DE1642726B - Process for the biotechnological production of L-threonine - Google Patents

Description

aerobes Schütteln der Kultur ode* unter Belüftung und Rühren einer Submerskultur. Der pH-Wert des Mediums während der Züchtung sollte innerhalb eines Bereiches von etwa 4,5 bis 9,0 gehalten werden. Gewöhnlich ist nach einer Züchtungsperiode von 2 bis 7 Tagen unter diesen Bedingungen eine wesentliche Menge von L-Threonin entstanden und hat sich in dem Fermentationsmedium angesammelt.aerobic shaking of the culture or * with aeration and stirring of a submerged culture. The pH of the Medium during cultivation should be kept within a range of about 4.5 to 9.0. Usually is an essential one after a cultivation period of 2 to 7 days under these conditions Amount of L-threonine was generated and accumulated in the fermentation medium.

Nach Vervollständigung der Fermentation kann das L-Threonin aus der Fermentationsfiüssigkeit nach üblichen Verfahren, z. B. lonenaustauschharzbehandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung mit Mctallsalzen, Adsorption, Chromatographie od. dgl. gewonnen werden.After the fermentation is complete, the L-threonine can be added from the fermentation liquid usual procedures, e.g. B. ion exchange resin treatment, extraction with solvents, precipitation with Metal salts, adsorption, chromatography or the like. Can be obtained.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.The following examples serve to illustrate the invention.

Beispiel 1example 1

Escherichia coli ATCC 21 150 wird als Impfstamm benutzt. Dieser Stamm wird 24 Stunden in einem Impfmedium mit der Zusammensetzung (je Liter Wasser) 20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt. 25 g/l NaCl und 50 mg/1 Diaminopimelinsäure gezüchtet.Escherichia coli ATCC 21 150 is used as a vaccine strain used. This strain is in an inoculation medium with the composition (per liter Water) 20 g / l glucose, 10 g / l peptone, 10 g / l yeast extract. 25 g / l NaCl and 50 mg / l diaminopimelic acid bred.

Die entstehende Impfkultur wird in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in einen 250 ecm dreieckigen Kolben übertragen, der 20 ecm eines Produktionsmediumi. der folgenden Zusammensetzung (je Liter Wasser) enthält.The resulting inoculum is in a ratio of 10 percent by volume in a 250 ecm triangular Piston transferred, the 20 ecm of a production mediumi. contains the following composition (per liter of water).

100 g/l D-Fructose
20 g/l (NHJ₂SO₄
1 g/l KH₂PO₄
0,3 g/l MgSO₄-7 H₂O
30 g/l CaCO₃
100 mg/1 Diaminopimelinsäure100 g / l D-fructose
20 g / l (NHJ ₂ SO ₄
1 g / l KH ₂ PO ₄
0.3 g / l MgSO ₄ -7 H ₂ O
30 g / l CaCO ₃
100 mg / 1 diaminopimelic acid

Der pH-Wert des Fermentationsmediums beträgt 7,2. 100 mg/l Diaminopimelinsäure
50 mg/1 DL-Methionm
25 mg/1 L-Isoleucin
20 g/l CaCO,The pH of the fermentation medium is 7.2. 100 mg / l diaminopimelic acid
50 mg / 1 DL-methionm
25 mg / 1 L-isoleucine
20 g / l CaCO,

Nach Beendigung der Züchtung betrug die Menge an in dem Fermentationsmedium erzeugtem und ίο angesammeltem L-Threonin 6,7 mg/ccm.After the completion of the cultivation, the amount of and generated in the fermentation medium was ίο accumulated L-threonine 6.7 mg / ccm.

Beispiel 3Example 3

Die Züchtung wird in der gleichen Weise, wie im Beispiel 2 beschrieben, bewirkt, nur daß eine Seifenabfallflüssigkeit, die einer Entsalzung unterworfen worden ist, mit einer Glycerinkonzentration von 50 g/l an Stelle der Rohrzuckerabfallmelassen in der Produktionsmediumzusammensetzung des Beispiels 2 benutzt wird. Als Ergebnis betrug die Menge des in dem Fermentationsmedium erzeugten L-Threonins 6,1 mg/ccm.The cultivation is effected in the same manner as described in Example 2, except that a soap waste liquid, which has been subjected to desalination, with a glycerol concentration of 50 g / l instead of the cane sugar waste molasses in the production medium composition of example 2 is used. As a result, the amount of L-threonine generated in the fermentation medium was 6.1 mg / cc.

Die Entsalzungsbehandlung der Seifenabfallflüssigkeit wurde in der folgenden Weise durchgeführt. Zunächst wurde ;ine aus dem Alkaliverfahren unter Verwendung von Hammeltalg als hauptsächlichem Ausgangsmaterial erhaltene Abfallflüssigkeit durch Zusatz von konzentrierter Salzsäure bis zum pH 7,0 neutralisiert. Die Flüssigkeit wurde dann zwecks Entfernung eines Niederschlages einmal filtriert und anschließend auf Vn ihres Volumens konzentriert. Drnach wurde das ausgefällte Natriumchlorid abfiltriert und das Filtrat (Glycerin: etwa 30% [Gewichtsvolumen], Natriumchlorid: etwa 22% [Gewichtsvolumen]) verwendet. The desalination treatment of the waste soap liquid was carried out in the following manner. Next one from the alkali process using mutton tallow as the main Waste liquid obtained from the starting material by adding concentrated hydrochloric acid to pH 7.0 neutralized. The liquid was then filtered once to remove a precipitate and then filtered focused on Vn of their volume. Afterwards the precipitated sodium chloride was filtered off and the filtrate (glycerin: about 30% [weight volume], sodium chloride: about 22% [weight volume]) was used.

Beispiel 4Example 4

Escherichia coli ATCC 21 148 wird als Impfstamm benutzt. Er wird in ein Produktionsmedium der folgenden Zusammensetzung übertragen:Escherichia coli ATCC 21 148 is used as a vaccine strain. He becomes a production medium of the following composition:

3535

4040

Die Züchtung wird dann unter 96stündigem aeroben Schütteln bei 30° C ausgeführt. Nachdem die Züchtung 96 Stunden bewirkt worden ist, beträgt die in dem Fermentationsmedium angesammelte Menge an r.-Thrconin 12,1 mg/ccm. Das L-Threonin wird durch eine [onenaustauschharzbehandlung nach Entfernung der Zellen und des CaCO₃ aus der Fermentationsflüssigkeit gewonnen.The cultivation is then carried out with aerobic shaking for 96 hours at 30 ° C. After the cultivation was effected for 96 hours, the amount of r.-thrconine accumulated in the fermentation medium is 12.1 mg / cc. The L-threonine is obtained from the fermentation liquid by an ion exchange resin treatment after removing the cells and the CaCO _3.

Beispiel 2Example 2

Lscherichia coli ATCC 21 148 wird als Impfstamm benutzt. Eine Impfkultur dieses Stammes wird unter der gleichen, im Beispiel 1 beschriebenen Bedingung, in einem Praduktionsmedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet.Lscherichia coli ATCC 21 148 is used as a vaccine strain used. An inoculum of this strain is made under the same condition described in Example 1, grown in a production medium of the following composition.

83 g/l83 g / l

Rohrzuckerabfallmelassen
(50 g/l für Zucker berechnet)Waste cane sugar molasses
(50 g / l calculated for sugar)

14 g/l (NH₄)₂SO₄
lg/1 KH₂PO₄
0,3 g/l MgSO₄-7 H₂O14 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄
lg / 1 KH ₂ PO ₄
0.3 g / l MgSO ₄ -7 H ₂ O

50 g/l Xylose
14 g/l (NHJ₂SO₄ 50 g / l xylose
14 g / l (NHJ ₂ SO ₄

1 g/l KH₂PO₄ 1 g / l KH ₂ PO ₄

0,3 g/l MgSO₄-7 H₂O
100 mg/1 Diaminopimelinsäure
50 mg/1 DL-Methionin
10 g.'l Maisquellwasser
20 g/I CaCO_n 0.3 g / l MgSO ₄ -7 H ₂ O
100 mg / 1 diaminopimelic acid
50 mg / 1 DL-methionine
10 g. L corn steep water
20 g / I CaCO _n

Die Züchtung wird dann in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 1. beschrieben, ausgeführt. Die Menge des in dem Fernientationsmedium nach Vollendung der Fermentation erzeugten i.-Thrconins betrug 6,3 mg/ccm.Cultivation is then carried out in the same way and under the same conditions as in Example 1. described, executed. The amount of in the remote orientation medium after the fermentation is complete I. thrconine produced was 6.3 mg / cc.

Neben der Anwendung der oben aufgezählten billigen Kohlenstoffquellen als HauptkohlenstofF-quelle in dem Nährmedium können auch andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Maltose, Rohrzucker, Mannit, organische Säuren, Sorbit u. dgl., in kleineren Mengen verwendet werden.In addition to the use of the cheap carbon sources listed above as the main carbon source Other carbon sources such as glucose, maltose, cane sugar, Mannitol, organic acids, sorbitol and the like can be used in smaller amounts.

Claims (1)

Hilfe der vorliegenden Erfindung dadurch insofernHelp the present invention thereby Patentanspruch: ausgeschaltet, als die benutzten KohlenstoffquellenClaim: turned off when the carbon sources used nicht teuer sind, während die mit ihnen erzeugtenare not expensive while those made with them Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Mengen an L-Threonin ziemlich groß sind. i.-Threonin durch Züchten von Escherichia coli 5 Das Verfahren der vorliegenden Erfindung, in in assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquel- welchem die obenerwähnten »AbfalU-Kohlenstofflen, Mineralsalze und Diaminopimelinsäure ent- quelle FruHose, Rohrzuckerabfallmelassen, Stärke haltenden Nährmedien bei hierfür üblichen pH- ermöglicht die Ansammlung des L-Threonins in der Werten und Temperaturen, dadurch ge- Kulturflüssigkeit in Mengen von 6 mg/ml oder kennzeichnet, daß man als Escherichia coli, m darüber. Das wird in den unten gebrachten Beispielen Escherichia coli ATCC 21 148 oder Escherichia aufgezeigt. Aus all dem kann leicht ersehen werden, coli ATCC 21 150 einsetzt und als Hauptkohlen- daß das Verfahren zur Herstellung von L-Threonin stoffquelle Fructose, Xylose, Stärke, Rohrzucker- durch Fermentation nach der vorliegenden Erfindung abfallmelassen, entsalzte Seifenabfa'lflüssigkeiten bemerkenswert wirtschaftlich ist. oder Gemische dieser Materialien verwendet. 15 Wie oben erörtert, enthält das Nährmedium gemäßProcesses for the biotechnological production of quantities of L-threonine are quite large. i.-threonine by culturing Escherichia coli 5 The method of the present invention, in into assimilable carbon and nitrogen sources, which contain the abovementioned »waste carbons, Mineral salts and diaminopimelic acid are removed from FruHose, cane sugar waste molasses, starch holding nutrient media at the pH customary for this purpose enables L-threonine to accumulate in the Values and temperatures, as a result, culture fluid in amounts of 6 mg / ml or indicates that one is called Escherichia coli, m above. This is shown in the examples below Escherichia coli ATCC 21 148 or Escherichia indicated. From all of this it can easily be seen coli ATCC 21 150 uses and the main carbon is the process for the production of L-threonine source of material fructose, xylose, starch, cane sugar by fermentation according to the present invention waste molasses, desalinated soap waste liquids is remarkably economical. or mixtures of these materials are used. 15 As discussed above, the nutrient medium contains according to der vorliegenden Erfindung als Hauptkohlenstoffquelle, Fruktose, Rohrzuckerabfallmelassen. Stärkethe present invention as the main carbon source, Fructose, cane sugar waste molasses. strength oder stärkehaltige Substanzen, Seifenabfallflüssigkei-or starchy substances, soap waste liquids ten, die Glycerin enthalten, Xylose oder xylosehaltige 20 Substanzen oder Mischungen dieser Kohlenstoff-that contain glycerine, xylose or xylose-containing 20 substances or mixtures of these carbon i.-Threonin ist eine sogenannte essentielle, für die quellen. Die verwendeten Seifenabfallflüssigkeiten Ernährung von Mensch und Tier wichtige Amino- sind diejenigen, die nach der Neutralisation konzenjäure. sie ist in Getreideproteinen nur in kleinen friert worden sind (gewöhnlich auf ein Sechstel des Mengen enthalten, verbessert bzw. ergänzt aber deren Volumens) und durch Filtration von dem ausge-Kährwert ganz erheblich. Die biotechnische Herstel- ²5 schiedenen Natriumchlorid befreit worden sind, oder lung von i.-Threonin durch Züchten von i.-Threonin diejenigen, die durch eine Ionenaustauschbehandlung erzeugenden Mikroorganismen, die zur Fani'Iie entsalzt worden sind. Die genannten Kohlenstoff-Enterobacteriaceae gehören, in wäßrigen Kohlenstoff- quellen können in dem Medium in verschiedenen lind Stickstoffquellen, Mineralsalze und Wachstums- Konzentrationen verwendet werden. Gewöhnlich jcfakorcn enthaltenden Nährmedien ist bereits bc- 3° doch wird eine Konzentration von 4 bis 20 Gewiclitskannt. wozu auf die USA.-Patentschriften 2 937 121 prozent dieser Substanzen mit Bezug auf die anderen lind 2 937 122 verwiesen sei. die die Stämme Mediumbestandteile, mit Ausnahme der Haupt-Escheiichia coli ATCC 13 070 und ATCC 13 071 in, kohlenstoffquelle und der Diaminopimelinsäure (siehe wie vorstehend angegeben, zusammengesetzten unten) benutzt, wobei die anderen Nährstoffbestand-Medien züchten, wobei jedoch als HauptkohlenstofT- 35 teile im allgemeinen in den Mengen angewandt werqiiellen Sorbit oder Mannit verwendet werden. Bei den. wie das bei der Züchtung von Mikroorganismen der Züchtung dieser Stämme in einem Medium, wie üblich ist.i.-Threonine is a so-called essential for the swell. The soap waste liquids used for nutrition of humans and animals are important amino- are those that, after neutralization, are konzenjic acid. it is only frozen in small amounts in cereal proteins (usually contained in one sixth of the amount, but improves or supplements their volume) and, through filtration, of the extended nutrient value. The biotechnical manufacturing ² 5 different sodium chloride have been freed, or lung of i.-threonine by culturing i.-threonine those produced by an ion exchange treatment microorganisms which have been desalted to Fani'Iie. The carbon Enterobacteriaceae mentioned belong to, in aqueous carbon sources can be used in the medium in various and nitrogen sources, mineral salts and growth concentrations. Usually, nutrient media containing factors is already bc- 3 °, but a concentration of 4 to 20% by weight is known. for which reference is made to U.S. Patents 2,937,121 percent of these substances with respect to the others and 2,937,122. which uses the medium components of the strains, with the exception of the main Escheiichia coli ATCC 13 070 and ATCC 13 071 in, carbon source and diaminopimelic acid (see composite below as indicated above), the other nutrient component growing media, but with the main carbon T-35 parts are generally used in the amounts appropriate for sorbitol or mannitol. Both. as is the case with the cultivation of microorganisms by culturing these strains in a medium as is usual. es in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben ist. Die anderen zu benutzenden Nährstoffe sind in derit is described in Example 1 below. The other nutrients to be used are in the wird '-Threonin bei Verwendung von ATCC 13 070 Technik wohlbekannt. Zu ihnen gehören eine Stick-ZU 1.2 mg ml und bei Verwendung von ATCC 13 071 4° stoffquellc, anorganische Verbindungen u.dgl.. die zu 0.7 mg'ml erhalten. von den angewandten M^;kroorganismen in den rich-'-Threonine becomes well known using ATCC 13 070 technique. To them belong a stick-ZU 1.2 mg ml and when using ATCC 13 071 4 ° stoffquellc, inorganic compounds etc. which get 0.7 mg ml. of the applied M ^; croorganisms in the right Dic Rrfindimg betrifft ein Verfahren zur biotech- tigen Mengen verwendet werden. Als Stickstoffquelle iiivthcn Herstellung von i.-Thrconin durch Züchten können verschiedene Arten von anorganischen oder von Fschcrichia coli in assimilierbare Kohlenstoff- organischen Salzen oder Verbindungen, wie Harnimd Sticksloffqucllcn. Mineralsalze und Diamino- 45 stoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, pimelinsäure enthaltenden Nährmedien bei hierfür Ammoniumsulfat. Ammoniumnitrat, Ammoniumühl.chen pH-Werten und Temperaturen, das dadurch «cetat, Ammoniumphosphat usw. oder natürliche ückenn/cichnct ist, daß mar. als Escherichia coli. stickstoffhaiVige Substanzen, wie Maisquellwasser, F.sdu richia coli ATCC 21 148 oder IZschcrichia coli Hefeextrakt. Fleischextrakt, Pcpton. Fischmehl. 21 150 einsetzt und als Hauptkohlcnstorfqucllc Fruk- 5" Bouillon- Caseinhydrolysate, lösliche Fischextrakte, tose. Xylose. Stärke. Rohrzuckcrabfallmclasscn. ent- Rcisklciccxtraktc usw. benutzt werden. Von diesen salzte Scifenabfallfliissigkcitcn oder Gemische dieser Substanzen kann man entweder jede für sich oder in Materialien verwendet. Kombinationen von zweien oder mehreren vcrwcn-Dic Rrfindimg relates to a method for biotech- tigen quantities to be used. As a nitrogen source iiivthcn production of i.-Thrconine by growing can be different kinds of inorganic or from Fschcrichia coli into assimilable carbon-organic salts or compounds, such as urine Sticksloffqucllcn. Mineral salts and diamino- 45 or ammonium salts, such as ammonium chloride, pimelic acid-containing nutrient media for this purpose ammonium sulfate. Ammonium nitrate, ammonium cooler pH values and temperatures, which result in acetate, ammonium phosphate, etc. or natural ückenn / cichnct is that mar. as Escherichia coli. Nitrogen sharkVarious substances, such as corn steeple, F.sdu richia coli ATCC 21 148 or IZschcrichia coli yeast extract. Meat extract, pcpton. Fish meal. 21 150 is used and the main carbonaceous source is fruct 5 "bouillon-casein hydrolysates, soluble fish extracts, roar. Xylose. Strength. Cane sugar waste classes. ent- Rcisklciccxtraktc etc. can be used. Of these Salted waste liquids or mixtures of these substances can either be used individually or in Materials used. Combinations of two or more Frimduns:· "emäß ist gefunden worden, daß Fmk- den. Anorganische Verbindungen, die dem Nährtose. Rohr/uckerabfallmelasscn, Scifenabfallaugcn, 55 medium zugesetzt werden können, umfassen Magnedic Glycerin enthalten, Stärke und stärkehaltige Sub- siumsulfat," Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenstanzcn oder Xylose und xylosehaltige Substanzen, phosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulciie ziemlich billig sind und ganz allgemein als land- fat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Calctumwirtschaftlichc und industrielle Abfallstoff ange- chlorid oder andere geeignete Metallsalze von Magnesehen werden, bemerkenswert wirksame Gmndmatc- ^6o sitnn, Calcium. Natrium, Mangan usw. Wie in der rialicn für die Herstellung von i.-Thrconin unter Ver- Technik üblich, können dem Medium wachstumswcndung der Mikroorganismen Escherichia coli fördernde Mittel, wie Biotin oder Vitamine, zuge-ATCC 21 148 oder Fscherichia coli ATCC 21 150 setzt werden.Frimduns: It has been found that substances. Inorganic compounds which can be added to the nutrient, cane / sugar waste molasses, scifen waste glasses, 55 medium include magnedic glycerine, starch and starchy substance sulphate, sodium phosphate, potassium dihydrogen substances or Xylose and xylose-containing substances, phosphate, potassium monohydrogen phosphate, iron sulphate are fairly cheap, and are generally used as agricultural or other iron salts, manganese chloride, calcium and industrial waste, chloride or other suitable metal salts of magnesium, remarkably effective ^basic substances, calcium. Sodium, manganese, etc. As is customary in the rialicn for the production of i.-Thrconine under Ver Technik, agents such as biotin or vitamins, such as biotin or vitamins, can be added to the medium for the growth of the microorganisms. ATCC 21 148 or Fscherichia coli ATCC 21 150 are set. sind. Zur gleichen Zeit werden die bei Verwendung Die Züchtung wird bei Temperaturen bewirkt, beiare. At the same time, when using the growth is effected at temperatures at dieser Substanzen als Ausgangsstoffe erzeugten Men- ⁶5 denen die eingesetzten Stämme gewöhnlich wachsen gen an τ.-Threonin stark erhöht, wenn man mit den und sich vermehren. Das umfaßt gewöhnlich einen üblkhen Verfahren der Technik vergleicht. Demzu- Temperaturbereich von 20 bis 40° C. Die Züchtung folge sind die Mangel der bekannten Verfahren mit erfolgt unter aeroben Bedingungen, z.B. durchof these substances as starting materials produced men- ⁶ 5 which the strains used usually grow gene at τ.-threonine greatly increased when one with the and multiply. This usually involves some common technique of comparing art. In addition, temperature range from 20 to 40 ° C. The breeding consequence are the shortcomings of the known processes with takes place under aerobic conditions, for example by