DE1910803A1 - Method and means for determining the level of alkaline phosphatase in serum - Google Patents
Method and means for determining the level of alkaline phosphatase in serumInfo
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Description
E. M e r c lc · 3. März 19 G9E. M e r c lc March 3, 19 G9
Aktiengesellschaft « , *Aktiengesellschaft ", *
DarmstadtDarmstadt
Verfahren und Mittel zur Bestimmung des Gehalts an alkalischer Phosphatase im Serum (Zusatz zu DBP » a ο (deutsche Patentanmeldung P iö 98 778.7 (früher M ü8 25β IXb/42 I))Method and means for determining the content of alkaline phosphatase in serum (addition to DBP » a ο (German patent application P iö 98 778.7 (formerly M ü8 25β IXb / 42 I))
Die Bestimmung des Gehalts an alkalischer Phosphatase im Serum ist von Bedeutung für die Diagnose und Verlaufskontrolle von · Knochenerkrankungen, Tuinorkrankheiten sowie von Leber- und Gallengangkrankheiten, The determination of the level of alkaline phosphatase in the serum is important for the diagnosis and follow-up of: Bone diseases, Tuinor diseases as well as liver and bile duct diseases,
Eine solche EnzymbeStimmung kann nach einer großen Zahl verschiedener Verfahren durchgeführt werden, die sich durch das verwendete Substrat, die Substratkonzentration, durch die Art des Nachweises der Reaktionsprodukte, durch die benötigte Serummenge, durch den pH-Wert, die Inkubationsdauer und -temperatur sowie durch die Art des verwendeten Puffers unterscheiden. Eine der wichtigsten Methoden ist das von Bessey, Lowry und Brock in Journal of the Biological Chemistry, Bd. 164 (Ι94ι5), S. 321, beschriebene Verfahren, Dabei wird Serum in einem Glycin-NaOH-Puffer bei einem pli-Y/ert von 10, ό zusammen mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat 30 Minuten bei einer Temperatur von 37° C inkubiert und anschließend aus der gebildeten Menge p-Nitrophenol auf den vorhandenen Enzymgehalt geschlossene Das gebildete p-Nitrophenol kann dabei photometrisch bestimmt werden» Dieser diskontinuierlichen sogenannten Zweipunktmethode haften, wie auch allen übrigen bisher bekannten Verfahren, verschiedene Fehlormöglichkeiten ana So kann Zo B0 eine während der Inkubationsduuer auftretende Euzyuhemmuug, d, h. ein nicht linearer Ileaktionsverlauf, hervorgerufen z„ Ii0 durch eine pli-Vertverschiebung, nicht beobachtet werden. Das dürfte mit ein Grund gewesen sein, weshalb die Commission of Enzymes of the International Union of Biochemistry (vgl. Florkiu und Slotz, in Comprehensive Biochemistry, Dd. 13 (1964), S, 6) empfohlen hat, wann immer möglich, Enzymreaktionen optisch-Such an enzyme determination can be carried out according to a large number of different methods, which depend on the substrate used, the substrate concentration, the type of detection of the reaction products, the amount of serum required, the pH value, the incubation time and temperature and the Differentiate the type of buffer used. One of the most important methods is the method described by Bessey, Lowry and Brock in Journal of the Biological Chemistry, Vol. 164 (Ι94ι5), p. 321, where serum is in a glycine-NaOH buffer with a pli-Y / ert of 10, ό incubated together with p-nitrophenyl phosphate as substrate for 30 minutes at a temperature of 37 ° C and then closed from the amount of p-nitrophenol formed to the existing enzyme content. The p-nitrophenol formed can be determined photometrically »This discontinuous so-called two-point method adhere, as well as all other previously known methods, various Fehlormöglichkeiten to a to Zo B can be 0 occurring during Inkubationsduuer Euzyuhemmuug, d, h. a non-linear Ileaktionsverlauf caused z "Ii 0 by a pli-Vertverschiebung not be observed. That should have been one of the reasons why the Commission of Enzymes of the International Union of Biochemistry (cf. Florkiu and Slotz, in Comprehensive Biochemistry, Dd. 13 (1964), p. 6) recommended optical enzyme reactions whenever possible -
.0 09841/05AO BAD ORIGINAL.0 09841 / 05AO BATH ORIGINAL
kinetisch zu messen, (1„ li» zum Beispiel bei der Bestimmung der aJ.kalischen Phosphatase dia Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse dos Phosphorsäureester zu bestimmen.to measure kinetically, (1 "li" for example when determining the aJ.kalischen phosphatase to determine the initial rate of hydrolysis dos phosphoric acid ester.
Bei dem Substrat p-Nitrophenylphosphat ist der Nachweis des im alkalischen Medium unter der Enzymwirkung gebildeten p—Nitrophenols photometrisch (bei 400 mn) direkt möglich, da der In the case of the substrate p-nitrophenyl phosphate, the detection of the im alkaline medium under the enzyme action formed p-nitrophenol photometrically (at 400 mn) directly possible, since the
pK -Wert von p-Nitrophenol bei 7,16 liegt. Die Bestimmung ist apK value of p-nitrophenol is 7.16. The determination is a
somit nach der optisch-kinetischen Methode uöglich, indem die gepufferte Substratlösung mit Serum versetzt und die durch das fe freigesetzte p-Nitrophenol bedingte Extinktion fortlaufend abgelesen oder mit Hilfe eines Kompensationssohreibers registriert wird. Methoden auf dieser Grundlage wurden beschrieben z. B. für Serum von W.J. Trajola u„ a. in American Journal of Clinical Pathology, Bd„ 43 (196ΰ), S. 2ül, und für Harn von Wacker, Ainador, Dorfium und Zimiaermunn in Das ärztliche Laboratorium, Bd. 11 (I9ü5), S, 204. Bei diesen Verfahren erfolgt die Inkubation in bekannten Puffern von üblicher'geringer Molarität und mithin geringer Pufferkapazität«thus impossible according to the opto-kinetic method, in that the buffered substrate solution mixed with serum and the Fe released p-nitrophenol-related absorbance read continuously or registered with the help of a compensation ear bur will. Methods based on this have been described e.g. B. for serum from W.J. Trajola et al. in American Journal of Clinical Pathology, Vol "43 (196ΰ), p. 2ül, and for Urn von Wacker, Ainador, Dorfium and Zimiaermunn in The Medical Laboratory, Vol. 11 (195), p. 204. In this process, the incubation takes place in known buffers of usual low molarity and therefore low buffer capacity «
Das Hauptpatent betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des GeliaIts an alkalischer Phospliatase im Serum unter Verwendung einer gepufferten wäßrigen p-Nitrophenylphosphatlüsung als Substrat und ™ mit Hilfe einer photonietrischen Messung der Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse dieses Phosphorsäureester, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Puffersubstanz Diäthanolamin-llydrochlorid verwendet. Ferner hat das Hauptpatent ein Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens mit einem Gehalt an gepuffertem p-Nitrophenylphosphat als Substrat, das gekennzeichnet ist durch die Verwendung von Diäthanolaiain-IIydrochlorid als Puffer, zum Gegenstand.The main patent relates to a method for determining the gelatin on alkaline phosphate in serum using a buffered aqueous p-nitrophenyl phosphate solution as substrate and ™ with the help of a photometric measurement of the initial speed the hydrolysis of this phosphoric acid ester, which is characterized in that the buffer substance used is diethanolamine-llydrochloride used. Furthermore, the main patent has a means for carrying out this process with a content of buffered p-Nitrophenyl phosphate as a substrate, which is characterized by the use of diethanolaiain-IIydrochlorid as a buffer, for Object.
009841/05AO009841 / 05AO
Dei Verwendung des Diüthanolamin-Hydrochlorid-Puffers bei einem plI-Hereich von 9,4 — 10,2 nach dem Verfahren des Uauptpatents ist die Enzyuiaktivität bemerkenswertorweise ca. 3mal höher als in allen bisher bekannten Puffern. Dieser Effekt, nämlich daß in oinera Puffer solcher Stärke das Enzym nicht überdurchschnittlich gehemmt, sondern im Gegenteil stark aktiviert wurde, war nicht vorherzusehen.The use of diethanolamine hydrochloride buffer in one pII range from 9.4 to 10.2 according to the method of the main patent the enzyme activity is remarkably about 3 times higher than in all known buffers. This effect, namely that in oinera buffers of such strength the enzyme is not above average was inhibited but, on the contrary, was strongly activated not foreseen.
Nach dem Verfahren des Hauptpatents ist es möglich, mit nur wenig Serum in äußerst kurzer Zeit die Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion zu messen. Dieses Verfahren gestattet somit, die llestimmung der alkalischen Phosphatase auf optisch-kinetischem Wege unter optimalen Bedingxmgen.Following the procedure of the main patent it is possible with only little serum to measure the initial rate of the enzyme reaction in an extremely short time. This procedure thus allows the determination of alkaline phosphatase by optical-kinetic means under optimal conditions.
Eine besonders optimale Steigerung der Lnzymaktivität wird bei diesem Verfahren erreicht, wenn man bei eineu pll-Vert von 9,8 urbeitet und eine 1 molare Pufferkonzcntration verwendet.A particularly optimal increase in enzyme activity is achieved with this method is achieved if you get a u pll-Vert of 9.8 and used a 1 molar buffer concentration.
Ein wesentlicher Vorteil der Methode besteht, wie im Ilauptpatent schon angeführt ist, darin, daß sie schnell und einfach arbeitet und daß sie vor allem eine sehr gute Heproduzierbarkeit besitzt. Gerade die bisher bekannten Methoden zeichneten sich durch eine sehr unvollkommene Heproduzierbarkeit aus, vas bisher immer zu relativ unsicheren Meßergebnissen führte.There is a major advantage of the method, as in the Ilaupt patent has already been mentioned in the fact that it works quickly and easily and, above all, that it is very easy to produce. The previously known methods in particular were characterized by a very imperfect ability to be reproduced, something that has always been the case up to now led to relatively uncertain measurement results.
üei den bisher bekannten Verfahren ve'nveudet man üblicherweise einen 0,05 bis 0,5 molaren Puffer. Für das Verfahren nach dem Hauptpatent ist demgegenüber als bevorzugter Bereich für den Diiithanolaiaiu-llydrochlorid—Puffer eine 0,5 bis 1,5 molare, vorzugsweise 1 molare, Konzentration angegeben.The previously known methods are usually used a 0.05 to 0.5 molar buffer. For the method according to the main patent, on the other hand, is a preferred range for the Diiithanolaiu-llydrochloride buffer a 0.5 to 1.5 molar, preferably 1 molar, concentration indicated.
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BAD ORIGiNAt 009841/05
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Es wurde nun gefunden, daß die Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum mit dein Verfahren des Ilauptpatents auch besonders günstig verläuft, wenn das üiathanolamin-IIydrochlorid in einer Konzentration von mindestens 1,5 und höchstens 4,5 Mol/l, insbesondere etwa 2 Mol/l, angewandt wird. Insbesondere auch durch Anwendung dieser relativ hohen Pufferkonzentration erhält man eine hohe Pufferkapazität, die die schädlichen Einwirkungen von CO„ (aus der Luft) ausschließt und den pII-V«rert während der gesamten Versuchsdauer konstant hält.It has now been found that the determination of the alkaline phosphatase in the serum with the method of the main patent also proceeds particularly favorably if the ethanolamine-IIhydrochloride in a concentration of at least 1.5 and at most 4.5 mol / l, in particular about 2 mol / l, is applied. In particular, by applying this relatively high concentration buffer to obtain a high buffering capacity, which excludes the harmful effects of CO "(from the air) and the p II-V" r ert during the entire test period keeps constant.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an alkalischer Phosphatase im Serum unter Verwendung einer mit üiäthanolamiu-Hydrochlorid gepufferten wäßrigen p-Nitrophonylphosphatlösung als Substrat und mit Hilfe einer photoinetrischeu Messung der Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse dieses Phosphorsäureesters nach IHlP . . . (deutsche Patentanmeldung P 15 98 778.7 (früher M 68 25G IXb/42 I)), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Diäthanolamin-liydrochlorid in mindestens 1,5- bis höchstens 4,5-raolarer, insbesondere etwa 2-niolarer, Konzentration verwendet.The present invention accordingly relates to a method for determining the content of alkaline phosphatase in serum using a buffered with üiäthanolamiu hydrochloride aqueous p-nitrophonyl phosphate solution as substrate and with With the help of a photoinetric measurement of the initial rate of hydrolysis of this phosphoric acid ester according to IHIP. . . (German Patent application P 15 98 778.7 (formerly M 68 25G IXb / 42 I)), the is characterized in that the diethanolamine liydrochlorid in at least 1.5 to at most 4.5 raolar, in particular about 2 niolar, concentration used.
Ferner umfaßt der Gegenstand der Erfindung ein Mittel zur Durchführung dieses \rerfahrens mit einem Gehalt an mit Diäthanolamin-llydrochlorid gepuffertem p-Nitrophenylpliospliat als Substrat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Puffer in mindestens i,5- und höchstens 4,5-, insbesondere etwa 2-raolarer, Konzentration vorliegt.Further, the object of the invention comprises means for carrying out this \ r experiencing containing with diethanolamine-p-buffered llydrochlorid Nitrophenylpliospliat as a substrate which is characterized in that the buffer in at least i, 5- and at most 4,5, in particular about 2-polar, concentration is present.
Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung. The following examples serve to explain the invention in more detail.
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BAD ORtOfNAt.BAD ORtOfNAt.
a) 210,28 g Diäthanolamin (kristallisierbar) werden in ca. 600 ml Mdestilliertem Wasser gelöst. Anschließend werden unter Rühren (Glasrührer) ca. 160 ml 2 N Salzsäure zugesetzt. Hierauf werden 500 mg Natriumazid und 101,5 mga) 210.28 g of diethanolamine (crystallisable) are dissolved in approx. 600 ml of distilled water. Then be 160 ml of 2N hydrochloric acid were added with stirring (glass stirrer). This is followed by 500 mg of sodium azide and 101.5 mg
WgOlp.6HpO zugegeben. Die Lösung wird mit Wasser auf "beinahe 1000ml aufgefüllt. Anschließend wird der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 1N Salzsäure genau auf 9,8 eingestellt und die Lösung mit bidestilliertem Wasser vollends auf 1000 ml aufgefüllt.WgOlp.6HpO added. The solution becomes "almost" with water 1000ml filled up. The pH is then adjusted to exactly 9.8 by adding 1N hydrochloric acid dropwise and the solution is made up to 1000 ml with double-distilled water.
b) Herstellung der Puff er-Substratlösung; b) preparation of the buffer substrate solution;
Eine Tablette, die 131,5 mg 100 %iges p-Nitrophenylphosphat-Dinatriumsalz enthält und welche bis zum Gesamtgewicht von 100 mg noch Natriumchlorid und gegebenenfalls etwas Feuchtigkeit enthält, wird in 10 ml der oben genannten Pufferlösung gelöst. Diese Lösung ist, bei 4°0 unter LichtausSchluß aufbewahrt, für die unten beschriebene EnzymbeStimmung 2 Tage verwendbar.One tablet containing 131.5 mg of 100% p-nitrophenyl phosphate disodium salt contains and which up to a total weight of 100 mg also sodium chloride and possibly some moisture contains, is dissolved in 10 ml of the above-mentioned buffer solution. This solution is stored at 4 ° 0 with exclusion of light, 2 days for the enzyme determination described below usable.
c) Enz ymb e s t immung c) Enz ymb est immunity
Puffer-Substrat und Serum werden auf 250C erwärmt. Die Temperatur wird in der Lösung kontrolliert.Buffer substrate and serum are warmed to 25 ° C. The temperature is controlled in the solution.
2 ml der Puffer-Substratlösung werden mit 0,02 ml Serum (frisch) versetzt und sehr gut gemischt. Nach etwa 1 Minute wird die Extinktion bei 250C gemessen und gleichzeitig die Zeit festgestellt (Stoppuhr). Die Messung wird jede Minute,2 ml of the buffer-substrate solution are mixed with 0.02 ml of serum (fresh) and mixed very well. After about 1 minute, the extinction is measured at 25 ° C. and the time is determined at the same time (stop watch). The measurement is made every minute,
3 Minuten lang, wiederholt.For 3 minutes, repeated.
Die Extinktionsmessung erfolgt z.B. mit einem Photometer, das mit einem Filter für die Quecksilberlinie bei. 405 nm ausgerüstet ist. Die Schichtdicke beträgt 1 cm.The absorbance measurement is carried out e.g. with a photometer with a filter for the mercury line. 405 nm is equipped. The layer thickness is 1 cm.
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Sind die Extinktionsdifferenzen ΖΛΕ/min zu Beginn der Messung größer als 0,2,'so wird die Bestimmung mit dem 1 : 5 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnten Serum wiederholt und das Ergebnis mit 5 multipliziert.If the extinction differences ΖΛΕ / min at the beginning of the measurement are greater than 0.2, the determination is repeated with the serum diluted 1: 5 with physiological saline and the result is multiplied by 5.
1 Internationale Enzymeinheit (U) ist die Enzymmenge, die 1 uMol Substrat in einer Minute unter Standardbedingungen umsetzt. 1 Milli-Einheit (mU) = 1/1000 U.1 International Enzyme Unit (U) is the amount of enzyme that 1 µmole substrate in one minute under standard conditions implements. 1 milli-unit (mU) = 1/1000 U.
Die Extinktionsdifferenz pro Minute ,Δ E4O5 wird in folgende Berechnungsformel eingesetzt:The absorbance difference per minute, Δ E4O5, is given in the following Calculation formula used:
Enzymkonzentration =.Δ.Ε4Ο5 · 5460 mIT/mlEnzyme concentration = .Δ.Ε4Ο5 · 5460 mIT / ml
Als Normalbereich gelten bei diesem Beispiel 90 - 250 mU (25°C)/ml.In this example, the normal range is 90 - 250 mU (25 ° C) / ml.
a) Herstellung des Puffers a) Preparation of the buffer
Die Herstellung des Puffers erfolgt analog Beispiel 1, wobei jedoch das MgCIp . 6HpO in einer Menge von 203,0 mg zugegeben wird.The buffer is produced in the same way as in Example 1, except that the MgClp. 6HpO in the amount of 203.0 mg is admitted.
b) Herstellung der Puffer-Substratlösung b) Preparation of the buffer-substrate solution
Eine Tablette, die 39,45 mg 100 ^iges p-Nitrophenylphosphat-Dinatriumsalz enthält, wird in 10 ml Pufferlösung von Beispiel 2 a) analog Beispiel 1 b) gelöst.One tablet containing 39.45 mg of 100% p-nitrophenyl phosphate disodium salt contains, is dissolved in 10 ml of the buffer solution from Example 2 a) analogously to Example 1 b).
c) Enzymbestimmung c) enzyme determination
Die Enzymbestimmung wird analog Beispiel 1c) durchgeführt, wobei jedoch 1 ml Puffer-Substratlösung zu 0,02 ml Serum gegeben wird.The enzyme determination is carried out analogously to Example 1c), however, 1 ml of buffer-substrate solution is added to 0.02 ml of serum.
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Die Berechnung des Enzymgehalts erfolgt in diesem Beispiel . mit der FormelThe calculation of the enzyme content is carried out in this example. with the formula
Enzymkonzentration = -Δ. E/Min . 2757 mU/mlEnzyme concentration = -Δ. E / min. 2757 mU / ml
Sofern in einer Variante dieses Beispiels 4,0 ml Puffer-Substratlösung zu 0,02 ml Serum zugesetzt werden, wird der Enzymbestimmung die folgende Formel zugrunde gelegt:If in a variant of this example 4.0 ml of buffer-substrate solution are added to 0.02 ml of serum, the enzyme determination is based on the following formula:
Enzymkonzentration =ΔΕ/Μίη . 10865 mU/mlEnzyme concentration = ΔΕ / Μίη. 10865 mU / ml
Die Zubereitung des Puffers erfolgt analog Beispiel 1 a), jedoch unter Verwendung der folgenden Mengen der einzelnen Bestandteile:The buffer is prepared analogously to Example 1 a), but using the following amounts of the individual components:
168,22 g Diethanolamin
128 ml 2n HCl
101,5 mg MgCl2 . 6H2O 168.22 grams of diethanolamine
128 ml of 2N HCl
101.5 mg MgCl 2 . 6H 2 O
Die übrigen Bestandteile werden in derselben Konzentration wie in Beispiel 1 angewandt.The remaining ingredients are in the same concentration as used in Example 1.
Ebenso erfolgt die Herstellung der Puffer-Substratlösung und die Enzymbestimmung analog Beispiel 1 b) und 1 c).The buffer-substrate solution and are also prepared the enzyme determination analogous to example 1 b) and 1 c).
In Abweichung von Beispiel 1 bereitet man den Puffer aus folgenden Bestandteilen:In deviation from Example 1, the buffer is prepared from the following Ingredients:
420,56 g Diäthanolamin , ohne zusätzliches Wasser 320 ml 2n HCl
101,5 mg MgCl2 . 6H2O420.56 g diethanolamine, without additional water 320 ml 2N HCl
101.5 mg MgCl 2 . 6H 2 O
Im übrigen erfolgt die Zubereitung der Substratlösung, die Herstellung des Puffer-Substratgemisches und die Enzymbestimmung analog Beispiel 1.In addition, the preparation of the substrate solution takes place, the production of the buffer-substrate mixture and the enzyme determination analogous to Example 1.
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