DE1919894C3 - Vorrichtung zur Trennung von proteinartigen Substanzen durch Gel-Elektrophorese - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Trennung von proteinartigen Substanzen durch Elektrophorese.
Die Gel-Elektrophorese ermöglicht die Trennung

von komplexen Mischungen proteinartiger Substanzen, z. B. Serum-Proteinen, Gewebeextrakten, Hormonen, Enzymen, Polypeptiden usw. mit der Hilfe einer differenzierten Wanderung der Komponenten der Mischung durch ein Gel-Medium in einem elektrischen

Feld. Obwohl die Gel-Elektrophorese ein bekanntes analytischei Verfahren ist, stand einer breiteren Verwendung dieser Elektrophorese für präparatives Arbeiten in der Biologie und den verwandten Wissenschaften der Mangel einer geeigneten und verhältnismäßig billigen Vorrichtung für diesen Zweck entgegen.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung einer Vorrichtung zur präparativen Gel-Elektrophorese, die eine große Kapazität besitzt, einen

hohen Grad an Trennfähigkeit aufweist, billig, dauerhaft und leicht zu handhaben ist und zur Reinigung oder zur Lagerung auf einfache Weise zerlegt werden kann. Gleichzeitig soll erfindungsgemäß eine Vorrichtung geschaffen werden, welche ein diskontinuierliches

Puffersystem aufweist und eine kontinuierliche Elution der Komponenten ermöglicht, so daß die Sammlung der Fraktionen der Komponenten während der Elektrophorese wesentlich erleichtert wird.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Gel-Elektrophorese ist gekennzeichnet durch eine vertikale Säule aus Elektrophorese-Gel mit einem oberen Bereich und einem unteren Bereich, eine Vorrichtung zur Schaffung eines im wesentlichen gleichmäßigen in einer Richtung verlaufenden Potentials in Längsrichtung der Säule, eine Sammelkammer, die unterhalb der Gelsäule angeordnet ist und mit deren unterem Bereich in Verbindung steht, sowie eine Gewinnungsvorrichtung die eine proteinartige Substanz, die in die Sammelkammer eintritt, von der Säule in im wesentlichen radialer Richtung zu einer zentral angeordneten Austrittsvorrichtung und durch diese hindurch nach außen leitet.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispiels der Erfindung an Hand der Zeichnung.

Die Figur der Zeichnung zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung im Querschnitt.

Entsprechend der Darstellung in der Figur ist an einem Stützteil 12 ein an beiden Enden offener Zylinder 10 vertikal in ein offenes Gefäß oder Becherglas 11 eingehängt. Das Gefäß 11 dient der Aufnahme einer ersten Pufferlösung 19. Der Zylinder 10 enthält ein Elektrophorese-Gel 16 und eine darüber befindliche zweite Pufferlösung 20. Das Gel 16 kann starr (self-supporting) oder auch halbstarr sein und wird in seiner Stellung durch eine Trennwand 15 gehalten, welche für Ionen und gleichzeitig auch für die proteinartigen Substanzen, die durch das Gel wandern, durchlässig ist. Ein für diesen Zweck geeignetes

Material ist poröses Polyäthylen mit einer Porengröße im Bereich von 10 bis 50 Mikron. Vorzugsveise liegt die Größe der Poren zwischen 30 bis 40 Mikron.

Eine Elutionsplatte 13, welche durch eine für Ionen durchlässige Scheibe dargestellt wird, die vorzugsweise aus porösem Polyäthylen oder einem ähnlichen Material besteht, ist in einem bestimmten Abstand unterhalb der Trennwand i5 angeordnet Die Elutionsplatte 13 und die Trennwand 15 bilden zusammen eine Sammelkammer 29, die sich unterhalb der Gelsäule 16 befindet. Vorzugsweise ist die Durchlässigkeit der Elutionsplatte 13 für Ionen derart gewählt, daß ein im wesentlichen gleichförmiges Potential in Längsrichtung der Säule 16 gebildet' werden kann, wie dies im weiteren erläutert wird.

Die Elutionsplatte 13 ist mit einer zentralen öffnung 30 versehen, die mit der Sammelkammer 29 in Verbindung steht und eine kontinuierliche Ableitung der in der Sammelkammer 29 gesammelten proteinartigen Substanz ermöglicht Die Substanz wird durch die Öffnung 30 einer Leitung 14 zugeführt. Die Elutionsplatte 13 ist beweglich an der benachbarten Wand des Zylinders 10 angeordnet, so daß die Pufferlösung 19, die im Gefäß 11 untergebracht ist, frei dazwischen und in die Sammelkammer 29 strömen kann.

Wenn durch eine Pumpe oder einen geeigneten Siphon im flüssigen Material in der Kammer 29 durch die Leitung 14 ein Unterdruck gebildet wird, so strömt an der Peripherie der Elutionsplatte 13 frische Pufferlösung in die Kammer 29. Die Lösung bewegt sich in radialer Richtung zur zentralen öffnung 30 und schwemmt die aus der Gelsäule 16 eluierte proteinartige Substanz in die öffnung 30. Die besondere radiale Strömung der Pufferlösung 19 durch die Kammer 29 kann auch durch die Anordnung geeigneter kleiner öffnungen in der Elutionsplatte 13 oder durch eine geeignete Wahl der Porosität der Platte variiert werden. Die Strömungsgeschwindigkeit der Pufferlösung durch die Sammelkammer 29 kann durch die Geschwindigkeit der Ableitung der Flüssigkeit durch die Leitung 14 gesteuert werden. Die Elutionsplatte 13 kann durch einen Haltering 17 oder eine andere geeignete Vorrichtung in ihrer Stellung gehalten werden. Um zu gewährleisten, daß die Kammer 29 ein konstantes Volumen behält, kann auch ein Distanzhalteteil 18 zwischen der Platte 13 und der Trennwand 15 angeordnet werden. Zu diesem Zweck kann ein Nylonsieb oder ein ähnliches Teil verwendet werden. Um eine Strömung der proteinartigen Substanz durch die Elutionsplatte 18 zu verhindern, kann falls nötig zwischen dem Distanzhalteteil 18 und der Platte 13 eine Dialyse-Membran oder ein ähnliches Element angeordnet werden.

Die treibende Kraft für die unterschiedliche Wanderung der verschiedenen Komponenten in einem proteinartigen Gemisch ist die elektromotorische Kraft durch die Säule. Um eine verhältnismäßig scharfe Trennung der einzelnen Komponenten zu gewährleisten, muß ein gleichförmiges Gleichstrom-Potential in der Längsrichtung der Gelsäule 16 wirken. Zu diesem Zweck ist die erfindungsgemäüe Vorrichtung mit einer Elektrode 21 versehen, welche in elektrischem Kontakt mit der Pufferlösung 20 steht und durch Leitung 23 mit einem Pol einer Gleichstromquelle 28 verbunden ist. Die andere Elektrode 22 ist im elektrischen Kontakt mit der Pufferlösung 19 angeordnet und ist durch Leitung 24 mit dem anderen Pol der Gleichstromquelle 28 verbunden, nie Elektroden 21 und 22 können aus Kohlenstoff einem Edelmetall, z. B. Platin, oder dergleichen bestehen.

Da die Pufferlösungen 19 und 20 leitfähig sind und Wasser enthalten, tritt bei Betrieb der Vorrichtung eine beträchtliche Elektrolyse ein, die mit einer Gasentwicklung verbunden ist. Zu diesem Zweck ist vorzugsweise die untere Elektrode 22 derart angeordnet, daß Gasblasen, die an ihr entwickelt werden und an ihr aufsteigen, nicht im unteren Bereich des Zylinders 10 gefangen werden, sondern zur Oberfläche der Pufferlösung 19 aufsteigen und von der umgebenden Atmosphäre aufgenommen werden können.

Die Pufferlösungen 19 und 20 dienen gleichzeitig im Betrieb auch zur Ableitung der während der Gel-Elektrophorese entwickelten Wärme. Falls sich diese Wärmeableitung als ungenügend erweist, können geeignete Vorrichtungen zum Wärmeaustausch, z. B. Kühlschlangen, sogenannte »Kühifinger«, ein Kühlmantel um den Zylinder 10 oder den Behälter 11 oder andere geeignete Anordnungen verwendet werden.

Der Zylinder 10 kann auch mit einem Deckel 25 versehen sein, welcher eine öffnung 26 aufweist.

Für vorliegende Vorrichtung kann eine Vielzahl verschiedenartiger Elektrophorese-Gele verwendet werden, z. B. Stärkegele, Silikagele, Agargele und dergleichen.

Die Gele können starr oder halbstarr sein. Für die Verwendung in der vorliegenden Vorrichtung ist vorzugsweise ein halbstarres wasserunlösliches Acrylamid-Polymer-Gel geeignet, welches durch eine Kopolymerisation von Acrylamid mit Methylenbisacrylamid erhalten wird. Das Gel ist praktisch durchsichtig und kann mit einem Minimum ' υ η etwa 2,5% des Mononierengemisches gebildet werden, wobei die maximale Konzentration des Polymeren im Gel nur durch die Löslichkeit des Acrylamids und des Methylenbisacrylamids begrenzt ist. Das vernetzende Mittel ist Methylenbisacrylamid, dessen Konzentration von einem Minimum von etwa 1% des gesamten Gehaltes der Monomeren bis zu einem Maximum, das durch die Grenze seiner Löslichkeit in Wasser begrenzt ist, variiert werden. Bei einer Erhöhung der Konzentration des Polymeren wird das Gel fester und starrer. Ein festes Gemisch von etwa 95% Acrylamid und 5% Methylenbisacrylamid ist im Handel erhältlich.

Die Vorrichtung wird durch gebrauchsfertig gemacht, daß ein geeignetes Gel, z. B. das vorstehend erwähnte Acrylamid-Polymer-Gel in den Zylinder 10 im wesentlichen wie in Figur gezeigt, eingegossen wird. Das Gießen kann auf die Weise erfolgen, daß zuerst das untere Ende des Zylinders 10 verschlossen wird, der Zylinder so hoch mit Wasser gefüllt wird, daß die Elutionsplatte 13 und die Trennwand 15 bedeckt sind, wenn sie sich an ihrer Stelle befinden und dann diese beiden Elemente in ihre normale Stellung gebracht werden. Ein über der Trennwand 15 befindlicher Wasser-Überschuß wird dekantiert und die gewünschte Gel-Lösung eingefüllt. Das Luftvolumen über der eingefüllten Gel-Lösung wird durch Stickstoff verdrängt, und die Lösung wird zum Erstarren (to set) gebracht. Die zur Erstarrung erforderliche Zeit kann abgekürzt werden, wenn der Gei-Lösung der Sauerstoff entzogen wird.

Sobald das Gel erstarrt ist, wird der untere Teil des Zylinders 10 geöffnet und das Wasser aus dem Zylinder 10 abgeleitet. Die Leitung 14 wird an die Öffnung 30 der Elutionsplatte 13 angeschlossen und der Zylinder 10 im Gefäß 11 befestigt. Anschließend werden die Pufferlösungen 19 und 20 eingefüllt, die erforderlichen

elektrischen Anschlüsse durchgeführt und das zu trennende proteinartige Gemisch auf die obere Fläche 27 des Gels 16 mittels einer Pipette oder dergleichen aufgetragen. Dann wird die Gleichstromquelle eingeschaltet und der durch das Gel fließende Strom derart eingestellt, daß das proteinartige Gemisch in das Gel 16 ohne übermäßige Distorsion eindringen kann. Wenn das Eindringen erfolgt ist, wird die Stromstärke aul normalen Betriebswert erhöht und die Tren durchgeführt. Die Spülung der Sammelkammer 29 begonnen, kurz bevor die erste abgetrennte Kornpi te des Gemischs durch die Trennwand 15 austrit wird so lange fortgesetzt, bis alle gewüns Komponenten gewonnen worden sind.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zur Trennung von proteinartigen Substanzen durch Gel-Elektrophorese, gekennzeichnet durch eine Säule (16) aus Elektrophorese-Gel mit einem oberen Bereich und einem unteren Bereich, eine Vorrichtung (21, 22, 28) zur Bildung eines im wesentlichen gleichmäßigen Potentials in Längsrichtung der Säule (16), eine Sammelkammer (29), die «ich unterhalb der Säule (16) befindet und mit deren unteren Bereichen in Verbindung steht, sowie eine Gewinnungsvorrichtung (13,14), welche eine proteinartige Substanz, die in die Samrnelkammer (29) eintritt, von der Säule in im wesentlichen radialer Richtung zu einer zentral angeordneten Austrittsvorrichtung (30) und durch diese hindurch nach außen leitet.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Säule (16) aus Elektrophorese-Gel durch eine poröse, für Proteine durchlässige Trennwand (15) getragen wird.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnungsvorrichtung eine für Ionen durchlässige poröse Scheibe enthält, die sich unterhalb der Säule (16) aus Elektrophorese-Ge! befindet, im Abstand von dieser angeordnet ist und eine zentrale öffnung (30) aufweist, welche mit der Sammelkammer (29) in Verbindung steht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Bildung eines gleichmäßigen Potentials in Längsrichtung der Säule ein Paar Elektroden (21, 22) enthält, die in getrennten Pufferlösungen (19, 20'; angeordnet sind, welche in elektrischer Verbindung mit dem oberen bzw. dem unteren Bereich der Säule (16) stehen und an eine Gleichstromquelle (28) angeschlossen sind.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Elektrophorese-Gel ein Acrylamid-Polymer-Gel ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Säule (16) in einem an beiden Enden offenen Zylinder (10) befindet, der im wesentlichen vertikal in einem offenen Gefäß (11) mit einem festen Boden angeordnet ist, wobei das Gefäß (11) der Aufnahme einer Pufferlösung (19) dient.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß im oberen Bereich des Zylinders (10) eine Elektrode (21) angeordnet und in eine Pufferlösung (20) eingetaucht ist, eine zweite Elektrode (22) in der Pufferlösung (19) des Gefäßes (11) eingetaucht ist und beide Elektroden mit den Polen einer Gleichstromquelle verbunden sind.

8. Votrichtung nach Anspruch 2, 3 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für Proteine durchlässige poröse Trennwand (15) im unteren Bereich des Zylinders (10) angeordnet ist und die Säule (16) aus Elektrophorese-Gel trägt, wobei im Abstand unterhalb der Tunnelwand (15) eine für Ionen durchlässige Scheibe (13) angeordnet ist, welche eine zentrale öffnung (30) aufweist, an die eine Leitung (14) angeschlossen ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die für Proteine durchlässige Trennwand (15) und die Scheibe (13) die Sammelkammer (29) begrenzen.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch

gekennzeichnet, daß die Scheibe an der der Sammelkammer (29) zugewandten Seite mit einer Dialyse-Membran versehen ist.

H. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der für die Proteine durchlässigen Trennwand (15) und der Scheibe (13) ein Distanztei! (18) angeordnet ist.