DE177497T1 - Immobilisierung von nukleinsaeuren. - Google Patents
Immobilisierung von nukleinsaeuren.Info
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Claims (5)
1. NukI einsäure-Matriχ syst em, umfassend:
einen festen Träger: ;
einen Kuppler, beinhaltend ein DNA-Molekül mit einem
ersten und einem zweiten Ende, wobei das erste Ende kovalent an den festen Träger gebunden ist und das zweite
Ende nicht an den festen Träger gebunden ist und eine Begrenzungs-Enzymhalbstelle darstellt; und
ein DNA-Molekül mit einem ersten Ende mit einer zu dem
zweiten Ende des Kupplers komplementären Begrenzungs-Halbstelle,
wobei das Molekül an der komplementären Halbstelle
an das zweite Ende des Kupplers gekuppelt ist.
2. Matrixsystem nach Anspruch 1, wobei der Kuppler ein aus natürlich vorkommender DNA durch aufeinanderfolgende
Behandlung der DNA mit zwei verschiedenen Begrenzungs-EndonukIeasen
isoliertes Begrenzungs-Fragment
umfaßt.
3. Matriχ sy st em nach Anspruch 2, wobei die natürlich
vorkommende DNA aus der DNA des Plasmids pl)C9 erhalten
wordenist.
4. " tfatrixsystem nach Anspruch 3, wobei die zwei
^verschiedenen Begrenzungs-EndonukLeasen BgI I und Hind III
sind.
5.Matrixsystem nach Anspruch 1, wobei der Kuppler OLigonükleötid
und Mononukleotid umfaßt, wobei das .-'Wo.nonükleotid
in vitro chemisch an das Ol igonukIeotid gebunden
fwörden ist.
6. Matrixsystem nach Anspruch 5, wobei das OLigonukleotid
ein synthetischer Ei rvz'ei strang mit der Basensequenz 5'-d(fpCp&pG)-3*
ist.
■■?■. Matrixsystem nach Anspruch 6, wobei dem OligonukLeotid
an sei riem 3'-OH-Ende ein bi ot i nyL i ertes Ribonuk Leot i d
äiddiert worden ist.
so. Matrixsystem nach Anspruch 7, wobei der feste Träger
Ägarose ist, an der Streptavidiη kovaLent gebunden ist und
wobei das biotinyLierte RibonukIeotid durch Kondensation
äh das St reptavid i η gebunden worden ist.
9. Matrixsystem nach Anspruch 5, wobei das OLigonukLeotid
ein·an seinem 3*-0H-Ende gebundenes RibonukLeotid
aufweist.
'10 .Mat r i χ sys t em nach Anspruch 9, .wobei de r feste Träger
ZeLLüLose ist, an der Adipinsäurehydrazid kovaLent gebunden
ist und wobei das Ribonuk L eot id durc h Per j odatox idation
in ein D.ialdehyd umgewandelt worden ist und wobei das Dia Idehyd durch Kondensation an das Adipinsäurehydrazid
:gebunden worden ist.
11. Matrixsystem nach Anspruch 1, wobei der feste Träger
Zellulose ist, an der Adipinsäurehydrazid kovalent gebunden
i st.
O Ί 77497
12. Matrixsystem nach Anspruch 1, wobei der Kuppler ein
Begrenzungs-Fragment und ein MononukLeotid umfaßt/ wobei
das MononukLeotid in vitro chemisch an das Begrenzungs-Fragment gebunden worden ist.
13. Matrixsystem nach Anspruch 12, wobei das Begrenzungs-Fragment ein an seinem 3%-0H-Ende gebundenes RibonukIeotid
aufwei st.
14. Matrixsystem nach Anspruch 13, wobei der feste Träger
Zellulose ist, ander Adi pinsäurehydrazid kovalent gebunden ist, wobei das RibonukIeotid durch Perjodatoxidation
in ein Dialdehyd umgewandelt worden ist und wobei das Dialdehyd durch Kondensation an das Adipinsäurehydrazid
gebunden worden ist.
15. Matrixsystem nach Anspruch Λ, wobei der feste Träger
Agarose ist/ an der streptavidin kovalent gebunden ist.
16. Kuppler-Matrixsystem umfassend:
einen festen Träger; und
einen Kuppler mit einem Ende, das kovalent an den festen Träger gebunden ist und einem Abschnitt, der
sich von dem gebundenen Ende erstreckt und eine Begrenzungsenzym-Rekognitions st el Ie enthält;
wobei die Rekognitionsstel Ie aktiviert werden kann,
um die Rekognitionsstel Ie in eine Begrenzungsenzym-Halbstelle
umzuwandeln.
17. Matrixsystem nach Anspruch 16, wobei der Kuppler ein
aus natürlich vorkommender DNA durch aufeinanderfolgende
Behandlung der DNA mit zwei verschiedenen Begrenzungs-EndonukIeasen
isoliertes Begrenzungs-Fragment umfaßt.
-A-
18. Matrix sy stem nach Anspruch 16, wobei der Kuppler ein
Bregrenzungs-F ragment und eiη MpnonukLeotid umfaßt, wobei
das, Mönonukleotid in vitro chemiseh an das Begrenzungs-Fr.agmeht
g e b unden;worden i st.
19i Hatrixsystem nach Anspruch16, wobei der feste Träger
Zellulose ist, an der Adi pi nsäu rehyd razi d kpyaL ent gebunden
ist.
20. ;Matrixsyst em nach Anspruch 17, wobei die natürlich
yankommendeDNA aus der DNA des Plasmids pUC.9 erhalten
worden ist.
21. Matrixsyst em nach Anspruch 20, wobei die zwei
verschiedenen Begrenzungs-EndonukIeasen BgI I und Hind III
sind.
22> Matrixsystem nach Anspruch 18, wobei, dem Begrenzungs-Fragment
an seinem 3'-0H-Ende ein RibonukLeptid addiert
worden ist.
23:. ;Mat r i χ sy st em nach Anspruch 22, wobei der feste Träger
ZeIIuI öse ist, an der Adipinsäurehydrazid kovalent ge-■
,bu.nde.-n, ist, wobei das R i bonuk I eot i d durch Perjodato,xidat..i.on
in ein Dialdehyd umgewandelt worden ist und
wobei das Dial.dehyd durch Kondensation an das Adipinsäurehydrazid
gebunden worden ist.
2,4 . Kup.pl e r-Nuk Lei nsäu re-Sy st em, umfassend :
ein DNA-MoLeküI mit einem ersten Ende mit einer
... Beg r enzung s enzym-H a lbstelle; und
einen Kuppler, beinhaltend ein zweites DNA-Molekül mit einem ersten Ende mit einer zu der Begrenzungs-Halbstelle
des ersten DNA-Moleküls komplementären
Begrenzungsenzym-HaLbsteLLe, wobei das erste Ende
an das Ende des ersten DNA-MoLeküLs gekuppeLt ist/
sowie ein zweites Ende, das mit einem festen Träger verbi ndba r ist.
2 5. NukLeinsäuresystem nach Anspruch 24, wobei der KuppLer
ein OLigonukLeotid umfaßt, an das Biotin addiert worden
ist.
26. NukLeinsäuresystem nach Anspruch 24, wobei die DNA
ein Begrenzungs-EndonukLeasefragment ist.
27. NukLeinsäuresystem nach Anspruch 25, wobei das
OLigonukLeotid ein EinzeLstrang mit der Basensequenz
5%-d(TpCpGpG)-3l ist.
28. NukLeinsäuresystem nach Anspruch 26, wobei die Begrenzungs-EndonukL
ease Aval ist.
29. Verfahren zum Binden einer exponierten HaLbsteile
einer BegrenzungssteLLe für eine gegebene Begrenzungs-EndonukLease
an einen festen Träger, umfassend, in beliebiger
Reihenfolge, das
kovalente Binden eines KuppLers, beinhaltend ein
OLigonukLeotid, das die BegrenzungssteLLe enthält,
an den festen Träger; und
SpaLten des 0LigonukIeotids an der BegrenzungssteLLe
mit der Begrenzungs-Endonuklease, um die exponierte
Halbstelle zu erzeugen.
30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei der feste Träger
eine Matrix aus Zellulose- oder Agarose-Adipinsäuredehydrazid
ist und das chemische Binden des BgI I-Endes
des Begrenzungs-Fragments an den festen Träger erreicht
w i r d durch
Addition eines RibonukLeotids an das Ende der BgI I-Halbstelle des Begrenzungs-Fragments;
Oxidieren des RibonukLeotids mit Perjodat, um dessen
Ribose-cis-Diöl in ein DiaLdehyd umzuwandeln; und
Vermischen des■Begrenzungs-Fragments mit der Matrix.
31. Verfahren zum Binden einer exponierten Halbst el Ie
einer Begrenzungsstelle für jede erwünschte der Begrenz ungs-Endonukleasen Hind III, Pst I, H inc II, BamH I,
Sma I oder EcoR I an einen festen Träger, umfassend
das Isolieren aus Plasmid pUC9 DNA eines BgI I/Hind III-Begrenzungs-Fragments;
chemisches Binden des BgI I-Endes des Begrenzungs-Fragments an den festen Träger; und
Spalten des Begrenzungs-Fragments mit der Begrenzungs-Endonuklease, für die eine exponierte 'Halbstelle erwünscht
ist.
32. Verfahren zum Immobilisieren von DNA an einem festen
Träger, umfassend das
stabile Binden an den festen Träger über ein Ende eines Oligonukleotids, das an seinem anderen Ende eine erste
Ha Lbs teile für eine bekannte Begrenzungs-Endonuklease
besitzt und für das die DNA eine Rekognitionsstelle
für die Begrenzungs-Endonuklease enthält;
Spalten der Begrenzungsstelle an der DNA mit der Begrenzungs-Endonuklease,
um eine zweite und eine dritte
Halbstelle an der DNA zu bilden; und
Verbinden der ersten HalbsteLle entweder mit der zweiten
oder der dritten HalbstelLe durch Behandlung mit DNA-L i gase.
33. Verfahren zum Immobilisieren von DNA an einem festen
Träger, umfassend das
Binden der DNA an einen Oligonukleotid-Kuppler über
korrespondierende Begrenzungs-Endonukleasen-Halbstellen,
lokalisiert an einem Ende der DNA und einem ersten Ende des Kupplers; und
stabile· Binden des Kupplers an den festen Träger über
ein zweites Ende des Kupplers.
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