachfolgend zusammengefaßt:

Dosis	Embryonenhaut	Cortison
5 mg	Λ CJOL I OyO	. 8%
25 mg		21%
50 mg		29%
100 mg
200 mg 8	6. 78%,* 87*	4-5$, 51#, 28#
⁺intraperitonale Injektion

b) Kurzzeitige vorbeugende Behandlung durch lokale Anwen-009838/2081 -29-

Um die Wirksamkeit der Mucopolysaccharide nach der Erfindung zu vergleichen, wurde eine Hydrocortxsonsalbe verwendet, während die Mucopolysaccharide in einer gepufferten Lösung gelöst wurden.

Nachfolgende Ergebnisse wurden erhalten:

- 0,5 ml - Erabryohaut

- 500 mg Pomade

mit 2,5# - Cortison

Die Entzündungs-hemmende Wirksamkeit wurde ebenso weiterhin mit dem experimentiellen Kaolinödem, jedoch bei Hatten, denen die Nebennieren entfernt wurden, untersucht.

Unter Versuchsbedingungen, die den vorausgehenden entsprachen, fand sich die Wirkung der Mucopolysaccharide nach der Erfindung bei -Ratten, denen die Nebennieren entfernt wurden, unverändert wieder. Die Mucopolysaccharide wirken also nicht über die Nebennieren im Sinne einer Ereigabe von Cortison. Ihre Wirkung ist davon völlig unabhängig.

2 - Die Entzündungs-hemmende bzw. -verhütende Wirksamkeit der Mucopolysaccharide der Erfindung wurde weiterhin

009838/2 081 ~³°"

bei anderen experimentiellen Ödemen untersucht.

a) Experimentielles Ödem mit Bradykinin

Dieses Ödem wurde durch Injektion unter die Fußsohle von 0,1 ml einer Lösung mit 0,1 mg/ml synthetischem Bradykinin ("calbiochem") provoziert. Bei diesem Versuch wurde eine vorbeugende Behandlung 1 Stunde vorher durchgeführt und die Tiere wurden 15 Minuten nach dem Auftreten des Ödems getötet,

- 200 mg/kg -Embryohaut

intraperitonal - Cortison

b) Experimentielles Ödem mit Carraghenin

Das experimentielle Ödem mit Carraghenin manifestiert sich den rheumatischen Krankheiten am ähnlichsten. Dieses Ödem wird unter ähnlichen Bedingungen provoziert, wie das mit Hilfe von Kaolin erhaltene, Man gibt eine Injektion von 0,1 ml 2#iger Carragheninlösung unter die Sohle des Tieres.

- 200 mg/kg - Embryohaut 68$

intraperitonal · - Cortison

V - Untersuchung hinsichtlich der Kapillardurchlässigkeit 'der Zubereitungen der Erfindung

Für diesen Zweck werden die Ratten am Tag vor dem Versuch 009838/2081

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an ihrer Rückenpartie geschoren. Man verabfolgt dann eine intravenöse Injektion von 1 ml 1#igera "Prontamine Sky Blue". 5 Minuten nach dieser Injektion erhalten die Ratten auf die linke Seite drei intradermale Injektionen von 0,1 ml Histaminlösung von 1 mg/ml . Man stellt dann die Zeit bis zum Auftreten des Farbstoffs in der Höhe der intradermalen Papula fest. Dieselben Ratten erhalten dann mittels intraperitonaler Injektion die Mucopolysaccharide der Erfindung in einer Dosis von 200 mg/kg. Nach 30 Minuten erfährt die rechte Seite der Ratten die gleiche Behandlung wie die linke -Seite. Man stellt dann wie im vorausgehenden Fall die Zeiten des Farbauftretens fest.

Zeit des linke Seite rechte Seite

(Kontrolle) (behandelt) Farbauftretens

5 i

Die Mucopolysaccharide haben demgemäß eine deutliche Einwirkung auf die kapillare Durchlässigkeit.

VI - Untersuchung der Narben-bildenden Wirksamkeit bei Wunden, deren Heilung experimentiell durch Cortison gestört wird.

Man bringt Kaninchen an den Ohren Epithelgewebewunden mittels einer Lochzange bei. Die Narbenbildung wird durch tägliche intraperitonale Injektion einer Cortisonlösung

009838/20 81 ~³²~

25 mg/ml im Verhältnis von 25 mg/kg Körpergewicht während 4 Tagen verzögert.

Die tägliche Anwendung 15 Tage lang einer Lösung der Mucopolysaccharide der Erfindung mit einer Konzentration von 50 mg/ml im Verhältnis von 0,1 ml pro Wunde, bringt die Vernarbungskurve, besonders nach dem zehnten Tag, zum normalen Ablauf.

Bei einer Injektion der Mucopolysaccharide mittels intraperitonaler Verabfolgung von 25 mg/kg wird die Vernarbungskurve nach dem vierten Tag zum Normalen zurückgeführt.

Beispiele der Zubereitungen der Erfindung.

Beispiel 1

Man stellt eine zur Injektion am Entzündungsort bestimmte Lösung her, wobei man im Augenblick der Verwendung den Inhalt der nachfolgenden beiden Ampullen mischt:

1. Ampulle: 5 mg oder 10 mg Mucopolysaccharide, die ihrerseits nach dem Herstellungsverfahren 1 erhalten wurden.

2. Ampulle: 5 ml steriles, kein Fieber erzeugendes, auf pH 7 gepuffertes Lösungsmittel*

Die Zusammensetzung dieses Lösungsmittels ist,pro 1000 ml Wasser, 1 g Monokaliumphosphat, 1 g Natriumbicarbonat und

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9 g Natriumchlorid«

25	S
8	S
10	S
ο,	2 S
2	S
100	S

Beispiel 2

Man stellt einen Narben-bildenden Aerosolschaum her, wobei man im Aerosolbehälter die nachfolgenden Bestandteile

mischt:

Vernetzte Polyacrylsäure, auf den Markt gebracht unter der Bezeichnung
"OARBOPQL- 934"

Magnesxumathoxylaurylsulfat Glycerin Ammoniak

Mucopolysaccharide, hergestellt nach dem Verfahren Nr. 1

Wasser auf

Man nimmt 88 g der oben beschriebenen Lösung, wobei man sie in einem Aerosolbehälter mit 12 g Difluordichlormethan konditioniert.

Beispiel 3

Man stellt eine kräftig wirkende Creme her, die gegen Kupferausschlag (Kupferose) und Krampfadern, wobei man folgende Bestandteile mischt, wirkt:

Mucopolysaccharide, die nach dem Herstellungsverfahren 1 erhalten wurden 2 g

oxäthylierter Cetylstearylalkohol 7 S

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Siliconöl 1 g

Diathylenglycolstearat 6g

Methylparahydroxybenzoat-Konservierungsmittel, auf den Markt gebracht unter der Bezeichnung "NIPAGINE" 0,10 g

Propylparahydroxybenzoat-Konservierungsmittel, auf den Markt gebracht unter der Bezeichnung "JpPASOL" 0,10 g

Wasser auf 100 ecm

Beispiel 4

Man stellt ein eindringendes Gel gegen Cellulitis aus den nachfolgenden Bestandteilen her:

lyophilisierter Extrakt nach Herstellungsverfahren 1 3 g

Parfüm in ausreichender Menge

Gel Garbopol pH 8 auf 1000 g

Das Gel Garbopol wird in der Weise hergestellt, daß man Carbopol 94-0 im Verhältnis von 1 g auf 100 ml destilliertem Wasser bei 70°C löst, bis man ein homogenes Gel erhält. Nach Abkühlen wird das Gel mit einer Ammoniaklösung auf pH 8 gebracht, wobei man es mit dem Mörser trituriert, um es gut zu homogenisieren und dann wird Natriummerthiolat Teile/10 000 zugegeben.

-35-00 983 8/2081

Claims

Neue Patentansprüche

1. Kosmetische bzw. pharmazeutische Zubereitung, die zur lokalen Behandlung, insbesondere von Cellulitis, Palten, Kupferausschlag, Sonnenbrand und Hitzeblattern geeignet ist bzw. antirheumatische, entzündungsverhütende bzw. entzündungshemmende, Wunden-heilende, d.h. Vernarbung- fördernde , Hautgewebe-regenerierende Arzneizubereitung, die auch gegen Krampfadern, Kupferausschlag und Verbrennungen wirksam ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem geeigneten kosmetischen Träger sterile

_x/x

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Extrakte enthält, die durch Extraktion mittels einer ionenhaltigen Lösung von Hautdecken und/oder den Nabelschnurgeweben von Rinder- oder Schafsföten erhalten wurden.

2. Kosmetische Zubereitung nach Anspruch .1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwischen 0,5 und 5% Wirkstoff enthält.

3. Gegen Cellulitis wirkende kosmetische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Enzyme mit Wirkung auf den Metabolismus der Lipoide und Mucopolysaccharide enthält.

4. Kosmetische Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Hyaluronidasen, Lipasen und/oder Thiomucasen sind.

5. Kosmetische Zubereitung nach einem der Ansprüche 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die En-zyme in einer Konzentration von 1 bis 5 Gew.-% vorhanden sind.

6. Kosmetische Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5j dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Lotion, eines Gels oder einer Creme vorliegt.

00 983 8/208 1 - "*

7. Kosmetische Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie kosmetische Adjuvantien, wie Farbstoffe, Parfüme oder penötrationsfordernde Mittel enthält.

8. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer durch die Haut zu verabfolgenden Zubereitung vorliegt.

9. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer durch intramuskuläre Injektion zu verabfolgenden Zubereitung vorliegt.

10. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Creme oder eines Gels vorliegt.

11. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 sowie 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Konzentration von 0,5 bis 5 Gew.-% Mucopolysaccharide enthält.

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