DE177497T1 - Immobilisierung von nukleinsaeuren. - Google Patents

Immobilisierung von nukleinsaeuren.

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DE177497T1 DE198484901838T DE84901838T DE177497T1 DE 177497 T1 DE177497 T1 DE 177497T1 DE 198484901838 T DE198484901838 T DE 198484901838T DE 84901838 T DE84901838 T DE 84901838T DE 177497 T1 DE177497 T1 DE 177497T1
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W. Robert Frederick Md 21701 Blakesley
A. John Myersville Md 21773 Thompson
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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Claims (5)

1. NukI einsäure-Matriχ syst em, umfassend: einen festen Träger: ;
einen Kuppler, beinhaltend ein DNA-Molekül mit einem ersten und einem zweiten Ende, wobei das erste Ende kovalent an den festen Träger gebunden ist und das zweite Ende nicht an den festen Träger gebunden ist und eine Begrenzungs-Enzymhalbstelle darstellt; und
ein DNA-Molekül mit einem ersten Ende mit einer zu dem zweiten Ende des Kupplers komplementären Begrenzungs-Halbstelle, wobei das Molekül an der komplementären Halbstelle an das zweite Ende des Kupplers gekuppelt ist.
2. Matrixsystem nach Anspruch 1, wobei der Kuppler ein aus natürlich vorkommender DNA durch aufeinanderfolgende Behandlung der DNA mit zwei verschiedenen Begrenzungs-EndonukIeasen isoliertes Begrenzungs-Fragment umfaßt.
3. Matriχ sy st em nach Anspruch 2, wobei die natürlich vorkommende DNA aus der DNA des Plasmids pl)C9 erhalten wordenist.
4. " tfatrixsystem nach Anspruch 3, wobei die zwei ^verschiedenen Begrenzungs-EndonukLeasen BgI I und Hind III sind.
5.Matrixsystem nach Anspruch 1, wobei der Kuppler OLigonükleötid und Mononukleotid umfaßt, wobei das .-'Wo.nonükleotid in vitro chemisch an das Ol igonukIeotid gebunden fwörden ist.
6. Matrixsystem nach Anspruch 5, wobei das OLigonukleotid ein synthetischer Ei rvz'ei strang mit der Basensequenz 5'-d(fpCp&pG)-3* ist.
■■?■. Matrixsystem nach Anspruch 6, wobei dem OligonukLeotid an sei riem 3'-OH-Ende ein bi ot i nyL i ertes Ribonuk Leot i d äiddiert worden ist.
so. Matrixsystem nach Anspruch 7, wobei der feste Träger Ägarose ist, an der Streptavidiη kovaLent gebunden ist und wobei das biotinyLierte RibonukIeotid durch Kondensation äh das St reptavid i η gebunden worden ist.
9. Matrixsystem nach Anspruch 5, wobei das OLigonukLeotid ein·an seinem 3*-0H-Ende gebundenes RibonukLeotid aufweist.
'10 .Mat r i χ sys t em nach Anspruch 9, .wobei de r feste Träger ZeLLüLose ist, an der Adipinsäurehydrazid kovaLent gebunden ist und wobei das Ribonuk L eot id durc h Per j odatox idation in ein D.ialdehyd umgewandelt worden ist und wobei das Dia Idehyd durch Kondensation an das Adipinsäurehydrazid :gebunden worden ist.
11. Matrixsystem nach Anspruch 1, wobei der feste Träger Zellulose ist, an der Adipinsäurehydrazid kovalent gebunden i st.
O Ί 77497
12. Matrixsystem nach Anspruch 1, wobei der Kuppler ein Begrenzungs-Fragment und ein MononukLeotid umfaßt/ wobei das MononukLeotid in vitro chemisch an das Begrenzungs-Fragment gebunden worden ist.
13. Matrixsystem nach Anspruch 12, wobei das Begrenzungs-Fragment ein an seinem 3%-0H-Ende gebundenes RibonukIeotid aufwei st.
14. Matrixsystem nach Anspruch 13, wobei der feste Träger Zellulose ist, ander Adi pinsäurehydrazid kovalent gebunden ist, wobei das RibonukIeotid durch Perjodatoxidation in ein Dialdehyd umgewandelt worden ist und wobei das Dialdehyd durch Kondensation an das Adipinsäurehydrazid gebunden worden ist.
15. Matrixsystem nach Anspruch Λ, wobei der feste Träger Agarose ist/ an der streptavidin kovalent gebunden ist.
16. Kuppler-Matrixsystem umfassend:
einen festen Träger; und
einen Kuppler mit einem Ende, das kovalent an den festen Träger gebunden ist und einem Abschnitt, der sich von dem gebundenen Ende erstreckt und eine Begrenzungsenzym-Rekognitions st el Ie enthält;
wobei die Rekognitionsstel Ie aktiviert werden kann, um die Rekognitionsstel Ie in eine Begrenzungsenzym-Halbstelle umzuwandeln.
17. Matrixsystem nach Anspruch 16, wobei der Kuppler ein aus natürlich vorkommender DNA durch aufeinanderfolgende Behandlung der DNA mit zwei verschiedenen Begrenzungs-EndonukIeasen isoliertes Begrenzungs-Fragment umfaßt.
-A-
18. Matrix sy stem nach Anspruch 16, wobei der Kuppler ein Bregrenzungs-F ragment und eiη MpnonukLeotid umfaßt, wobei das, Mönonukleotid in vitro chemiseh an das Begrenzungs-Fr.agmeht g e b unden;worden i st.
19i Hatrixsystem nach Anspruch16, wobei der feste Träger Zellulose ist, an der Adi pi nsäu rehyd razi d kpyaL ent gebunden ist.
20. ;Matrixsyst em nach Anspruch 17, wobei die natürlich yankommendeDNA aus der DNA des Plasmids pUC.9 erhalten worden ist.
21. Matrixsyst em nach Anspruch 20, wobei die zwei verschiedenen Begrenzungs-EndonukIeasen BgI I und Hind III sind.
22> Matrixsystem nach Anspruch 18, wobei, dem Begrenzungs-Fragment an seinem 3'-0H-Ende ein RibonukLeptid addiert worden ist.
23:. ;Mat r i χ sy st em nach Anspruch 22, wobei der feste Träger ZeIIuI öse ist, an der Adipinsäurehydrazid kovalent ge-■ ,bu.nde.-n, ist, wobei das R i bonuk I eot i d durch Perjodato,xidat..i.on in ein Dialdehyd umgewandelt worden ist und wobei das Dial.dehyd durch Kondensation an das Adipinsäurehydrazid gebunden worden ist.
2,4 . Kup.pl e r-Nuk Lei nsäu re-Sy st em, umfassend :
ein DNA-MoLeküI mit einem ersten Ende mit einer ... Beg r enzung s enzym-H a lbstelle; und
einen Kuppler, beinhaltend ein zweites DNA-Molekül mit einem ersten Ende mit einer zu der Begrenzungs-Halbstelle des ersten DNA-Moleküls komplementären
Begrenzungsenzym-HaLbsteLLe, wobei das erste Ende an das Ende des ersten DNA-MoLeküLs gekuppeLt ist/ sowie ein zweites Ende, das mit einem festen Träger verbi ndba r ist.
2 5. NukLeinsäuresystem nach Anspruch 24, wobei der KuppLer ein OLigonukLeotid umfaßt, an das Biotin addiert worden ist.
26. NukLeinsäuresystem nach Anspruch 24, wobei die DNA ein Begrenzungs-EndonukLeasefragment ist.
27. NukLeinsäuresystem nach Anspruch 25, wobei das OLigonukLeotid ein EinzeLstrang mit der Basensequenz 5%-d(TpCpGpG)-3l ist.
28. NukLeinsäuresystem nach Anspruch 26, wobei die Begrenzungs-EndonukL ease Aval ist.
29. Verfahren zum Binden einer exponierten HaLbsteile einer BegrenzungssteLLe für eine gegebene Begrenzungs-EndonukLease an einen festen Träger, umfassend, in beliebiger Reihenfolge, das
kovalente Binden eines KuppLers, beinhaltend ein OLigonukLeotid, das die BegrenzungssteLLe enthält, an den festen Träger; und
SpaLten des 0LigonukIeotids an der BegrenzungssteLLe mit der Begrenzungs-Endonuklease, um die exponierte Halbstelle zu erzeugen.
30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei der feste Träger eine Matrix aus Zellulose- oder Agarose-Adipinsäuredehydrazid ist und das chemische Binden des BgI I-Endes des Begrenzungs-Fragments an den festen Träger erreicht
w i r d durch
Addition eines RibonukLeotids an das Ende der BgI I-Halbstelle des Begrenzungs-Fragments;
Oxidieren des RibonukLeotids mit Perjodat, um dessen Ribose-cis-Diöl in ein DiaLdehyd umzuwandeln; und
Vermischen des■Begrenzungs-Fragments mit der Matrix.
31. Verfahren zum Binden einer exponierten Halbst el Ie einer Begrenzungsstelle für jede erwünschte der Begrenz ungs-Endonukleasen Hind III, Pst I, H inc II, BamH I, Sma I oder EcoR I an einen festen Träger, umfassend das Isolieren aus Plasmid pUC9 DNA eines BgI I/Hind III-Begrenzungs-Fragments;
chemisches Binden des BgI I-Endes des Begrenzungs-Fragments an den festen Träger; und
Spalten des Begrenzungs-Fragments mit der Begrenzungs-Endonuklease, für die eine exponierte 'Halbstelle erwünscht ist.
32. Verfahren zum Immobilisieren von DNA an einem festen Träger, umfassend das
stabile Binden an den festen Träger über ein Ende eines Oligonukleotids, das an seinem anderen Ende eine erste Ha Lbs teile für eine bekannte Begrenzungs-Endonuklease besitzt und für das die DNA eine Rekognitionsstelle für die Begrenzungs-Endonuklease enthält;
Spalten der Begrenzungsstelle an der DNA mit der Begrenzungs-Endonuklease, um eine zweite und eine dritte Halbstelle an der DNA zu bilden; und
Verbinden der ersten HalbsteLle entweder mit der zweiten oder der dritten HalbstelLe durch Behandlung mit DNA-L i gase.
33. Verfahren zum Immobilisieren von DNA an einem festen Träger, umfassend das
Binden der DNA an einen Oligonukleotid-Kuppler über korrespondierende Begrenzungs-Endonukleasen-Halbstellen, lokalisiert an einem Ende der DNA und einem ersten Ende des Kupplers; und
stabile· Binden des Kupplers an den festen Träger über ein zweites Ende des Kupplers.
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