DE1902607A1

DE1902607A1 - Verfahren zur Herstellung von Lysolecithin

Info

Publication number: DE1902607A1
Application number: DE19691902607
Authority: DE
Inventors: Dr Hans Betzing
Original assignee: A Natterman und Cie GmbH
Current assignee: A Natterman und Cie GmbH
Priority date: 1968-04-17
Filing date: 1969-01-20
Publication date: 1969-11-20
Also published as: JPS5422965B1; DK126658B; NL6905960A; CH579095A5; FR2070050A1; GB1254056A; SE357753B; BE730690A; AT277461B; FI50128B; US3592829A; FI50128C; FR2070050B1

Description

Beschreibung zu der Patentanmeldung

A. Nattermann & Cie., GmbH, Köln-Braunsfeld 1, Postfach 105

betreffend
Verfahren zur Herstellung von Lysolecithin

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lysolecithin mit hohem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren aus Phospatidylcholin, d.h. Lecithin aus pflanzlichen oder tierischen Quellen.

Lysolecithin ist ein durch Abspaltung eines Fettsäurerestes wasserlöslich gemachtes Lecithin. Seine Herstellung erfolgt bisher durch Hydrolyse von chemisch reinem Lecithin (Phosphatidylcholin) auf enzymatischem Wege mittels der Phospholipase A des Schlangengifts. Bekannt ist auch die Herstellung eines synthetischen Mono-oleyl-lysolecithins, einer Verbindung, die bei pharmakologischen Untersuchungen eine Verbesserung \ev Kontraktionsfähigkeit des Herzens zeigte.

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Bei der bekannten enzymatischen Hydrolyse des Lecithins mit Phospholipase A wird im wesentlichen die in S-Stellung des Glyzerinrestes stehende Fettsäure abgespalten, -öa die ungesättigten Fettsäuren des Lecithins im wesentlichen sich gerade in dieser S-Stellung befinden, erhält man daher mit der bekannten enzymatischen Methode nur ein Lysolecithin, welches relativ arm an ungesättigten Fettsäuren ist.

Da bekanntlich gerade die ungesättigten und insbesondere die mehrfach ungesättigten Fettsäuren für die therapeutische Bedeutung der Lecithine von grosser Wichtigkeit sind, besteht seit langem der Wunsch, Lysolecithine mit hohem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren herzustellen. Wegen der Empfindlichkeit der mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist eine Synthese praktisch nicht möglich. Versuche, durch eine unspezifische wässrige Hydrolyse der Lecithine mittels Säuren oder Alkalihydroxyden zu solchen Lysolecithinen- zu gelangen, " zeigten keinen Erfolg, da hierbei im wesentlichen Glycerylphosphorylcholin durch Abspaltung beider Fettsäuren bzw. sogar eine Hydrolyse bis zur Glyzerinphosphorsäure durch Abspaltung auch des Cholinrestes eintritt.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass man durch eine milde Alkoholyse zu neuen bisher nicht bekannten Lysolecithinen gelangt, bei denen der Prozentsatz der ungesättigten Fettsäuren mindestens dem Ausgangsmaterial entspricht. Das Verfahren zur Herstellung von Lysolecithin bzw. vorwiegend

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Lysolecithin enthaltenden Gemischen mit Lecithin oder lecithin und Glyzerylphosphorylcholin mit hohem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren aus chemisch reinem Lecithin durch Abspalten eines Fettsäurerestes bestellt erfindungsgemäss darin, dann man eine alkoholische Lösung des Lecithins bei Temperaturen zwischen 1O⁰C und Siedetemperatur unter Schutz des inerten Gases bei Ausschluss von Licht, Luft und Feuchtigkeit mit einem schwachen Alkali behandelt, dann die Lösung neutralisiert, durch Dialyse gegen Petroläther oder durch wiederholte Behandlung mit Aceton die entstandenen Fettsäureester abtrennt, worauf man im Falle der Herstellung reinen Lysolecithins durch Behandlung mit Dichloräthan bzw. Dichloräthylen das entstandene Glyzerylphosphorylcholin entfernt und in bekannter V/eise das Lysolecithin isoliert. Durch die spezielle chemisch induzierte Spaltung des Lecithins mit schwachem Alkali in alkoholischer Lösung gelangt man relativ schnell zu xteaktionsgemischen, die einen hohen Anteil an Lysolecithin aufweisen, da durch die Alkoholyse in Gegenwart von schwachem Alkali die Spaltung auf der Stufe der Lysoverbindungen stehen bleibt bzw. die Abspaltung der zweiten Fettsäure wesentlich langsamer er-, folgt als die Abspaltung der ersten Fettsäure.

Die Bildung von Glycerylphorylchon ist durch V/ahl des speziellen Mediums und des milden Alkalis weitgehend zurückgedrängt, Die abgespaltenen Fettsäuren liegen in Form der Ester des zur Reaktion verwendeten Alkohols vor, woraus folgt, dass die Reaktion in einer Alkoholyse bzw. Umesterung besteht.

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Das Hauptprodukt Lysolecithin weist überraschenderweise einen hohen Gehalt an ungesättigten Fettsäuren auf. Die Tatsache, daß praktisch die gesamten ungesättigten, vor allem auch die essentiellen Fettsäuren des Phosphatidylcholins im verfahrensgemäß gewonnenen Lysolecithin noch vorhanden sind, beweist, daß die hydrolytische Abspaltung der Fettsäuren aus dem Phosphatidylcholinmolekül auch in ö<—Stellung stattfindet, in der eich bevorzugt die gesättigten Fettsäuren befinden*, im Gegen-

^ satz zur enzymatischen Spaltung mit Phospholipase A, die praktisch ausschließlich die in S-Stellung stehenden ungesättigten Fettsäuren abspaltet. Während durch den Angriff der Phoepholipase ausschließlichoL-Lysolecithin entsteht, liegt im Lysolecithin des vorliegenden Verfahrens ein Gemisch, von oC_ und ß-Lysolecithin vor, was für die biologische Wirkung von großer Bedeutung ist» Hajdu und Mitarbeiter (J.Pharmacol. Exptl.Therap. 120 (1957) S. 99), die beioO-Lysolecithinei hergestellt durch Einwirkung von Phospholipase A auf natürliches Phosphatidylcholin, am isolierten Froschherzen eine digitalis-

" ähnliche Wirkung nachweisen konnten, haben bei Anwendung einer Mischung voncC- und ß-Lysolecithin außerdem noch eine Erhöhung des Minuten Volumens durch Verbesserung der Kontraktionsfähigkeit des Herzens feststellen können.

Im allgemeinen können die üfaktionsgemisc he nach Abtrennung der entstandenen Fettsäureester unmittelbar verwendet werden. Falls man jedoch reines Lysolecithin wünscht, so muß aus dem Reaktionsgemisch das entstandene Glycerylphorylcholin entfernt werden, was erfindungsgemäß durch Verwendung

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von Dichloräthan bzw. Dichlorethylen als Lösungsmittel geschieht.

Ein besonders geeignetes Lecithinausgangsmaterial ist das nach DBP 1 053 299 erhaltene Phosphatidylcholin der Soja-Bohne. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens entsteht hiermit bis zu 80$ Lysolecithin mit mehr als 70$ ungesättigten Fettsäuren im Fettsäureanteil. Als schwaches Alkali sind Magnesium- und Calciumoxid besonders geeignet, aber auch Magnesiumhydroxidcarbonat und Magnesiumcarbonat sowie Natriumhydrogencarbonat und Natriumcarbonat sind noch brauchbar.Auch Ammoniak wirkt in geringer Konzentration als schwaches Alkali im Sinne der Erfindung, weshalb man die Spaltung auch in wasserfreier alkoholischer Ammoniaklösung durchführen kann. Als Lösungsmittel können Methanol und Äthanol verwendet werden; Methanol in Verbindung mit aktiviertem Magnesium bzw. Calciumoxid stellt die bevorzugte Ausführungsform dar.

Die Wahl des zur Umesterung verwendeten Agens ist in Verbindung mit der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit von entscheidendem Einfluß auf die Zusammensetzung des Endproduktes. Außerdem spielt bei den Oxiden des Calciums und des Magnesiums deren Aktivität eine wichtige Rolle. So wurde gefunden, daß man mit einem handelsüblichen Magnesiumoxid wie es s.B. als Magnesium us ta im Handel ist, nach etwa 3-a1üadigem Kochen in Methanol unter Rückfluß einen Gehalt an Lysolecäihin von ca. 5O5C erreicht. Wird ein solches Magnesiumoxid durch Sthen an der Luft desaktiviert, so muß man bereits 7 Stunden

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unter Rückfluß kochen, um zum gleichen Ergebnis zu gelangen. Mit einem bei 300 - 1000° geglühten Magnesiumoxid genügt es, wenn man 30 Minuten zum Sieden erhitzt oder man kann auf ein Erhitzen völlig verzichten und braucht nur noch ca. 4 Stunden bei Raumtemperatur zu rühren, um zur gleichen Menge Lysolecithin zu gelangen. Die stets einhergehende Bildung von GLyceryl·- phosphorylcholin kann auf ein Minimum herabgesetzt werden,wenn man die Reaktion bei Temperaturen unterhalb + 2O⁰C (=Zimmertemperatur) ablaufen läßt, wobei die Reaktionszeit entsprechend verlängert werden muß. Sie Konzentration des Phosjbatidylcholins in der Reaktionslösung hat keinen nennenswerten Einfluß auf den Reaktionsverlauf, anders dagegen veralt es sich mit der Menge an Magnesium- bzw. Calciumoxid. Eine Erhöhung dieser die Umesterung bewirkenden Stoffe führt zu einer beschleunigten Lysolecithinbildung, aber gleichzeitig auch zu einem Anstieg an unerwünschtem Glycerylphosphorylcholin. Eine Konzentrationsabnahme verlangsamt die Lysolecithinbildung und führt zwangsläufig zu einer längeren Reaktionszeit.

Die nach dem vorliegenden Verfahren erhaltenen Produkte stellen in der Regel Substanzgemische dar, die neben dem Ljhd-

lecithin noch unverbrauchtes Phosphatidylcholin sowie Glyeerylphosphorylcholin und Fettsäureester enthalten. Mittels üblicher Dialyse durch einen dünnen Gummischlauch oder durch eine wiederholte Behandlung mit kaltem Aceton lassen sich die Fettsäureester schnell und auf einfache Weise quantitativ entfernen. Die so resultierenden Gemische aus Lysolecithin,Phosphatidylcholin und Glycerylphosphorylcholin können zur intravenösen

Injektion

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verwendet werden. Um hierfür klare Lösung zu erhalten, empfiehlt sich ein kleiner Zusatz eines Alkalisalzes, der Desoxychlosäure- bzw. Apocholsäure. Hierdurch wird auch der

restliche an sich wasserunlösliche LecithinrAnteil des Reaktionsgemisches vollständig wasserlöslich.

Sollte die Entfernung des Glycerylphosphorylcholins erwünscht sein, so behandelt man das Substanzgemisch mit Dichloräthan bzw. Dichloräthylen, dem zur Verbesserung der Ausbeute zweckmäßigerweise 5$ Äthanol zugefügt wurde. Dabei gehen Phosphatidylchiin und Lysolecithin in Lösung während das Glycerylphosphorylcholin dagegen ungelöst zurück bleibt, so daß es durch anschließende Filtration praktisch quantitativ entfernt werden kann.

Aus dem resultierenden Gemisch kann das Lysolecitin mit Hilfe einer Gegenstromverteilung im System: Petroläther - 98$ Methanol (2 : 1) oder durch präparative Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten isoliert und quantitativ bestimmt werden. Eine typische Analyse eines nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Lysolecithins aus Phospatidylcholin der Soja-Bohhe zeigt folgende Werte:

Gesamtphosphor 5»95 %

Cholin . 23,50 <j> Fettsäuren 52,00 i»

Phosphor-Cholin-

Molverhältnis 1,01 #

Jodzahl 77 '

909847/(UIf .

Die gaschromatographische Analyse der Fettsäuren des · Lysolecithins ergibt folgende Durchschnittswerte:

gesätt. C₁₆ 13,0 $>

tt π ^

18 2,5 $>

ungesätt. C₁₈I 7,0 fi

" C₁₈2 72,0 fo * " C 3 5,5 $

Demgegenüber zeigt ein Lysolecithin, das aus dem gleichen Ausgangsmaterial, nämlich Phosphatidylcholin aus Sojabohnen, jedoch mittels des enzymatischen Hydrolyseverfahrens durch Schlangengift aus Crotalus adamanteus erhalten wurde, eine deutlich andere Fettsäurebesetzung: ·:

gesätt. C₁₆ 26,7 ?°

¹¹ G₁₈ 4,5 fo

" ungesätt. C _1 6,7 i°

" C₁₈2 57,3 $>

ti

4,8 fo

Geht man von tierischem Phosphatidylcholin, z.B. gewonnen aus Eilecithin, das an sich weniger ungesättigte Fettsäuren enthält, aus, so ergibt das vorliegende Verfahren Überraschenderweise ein Lysolecithin, das etwa 41 $ ungesättigte Fettsäuren enthält, während man auf bekannte Weise durch enzymatische Hydrolyse mittels Schlangengift ein Lysolecithin mit

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etwa 95 i° gesättigten Fettsäuren, d.h. also ein Produkt das nur einen geringen Anteil von etwa 5 % ungesättigte Fettsäuren, aufweist, enthält.

Beispiele Beispiel 1

300 g chemisch reines Phosphatidylcholin, gewonnen aus dem Phosphatidgemisch der Soja-Bohne, werden unter Rühren und Schutz eines inerten Gases in 4,5 1 Methanol gelöst und mit 30 g Magnesiumoxid, aktiviert durch 1,5 stündiges Glühen bei 850°, unter Ausschluß von Luft und Feuchtigkeit 4,2 Stunden bei 18⁰C gerührt. Nach dem Abtrennen des Magnesiumoxids, zweckmäßigerweise mit Hilfe einer Filterhülse, wird die Lösung zur Neutralisation 20 - 30 Minuten mit 45 g saurem Aluminiumoxid gerührt und dann filtriert. Nach dem Abdampfen des Methanols im Vakuum unter Inertgasschutz wird der zähe, ölige Rückstand mittels Petroläther in einen geeigneten Gummischlauch überführt und 8 Stunden gegen Petroläther (Kp 30 - 50°) im Soxhlet dialysiert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum unter (Ausbeute 102 g = 34 #), im Retentat eine fast farblose, pastenartige Substanz zurück, die aus einer Mischung von Lecithin, Lysolecithin und GPC besteht. Zur Abtrennung des GPC wild die Substanz in 1,8 1 Dichloräthan-Äthanol (95 : 5) aufgenommen, vom Unlöslichen abfiltriert und die klare Lösung durch Destillation im Vakuum unter Stickstoff vom Lösungsmittel befreit. Es resultieren 155 g (= 52 %) einer fast farblosen Substanz pastenartiger Konsistenz, die nach dünnschichtchromatographischer Trennung und anschließender Phosphor-Bestimmung aus 52,5 $> Lysolecithin und 47,5 # Lecithin besteht.

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Das Substanzgemisch ergibt folgende Analysenwerte:

Jodzahl:	89	75 $>
Phosphor:	4,	9 f°
Cholin:	18,	5 io
Fettsäuren:	61,
Phosphor-Cholin-		01
Molverhältnis:	1.

Die gaschromatographische Bestimmung ier Fettsäuren ergibt folgende Durchschnittswerte:

Palmitinsäure:	10,8 ?
Stearinsäure:	2,5 7
ölsäuiej	6, 5Si
Linolsäure	74,8 fo
Linolensäure:	5,4 %>
Beispiel 2

300 g Phosphatidylcholin werden wie oben beschrieben in 6 1 Methanol gelöst und mit 30 g Calciumoxidpulver, das durch 2-stündiges Erhitzen bei 450° C aktiviert wurde, 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Das Oxid wird abfiltriert und die methanolische Lösung dann durch Zugabe von 5 ml 5 ^iger methanolischer Salzsäure neutralisiert. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum unter Stickstoff wird der Rückstand zur Abtrennung der Fettsäuremethylester mit kaltem Aceton wiederholt behandelt, durch Destillation im Vakuum vom Aceton befreit und dann in ca. 2 1 Dichloräthan-Äthanol (95 : 5) aufgenommen. Nach dem Filtrieren wird die klare Lösung im Vakuum unter Stickstoff vom Lösungsmittel befreit. Ea resultieren 195 g (= 65 $>) einer fast farblosen Substanz von pastenartiger Konsistenz, die nach dünnschicht- bzw. säulenchromatographischer Analyse aus 55 i> Lysolecithin und 45 $> Lecithin besteht.

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Beispiel 3

200 g chemisch reines Phosphatidylcholin werden unter Rühren und dem Schutz eines inerten Gases in 1 1 Äthanol gelöst und mit 30 .g Calciumoxid (aktiviert durch 2-stündiges Erhitzen bei 450° G) 10 Stunden bei 40° C unter Ausschluß von Luft und Feuchtigkeit gerührt. Nach dem Abfiltrieren des Oxids wird die äthanolische Lösung zur Neutralisation mit 40 g saurem Aluminiumoxid 20 Minuten gerührt, dann filtriert und schließlich das Lösungsmittel im Vakuum unter Stickstoff abdestilliert. Zur Entfernung der gebildeten Fettsäureäthylester wir der Rückstand wiederholt mit kaltem Aceton behandelt und dann durch Destillation im Vakuum unter. Stickstoff vom Aceton befreit. Es bleiben 150 g (= 75 ^c/<>) eines Gemisches aus 45 # Lysolecithin, 50 # Lecithin und 5 /» GPC zurück.

Beispiel 4

100 g Phosphatidylcholin werden in 1,2 1 Methanol gelöst und mit 10 g aktiviertem Calciumoxid, wie in Beispiel 3 beschrieben, 1,33 Stunden bei 20° C gerührt. Nach dem Entfernen des Oxids wird die Lösung zur Neutralisierung noch 30 Minuten mit 20 g saurem Aluminiumoxid gerührt, anschließend filtriert und dann das Methanol im Vakuum unter Inertgasschutz abdestilliert. Die entstandenen Fettsäuremethylester werden durch Dialyse in einem Gummischlauch gegen Petroläther (siehe Beispiel 1) quantitativ entfernt. Kach dem Abdestillieren des Petroläthers unter Stickstoff wird der Rückstand in 400 ml Dichloräthan-Äthanol (95 » 5) aufgenommen, vom Unlöslichen abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum unter Stickstoff abdestilliert. Es resultieren 22 g eines Gemisches aus 80 # Lysolecithin und 20 fi Lecithin.

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Beispiel 5

300 g Fhosphatidylcholin pflanzlichen Ursprungs werden unter Rühren und Schutz eines inerten Gases in 3 1 Methanol gelöst und mit 37»5 g'handelsüblichem Magnesiumoxid (Magnesia unta) 3f2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Fach dem Abkühlen des Reaktion gemisches auf Zimmertemperatur erfolgt die weitere Aufarbeitung analog Beispiel 1. Ausbeute 165 g eines Gemisches aus 51 $ w Lysolecithin und 49 % Lecithin.

ORIGINAL INSPECTED

Claims

BR. ING, F. ΛνίΓΕΒΤΙΙΟΡΡ 1 Q Π 9 R Π 7 DiFL·. j>g. g. puls ι α υ /_ υ υ / BR.E.v.FECHMANN DH. ING. D. BEHRENS β MÜNCHEN BO lA-35 466 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Lysolecithine mit hohem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren bzw. vorwiegend derartige Lysolecithine enthaltenden Gemischen mit Lecithin oder Lecithin und Glycerylphosphorylcholin aus chemisch reinem Lecithin pflanzlicher oder tierischer Herkunft, dadurch gekennzeichnet, dass man eine alkoholische Lösung des Lecithins bei Temperaturen zwischen 1O⁰G und Siedetemperatur unter Schutz eines inerten Gases bei Ausschluss von Licht, Luft und Feuchtigkeit mit einem schwachen Alkali behandelt, dann die Lösung neutralisiert, durch Dialyse gegen Petroläther oder durch wieder-

At*.f*,l· ³O

holte Extraktion mit kaltem die entstandenen Fettsäureester abtrennt, worauf man im Falle der Herstellung reinen Lysolecithins durch Behandlung, mit Dichloäthan bzw. Dichloathylen Glycerylphosphorylcholin entfernt und dann in bekannter ,veise das Lysolecithin isoliert.

it

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als schwaches Alkali ein Oxid dea Magnesiums oder Calciums verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine methanolische .Lösung und als schwaches Alkali aktiviertes Magnesium- bzw. Calciumoxid verwendet und bei Temperaturen zwischen 1o und 2o C arbeitet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine äthanolische Lösung und als schwaches Alkali aktiviertes Caciumoxid verwendet und bei erhöhten Temperaturen arbeitet

5· Verfahren nach Anspruch 1 — 4-» dadurch g e k e η η zeichnet, dass man das Reaktionsgemisch durch eine Behandlung mit saurem Aluminiumoxid neutralisiert.

6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Entfernung dea Glycerylphoaphorylcholins Dichloräthan bzw. Dichloräthylen verwendet, dem 5 ^ Äthanol zugesetzt sind.