DE1929314A1

DE1929314A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Bekaempfen schaedlicher Organismen in Substraten mit Hilfe bakterieller Parasiten und anderer Mittel

Info

Publication number: DE1929314A1
Application number: DE19691929314
Authority: DE
Inventors: Ricard Dr Jean Jacques Louis
Original assignee: RICARD DR JEAN JACQUES LOUIS
Current assignee: RICARD DR JEAN JACQUES LOUIS
Priority date: 1969-04-29
Filing date: 1969-06-10
Publication date: 1970-12-17
Also published as: SE373526B; SE373526C; FR2044750A1; DE1965970A1; FR2158065A1; GB1274291A; GB1274292A; FR2158065B1; CA963387A; FR2044750B1

Description

Verfahren und Vorrichtungen zum Bekämpfen schädlicher Organismen in Substraten mit Hilfe bakterieller Parasiten und

anderer Mittel

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Vorrichtungen zum Einimpfen akao· und verwandter Mikroorganismen zur vorbeugenden oder heilenden Behandlung von Holzstrukturen wie Nutzpfählen und Bäumen, beispielsweise Norwegischer Monte (Eioea abiea) oder Kiefern (Pinus silvestris) in form von Sämlingen, Jungpflanzen oder fertigen Bäumen.

Diese -a bestehen aus einer oder mehreren

Spezien wie Trichoderma album (-T. polysporum), Trichoderma lignorum (= T.viride), Gliooladium roseum, Scytalidium sp, Oeratooystis piceae, Penioillium rubrura, Ϊ. vermiculatum, Ooryne sarcoides, Aspergillus sp, Ghaetoaium βρ, Pusarium sp_f Gephalosporium sp, Geptrichum sp, Leptosphaeria, Mycorriiizal-Pilzen ( mit unterirdischem, fadenartigen Myzelen) Boletus bovinua, Retinooyolus abietis, Pythium sp, Helminthoeporium aativum, Bhino trio hum macrosporum, Triohtheoium roseuni| ' 001851/2100

Galcarisporium parasiticun, Gronatobotrys simplex, Phj"tophthora parasitica, Sei erouium rolfsii, Chaetor.:ium globosum, Pusarium roaeum sp, ceraalis, Cryptosporiop3is, Cephalosporins, charti ;ola, Vertieillium, Pullularia pullulans, Pul^ulariu. iila^irium, Pythium debaryaiiuia, Tuberculina maxima, Oicir-nobolus ce^ti, Penicillium patulura, P. nigricans, Oeratocys*;is plurin^nuluta, Penicillium crusta;eun, Hueor sp, Mortierella ερ, 1.1 e lane ο ni αν. sr., Honilia sitophila, Rhiaopua nigricana, Pyrnena sp, LidymeIIa exitialis, Spicaria sp, Phoma sp, Mucor ramannianus, Hypoicylon punctualatum, Suilxus granulatus, *Rus3ula, Beauvaria bassiann, Paecilornyces farinosus, Lentinus lepidens, 0eratocy3tia fin-briata, Actinorayceten v/ie Hicroriondspora ^lobosa^cyliudrpsporus und Streptonyces sp, Bakterien einschließlich Serratia marcescens, Bacillus suoxilis, B. polymyxa, Brivinia sp, Pseumonon.-it; sp und Achroiaobacteria sp.

Die Forschung auf dem 3ebiet der biologischen Untersuchungsmethoden hat in den letzten Jahren 3teigende Bedeutung erlangt. Bs war notwendig, anstelle der hergebrachten verfahrän neue Methoden einzusetzen, die die Verwendung speziell ausgewählter Chemikalien mit sich bringen, die lästige, lang zurückbleibende Rückstände bilden, wie dies in dem Buch von Bachel Oarson "Silent Spring¹* beschrieben ist» Ein anderes Ziel der biologischen Untersuchung ist es, wirtschaftlich durchführbare lösungen für bestimmte Probleme zu geben, v/ie z.B. Schaden, die durch Ebmes annosus verursacht sind, einer Pilzkrankheit, die zahlreiche Arten von Waldbäumen befällt.

Bei der Durchforschung biologischer Untersuchungsverfahren sind zahlreiche Versuche gemacht worden, die bakteriologische Umwelt des Wurzelgebiet4s und andere Bestandteile der äußeren Umgebung der Pflanzen, insbesondere innerhalb des Bodens zu beeinflussen. Die meisten dieser Versuche öind fehlgeschlagen, vielfach infolge der außerordentlichen Verschiedenheit der chemischen und. biologischen laktoren» die in einem solchen System vorhanden sind, das infolgedessen ein erhebliches Pufferungsvermögen be-

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sitzt. Einige wenige, merkliche Erfolge sind erzielt worden bei der Beeinflussung der durch Phymatotrichum erzeugten Wurzelf ;.ule von BauV>lle, der durch Ophiobolus erzeugten Wurzelr.uie von Weizen, dem Streptoiayces-Schorf von Kartoffeln der durch Fusariun erzeugten Y/urzelfäule von Bohnen, der durch 3cl-.ro tiur. erzeugten Faule von Erdnüssen und der durch Fomes ers-.ⁱu-ten Wurzelfäule des Kautschukbaums in Halaya.

Ein neuer Fortschritt in der biologischen Beeinflussung wurde von Erfinder erzielt, insbesondere durch Verwendung von bakteir/jaUiiiaierenden^. ^ieeer Gedanke wurde unter Zur

natürlichen VSiachstujusbedingungen im freien in die Praxis tiberfüiirt. Dicüe zeigten die Wirksankeit im Hinblick auf die traditionellen Kriterien des Zusammenhangs zwischen Ursache und Wir :u!i_L: im Bereich der Mikrobiologie und verwandter Gebiete ent-\\.rech*md den Kochschen Forderungen.

I: .nun; sierandeira sind Uikroorganismen, die im Beraich - i:a Gegensatz zu dem äußeren Bereich der Umgebung_f beispielsweise dem Brdboden - von höheren Pflanzen und fieren oder uiderer: Substraten ohne Kachteil existieren können. Das Auftreten dieser Mikroorganismen schafft einen Schutz £ür den jeweiligen Wirt gegenüber bestimmten schädlichen Organismen.

Frühere Patente, die auf diesem oder verwandtem Gebiet erteilt oder angemeldet sind, stellen die amerikanischen Patente 5 255 095 und 3 424 655 von Jacques 1. Ricard, dem Erfinder der vorliegenden Anmeldung darf ferner eine amerikanische An-r meldung "Verfahren zum Holzschutz und Antibiotika" von Jaoquee L. Ricard und Walter B. Bollen, die im Samen der Research Corporation von New York City für das Hinisterium für fortgeschrittene Erziehung des Staates Oregon im Januar 1967 angemeldet iet| ferner eine amerikanische Anmeldung "Verfahren ziur Verwendung iununisierender *a*a3f%e»" von Jacques 1. Sicard, dem Erfinder £ der vorliegenden Anmeldung, die im Juni 196? eingereicht worden*¹" ist; weiterhin eine französische Patentanmeldung "Verfahren zur

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SAO OR(GINAL

Gewinnung und ihre Verwendung zur Be- *"*' känpfung von Mikroben, Insekten und anderen schädlichen Organismenauf Pflanzen, Tieren oder Menschen, sowie ihre Produkte, Bestandteile und Abkömmlinge und ihre synthetischen Substrate" Äktenz· Hr. 119 895j schließlich eine amerikanische Anmeldung mit dem litel "Extruded Bark Pellets" von Jacques L. Bicard und Baynond A. Currier vom 10. Februar 1969.

Die vorliegende neue Anmeldung beschreibt Verbesserungen gegenüber diesen früheren Anmeldungen und bezieht sich insbesondere auf Verfahren und Einrichtungen zum Einimpfen anderer Mikroorganismen anstelle von Scytalidium sp. Diese» letztgenannte immunisierende hat bestimmte Nachteile, insbesondere im Hinblick auf eine langsame Wachstumsgeschwindigkeit, Unbeständigkeit in der antagonistischen Wirkung und mangelnde Wirksamkeit gegenüber Insekten. Diese Nachteile können durch Verwendung anderer Mikroorganismen beseitigt werden. Gegenstand , _: der vorliegenden Erfindung ist es, diese Nachteile zu über- . winden und Verfahren und Einrichtungen zur Bekämpfung schädlicher Organismen in wirksamer Weise zu schaffen.

Das Verfahren zur Bekämpfung schädlicher Organismen in oder auf einem zu schützenden Substrat gemäß vorliegender Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß in oder auf dieses Substrat ein ttgaagaair* eingebracht, bzw. aufgebracht wird, der eine heilende und/oder eine vorbeugende Wirkung im Hinblick auf die Tätigkeit der schädlichen Organismen ausübt.

Dieser , der eine heilende und/oder vorbeugende Wirkung besitzt, kann aus den Spezien ausgewählt werden, die in der Einleitung angegeben Bind· ■ j

Dad Verfahren der Erfindung kann dadurch verbeseert werdtn, . ' daß man eine oder mehrere der folgenden Komponenten e^t ein- '·*,«,

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a) einen Mikroorganismus, dessen Stoffwechselprodukte oder physiologisch ähnliche Substanzen einen Anreiz für die Bildung von Antibiotika in mindestens einem der vorgenannten Mikroorganismen, bewirken,

b) einen Mikroorganismus, der eine synergistische Wirkung ausübt, indem er in erster linie solche Substanzen umformt oder eliminiert, die die Entwicklung eines nützlichen a9 hindern,

c) ein bakterielles Stoffwechselprodukt, das in der lage ist, die antagonistische Wirksamkeit in einem oder mehreren der

zu stimulieren,

d) eine chemische Yerbindung, die in der Lage ist, die antagonistische Wirksamkeit in einem oder mehrerer der bakteriellen Parasiten zu stimulieren.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren der Herstellung antibiotischer Stoffe oder anderer nützlicher Stoffwechselprodukte zur Verwendung bei der Durchführung des o.a. Verfahrens, das in der folgenden Beschreibung erläutert wird, und auf antibiotisehe Substanzen oder andere nützliche Stoffwechselprodukte, die bei einem solchen Verfahren erhalten sind.

Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Impfvorrichtung zur Erleichterung der Anwendung des Verfahrens der Erfindung unter natürlichen Bedingungen im Preien. Diese Vorrichtung besteht aus einem länglichen Stäbchen aus Holz, Kunststoff oder einem anderen geeigneten Material, das in der lage ist, in das zu schützende Substrat hineingetrieben zu werden, und das mit den gewünschten bakteriellen Parasiten imprägniert ist, der heilende und/oder vorbeugende Wirkungen im Hinblick auf die Tätigkeit der schädlichen Mikroorganismen besitzt,

Die Erfindung wird im folgenden näner unter Bezugnahme auf die - beiliegenden Zeichnungen beschrieben·

OFHGINAL INSPEGTgD

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Fig. 1 erläutert die Herstellung einer Impfsubstanz und einer Impfvorrichtung,

KLg. 2, 3 und 4 sind perspektivische Seitenansichten verschiedener Ausführungsformen einer Impfvorrichtung (eines Stäbchens) gemäß der Erfindung·

Das grundlegende Verfahren zur Herstellung von Impfstäbchen besteht in folgendem»

Beispiel 1

Impfstäbchen für Gebrauchspfähle atm Douglas-Fichten, die durch Poria carbonica infiziert sind und sich beispielsweise im Beginn der Fäulnis befinden. Diese Stäbchen können aus Birkenzapfen hergestellt werden. Das Material kann nach 3einem hohen Xylan-Gehalt ausgewählt werden, der eine bevorzugte Energiequelle für Scytalidiun sp. istj außerdem ist es härter als die Douglas-Fiahten-Pfähle. Die Härte ist erforderlich für die beschriebene rasche Impfung.

Die wichtigsten Uaßnahmen zur praktischen Kultur sind in Hg, der Zeichnung beschrieben. Eine Kultur 1 von Seytalidiun sp> die frisch aus Kernholz eines Douglas-Fichten-Pfahls isoliert ist, läßt man auf einem Agar-Nährboden, der 2_f5j6 Malzextrakt enthält, wachsen. Ausgewählte Stämme mit stark antagonistischer Wirkung sind gekennzeichnet durch die Produktion eines gelben wasserlöslichen Pigments und die Fähigkeit, auch gegenüber konkurrierenden Kolonien von Poria carbonica und Fomes annosus zu wachsen. Um die Reinheit und Homogenität der Kultur sicherzustellen, wird ein einzelner gelber Myu *1-Faden aus der Kolonie in ein schräg liegendes Heagenzrohr 5, das mit einem Malzextrakt-Agar gefüllt ist, übertragen und etwa zwei TToehen lang bei Zimmertemperatur bebrütet. ·

Wenn das Agar mit Pilzmyzel bedeckt ist, wird es unter aseptischen Bedingungen mit einem Spatel aus rostfreiem Stahl oder einem ähnlichen Instrument in einzelne Bruchstücke zerteilt

ur:d in-etwa 150 ccta einer sterilen 2#Lgen Malznährlcsung überführt, die sich in einer 3ü0 ecm fassenden vorschriftsmäßigen Flauehe oder in einem 250 ccn fassenden Erlenmeyerkolben 7 befindet. Han läßt die Kultur etv/a drei Wochen lang, ohne sie zu aohütte'n, wachsen, dann überträgt man sie in etwa IX)OO ccn einer frischen Ifalznährlösuhg, die sich in einer 2000 ecm fassender. Fernbach-Gärflasche oder in einem 2000 ecm fassenden Erlenmeyerkoiben 9 befindet! hi-r züchtet man sie etwa drei Wochen lang bei Zinnertenperatur ohne Schütteln weiter. Das Mysei wird dann in ein Hischgefäß überführt und in etwa 500 ecm einer frischen sterilen 2^igen Ilalznährlösung wieder suspendiert. Das Myzel wird gerade so weit zerkleinert_t daß die Myzelinasse in Bruchteile unter 1 cn Länge aufgeteilt wird. Die Sus- : eiiision wird niit frischer steriler Kalznilhrlosung in Verhältnis 1 t 10 verdünnt und über sterile Abschnitte von Birkenaairfei; 11 gegossen, die etwa 100 mm lang sind und einen Durchmesser von etwa 5 rja haben. Diese Zapfen werden vollständig von der Suspension von Scyt J.idiun sp (Ρϊ-Stanm) bedeckt und bei Sinn.rtemperatur drei Wochen lang bebrütet. Die Nährlösung wird dann abgegossen und die Zapfen werden für eine weitere Zeitdauer bebrütet oder so lange, bis das Holz vollständig mit Ky ζ si !fäden vjn Scytaiidium sp (FY-Stamm) durchzogen ist·

Aus den Behältern läßt man die Feuchtigkeit verdampfen, da die Uyselfaden den Gegenden hoher Feuchtigkeit innerhalb jedes Zapfens zu foJgen scheinen. Hit fortschreitender Trocknung erscheint das gelbe Pigment, das typisch für die aktiven ScytalidiuTiStänaae ist, auf dem Holz, was eine erfolgreiche Durchtränlcung des Zapfenabschnittes durch die Pilzkultur und die Bildung von antibiotische» Material anzeigt. Obwohl die antibiotische Substanz farblos sein mag, scheint ihr Auftreten alt der BiI-. dung des wasserlöslichen gelben Pigments durch, das My«el zusammenzufallen.

Nach dem Bebrüt en. wird jeder Abschnitt dadurch, getestet« daß man auf aseptischem Wege einen etwa 1 ca langen, 0*5 ein breiten

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und* 0,1 biß 0,2 6m dicken Span abnimmt. Dieser Span wird am Bande einer llalzextrakt-Agarplatte eingesetzt· Im Zentrum der derselben Platte wird ein Impfstoff aus P. carbonica in Form eines Agarwürfels von etwa 0,5 cm Kantenlönge angebracht, der mit einem Myzel des die Holzfäule Verursachenden Pilzes bedeckt iet. Wenn der Span in wirksamer Weise mit Scytalidium sp (Fi-Stamm) durchtränkt ist, breitet sich auf dem Agar rund um den Span eine Kolonie dieses Pilzes aus, wobei sich das typische gelbe Pigment und antagonistische Wirkungen gegenüber P*carbonica zeigt. Die Abschnitte, die sich als zufriedenstellend erwiesen haben, werden dann unter Takuum bei Temperaturen, die 38° nicht übersteigen sollen, bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der Impfstoff wird dann in einen sterilen Behälter, beispielsweise ein Bohr aus Kunststoff gebracht, um ihn an die Impfstelle zu bringen· Die Abschnitte 13 der Birkenzapfen werden an dem einen Ende mit einer Pfeilspitze 15 aus rostfreiem Stahl verstärkt.

Die Birkenetäb&hen werden dann in die Pfähle mit Hilfe eines Hilti-Schießgerätes DX 100 L unter Verwendung einer mittleren Treibladung oder in ähnlicher Weise hineingeschossen·

Beispiel 2

Das Beispiel beschreibt komplexe Imfstäbchen zum Impfen unter ' Verwendung verschiedener Mikroorganismen· Das Stäbchen ist aus zwei Teilen zusammengesetzt· Der eine Teil 21 ist ein zapfenfärmiger Abschnitt, wie er is Beispiel 1 beschrieben ist, der ringsherum öffnungen 27 von etwa 2 ma Durchmesser besitzt, die , im Abstand von etwa 1 cm voneinander am Umfang des Stäbchens angeordnet sind· Der Mittelteil de· Stäbchens ist ausgebohrt, wobei eine Öffnung 23 von etwa 5 bis 4 mm Durchmesser erhalten wird. Der andere Teil 25 besteht aus einem weiteren schmaleren Stäbchen mit solchen Abmessungen, dafi es in die Bohrung 23 des Teiles 21 hineinpaßt. Beide feile werden in der gleichen Weise* * gehandhabt wie der Hol«apfen, der für das normale Stäbchen

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naoh Beispiel 1 verwendet wird mit der Ausnahme, daß für die beiden Teile verschiedene Pilze benutzt werden. So kann beispielsweise im !feil 21 Gliooladium roseum kultiviert werden, während im Teil 25 Triohoderma album angesiedelt wird.

Beispiel ,5

Das Beispiel beschreibt^ein zusammengesetztes Stäbchen zum Impfen mit verschiedenen Mikroorganismen. Diese Art Stäbchen ist aus einem ähnlichen TeIh wie Teil 21 im vorhergehenden Beispiel 2 zusammengesetzt, aber die Bohrung 23 ist mit Sägespänen gefüllt, die von einem oder mehreren Mikroorganismen durchwachsen sind. So kann beispielsweise in dem ausgehöhlten Teil des Stäbchens Glioeladium roseum angesiedelt sein, während in den Sägespänen Geratocystis picea gezüchtet ist.

Der die Sägespäne enthaltende Teil wird wie folgt hergestellt! Die Sägespäne werden bis zur Sättigung mit einer 2,5$igen Malznährlösung befeuchtet und in einen Erlenmeyerkolben gebracht, und zwar in einer Menge, die etwa der Hälfte des !Fassungsvermögens des Kolbens entspricht. Sojwird beispielsweise in einen 250 ccm-Erlenmeyerkolben ein Volumen aus angefeuchteten Sägespänen eingebracht, das etwa 125 ecm entspricht. Der Kolben wird durch mehrfach unterbrochene Anwendung von Hitze sterilisiert, um die Sporen in ihrer weniger widerstandsfähigen Entwicklungsform zu zerstören (sog. Tyndalisierung), anschließend beimpft und bei Zimmertemperatur von etwa 25°. bebrütet. Sobald die beimpften Sägespäne mit Mikroorganismen durchsetzt sind, werden sie unterhalb 25° unter Vakuum getrocknet und vorsichtig in die Bohrung des hohlen Teils hineingebracht. Das Stäbchen wird dann in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gehandhabt.

Beispiel 4 >

Das Beispiel beschreibt ein komplexes Stäbchen zur Aktivierung von antagonistischen Stoffen in den eingeführten Mikroorganismen. Das in Pig* 3» dargestellte Stäbchen ähnelt demjenigen nach

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Beispiel 2, aber der hohle Teil 21 in ?iä-. 2 ist durch eine dünne Umkleidung 31 ersetzt, die um den Teil 33 herungevvickelt ist, der ähnlich wie der Teil 25 in Beispiel 2 gestelltet sein kann. Die furnierartige Umkleidung kann beispieisv/eise mit Poria oarbonica, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchwachsen sein, die dann in strömendem Dampf bei AtEiosph&rendruck vor dem Trocknen erhitzt worden ist. Der Teil 33 wird in üblicher Weise gehandhabt und für die Kultur von iJcytalidium ^p (PY-Stanm) verwendet. Der Purnierstrei'fen 31 '.vird dann ur: den Teil 33 herumgewickelt, am zugespitzten Ende riit Kasein oder Sojabohnenklebstoff angeleimt und zu einem zusammengesetzten'Stäbchen 35 geformt, wie das in Beispiel 1 beschrieben ist.

Anstelle der Imprägnierung mit einem Pilzmyzel kann der Furnierabschnitt auch mit geeigneten Stoffwechselproäukten von Pilzen oder Chemikalien imprägniert werden. -

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt ein zusammengesetztes Stäbchen zuia Einführen von verschiedenen Pilzen in das Substrat an verschiedenen Stellen. ,

Das Verfahren ist in den Grundzügen in Beispiel 2 beschrieben, aber der hohle Teil 41 ist in zwei Bestandteile 41a aus Kunststoff und 41b aus Holz unterteilt» Mindestens ein Teil ist mit den üblichen Perforationen ausgestattet. Der Teil 41 wird zur Kultur eines synergistischen Mikroorganismus, beispielsweise Poria vaporaria,verwendet, v/ährend de innere Teil 43 mit einem immunisierenden Parasiten wie Trichoderma album durchtränkt werden soll. Das Stäbchen wird in der 77eise angewendet, daß der ii!imunisierendessich innerhalb des Kernholzes entwickeln^ kann, v/ährend der synergistische llikroOrganismus in dem äußeren**'* Teil des Pfahl wächst und hierbei toxische Substanzen entfernt.

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Beispiel 6 " . .

Dieses Beispiel beschreibt Impfgeschosse. Nach dem Verfahren des Beispiels 1 werden Holzzapfen präpariert und nach dem Trocknen in Abschnitte von 30 mm Iiänge geschnitten* Sie werden dann in den üblichen Geschoßhülsen montiert, wobei eine Übliche Pfeilapitzenhülse über dem Ende des HolEBapfens mit Hilfe Ton Epoxylair. oder einem ähnliehen Bindemittel befestigt wird.

Derartige Impfgeschösse sind besonders brauchbar für das Impfen von ausgewachsenen Bäumen«

Beispiel 7 .

Dieses Beispiel beschreibt besondere kleine Impfstäbchea. Die

Imrfstäbchen werden nach dein Verfahren des Beispiels 1 hergestellt, wobei Holzatücke von etwa 2 χ 50 mm verwendet werden. NachieE. die Kultur herangewachsen, und getrocknet ist, wird der Ho Iss tab in Abschnitte von 5 bis IjO mia Länge geschnitten.

Diese besonders kleinen Stäbchen können mit einer Ketallspitze oder nit einer perforierten Hetallhülle verstärkt werden, ähnlich Y/ie die Ausführungsformen, die in den vorhergehenden Beispielen beschrieben sind·

Diese kleinen Stäbchen können zum impfen von Jungpflanzen, beispielsweise im Alter von 3 bis 5 Jahren in der Gegend des Wurselaiisatses verwendet werden.

Beispiel 8

Das Beispiel beschreibt durchjuspressen geformte Impfpräparate aus Binde· Gemahlene Binde wird mit trockenen Sporen und Fadenbestandteilen des gewünschten Mikroorganieeus vermischt, bevor das Material ausgeformt wird, wie dies in der oben erwähnten amerikanischen Anmeldung mit den Titel «Extruded Bark Pellets" beschrieben ist· Die erhaltenen Kügelchen «erden dann mit einem geeigneten Bindemittel, wie beispielsweise lasein oder Soja-

SAO ORiGtNAL

bohnenmehl überzogen, bevor sie in der gewünschten Gestalt ausgeformt werden, um eine Schutzhülle rund um die Wurzeln von Pflanzensämlingen zu bilden.

Ursprünglich wurde die Erfindung mit Seytalidium sp (ίΎ-Stamm) in die Praxis überführt. Dieser Pilz zeichnet eich durch eine ; Mehrzahl erwünschter Kennzeichen aus, so z.B. durch seine Eignung, im Kernholz der Douglas-ELchte zu wachsen, eine Mehrzahl von Basidiomyzeten, die die Holzfäule verursachen, £U zereto'-ren und beim Wachstum unter bestimmten Bedingungen eine stabile antibiotische Substanz im Substrat zu bilden. Allerdings hat der Pilz verschiedene Nachteile, wie beispielsweise eine verhältnismäßig langsame Wachstumsgeschwindigkeit und den Mangel an Konstanz in der Bildung von antibiotischen Stoffwechselprodukten. Auch hat diese^ keine bekannte Wirkung hinsichtlich des Schutzes des Substrates gegenüber Insekten. ?.j.ff

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, diese Nachteile zu überwinden erstens durch Verwendung anderer Organismen zusätzlich oder anstatt oder in Kombination mit Scytalidium (IT-Stamm).

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist eine Verbesserung der Bildungsgeschwindigkeit von antibiotischen Stoffen durch* FY. Schließlich ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung eine Synergistisehe Wirkung durch andere Mikroorganismen zu erzielen zur Eliminierung'oder Umwandlung von Substanzen, die bei der Entwicklung immunisierender Parasiten sich störend bemerkbar machen. Der Mangel an Konstanz in der Bildung voηÄitibiotischen und anderen Stoffen, die bei der Hemmung oder Zerstörung von Basidiomyzeten wirksam sind, wurde vom Erfinder schon früher tu einer Studie über ScytalidiUfc ep beobachtet, und zwar kurz nach der Isolierung des Pilze· aus Douglas-Fichten-Holz in fahr« 1964 in Oregon, USA, wo der Pilz* , unter Standard-LaboratoriuBsbedingungen gezüchtet wurde·

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Die Entwicklung einer Konstanz in der Bildung der antibiotisGhen Substanz neben der Produktion eines entsprechenden Volumens einer derartigen Verbindung sind die wichtigsten Kennzeichen bei dem. Programm einer systematischen Verbesserung, das mit einer Vorrichtung zur Auffindung bakterieller Varianten, einem sog. Mutektor, durchgeführt wurde und zur Entwicklung des FY-Stammes führte. Obwohl dieser gegenüber den wilden Hassen wesentlich verbessert ist, erzeugt der FY-StammkBine antibiotischen Substanzen, wenn er unter Standard-laboratoriums** bedingungen innerhalb einer Periode von mehreren Wochen- gezüchtet wird. ■ ■ - ".

Diese Tatsache ist nicht für Scytalidium sp allein kennzeichnend, sondern wird bei verschiedenen Gelegenheiten in der einschlägigen Fachliteratur unter der Bezeichnung "Alterung* oder verwandten Angaben diskutiert. Der Erfinder hat jedoch entdeckt, daß die gewünschte Konstanz in der Bildung von Antibiotika durch den verbesserten FY"-Stamm bei dauernder oder auch unterbrochener Einwirkung von Stoffweiffhseiprodukten bestimmter Basidiomyzeten, die möglicherweise ausschließlich flüchtig sind, erreicht werden kann.

Die Alterung ist besonders offensichtlich bei dem FY-Stamm, da die Bildung von antibiotischen Stoffen mit dem Auftreten eines gelben wasserlöslichen Pigments Hand in Hand geht. Obwohl das gelbe Pigment selbst keine aktive Wirkung zeigt, fällt sein Auftreten stets mit der antagonistischen Wirkung des FY-Stammes zusammen.

Stoffwechselprodukte von Poria carb,onica sind besonders wirjcsam, um die Bildung von Antibiotika^ aus dem FY-Stamm hervorzurufen· Aucji F.annosus ist ein gutei Anreger, während Poria j vaporaria in dieser Hinsicht sehr wenig wirkssamist» Die Folge*- rungen auej dieser Tatsache aind fü$ $raktisohe Verwendung von beträchtlicher Bedeutung. Sie zeigen, daß man si oh auf den

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FY-Staoi zur vorbeugenden Anwendung nicht verlassen kann. Beispiele für Bedingungen, bei denen der FY-Stamm v/ertloa is"t_t sind folgendeι

1. Der FY-Stamm wird in einen Baumstamm oder einen Pfahl, der keine anregenden Stoffe enthält, eingeführt. Er entwickelt eich dann ohne die Bildung von Antibiotika. Ss kann auch kein wirksamer Schutz mehr erwartet werden, wenn der FY-Starr-m seine Sntwicklung im Substrat einmal beendet hat und sich, autolysiert oder untätig wird.

2. Der PY-Stamm wird in einen Baumstamm oder einen Pfahl eingeführt, in welchem Anregerstoffe lediglich in einem kleinen Teil des Substrats vorhanden sind· Dann werden Antibiotika in , diesem kleinen Gebiet gebildet werden, in welchem Anregerstaffe vorhanden sind, indessen nicht in einer Entfernung von wenigen Zentimetern davon.

3. Der FY-Staiam wird in einen Baumstamm oder einen Pfahl eingeführt, der bereits mit einem Holzfäulnispilz wie Poria vaporaria infiziert ist, der nicht als Anreger wirkt. In iliesem fall wird der PY-Stamm den Fäulnispilz nicht töten.

Wenn jedoch der Impfstoff bestimmte innunisierende wie den FY-Stamm und Trichoderma album, Stanm 3-5 enthält, besteht ein ständiger Anreiz, und es findet die Bildung von antibiotischen Substanzen innerhalb des ganzen Gebietes statt, das von den eingeimpften Organismen durchsetzt ist. Pur bestimmte Anwendungszwecke ist T. album dem EY-Stacua vorzuziehen, da er eine schnellere Wachstumsgeschv/indigkeit und zusätzlich eine Konstanz in der antagonistischen Wirkung zeigt. Der PY-Stamin hat jedoch praktisch keine nachteilig. Wirkung auf die Tracheidzellen, während gewisse Stämme von Trichoderma eine schwache weiehfäuleartige Zerstörung des Holzes verursachen.

Wie Fachleute mit durchschnittlicher Kenntnis der vorliegenden Zusammenhänge leicht feststellen können, kann die gleiche Wirkung der Bildung von Antibiotika in PY-Stämmen durch Stoffwechselpraöukte von Piäzen erzielt werden, die aus dem Myzel von

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Porin curbonica .-isoliert -sind« oder durch ähnliche chemische Verbindungen, die ohne derartige !lebewesen synthetisch gewonnen uind. Bei bestimmten Anwendungsgebieten» bei denen die Kultur des ?Y-3t3EiKeB ale Erzeuger von Antibiotika unter künstlichen !Bedingungen dienen soll, kann das letztgenannte Verfahren vorzuziehen sein gegenüber der Verwendung der ungereb· tilgten, eine bildung, "von Antibiotika verursachenden Substanz, wie s.B· dem durch Hitze getöteten gesamten Myzel von Boria carbonica. . , . . \

Auch Ycalliufer von Antibiotika können in dem Impfe to ff oder dem Kulturmedium zur Herstellung von antibiotischen Einheiten vorhanden sein. Bei den Impfstäbchen können diese Vorläuferstoffe durch Imprägnieren des Teils 21 des Stäbchens, wie es in den Beispielen 2 und 3 beschrieben ist, vorgesehen sein. Die Art iioeer Vorläufer lütt sich leicht identifizieren, sobald die Susarjaensetsutie und die Struktur der antibio tischen Substanz bekannt ist. Die Identifi2ierungsuntereuchungen der antibiotischen SubstiUis und ebenso ihrer Vorläufer ist in manchen Fällen erheblich vereinfacht, da diese Stoffe in Gelen, wie z.B. dem At-ar-Kulturredium, unter Bildung von Kristallen ausfallen. Diese Feststoffe können aus dem Agarmedium isoliert werden mitunter ohne weitere Abtrennung mit %lfe von Gaschromatographen oder anderen Verfahren, die für diesen Zweck wirksam sind.

In verschiedenen Killen kann es wünschenswert sein, Verbesserun-

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gen verschiedener Kennzeichen der immunisierenden Bwiiitm zuA& erreichen, beispielsweise hinsichtlich der Wachstumsgeechwindigkeit, und zwar lieber durch den Zusatz von chemischen Stoffen zu dem Impfstäbchen oder der Impfkugel als durch- Verwendung ver* schiedener bakterieller Arten. Dies kann bei den Stäbchen, wie sie in Beispiel 2 und 3 beschrieben sind, beispielsweise leicht dadurch geschehen, daß man den Seil 21 ait Spurenelementen in der lon von Salxen oder Ohelaten einschließlich Zink, Mangan, Eisen, Kupfer oder Chlor imprägniert; dabei können auch Düngemittel wie Stickstoff, beispielsweise in der ΪΟΓβ von Harnstoff^

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oder Phosphor, beispielsweise als Phosphate oder Kalium, angewendet werden. Die Verwendung von Düngemitteln muß besonders sorgfäMg geprüft werden, da sie einen Bedarf an Energie des immunisierenden bewirkt unter Umständen, die Angriff auf die Kohlenstoffverbindungen .des Substrats in verer Form bewirken, was möglicherweise zu einer Beschädigung der Wände der Tracheidzellen führt.

Gewisse immunisierende sind gegenüber Arsen-jKupfer- oder Besten anderer Verbindungen, die in dem geimpften Holz '■ noch vorhanden sind, empfindlich. Unter diesen Umständen ist es empfehlenswert, gleichzeitig mit den immunisierenden

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i»ynergistische Mikroorganismen wie Poria vaporaria, Ooniophora cerebella und Mucor sp einzuführen, die in der Lage sind, die störenue Wirkung solcher giftiger Verbindungen aus der Welt zu schaffen, obwohl^n der Zerstörung des Substrats in irgendwelchem nennenswerten Ausmaß durch den immunisierenden VFaraaitan leicht gehindert werden. Dabei ist das Verhältnis ./vif des Wachstums des immunisierenden und des synergistischen Stoffs in 3etracht zu ziehen ebenso wie auch das Verhältnis der einzelnen Impfstellen zueinander. Eine einfache Erläuterung dieser bei den Stäbchen nach Beispiel 4 erzielbaren Kombination ist die gleichzeitige Einführung von Poria vaporaria in das Splintholz und Trichoderma album in das Kernholz eines im Gebrauch befindlichen Kiefernpi'aiils, der mit Konservierungssalzen nach dem Soliden-Verfahren behandelt ist. Bei einem solchen Pfahl kann der Schutz der inneren Teile des Pfahls durch T. album erzielt werden. Die Salzreste der chemischen Behandlung kö-jien indessen die Entwicklung dieses Organismus hindern, ^ine vorherige Behandlung mit P. vaporaria beseitigt zum großen Teil dieses Hindernis und ermöglicht eine anschließende Behandlung nit dem immunisierenden Tagftaitatt.

Ξε ist bekannt, daß bestimmte holzzeretörende Insekten durch verschiedene, im Holz vorkommende Mikroorganismen vertrieben oder sogar getötet werden. So ist es beispielsweise bekannt,

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daß unterirdische Termiten, Reticulitermes flavipies, R. virginicus und R. hageni Zellulose von einer tiefer gelegenen Schicht aus, die frei von ISulnisbakterien ist, anzugreifen· vermögen, aber nicht in dem Falle, wenn Methylcinnamat, ein Stoffwechselprodukt, das durch Lentinus lepidus gebildet ist, anwesend ist. Daher ist es für bestimmte Anwendungszwecke erwünscht, diese i*ilze allein für sich einzuführen, z.B. im "Fall von Oephalosporium sp zur vorbeugenden Behandlung lebender BUume gegen solche schädlichen ^ürganismen wie Pomes annosus und Insekten wie Hyloicus pinastri oder Diprion pini. In anderen "Killen, in denen Termiten anwesend sind, kann eine zweifache Impfung mit Lentinus sp und Scytalidium sp, JY-Stamm, erwünscht sein, wobei der erste Pilz zur Bildung von termitenvertreibenden Stoffen dient und der letztere dazu, erhebliche Holzschäden durch den erstgenannten Organismus zu hindern. Das in Beispiel 4 beschriebene Stäbchen ist für diese Anwendungszwecke wiederum wertvoll.

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Claims

19293U Aktenz.: P 19 29 314.2 Anm.: Jacques Ricard Patentansprüche

1. Verfahren zur Bekämpfung oder zur Verhinderung der Entwicklung schädlicher Organismen in. einem Substrat, dadurch gekennzeichnet, daß ein mikrobielles Kommensal, welches heilende oder Torbeugende Wirkung .in bezug auf die Tätigkeit der schädlichen Organismen besitzt, gezüchtet und in das Substrat hineingebracht wird, wobei vorzugsweise zusätzlich Stimulantien hinzugefügt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mikrobielle lommensal, das heilende und/oder vorbeugende Eigenschaften besitzt, aus einer der folgenden Bakterien besteht» Trichoderma album (=T.polysporum), Trichoderma lignorum (=T.riride), Gliocladium roseum, Scytalidium sp, Ceratocystis pioeae, Penicillium rubrum, P.Termiculatum, Coryne sarcoides, Ispergillus sp, Chaetomium sp, fusarium ep, Cephalosporium sp, Geotrichum sp, Leptosphaeria, Mycorrhiza^ Pilzen ( mit unterirdischen, fadenartigen Myzelien), Boletus bovinus, Hetinocyclus abietis, Pythium sp, Helminthosporium sativum, Bhinotrichum macrosporum, Trichotecium roseum, Calcarisporium parasiticum, Gonatobotry· simplex, Phytophthora parasitica, Sclerotium rolfsii, Chaetomium globosum, Pusarium roseum sp cercealis, Cryptosporiopsis, Cephalosporium charticola, Verticillium, Pullularia pullulans, Pullularia lilacinum, Pythium debaryanum, Tubereulina maxima,Cicinnobolus oesati, Penicillium patulum,P.nigricans, Ceratocystis pluriannulata, Penieillium crustaceum, Mucor sp, liortierella sp, Melanconium sp, Monilia sitophila, Rhizopus nigricans, Pyronema sp, Didymella exitialis, Spicaria sp,

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Phoma sp, Mucor ramannianus, Hypoxylon punctualatum, Suillus granulatus, Russula, Beauvaria baesiana, Patcilomyoes farinosue, Lentinus lepideue, Ceratocystie fimbriata, Actinomyceten wie Micromonospora globosa, Acylindrosporus und Streptomyces sp, Bakterien einschließli«·' Serratia marcescens, Bacillus subtilis, B. polymyxa, Brwinia ep, Pseudomonas 3p und Achromobacteria sp.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, daß als Stimulant ein Mikroorganismus eingeführt wird, dessen StoffWechselprodukte oder physiologisch ähnliche Substanzen eine aktive Wirkung bei der Anregung der Bildung von Antibiotika in mindestens einem der vorerwähnten Mikroorganismen, d.h.dem mikrobiellen Kommensal ausüben.

4. Verfahren nach eindem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß außerdem noch ein Mikroorganismus eingeführt wird, der eine synergistische Wirkung in erster Linie bei der Umwandlung oder Entfernung solcher Stoffe ausübt,die die Entwicklung des wertvollen mikrobiellen Kommsnsals hindern.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß außerdem noch ein mikrobielle» Stoffwechselprodukt eingeführt wird, das in der Lage ist, die antagonistische Wirksamkeit in einem oder mehreren der mikrobiellen Kommensale zu stimulieren.

6. Verfahren nach einem der vorhergeherden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß außerdem noch eine chemische Verbindung eingeführt wird, die in der Lage ist, die antagonistische Wirkung in einem oder mehreren der mikrobiellen Kommensale zu stimulieren.

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7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in das Substrat Trichoderma album und Gliocladium roseum einzeln oder in Kombination miteinander oder in Kombination mit Scytalidium sp oder irgendeinem anderen wertvollen mikrobiellen Kommensal eingeimpft werden.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst in das Substrat Ceratocystis piceae, Cephalosporium sp oder Goryne sp einimpft.

9. Verfahren nach eindem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der für eine synergistische Wirkung verwendete Mikroorganismus zur Gegenwirkung gegen Arsenverbindungen aus Mucor sp besteht.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus für eine synergistische Wirkung gegen Kupferverbindungen aus Poria vaporaria besteht.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobiellen Kommensale, beispielsweise Chqfcalosporium sp und Lentinus sp,.in erster Linie dafür verwendet werden, einen Befall des Substrats durch Insekten «ie Seticulitermes sp,Hyloicus sp und Diprloa sp zu hindern.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als zusätzliche Stimulantien antibiotische Substanzen oder andere wertvolle Stoffwechselprodukte verwendet werden, die man erhält, indem man ein oder mehrere mikrobielle Arten wie Trichoderma album (=T.polysporum), Trichoderma lignorum (=I.viride), Gliocladium roseum, Seytalidiuja sp, Ceratocystia piceae, Penicillium rubrum, P.veraicülatum, Coryae sarcoidee, Aspergillus ap, .(üiaetomium sp, Pusarium sp,

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Cephalosporin sp, Geotriohum sp, Leptosphaeria, Myoorrhizalpilze ( mit unterirdischem, fadenartigen Myzelien), Boletus bovinus, Eetinooyolus abietia, Pythium sp, Helminthosporium sativum, Hhinotrichum macrosporum» Irichdshecium roseum, Calcariaporium parasiticum, Gonatobotrys simplex, Phytophthora parasitica, Sclerotium rolfsii, Chaetomium globosum, Pusarium roseum ap, cerealis, Gryptosporiopsis, Cephaloaporium charticala, Terticillium, Pullularia pullulans, Pulltilaria lilacinma, Pythium debaryanum, Tuberonlina maxima, Cicinnobolus oesati, Penicillium patulum, P-. nigrioans, Oeratooystis pluriannulata, Penicillium crustaceum, Hucor sp, Mortierella sp, Monilia sitophila, Bhizopus nigrioans, Pyronema sp, Didymella exitialis, Spicaria sp, Phoma sp,Mueor aj ramannianus, Hypoxylon punetualatum, Suillue granulatus, Eussula, Beauvaria bassiana, Paeoilomyees farinoaus, Lentinus lepideus, Ceratooystis fimbriata, Actinoeyceten wie Micremonospora globosa, Aoylindrosporus und Streptpmyces sp, Bakterien einschließlich Serratia marceacens, Bacillus subtilis, Be polymyxa, Brwinia sp. Pseudomonas sp und Achromabacteria sp in einem flüssigen Nährmittel heranzüchtet, welches das Wachstum der Pilze und gegebenenfalls der antibiotiaohen Vorläufer zu unterstützen vermag, worauf man das Myzel abtrennt und die übrigbleibende Sährflüssig— keit eindampft.

13· "Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das mikrobielle Eommensal in das Substrat hineingebracht wird, indem ein längliches Stüek aus Holz, Kunststoff oder einem anderen geeigneten Material eingetrieben wird, das zuvor mit dem mikrobiellen Kommensal imprägniert isto

14· Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das in das Substrat hineingebrachte längliche Stück aus Holz, Kunststoff oder dergl.die form eines Stiftes besitzt, dessen

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Querschnitt einen Durchmesser zwischen 2 und 1o nun, vorzugsweise zwischen 3 und ? mm besitzt, und dessen Länge zwischen 5o und 2oo am, vorzugsweise zwischen 7ο und 13o mm liegt·

15· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das eine Ende des Stiftes mit einer Pfeilspitze aus einem harten Material wie z.B. rostfreiem Stahl versehen ist, um das Sindringen des Stiftes in das Substrat zu erleichtern·

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung von Jungpflanzen und Sämlingen» dadurch gekennzeichnet, daß das längliche Stück aus Holz, Kunststoff und dergl.die Porm eines dünnen Stäbchens mit einer Länge von etwa 5 bis 1o mm besitzt und gewünsehtenfalle mit einer Spitz· oder einem Hantel aus Metall oder einem anderen harten Material versehen ist·

17· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß durch Auspressen geformte Kugelchen aus Binde und/oder einem anderen passenden Material, das mit mikrobiellen Sporen, vegetativen Zellen oder mit Myaelteilchen und/oder Bruchstücken von Myzelfäden durchsetzt ist, eingebracht werden, wobei die fiindenkügelchen mit Kasein oder Sojabohnenmehl oder einem anderen geeigneten Bindemittel überzogen sind, um eine Pflanzgrundlage rund um die Wurzeln der durch die immunisierenden Kommensale schützenden Sämlinge zu bilden.

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