DE1642699C3 - Process for the production of mycophenolic acid - Google Patents

Description

Mykophenolsäure besitzt die FormelMycophenolic acid has the formula

ΓΗ ^OH ΓΗ ^OH

Y"3 !Y "3!

HO₂C ■ CH₂ ■ CH₂ · C=CH · CH₂ —f\- CO_x HO ₂ C ■ ■ CH ₂ CH ₂ · C = CH · CH ₂ -f \ - CO _x

I οI ο

CH₃OA/-CH/CH ₃ OA / -CH /

CH₃ CH ₃

In der GB-PS 11 57 100 wird berichtet, daß diese Säure und deren Salze und Ester mitotische Unterdrükker sind und Antitumoraktivität sowie immunosuppressive Aktivität aufweisen.In GB-PS 11 57 100 it is reported that this Acid and its salts and esters are mitotic suppressors and have antitumor activity as well as immunosuppressive Have activity.

In der Literatur ist die Herstellung dieser Säure sowohl durch Oberflächenkultivierung als auch durch submerse aerobe Kultivierung von Mykophenolsäure erzeugenden Penicilliumarten, wie z. B. Penicillium brevicompactum, beschrieben. Ganz allgemein sind einem Fachmann geeignete Mikroorganismen, die Zusammensetzung geeigneter Nährböden, die Kultivierungsbedingungen, das Verfahren zur Isolierung der Mykophenolsäure aus dem Medium und Methoden zur Überführung derselben in pharmazeutisch brauchbare Salze geläufig. Das bisher verwendete Verfahren zur Herstellung von Mykophenolsäure durch submerse aerobe Kultivierung war sehr schlecht und ergab nur eine Ausbeute von etwa 9 mg Säure/l Kiilturfiltrat.In the literature, the production of this acid is both by surface cultivation and by submerged aerobic cultivation of mycophenolic acid-producing Penicillium species, e.g. B. Penicillium brevicompactum. In general, microorganisms suitable for a person skilled in the art are the Composition of suitable nutrient media, the cultivation conditions, the method of isolation of the Mycophenolic acid from the medium and methods of making it pharmaceutically useful Commonly used with salts. The previously used process for the production of mycophenolic acid by submerse aerobic cultivation was very poor and gave a yield of only about 9 mg acid / l kililtur filtrate.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Mykophenolsäure zu schaffen, das höhere Ausbeuten ermöglich!.The invention was based on the object a To create a process for the production of mycophenolic acid that enables higher yields !.

Es wurde nunmehr die überraschende Feststellung gemacht, daß bei einer submersen aeroben Kultivierung erhöhte Ausbeuten an Mykophenolsäure erhalten werden können, wenn man dafür sorgt, daß die Nährlösung während des gesmaten Kultivierungsverfahrens eine bestimmte Menge assimilierbares Magnesium enthält.It has now been made the surprising discovery that in a submerged aerobic cultivation increased yields of mycophenolic acid can be obtained by ensuring that the Nutrient solution contains a certain amount of assimilable magnesium during the entire cultivation process contains.

Demgemäß wird die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Mykophenolsäure durch aerobe submerse Kultivierung eines Mykophenolsäure erzeugenden Penicillium-Vertreters, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Nährmedium verwendet, das zu Beginn der Fermentation Quellen von C, N, P, S und K und geringfügige Mengen von Spurenelementen sowie zusätzlich pro Liter des Nährmediums eine Magnesiumquelle in einer Konzentration von 10 bis 100 mg Magnesium enthält, und daß im Nähmedium während im wesentlichen des ganzen Verfahrens eine Magnesiumqueile vorhanden ist.Accordingly, the object on which the present invention is based is achieved by a method for the production of mycophenolic acid by aerobic submerged cultivation of a mycophenolic acid-producing Penicillium representative, which is characterized in that a nutrient medium is used that at the beginning of the fermentation sources of C, N, P, S and K and small amounts of trace elements as well as a magnesium source in a concentration of 10 to per liter of the nutrient medium Contains 100 mg of magnesium, and that in the sewing medium Magnesium swell is present throughout essentially the entire process.

Geeignete aktive Penicillium-Arten sind:Suitable active Penicillium species are:

Penicillium brevicompactum, D i e r c k χ (beispielsweise Stämme, die in The Commonwealth Mycological Institute, Kew, England unter der Bezeichnung I.M.I. 40225, 92034, 92044, 92262, 92274 und 94149 niedergelegt sind),Penicillium brevicompactum, D i e r c k χ (for example, strains listed in The Commonwealth Mycological Institute, Kew, England under the designation I.M.I. 40225, 92034, 92044, 92262, 92274 and 94149),

Penicillium stoloniferum. Thorn (beispielsweise I.M.I. 39824, 91960, 92219 und 126540, wobei der letztere Stamm der Stamm I.C.I. Nr. ACC 438 ist) undPenicillium stoloniferum. Thorn (for example I.M.I. 39824, 91960, 92219 and 126540, the latter strain being I.C.I. No. ACC 438 is) and

Penicillium viridicatum, W e s 11 i η g (beispielsweise I.M.I 49096).Penicillium viridicatum, W e s 11 i η g (for example I.M.I 49096).

Die Kultivierung wird üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 18 bis 38° C und vorzugsweise im Bereich von 20 bis 27° C ausgeführt.The cultivation is usually carried out at a temperature in the range of 18 to 38 ° C and preferably carried out in the range from 20 to 27 ° C.

Beispiele für eine geeignete Magnesiumquelle sind nichtgiftige lösliche Derivate oder Salze des Magnesiums, wie z. B. Magnesiumsulfat und die magnesiumhaltigen Verbindungen, die in Maisauszugsflüssigkeiten und ähnlichen Materialien enthalten sind. Es ist darauf hinzuweisen, daß das Verfangen der Mikroorganismen nach Magnesium der Konzentration der Zellen proportional ist, die wiederum der Menge der im Nährboden vorhandenen assimilierbaren Stickstoffquelle proportional ist. Je nach den Bedingungen werden 0,00175 bis 0,00288 mg Magnesium benötigt, damit 1 mg Zellen (Trockengewicht) gebildet werden können, die Mykophenolsäure erzeugen. Wenn die Stickstoffquelle gerade aufgebraucht werden ist, dann führen 0,09 bis 0,26 mg assimilierbare Stickstoffquelle je nach den Bedingungen zur Bildung von 1 mg Zellen (Trockengewicht).Examples of a suitable source of magnesium are non-toxic soluble derivatives or salts of magnesium, such as. B. Magnesium sulfate and those containing magnesium Compounds found in corn extract fluids and similar materials. It's on it to point out that the entanglement of the microorganisms after magnesium the concentration of the cells which in turn is proportional to the amount of assimilable nitrogen source present in the nutrient medium is proportional. Depending on the conditions, 0.00175 to 0.00288 mg of magnesium are required so that 1 mg of cells (dry weight) can be formed that produce mycophenolic acid. If the If the nitrogen source has just been used up, then carry 0.09 to 0.26 mg of assimilable nitrogen source each according to the conditions for the formation of 1 mg cells (dry weight).

Außer der Magnesiumquelle enthält das Kulturmedium zumindest am Anfang des Verfahrens Quellen für wesentliche Elemente, d. h. Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Kalium.In addition to the magnesium source, the culture medium contains sources for at least at the beginning of the process essential elements, d. H. Carbon, nitrogen, phosphorus, sulfur and potassium.

Auch enthält das Kulturmedium gewöhnlich geringfügige Mengen von sogenannten Spurenelementen, wie z. B. Eisen, Mangan, Zink, Molybdän und Kupfer. Die Kohlenstoffquelle kann aus einem Zucker, wie z. B. Saccharose oder Glucose, einem mehrwertigen Alkohol, wie z. B. Glycerin oder einem Ester davon, einem Polysaccharid, wie z. B." Stärke oder einem pflanzlichen öl bestehen. Die Stickstoffquelle kann eine anorganische oder eine organ'sche Quelle sein. Beispiele für anorganische Stickstoffquellen sind Ammoniumsalze oder Nitrate, wie z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumtar-The culture medium usually also contains small amounts of so-called trace elements such as z. B. iron, manganese, zinc, molybdenum and copper. The carbon source can be from a sugar, such as. B. Sucrose or glucose, a polyhydric alcohol, such as. B. glycerol or an ester thereof, a Polysaccharide, e.g. B. "Starch or a vegetable oil. The nitrogen source can be an inorganic or be an organic source. Examples of inorganic nitrogen sources are ammonium salts or nitrates, such as. B. ammonium nitrate, ammonium tar-

trat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat und Calciumnitrat Beispiele für organische Stickstoffquellen sind Aminosäuren, wie z, B. Glycin, ein Samenmehl, wie z, B. Baumwollsamenmehl, Maisauszugsflüssigkeit, Pepton, Harnstoff, Hefeextrakte und Fleischextrakte. Die Quellen für Phosphor, Schwefel und Kalium können beispielsweise aus Kalium-dihydrogen-phosphat, einem Sulfat bzw. Kaliumchlorid bestehen.stepped, ammonium sulfate, ammonium phosphate, sodium nitrate, Potassium Nitrate and Calcium Nitrate Examples of organic nitrogen sources are amino acids such as Glycine, a seed meal such as cottonseed meal, corn extract, peptone, urea, yeast extracts and meat extracts. The sources of phosphorus, sulfur and potassium can for example be from Potassium dihydrogen phosphate, a sulfate or potassium chloride exist.

Bei einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren in einem sogenannten unausgewogenen Kulturmedium durchgeführt, d.h., daß die Menge der verschiedenen Nährstoffe im Kulturmedium derart gewählt wird, daß bei einem Zwischenstadium des Verfahrens eine Quelle von einem lebenswichtigen Element (mit Ausnahme von Magnesium), z. B. die Stickstoff- oder Kohlenstoffquelle, verbraucht ist, während die Quellen der anderen lebenswichtigen Elemente noch vorhanden sind. Bei einem solchen Verfahren wird vorzugsweise die Stickstoffquelle zuerst verbraucht Dabei kann man so vorgehen, daß das Kulturmedium zu Beginn des Verfahrens i bis 300 g Kohlenstoffquelle (z.B. 100g Glucose) pro Liter Kulturmedium und 0,01 bis 10 g, z. B. 0,65 g. Stickstoffquelle (als Gewicht des elementaren Stickstoffs ausgedrückt) pro Liter Kulturmedium enthält Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in einen> unausgewogenen Kulturmedium ausgeführt wird, bei dem die Stickstoffquelle zuerst verbraucht wird, dann erhält man erfahrungsgemäß bessere Ausbeuten an Mykophenolsäure gegenüber der Verwendung eines ausgewogenen Kulturmediums (d. h. i-ines Kulturmediums, bei dem die Nährstoffe jeweils zu annähernd derselben Zeit verbraucht sind). Bei der Anwendung eines unausgewogenen Kulturmediums kann man auch so vorgehen, daß die Stickstoffquelle verbraucht ist, während immer noch etwas Kohlenstoffquelle und natürlich auch Magnesiumquelle im Kulturmedium vorhanden sind, worauf die verfügbare Kohlenstoffquelle aufrechterhalten oder erhöht wird, indem weitere Mengen der Kohlenstoffquelle zugegeben werden.In one embodiment, the method of the invention is implemented in a so-called unbalanced manner Culture medium carried out, i.e. that the amount of various nutrients in the culture medium such it is chosen that at an intermediate stage of the procedure a source from a vital one Element (with the exception of magnesium), e.g. B. the nitrogen or carbon source is consumed, while the sources of the other vital elements are still there. With one of these Method, the nitrogen source is preferably consumed first. You can proceed in such a way that the Culture medium at the beginning of the process 1 to 300 g carbon source (e.g. 100 g glucose) per liter Culture medium and 0.01 to 10 g, e.g. B. 0.65 g. Nitrogen source (expressed as the weight of elemental nitrogen) per liter of culture medium If that contains The method according to the invention is carried out in an> unbalanced culture medium in which the If the nitrogen source is consumed first, then experience has shown that better yields of mycophenolic acid are obtained versus the use of a balanced culture medium (i.e., i-ines culture medium in which the Nutrients are used up at approximately the same time). When applying an unbalanced Culture medium one can also proceed in such a way that the nitrogen source is consumed while still some carbon source and of course magnesium source are present in the culture medium, whereupon the available carbon source is maintained or increased by adding more amounts of the carbon source be admitted.

Nach beendeter Kultivierung kann die Mykophenolsäure aus dem Kulturmedium in an sich bekannter Weise abgetrennt werden. Man kann hierzu das verbesserte Verfahren gemäß GB-PS 11 58 387 verwenden. Hierbei wird zunächst der pH-Wert der Kulturbrühe vor dem Filtrieren auf 10 bis 11 eingestellt, worauf dann das Filtrat und die Waschflüssigkeiten bei einem alkalischen oder sauren pH-Wert mit einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch extrahiert werden.After cultivation has ended, the mycophenolic acid can be extracted from the culture medium in a manner known per se Way to be separated. The improved method according to GB-PS 11 58 387 can be used for this purpose. Here, the pH of the culture broth is first adjusted to 10 to 11 before filtering, whereupon then the filtrate and washing liquids at an alkaline or acidic pH with a suitable one Solvent or solvent mixture are extracted.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.The invention is illustrated in more detail by the following examples.

Beispiel 1example 1

Es- wurde ein Kulturmedium zubereitet, das die folgenden Bestandteile pro Liter enthielt:A culture medium was prepared which contained the following components per liter:

ZnSO₄
MnSO₄ · 4 H₃OZnSO ₄
MnSO ₄ · 4 H ₃ O

Glucoseglucose

NH₄NO₃ NH ₄ NO ₃

KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄

MgSO₄ · 7 H₂OMgSO ₄ · _{7H 2} O

SpurenelementkonzentratTrace element concentrate

Destilliertes Wasser aufDistilled water on

100g
3,72 g
5g100 g
3.72 g
5g

Ig
2 ml
1 mlIg
2 ml
1 ml

Die Zusammensetzung des Spurenelementkonzcntrats war wie folgt:The composition of the trace element concentrate was as follows:

Destilliertes Wasser aufDistilled water on

I₁Og
0,1g
0,1g
11I ₁ og
0.1g
0.1g
11th

Einige Tropfen konzentrierter Salzsäure wurden zur Erzielung einer klaren Lösung hinzugegeben.A few drops of concentrated hydrochloric acid were added to make the solution clear.

Es wurden 51 Kulturmedium mit Sporen des Organismus Penicillium stoloniferum (I.C.I.-Stamm Nr.51 culture medium with spores of the organism Penicillium stoloniferum (I.C.I. strain no.

κι ACC 438, d.h. l.M.I.-Stamm 126540) in einem Gefäß geimpft, das bei einer Rührdrehzahl von 712 U/min und einem Luftstrom von einem halben Volumen/Volumen/ Minute auf 25° C gehalten wurde. Nach 93 st wurden 65 ml einer 80%igen (G/V) Glucoselösung zugegeben.κι ACC 438, i.e. l.M.I. strain 126540) in one vessel inoculated, which at a stirring speed of 712 rpm and was maintained at 25 ° C with an air flow of half a volume / volume / minute. After 93 st were 65 ml of an 80% (w / v) glucose solution were added.

Nach 215 st wurde das Mycel von der Kulturbrühe abfilu iert 1 1 Filtrat wurde mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert Die erste Extraktion erfolgte mit 200 ml Lösungsmittel und die zweite und dritte Extraktion jeweils mit 100 mlAfter 215 hours, the mycelium was filtered off from the culture broth. 1 1 of the filtrate was treated with concentrated hydrochloric acid adjusted to pH 2 and extracted with ethyl acetate. The first extraction was carried out with 200 ml of solvent and the second and third extraction each with 100 ml

:» Lösungsmittel. Die vereinigten Äthylacetatextrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, worauf dann das Natriumsulfat durch Filtration entfernt wurde. Die Äthylacetatlösung wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei 2,5 g eines blaßbraunen: »Solvent. The combined ethyl acetate extracts were dried with anhydrous sodium sulfate, after which the sodium sulfate was removed by filtration became. The ethyl acetate solution was evaporated to dryness in vacuo yielding 2.5 g of a pale brown

:". Feststoffs erhalten wurden, der in 100 ml Äthylacetat aufgelöst wurde. Der Lösung wurden dann 5 g Aktivkohle zugesetzt. Das Gemisch wurde ! 0 min auf Rückfluß gehalten, und die Aktivkohle wurde dann durch Filtration entfernt Jetzt wurden 5CC ml verdünnte: ". Solid, which was dissolved in 100 ml of ethyl acetate. The solution then became 5 g Activated charcoal added. The mixture was! Refluxed for 0 min and then the charcoal was turned off removed by filtration. Now 5CC ml were diluted

in Salzsäure (4%ige [V/V] Lösung von konzentrierter Salzsäure in Wasser) langsam zugegeben, worauf die Mischung stehengelassen wurde, bis die Auskristallisation beendet war. Das Gemisch wurde filtriert, und der kristalline Rückstand wurde zunächst mit verdünnterin hydrochloric acid (4% [V / V] solution of concentrated Hydrochloric acid in water) was slowly added, whereupon the mixture was left to stand until crystallization ended. The mixture was filtered and the crystalline residue was first diluted with

j-, Salzsäure und dann mit Petroläther (Kp. 40 bis 60⁰C) gewaschen. Die Kristalle wurden dann im Vakuum getrocknet Auf diese Weise wurden 190 g Kristalle in Form von Nadeln mit einem Fp. von 139° C und mit einem Gehalt von 95,4% Mykophenolsäure (bestimmtj-, hydrochloric acid and then washed with petroleum ether (bp. 40 to 60 ⁰ C). The crystals were then dried in vacuo. In this way, 190 g of crystals in the form of needles with a melting point of 139 ° C. and a content of 95.4% mycophenolic acid (were determined

4(i in Methanollösung durch Absorption bei 304 μπι) erhalten.4 (i in methanol solution by absorption at 304 μπι) obtain.

Beispiel 2Example 2

In einem 1136 1 fassenden Gefäß wurden 654 1 eines ι". Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung eingebracht. In a jar with a capacity of 1136 l, 654 l became one ι ". Introduced culture medium of the following composition.

Glucoseglucose

NH₄NO₃ NH ₄ NO ₃

KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄

MgSO₄ · H₂OMgSO ₄ · H ₂ O

HefeextraktYeast extract

SpurenelementkonzentratTrace element concentrate

(siehe Beispiel 1)(see example 1)

12% G/V
0,52% G/V
0,5% G/V
0,056% G/V
0,1% G/V12% w / v
0.52% w / v
0.5% w / v
0.056% w / v
0.1% w / v

0,2% V/V0.2% v / v

FeSO.!
CuSO.,FeSO.!
CuSO.,

7H₂O
5 H₂O7H ₂ O
5 H ₂ O

1.0g
0.15g1.0g
0.15g

Nach Impfung mit 73 I einer wachsenden Kultur von Penicillium stoloniferum (I.C.I.-Stamm Nr. ACC 438; d. h. I.M.I.-Stamm Nr. 126540) wurde das Kulturmedium unter Rühren mit 200 U/min einer Inkubation bei 23°C unterworfen, wobei die stündliche Luftzufuhr etwa 25,5 m³ betrug. Nach 99 st hatte sich die Menge der Mykophenolsäure gemäß Fluoreszenzspektralfotometrie (siehe Beispiel 3) auf 1114 mg pro Liter erhöht. Das Ernten erfolgte wie üblich.After inoculation with 73 l of a growing culture of Penicillium stoloniferum (ICI strain No. ACC 438; ie IMI strain No. 126540), the culture medium was incubated at 23 ° C. with stirring at 200 rpm, the hourly air supply was about 25.5 m ³ . After 99 hours, the amount of mycophenolic acid according to fluorescence spectrophotometry (see Example 3) had increased to 1114 mg per liter. Harvesting took place as usual.

Vergleichsbeispiel IComparative example I.

Es wurden zwei Kultivierungsverstiche (auf 5-l-Basir.) unter gleichen Bedingungen mit den folgenden Kulturmedien durchgeführt.Two cultivation samples were carried out (on a 5-liter basis). carried out under the same conditions with the following culture media.

Behälter AContainer A

Bedingungenconditions

Luftstrom (l/min)
Temperatur CQ
Rührdrehzahl (U/min)Air flow (l / min)
Temperature CQ
Stirring speed (rpm)

KulturmediumCulture medium

Glucose
NH₄NO₃
KH₂PO₄ glucose
NH ₄ NO ₃
KH ₂ PO ₄

Spurenelementkonzentrat (siehe Beispiel 1)
MgSO₄ · 7 H₂OTrace element concentrate (see example 1)
MgSO ₄ · _{7H 2} O

2,5
23
7122.5
23
712

12% G/V 0,19% G/V 0,01% G/V 0,2% V/V12% w / v 0.19% w / v 0.01% w / v 0.2% v / v

2,5 23 7122.5 23 712

12% G/V 0,19% G/V 0,5% G/V 0,2% V/V12% w / v 0.19% w / v 0.5% w / v 0.2% v / v

0,1% G/V 0,002% G/V Die Behälter wurden mit Sporen von Penicillium stoloniferum (I.CI.-Stamm Nr. ACC 438; d.h. I.M.I.Stamm Nr. 126540) geimpft, worauf in Abständen Proben entnommen wurden. Jede Probe wurde mit einer 10 n-Kaliumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 10 gebracht, gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde dann mit Zitronensäure auf einen pH-Wert von 2 gebracht und anschließend mit Benzol extrahiert Die Benzollösung wurde mit einer 0,02 n-Natriumhydroxydlösung rückextrahiert Die Konzentration der Mykophenolsäure (als Natriumsalz vorhanden) in der wäßrigen Lösung wurde fluoreszenzspelciralfotometrisch gemessen (Messung der Fluoreszenzemission bei 428 μιη mit einer Aktivierungswellenlänge von 338 μπι).0.1% w / v 0.002% w / v The containers were filled with spores of Penicillium stoloniferum (I.CI. Strain No. ACC 438; i.e. I.M.I. Strain No. 126540), after which samples were taken at intervals. Each sample was with a 10 N potassium hydroxide solution brought to a pH value of 10, stirred and filtered. The filtrate was then brought to a pH of 2 with citric acid and then extracted with benzene Benzene solution was back extracted with a 0.02N sodium hydroxide solution. The concentration of mycophenolic acid (present as the sodium salt) in the aqueous solution was fluorescence spectral photometry measured (measurement of the fluorescence emission at 428 μm with an activation wavelength of 338 μm).

Die erhaltenen Resultate waren wie folgt:The results obtained were as follows:

Alter Behälter AOld container A

Trocken- Magnesium gewichtDry magnesium weight

(st) (mg/g) (m_c-nil)(st) (mg / g) (m _c -nil)

Mykophenolsäure Mycophenolic acid

(mg/1) Behälter B(mg / 1) container B

Trockengewicht Dry weight

(mg/g)(mg / g)

Magnesium MylOphenol-Magnesium MylOphenol-

(mg/ml)(mg / ml)

(mg/1)(mg / 1)

168
191168
191

10,1
9,510.1
9.5

0,12 0,120.12 0.12

125 195 6,0125 195 6.0

Null
Nullzero
zero

55 <5055 <50

Diese Ergebnisse zeigen die Vorteile der Verwendung einer Magnesiumquelle.These results demonstrate the benefits of using a source of magnesium.

Obwohl das Kulturmedium unterschiedliche Gehalte an KH2PO4 enthielt, sind die Ergebnisse aussagekräftig, weil nämlich kein Anzeichen besteht, daß die Erzeugung von Mykophenolsäure durch einen Mangel an Phosphor angeregt wird. Dies wurde durch das Vergleichsbeispiel 2 bestätigt.Although the culture medium contained different levels of KH2PO4, the results are meaningful, namely, because there is no indication that the production stimulated by mycophenolic acid due to a lack of phosphorus. This was demonstrated by the comparative example 2 confirmed.

Vergleichsbeispiel 2Comparative example 2

Um die wesentliche Rolle des Magnesiums zu bestätigen, wurden Versuche in Schüttelgefäßen mit dem folgenden Kulturmedium durchgeführt:In order to confirm the essential role of magnesium, experiments were carried out in shaking flasks with carried out with the following culture medium:

KulturmediumCulture medium

Glucoseglucose

Ammoniumtartrat
KH₂PO₄ Ammonium tartrate
KH ₂ PO ₄

Spurenelementkonzentrat
(siehe Beispiel 1)Trace element concentrate
(see example 1)

10% G/V 0,427% G/V 0,5% G/V10% w / v 0.427% w / v 0.5% w / v

0,2% V/V0.2% v / v

Temperatur 25° CTemperature 25 ° C

Schüttlergeschwindigkeit 200 U/minShaker speed 200 rpm

Schüttleramplitude 50,8 mmShaker amplitude 50.8 mm

Die Konzentration des Produkts in einer jeden Flasche wurde wie in Vergleichsbeispiel 1 gemessen, mit dem Unterschied, daß die Meßempfindlichkeit auf die niedrigeren zu erwartenden Konzentrationen angepaßt wurde. Die Ergebnisse waren wie folgt:The concentration of the product in each bottle was measured as in Comparative Example 1 with the difference is that the measurement sensitivity is adapted to the lower concentrations to be expected became. The results were as follows:

Zu Proben von 100 ml des Kulturmediums in 500-ml-FIaschen wurden verschiedene Mengen von Magnesium-, Kalzium , Strontium- oder Bariumsalzen, wie weiter unten angegeben, zugegeben. Nach Sterilisierung wurden jeweils drei Replikate aus einer jeden Probe mit 'Sporen von Penicillium stoloniferum (I.CI.-Stamm Nr. ACC 438; d.h. I.M.I.-Stamm Nr. 126540) geimpft, worauf die Kultivierung unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wurde:Various amounts of Magnesium, calcium, strontium or barium salts, as indicated below, are added. After sterilization three replicates were made from each sample with 'spores of Penicillium stoloniferum (I.CI.-Strain No. ACC 438; i.e. I.M.I.-Strain No. 126540), after which cultivation was carried out under the following conditions:

SalzzusatzSalt added

Mykophenolsäure nach 164 stMycophenolic acid after 164 st

(mg/1)(mg / 1)

4-, Vergleichsversuche
MgSO₄ · 7 H₂O4-, comparative tests
MgSO ₄ · _{7H 2} O

Ca(NO,)₂ -4 H₂O
Ba(NO₁):
Si(NOj)₂-4 H₂OCa (NO,) ₂ -4 H ₂ O
Ba (NO ₁ ):
Si (NOj) ₂ -4 H ₂ O

(kein(no

Salzzusatz)Salt addition)

0,001%0.001%

0,010%0.010%

0,050%0.050%

0,006%0.006%

0,030%0.030%

0,002 %0.002%

0,010%0.010%

0,003 %0.003%

0,016%0.016%

4242

4848

211211

226226

2828

4242

2121

2121

1414th

1414th

Die Ergebnisse zeigen
Magnesiums.The results show
Magnesium.

die wesentliche Rolle desthe essential role of the

Claims (4)

Patentansprüche:Patent claims: 1. Verfahren zur Herstellung von Mykophenolsaure durch aerobe submerse Kultivierung eines Mykophenolsäure erzeugenden Penicillium-Vertre- -. ters, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das zu Beginn der Fermentation Quellen von C, N, P, S und K und geringfügige Mengen von Spurenelementen sowie zusätzlich pro Liter des Nährmediunis eine Magnesi- ι ο umquelle in einer Konzentration von 10 bis 100 mg Magnesium eüthält, und daß im Nährmedium während im wesentlichen des ganzen Verfahrens eine Magnesiumqueile vorhanden ist1. Process for the production of mycophenolic acid by aerobic submerged cultivation of a Mycophenolic acid-producing Penicillium representative -. ters, characterized in that one a nutrient medium is used that contains sources of C, N, P, S and K and at the beginning of the fermentation small amounts of trace elements as well as an additional magnesia ι ο per liter of the nutrient medium umquelle in a concentration of 10 to 100 mg Magnesium keeps, and that in the nutrient medium Magnesium swell is present throughout essentially the entire process 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- r> zeichnet, daß die Mengen der Nährmediumbestandteile im Nährmedium zu Beginn der Fermentation so gewählt werden, daß die N-Quelle bei einem Zwischenstadium des Verfahrens verbraucht ist, während die Quellen der anderen lebenswichtigen :» Elemente noch vorhanden sind.2. The method according to claim 1, characterized in that r> draws that the amounts of the nutrient medium components in the nutrient medium at the beginning of the fermentation so be chosen so that the N source is consumed at an intermediate stage of the process, while the sources of the other vital ones: “Elements are still there. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium zu Beginn der Fermentation 1 bis 300 g C-Quelle pro Liter Nährmedium und 0,01 bis 10 g N-Quelle, als Gewicht r> des elementaren N ausgedrückt, pro Liter Nährmedium enthält3. The method according to claim 2, characterized in that the nutrient medium at the beginning of the Fermentation 1 to 300 g of C source per liter of nutrient medium and 0.01 to 10 g of N source, as weight r> of elemental N, per liter of nutrient medium 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die N-Quelle verbraucht wird, während immer noch etwas C-Quelle im Nährmedium m vorhanden ist, worauf die verfügbare C-Menge aufrechterhalten oder erhöht wird, indem weitere Mengen der C-Quelle dem Nährmedium zugegeben wurden.4. The method according to claim 2, characterized in that the N source is consumed while there is still some C source in the nutrient medium m, whereupon the available C amount is maintained or increased by adding further amounts of the carbon source to the nutrient medium became.