DE1617886A1 - Process for the preparation of drugs with selective tropism against cancer and certain organs - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln mit selektives Tropismus gegen Krebs und bestimmte Organ. Process for the preparation of drugs with selective tropism against cancer and certain organ.

Bei Spontan-Tumoren reicht die körpereigene immunologische Tuxorabwehr durch Antikörperglobuline mengenmä#ig nicht aus. Die Antikörper können einen selektiven Tropismus zu den Tumorzellen besitzen, ohne daß sie diese schädigen. Die immunologische Krebstherapie mu# deshalb sowohl die tumorspezifische Antikörperbildung, als auch die zell schädigende Wirkung der Antikörper auf Tumorzellen verstärken.In the case of spontaneous tumors, the body's own immunological Tuxor defense is sufficient in terms of quantity due to antibody globulins. The antibodies can be selective Have tropism to the tumor cells without damaging them. The immunological Cancer therapy must therefore include both tumor-specific antibody formation and increase the cell-damaging effect of the antibodies on tumor cells.

Die aktive Immunisierung des Tumor-Patienten mit Tumor-Antigenen, insbesondere aus dei körpereigenen Tumor, kann die Antikörperbildung nur wenig beeinflussen, weil sich im Vorlauf der Tuiorkrankheit eine immunologisch. Toleranz gegen diese Tumor-Antigene ausbildet. Sofern organspezifische Antigene mitverwendet werden besteht bei dieser Art der Behandlung dann die Gefahr ftlr eine Autosensibilisierung gegen das Organgewebe des Mutterbodens der Geschwulst.The active immunization of the tumor patient with tumor antigens, especially from the body's own tumor, can only slightly influence the formation of antibodies, because an immunological. Tolerance to this Forms tumor antigens. If organ-specific antigens are also used with this type of treatment there is a risk of auto-sensitization to the organ tissue of the topsoil of the tumor.

Erfindungsgemäß kann nun die Antikörperbildung gegen Tumore eingeleitet oder aktiviert worden, wenn man Messenger-Ribonucleinsäuren aus sensibilisierten lymphatischen Zellelementen des Blutes und der Körperflüssigkeiten, wie Makrophagen, , monosytoide Elemente, kleine Lymphozyten und spindelförmige Zellen (Histiozyten) anstatt des Antigens auf den Petienten überträgt. Nach dieser Methode ist auch die Einleitung einer Antikörperbildung in Mittler-Tieren sowie in Gewebekulturen von lymphatischen Geweben und in den aus solchen Geweben hergestellten zellfreien Synthesesystemen in vitro möglich.According to the invention, the formation of antibodies against tumors can now be initiated or activated when sensitizing messenger ribonucleic acids from lymphatic cell elements of the blood and body fluids, such as macrophages, , monosytoid elements, small lymphocytes and spindle-shaped cells (histiocytes) instead of the antigen transfers to the patient. According to this method is also the Initiation of antibody formation in intermediate animals as well as in tissue cultures of lymphatic tissues and in the cell-free synthesis systems produced from such tissues possible in vitro.

Dieses Verfahren der Induktion der Antikörperbildung durch Messenger.This method of inducing antibody formation by messenger.

RNS und der Gewinnung von Antikörpern in vitro wurde von JACHERTS Beschrieben in Z. med. Mikrobiol. u. Immunol. 152, 112-133 (1966), sowie in den dort unter Nr. 3, 11, 12 und 13 angegebenen diese bezüglichen weiteren Veröffentlichungen. Dieses Verfahren wurde Jedoch bisher nicht in der vorliegenden Weise zur Erzeugung von Messenger-RNS und Antikörpern gegen Tumoren und normale Organe verwendet. Das Verfahren läßt sich nämlich auch auf Organ-Extrakte bzw. Organ-Antigene als Ausgangsstoffe übertragen.RNA and the generation of antibodies in vitro was carried out by JACHERTS Described in Z. med. Microbiol. and Immunol. 152, 112-133 (1966), as in the further publications specified there under nos. 3, 11, 12 and 13. However, this method has not heretofore been produced in the present manner used by messenger RNA and antibodies against tumors and normal organs. That This is because the process can also be based on organ extracts or organ antigens as starting materials transfer.

Bei vorliegenden Verfahren ist die besondere Methode der aktiven Immunisierung durch RNS und der Antikörpergewinnung ein Bestandteil, der als Verfahrensschritt A bezeichnet wird.In the present procedure, the particular method is active immunization by means of RNA and the production of antibodies, a component that is considered a process step A is designated.

(A) Die Gewinnung von Tumor-Antigenen und geeigneten Tumor-Extrakten wie auch von Organ-Antigenen und Organ-Extrakten erfolgt nach bekannten Verfahren, z.B. nach DBP-Anneldung T 33 o36 IVa/3oh; dem DBP 1 090 821i nach POTTER, APPELLA und GEISSER: j. Mol. Biol.(A) Obtaining tumor antigens and suitable tumor extracts as well as organ antigens and organ extracts are carried out according to known methods, e.g. after DBP announcement T 33 o36 IVa / 3oh; the DBP 1 090 821i to POTTER, APPELLA and GEISSER: j. Mol. Biol.

(1963) u.a.. Zur Erzeugung der M-RNS in Zellen werden bei vorlieindem Verfahren auf bekannte Weiser z.B. durch Schwerkrafttrennung, spontane Sedimantation, Elektrophorese und Siebung aus Blutkonservon die leukozytären Blutzellen, insbesondere die antikörperbildenden Zellen isoliert und im natürlichen Milieu des Blutplasmas, gegebenenfalls unter Zusatz von Antibiotika und bzw. oder Chemotherapeutiks oder aber in einem geeigneten Gswebekulturmedium, z.B Hanck's-Lösung + 10 * Kälberserum sowie Zusatz von Antibiotika und bzw oder Chemotherapeutika (vergl. D. JACHERTS : Z. Med. Mikrobiol. o. Immunol, 152, 1 - 19 (1966), gegebenenfalls unter mechanischer Bewegung und Durchlüftung gezüchtet. Der Tumor-Extrakt bzw. die Tumor-Antigene werden entspr@chend diese. Verfahren in Verdünnungen zugesetzt, z.B. von 10-4 bis 10-12 g der Tumor- bzw. Organ-Trocken- substanzen oder den entsprechend@@/Konzentrationen von Frischextrakten pro ml des Gewebekulturmediums. Nach einer Bebrütungszeit von mehreren Stunden bis Tagen werden die Leukozyten mit UV-Licht bestrahlt (vergl.(1963) et al. To generate the M-RNA in cells, the leukocyte blood cells, in particular the antibody-forming cells, are isolated in the present method in known ways, for example by gravity separation, spontaneous sedimentation, electrophoresis and sieving from blood preservation and in the natural milieu of the blood plasma, optionally with the addition of antibiotics and or . or chemotherapeutics or in a suitable tissue culture medium, e.g. Hanck's solution + 10 * calf serum as well as the addition of antibiotics and / or chemotherapeutics (see D. JACHERTS: Z. Med. Mikrobiol. o. Immunol, 152, 1 - 19 (1966 ), if necessary cultured with mechanical movement and aeration. The tumor extract or the tumor antigens are added accordingly in dilutions, eg from 10-4 to 10-12 g of the tumor or organ dry substances or the corresponding @@ / concentrations of fresh extracts per ml of tissue culture medium. After an incubation time of several hours to days, the leukocytes are irradiated with UV light (cf.

JACHERTS : Z. med. Mikrobiol. u. Immunol. 152, 262 bis 272 (1966), oder ab.r durch andere physikalische Methoden, z.B. durch kurze Erwärmung auf 40°C, Bestrahlung mit ionisierenden Strahlen, oder durch chenische Einwirkung von radiomimetisch wirkenden Substanzen geschädigt.JACHERTS: Z. med. Microbiol. and Immunol. 152, 262-272 (1966), or ab.r by other physical methods, e.g. by brief heating to 40 ° C, Irradiation with ionizing rays, or by chemical action of radiomimetic acting substances are damaged.

Nach Eintreten des prämorbiden Stadiums, das ei beginnenden Absterbe von Zellen der Kultur zu erkennen ist, werden die Zellen durch vorsichtiges Abschleudern isoliert und mehrmals in physiologischer Koc salzlösung gewaschen und gefriergetrocknet. Es ist auch möglich, nec KIRBY: Progress in nucleic acid research and molecular biology, ed. by DAVIDSON and COHN. New York and London:"Acadeiie Press,"die RNS zu präparieren und anschliessend durch Gefriertrocknung zu konservie ren. After the premorbid stage has occurred, the egg begins to die can be recognized by cells of the culture, the cells are carefully thrown off isolated and washed several times in physiological Koc salt solution and freeze-dried. It is also possible, nec KIRBY: Progress in nucleic acid research and molecular biology, ed. by DAVIDSON and COHN. New York and London: "Acadeiie Press," the RNA to be prepared and then preserved by freeze-drying.

Die so gewonnenen lymphatischen Zellen bzw. RNS werden nun in Konzentrationen von 10-3 bis 10-9 g Trockensubstanz pro ml physiologischer Kochsalzlösung als Suspension bzw. Lösung gegebenenfalls (53 wiederholt im Arbeitsgang B Mittler-Tieren injiziert oder in Gewebekulturen unter Verwendung anderer lymphatischer Zellen oder geeigne. tor künstlich zusammengesetzter zellfreie Synthesesysteme zur Erzeugung von Antikörpern verwendet. The lymphatic cells or RNA obtained in this way are now in concentrations from 10-3 to 10-9 g of dry matter per ml of physiological saline solution as a suspension or solution, if necessary (53 injected repeatedly in operation B medium animals or in tissue cultures using other lymphatic cells or the like. tor artificially assembled cell-free synthesis systems for the generation of antibodies used.

Die Anregung der Antikörperbildung und Gewinnung von Antikörpern (C) von Krebs-Patienten entspricht dem Arbeitsgang C des vorliegenden Verfahrens. Auch hier erfolgen die Injektionen in Abständen von Stunden bis einigen Tagen. The stimulation of antibody formation and the production of antibodies (C) from cancer patients corresponds to operation C of the present method. Here, too, the injections are made at intervals of hours to a few days.

Die nach Arbeitsgang B) und C) gewonnenen Antikörperglobuline könne nun nun im Arbeitsgang D einzeln oder als Mischung nach ebenfalls bekannten Verfahren an Organ-Extrakten aus den Geweben dos normalen Mutterbodens der Geschwulst, oder den entsprechenden homologen oder heterologen Organ-Extrakten oder Homogenaten abgesättigt werden. The antibody globulins obtained according to operations B) and C) can now in step D individually or as a mixture according to known processes organ extracts from the tissues of the normal topsoil of the tumor, or the corresponding homologous or heterologous organ extracts or homogenates are saturated will.

Es eignet sich dazu das Vorfahren der Adsorption mittels Säulenchromatographie, wie euch bekannte immunologische Verfahren der Prä zipitation. Dieser Arbeitsschritt ist besonders wichtig, wenn zur Gewinnung der Antikörper bzw. der M-RNS keine isolierten Tumor-Antl gene, sondern Tumor-Totalextrakte verwendet wurden, die noch organspezifische Faktoren des normalen Gewebes enthalten. Der nicht präzipitierte Teil des Antikörper ist vorwiegend tumorspezifisch, (E) Eine weitere Einengung kann im Arbeitsgang E) durch Absättigung an dem entsprechenden Tumor-Extrakt erfolgen. Das durch Antigen-Antikörperbildung zustandekommende Präzipitat wird nach bekannten Methoden isoliert und gewaschen und in seine beiden Bestandteile dissoziiert, wobei die Antikörper und Antigene bzw. Haptene zurUckgewonnen werden können, (vergl. z.B. GRAMLICH: Naturwissenschaften 49 (1962), 451.) Die Antikörper-Globuline können z.3. aber auch nach Dissoziation vom Antigen durch Halbsättigung mit Ammoniumsulfat gefällt, von der überstehenden Antigenldsung getrennt und mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen werden. Aus der überstehenden Antigenlösung werden, z.3. gegebenenfalls nach bekannten Verfahren, durch Gel-Filtration oder Dialyse die Antigene und Hapter isoliert. Die isolierten Antigene können dann beim Verfahrensschritt A) und B) oder aber auch direkt zur aktiven Immunisierung und rneuten Antikörpergewinnung verwendot werden. The process of adsorption using column chromatography is suitable for this purpose, like you are familiar with immunological methods of precipitation. This step is particularly important if no isolated antibodies or M-RNAs are to be obtained Tumor antl genes, but total tumor extracts were used, which are still organ-specific Contain normal tissue factors. The unprecipitated part of the antibody is predominantly tumor-specific, (E) A further narrowing can be done in step E) by saturation on the corresponding tumor extract. That through antigen-antibody formation coming about Precipitate is isolated and washed according to known methods and into both of them Components dissociated, whereby the antibodies and antigens or haptens are recovered (cf. e.g. GRAMLICH: Naturwissenschaften 49 (1962), 451.) The antibody globulins can e.g. 3. but also after dissociation from the antigen due to half saturation with ammonium sulfate precipitated, separated from the supernatant antigen solution and treated with physiological saline solution getting washed. From the supernatant antigen solution, z.3. possibly according to known methods, by gel filtration or dialysis, the antigens and hapters isolated. The isolated antigens can then be used in process step A) and B) or but also used directly for active immunization and new antibody production will.

Die isolierten tumorspezifischen Antikörper werden nun im Arbeits-:) schritt F) nach bekannten Verfahren durch milde Reduktion, z.3. mit 3-Merkaptoaethanol, durch Sprengung der Disulfidbrücken in Bruchstücke gespalten (vergl. POTTER, APPELLA und GEISSER, j. Mol. The isolated tumor-specific antibodies are now in the working :) step F) according to known methods by mild reduction, z.3. with 3-mercaptoethanol, split into fragments by bursting the disulfide bridges (cf. POTTER, APPELLA and GEISSER, j. Mole.

Biol. (1965), 14, 361 bis 372, Dreesman : Proc. nat. Acad. Sci. 54 (1965) 822-830) Eine Frakturierung ist auch durch andere chemische Methoden, z.B. durch Anwendung von Salzlösungen und Erwärmung, wie auch durch chemische Hydrolyse (vergl. DBP ) und durch fermentative Spaltung, z.3. mit Papain (vergl. KRONVALL : Vox. Sang. Biol. (1965), 14, 361-372, Dreesman: Proc. nat. Acad. Sci. 54 (1965) 822-830) Fracturing is also possible by other chemical methods, e.g. using saline solutions and heating, as well as chemical hydrolysis (see DBP) and by fermentative cleavage, z.3. with papain (see KRONVALL : Vox. Sang.

10: 303-313 (1965) möglich. Der Tropismus zum Antigen muß dabei für einen Teil der Bruchstücke erhalten sein. Nach bekannten chemischen Methoden werden nun an diese Bruchstücke krebswirksame Arzneimittel gebunden. Diese müssen gegebenenfalls vor der Ankopplung chemisch aktiviert werden. So werden z.B. an die freien Sulfhydrilgruppen der Antikörperbruchstücke Schwefel-Lost-Derivate, die vorher am Schwefelatom reduziert worden sind, durch milde Oxidationsmittel angekoppelt. Es können jedoch such andere bekannte chemische Methoden der Ankopplung, Je nach Verwendung eines bestimmten Arzneimittels verwendet werden, wie z.B. die Diazotierung, Alkylierung, das Oxazolon-Verfahren, u.e.. Gegebenenfalls werden nun die nicht zur Reaktion genommenen Antikörper-Globuline erneut durch Aussalzung gefällt und die im Überstand vorhandenen angekoppelten konjugierten Moleküle z.B. durch Dialyse oder Gel-Filtration isoliert und nach bekannten Verfahren konserviert. 10: 303-313 (1965) possible. The tropism to the antigen must be for some of the fragments will be preserved. Use known chemical methods to be cancer-effective drugs are now bound to these fragments. These may have to be chemically activated prior to coupling. For example, the free sulfhydryl groups of the antibody fragments sulfur mustard derivatives, which were previously reduced at the sulfur atom have been coupled by mild oxidizing agents. However, others can also do so known chemical methods of coupling, depending on the use of a particular Drug, such as diazotization, alkylation, the oxazolone process, u.e .. If necessary, the antibody globulins not used for the reaction are now again precipitated by salting out and the coupled conjugated present in the supernatant Molecules e.g. isolated by dialysis or gel filtration and preserved by known methods.

Auch die isolierten Tumor-Antigene können einen Tropismus zum gleichartigen Tumor besitzen. Sie eignen sich dann ebenfalls als Vehikel für Arzneimittel, mit denen sie nach bekannten chemischen Methoden zusammengekoppelt werden können. Eine vorherige Abtrennung und Isolierung der chemisch reaktiven Gruppe des Moleküls, die für den Tropismus verantwortlich ist, kann auch hier erfolgen, bevor die chemische Verbindung mit dem tumorwirksamen Arzneimittel stattfindet Die Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten tumorspezifischer Arzneimittel liegen in der selektiven Anreicherung der Arzneimittel am gewünschten Ort der Wirkung. Gegen Krebs werden z.B. die bekannten zytotoxischen bzw. -statischen Substanzen, oder aber sitoh zytolytische Substanzen, wie z.B. Histaminebkd'mmlinge, das Puryl-Histamin, das Epsilon-Puryl-Lysin, oder auch das Dipuryl-Aethylendiamin verwendet, ebenso ist eine Übertragung von Nucleinsäuren oder internen Repressoren, sowie von Eiweißkörpern möglich. Durch den gezielten Transport wird eine vorzeitige Inaktivierung der wirksamen Substanzen vermieden. Die Vergrö#erung des Arznei-Moleküls durch Ankopplung an ein Antikörper- oder Antigen-Fragment verringert die Möglichkeit der Resorption durch andere Körperzellen, die keine Rezeptoren für das Antikörpervehikel besitzen. Gefährliche Nebenwirkungen entfallen.The isolated tumor antigens can also have a tropism to the same Own tumor. They are then also suitable as a vehicle for drugs which they can be coupled together using known chemical methods. One prior separation and isolation of the chemically reactive group of the molecule, which is responsible for the tropism can also be done here before the chemical Connection with the tumor-active drug takes place The advantages and possible applications Tumor-specific drugs lie in the selective enrichment of the drugs at the desired place of effect. For example, the well-known cytotoxic ones are used against cancer or static substances, or else cytolytic substances such as histamine bacteria, puryl histamine, epsilon puryl lysine, or dipuryl ethylenediamine used, as well as a transfer of nucleic acids or internal repressors, as well as protein bodies possible. The targeted transport becomes a premature Inactivation of the active substances avoided. The enlargement of the drug molecule coupling it to an antibody or antigen fragment reduces the possibility absorption by other cells in the body that do not have receptors for the antibody vehicle own. There are no dangerous side effects.

Wegen der Individual- und Tumorspszifitt und der Vielzahl der möglichen Arzneimittel und chemischen Ankopplungsmethoden bieten sich für vorliegendes Verfahren umfangreiche Anwendungsmöglichkeiten.Because of the individual and tumor specificity and the multitude of possible Medicinal and chemical coupling methods are suitable for the present process extensive application possibilities.

Auch ist eine getrennts Anwendung einzelner Verfahrensschritte möglich, so z.B. von Verfahrensschritt A; A und B; A und C; D und Eg D, E und F, sowie such E und F. Als Ausgangsprodukt bzw. Antigen für die Herstellung von Präparaten kann Jede Art von Neoplasma dienen, einschliesslich der sogenannten Blutkrobse.Separate application of individual process steps is also possible, e.g. from process step A; A and B; A and C; D and Eg D, E and F, as well as such E and F. As a starting product or antigen for the manufacture of preparations Any type of neoplasm are used, including the so-called blood clot.

Das erfindungsgeiäße Vorfehren läßt sich auf die Herstellung von organotropen Arzneimitteln übertragen. Dort worden anstatt der Tumor-Extrakte bzw. -Antigene Organextrakte, oder isolierte Organ-Antigene verwendet. Im Verfahrensschritt D) erfolgt die Absättigung der Antikörper-Globuline an einem Extrakt aus einer anderen Organart, z.3. bei der Isolierung von Antikörpern gegen Großhirn am Extrakt aus lCleinhirn, Zwischenhirn oder Rückenmark; bei solchen gegen Zwischenhirn an Rückenmark oder Gro#hirn ; bei Antikörpern gegen Niere an Leber oder Herz; bei solchen gegen Herz an Nieren Leber oder Milz; bei solchen aus Lymphdrüsen an Thymus; bei denen gegen Thymus, an Milz usw. Die Gewinnung von Organ-Antikörpern nach dem erfindungsgemäßen Verfahren des Arbeitsschrittes A) ist auch #### ebenso/wie die Kombination der weiteren Verarbeitung zu organotropen Arzneimitteln, neuartig. Hier bestehen besonders viele Anwendungsmöglichkeiten durch die Ankopplung der verschiedenartigsten Arzneimitteln und chemischer Moleküle. Diese können biologisch sowohl unmittelbar, als auch indirekt wirken F indem sie z.B. durch eleKtromagnetische Strahlen, die von einem besonderen Sender abgestrahlt werden, angeregt werden. Auf diese Weise ist die drahtlose Übermittelung von elektrischen Impulsen, z.B auf das Herz oder bestimmte Jehirnteile möglich, desgleichen auch die Verstärkung von lokalen bioelektrischen Vorgängen und ihre spezifische Ableitung. Am Ort der Wirkung können nicht unmittelbar biologisch aktive Moleküle durch andere Moleküle aktiviert werden.The inventive demonstration can be applied to the production of organotropic Transfer drugs. Been there instead of the Tumor extracts or antigenic organ extracts, or isolated organ antigens are used. In the process step D) the saturation of the antibody globulins takes place on one extract from another Organ type, e.g. 3. in the isolation of antibodies against cerebrum on the extract lcleinbrain, diencephalon, or spinal cord; in those against the diencephalon to the spinal cord or cerebrum; for antibodies against kidneys on the liver or heart; with such against Heart to kidneys liver or spleen; in those from lymph glands on the thymus; at them against the thymus, on the spleen, etc. Obtaining organ antibodies according to the invention The process of step A) is also #### as well as the combination of the others Processing into organotropic drugs, novel. There are particularly many here Possible applications through the coupling of the most varied of drugs and chemical molecules. These can be both direct and indirect biologically act F by, for example, electromagnetic rays emitted by a particular Transmitters are emitted, are stimulated. This is how wireless delivery works from electrical impulses, e.g. on the heart or certain parts of the brain, likewise the amplification of local bioelectrical processes and theirs specific derivation. At the place of action can not be directly biologically active Molecules are activated by other molecules.

Be-sniel 1@ Es sollen tumorspezifische S-Loste zur Behandlung eines Bronchial-Carzinoms hergestellt werden. Die Herstellung gliedert sich in 6 Arbeitsgänge. Im Arbeitagang A) werden die Tumor-Antigene sowie großmolekulare RNS zur Antikörpererzeugung gewonnen. Dazu wird der Tumor nach der chirurgischen Entnahme in kleinere Partikel zerschnitten. Diese werden in physiologischer Kochsalziösung gespült, denn in verfiüssia tem Stickstoff schlagartig gefroren und in tiefgekühlten Mühlen pulverisiert, denn lyophylisiert, anschliessend durch die wasserfreie Säuredampf-Hydrolyse im Vakuum nach DBP 1 090 821 aufgeschlossen und als haltbares Dauerpräparat steril unter Luftabschluss aufbewahrt.Be-sniel 1 @ Tumor-specific mustards for the treatment of a Bronchial carcinoma are produced. The production is divided into 6 work steps. In work step A), the tumor antigens and large-molecule RNA are used to generate antibodies won. To do this, the tumor is broken into smaller particles after surgical removal cut up. These are rinsed in physiological saline solution, because in verdiüssia tem nitrogen suddenly frozen and pulverized in deep-frozen mills, because lyophilized, then by anhydrous acid vapor hydrolysis in a vacuum unlocked according to DBP 1 090 821 and sterile under the exclusion of air as a durable permanent preparation kept.

Nun werden aus frischen Blutkonserven von menschlichem Blut oder such aus frischem tierischen Blut durch Sedimentation und bzw. oder andere bekannte Verfahren die Leukozyten von den roten Blutzellen und den Thrombozyten abgetrennt und im entsprechenden Blutserum nach bekannten Verfahren1g.gebenenfalls unter Zusatz von Antibiotika und bzw oder Chemotherapeutika, in Art einer Gewebekultur gezüchtet. Es können hierzu auch andere geeignete Nkhrmedien verwendet werden, wie z.B. Hanck's-Lösung mit Zusatz von lo % Kälberserum und eine Sombination von Antibiotika. Innerhalb einer Stunde nach Anlegung der Leukozytenkultur wird dieser ein wässriger verdünnter Extrakt aus dem Dauerpräparat des Tumors in einer Konzentration von 10-6 g Trockensubstanz pro ml des Nährmediums zugesetzt. U@ die Lipide des Tumor-Totalextraktes in Lösung zu bringen, werden 0,01 mg Lauryl-Natriumsulfat pro ml mitverwendet. Es können auch frische Tumor-Extrakte oder Homog.nate benutzt werden.Now fresh blood supplies of human blood or search from fresh animal blood by sedimentation and / or others acquaintance Procedure to separate the leukocytes from the red blood cells and platelets and in the corresponding blood serum according to known methods, if necessary with an addition of antibiotics and / or chemotherapeutic agents, grown in the manner of a tissue culture. Other suitable nutrient media can also be used for this purpose, such as Hanck's solution with the addition of lo% calf serum and a combination of antibiotics. Within one hour after the creation of the leukocyte culture, it is diluted with an aqueous solution Extract from the prepared preparation of the tumor in a concentration of 10-6 g dry substance added per ml of the nutrient medium. U @ the lipids of the total tumor extract in solution To bring, 0.01 mg of lauryl sodium sulfate per ml are also used. It can too fresh tumor extracts or Homog.nate can be used.

Nach einer Inkubationszeit von 2 Tagen bei 37°C, werden die -Zellen der Kultur lo Sek. langnit UV-Licht aus einer Quecksilber-Niederdrucklampe mit 8 Watt und. UG-Filter in, Abstand von 13 cm bestrahlt. After an incubation period of 2 days at 37 ° C, the cells of the culture for 10 seconds with UV light from a low-pressure mercury lamp with 8 Watts and. UG filter irradiated in, distance of 13 cm.

Nach etwa 15 Min. werden die Zellen aus der Kultur genommen, dann meh mals in PBS-LUsung gewaschen und gefriergetrocknet. After about 15 minutes, the cells are removed from the culture, then Washed several times in PBS solution and freeze-dried.

B) Im Arbeitsgang B) wurden nun Antikörper-Globuline gewonnen über Mittlertiere oder aus in-vitro-Kulturen von antikörperbildenen Zelles bzw. von geeigneten zollfreien Systemen. Die Methode entspricht einer aktiven Immunisierung, bei der anstatt des Antigens die nach Arbeitsgang A) erhaltenen Präparate in einer Verdünnung von 10-6 g Trookensubstanz pro ml physiologischer Kochsalzlösung verwendet werden Beim Makroorganismus erfolgt die Injektion parenteral, dreimal in Abständen von 1, 2 und 3 Tagen. Die Antikörperproduktion kann dabei unter Verwendung des Tumor-Antigens nach bekannten Methoden der Gel-Präzipitation überwacht werden, so daß nach Erreichen einer ausreiche den Konzentration die Antikörper-Globuliine nach bekannten Verfahren aus dom Blut oder den Körperflüssigkeiten bzw. den Nährmedien gewonnen und z.B. durch Gel-Filtration an Sephadex G 200 bzw. durch Halbeättigung mit Ammoniumsulfat angereichert werden. Das Fällungsprodukt der Ammoniumsulfatlösung wird zentrifugiert und, nachdem der Uberstand beseitigt ist, mit physiol. NaCl gewaschen C) Im Arbeitsgang C) wird im Tumor-Patienten die Antikörperbildung angeregt und verstärkt. Dabei werden in gleicher Weise, wie bei Mittlertisern, die aus Arbeitsgang A) gewonnenen Präparate parken teral injiziert. Die Gewinnung der Antikörper-Globuline erfolgt wie im Arbeitsgang B).B) In operation B), antibody globulins were now obtained using Medium animals or from in vitro cultures of antibody-producing cells or of suitable ones duty-free systems. The method corresponds to an active immunization in which instead of the antigen, the preparations obtained according to step A) in a dilution of 10-6 g Trookensubstanz per ml of physiological saline solution can be used In the case of the macroorganism, the injection is carried out parenterally, three times at intervals of 1, 2 and 3 days. The antibody production can be done using the tumor antigen be monitored by known methods of gel precipitation, so that after reaching A sufficient concentration of the antibody globules according to known methods obtained from blood or body fluids or the nutrient media and e.g. by gel filtration on Sephadex G 200 or by half saturation with ammonium sulfate be enriched. The precipitation product of the ammonium sulfate solution is centrifuged and, after the supernatant has been eliminated, with physiol. NaCl washed C) In step C), the antibody formation is stimulated and intensified in the tumor patient. In the same way as with Mittlertisern, those obtained from operation A) are obtained Park preparations terally injected. The antibody globulins are obtained as in step B).

Im Arbeitsgang D) werden nun die nach Arbeitsgang 13) und C) gewonnenen Antikörper-Globuline im Verhältnis 1s1 zusammengemischt und an Organ-Extrakten aus gesunden Geweben des normalen Mutterbodens der Geschwulst abgesättigt. Sofern es nicht möglich ist, aus dem Operations-Präparat gesunde Gewebe zu konservieren, können zur Absättigung auch tierische Organestrakte verwendet werden. Das nach bekamlten Methoden gewonnene Präzipitat enthält dann die organ- und gagebenenfalls art- und individualspezifischen Faktoren der Antikörper-Globuline. In operation D), those obtained after operation 13) and C) are now obtained Antibody globulins mixed together in a ratio of 1s1 and made from organ extracts healthy tissues of the normal topsoil of the tumor are saturated. Unless there is it is not possible to preserve healthy tissue from the surgical specimen Animal organs can also be used for satiety. That after got Methods obtained precipitate then contains the organ and gag also type and individual-specific factors of the antibody globulins.

Die nicht zur Reaktion genommenen Antikörper sind sowohl gegen die Tumor-Antigene, als auch gegen exogene Antigene gerichtet. Um letztere zu beseitigen, erfolgt im Arbeitsgang E) die Präzipitation der bisher nicht abgasättigten und sich in Lösung befindlichen Antikörper an dem nach Arbeitsgang A) gewonnenen Tumor-Extrakt. Auch hier werden die fsttlöslichen Bestandteile dieses Extraktes mitverwendet, indem diese durch Zusatz von Lauryl-Natriunsulfat der o.a.The antibodies not used for the reaction are both against the Tumor antigens, as well as directed against exogenous antigens. To get rid of the latter, takes place in step E) the precipitation of the so far not exhausted gas and itself Antibodies in solution on the tumor extract obtained in step A). Here, too, the permanently soluble components of this extract are used by this by adding lauryl sodium sulfate of the above

Konzentration emulgiert werden. Das Präzipitat wird nun in üblicher Weise isoliert, gewaschen und in seine Bestandteile dissoziiert. Concentration to be emulsified. The precipitate is now more common Way isolated, washed and dissociated into its components.

Die Antikörper-Globuline werden durch Halbsättigung mit Ammoniumsulfat gefällt und abzentrifugiert. Des übrigbleibende Tumor-Antigen kann dann gegebenenfalls später bei einer Wiederholung des Arbeitganges A) verwendet oder aber zur aktiven Immunisierung von Mittlertieren, bzw. zur Herstellung von organotropen Arzneimitteln benutzt wer den. The antibody globulins are made by half saturation with ammonium sulfate precipitated and centrifuged. The remaining tumor antigen can then optionally used later when repeating operation A) or used as an active one Immunization of middle animals or for the production of organotropic drugs to be used.

@)Im Arbeitsgang F) werden nun die isolierten Antikörper in #-Mercaptomethanol vorsichtig reduziert. Dazu wird eine Lösung vou 0,3 #-Mercaptosethanol, 7 M Guanidin-HC1 ; 0,5 M TRIS-HCl - Puffer (Ph 8,2) vorwendet, bei einem Gehalt von 1 bis 2 * der Antikörper-Globuline. @) In operation F) the isolated antibodies are now in # -mercaptomethanol carefully reduced. A solution of 0.3 # mercaptosethanol, 7 M guanidine HC1 ; 0.5 M TRIS-HCl buffer (Ph 8.2) is used at a content of 1 to 2 * der Antibody globulins.

Nach einer Einwirkungszeit von 1/2 Stunde bei 37°C werden nun 1 M S-Lost der Lösung zugesetzt und diese eine weitere Stunde bei 30 C gehalten. Nun wird auf 10° C abgekühlt und 0,7 M-Methylenblau als schwaches Oxidationsmittel zugesetzt. Nach einer Einwirkungszeit von 1/2 Stunde wird die Lösung für 24 Stunden gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert und dann lyophylisiert. Vorher können die nicht gespaltenen Antikörper-Globuline durch Absättigung mit Ammoniumsulfat ausgefällt, abzentrifugiert und beseitigt werden Der Überstand wird dann erneut gegen physiologische Kochsalzlösung dielysiert. Das fertige Präparat kann in frischem Zustand therapeutisch verwendet werden oder es wird lyophilisiert und vor der Anwendung in einem Lösungsmittel aufgelöst.After an exposure time of 1/2 hour at 37 ° C, 1 M S-mustard was added to the solution and this was kept at 30 ° C. for a further hour. so is cooled to 10 ° C. and 0.7 M methylene blue is added as a weak oxidizing agent. After an exposure time of 1/2 hour, the solution becomes against physiological for 24 hours Dialyzed saline and then lyophilized. Before that, those who cannot be divided Antibody globulins precipitated by saturation with ammonium sulfate, centrifuged off The supernatant is then reassigned against physiological saline dielysed. The finished preparation can be used therapeutically in the fresh state or it is lyophilized and dissolved in a solvent before use.

Beispiel 2s Bs sollen selektive Arzneimittel gegen ein Muskel-Sarkom hergestellt werden. Die Arbeitsschritte A und C entsprechen dem Beispiel 1.Example 2s Bs are intended to be selective drugs against muscle sarcoma getting produced. The work steps A and C correspond to example 1.

Der Arbeitsschritt B entfällt. Im Arbeitsschritt D erfolgt die Präzipitation der vom Patienten gewonnenen Antikörper mit einem frischen zellfreien Extrakt aus Muskelgewebe von Rind, der unmittelbar nach der Schlachtung hergestellt wurde. Das Präzipitat wird zentrifugiert und der Überstand mit dem Tumor-Extrakt inkubiert. Das sich bildende Präzipitat wird gewaschen und bei 370C fr 16 Stunden im Verhältnis 100: 1 mit Merouripapain als Enzym in einer Lösung von 0,01 M Cystein, 0,002 M EDTA, 0,19 M NaCl, o,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 % Das verdaute Präzipitat wird an Sephadex-G-ioo in einer Säule vom 4,4 x 38 cm nach Equilibrierung der Säulen mit o,oo5 M Phosphatpuffer von pH 8,o in einer Rate von 20 ml pro Stunde vom verwendeten Papain getrennt.Step B is omitted. In step D, the antibodies obtained from the patient are precipitated with a fresh cell-free extract from beef muscle tissue that was produced immediately after slaughter. The precipitate is centrifuged and the supernatant is incubated with the tumor extract. The precipitate that forms is washed and washed at 37 ° C. for 16 hours in a ratio of 100: 1 with merouripapain as enzyme in a solution of 0.01 M cysteine, 0.002 M EDTA, 0.19 M NaCl, 0.1 M phosphate buffer pH 7.0% The digested precipitate is digested on Sephadex-G-100 in a column of 4.4 x 38 cm after equilibration of the columns with 0.05 M phosphate buffer of pH 8, o separated from the papain used at a rate of 20 ml per hour.

Die Bruchstücke aus Antikörpern und Antigenen bzw. Haptenen, werden nu durch Diazotierung an Tri#ethylenmelamin (TEM) gekuppelt. Das nicht gebundene TEM wird durch Gel-Filtration entfernt.The fragments of antibodies and antigens or haptens are Now coupled to tri #ethylene melamine (TEM) by diazotization. The unbound TEM is removed by gel filtration.

Beispiel 3r Es soll ein selektiv auf das Großhirn einwirkendes Arzneimittel hergestellt werden Dazu wird im Arbeitsgang A aus einem chirurgischen Operationspräparat menschliches Gehirn gewonnen und zur Erzeugung von antikörperbildenden RNS verwendet, Im Arbeitsgang B werden damit Antikörper vom Pferd gewonnen. Diese werden im Arbeitsgang D an einem Extrakt aus Rückenmark vom Rind abgesättigt. Im Arbeitsgang E erfolgt die Präzipitation der nicht zur Reaktion gekommenen organspezifischen Antikörper mit dem Extrakt aus menschlichem Gehirn. Das Präzipitat wird durch 2-5-tige Glykokollösung nach OLITZKI und FRANKEL dissoziiert (vergl. NATURE: 126, 723 (1930) und Proc. Soz. exp. Biol. a. Med. 28, 492 (1931)) und die Globulin. durch Halbsättigung mit Ammoniumsulfat gefällt und zentrifugiert. Aus dem Überstand werden die Antigene gewonnen und zur Diagnostik dos Tropisums der später erhaltenen Präparate sowis des Senaibilisierungsgrades des Patienten gegen Gehirn verwendet. Die Antikörpor werden fermentativ in Bruchstücke gespalten und durch Ionenaustauscherchromatographie in DEAE-Zellulose (vergl. FRANKLI@ J. clin. Invest. 39t 1933 (1960)) getrennt. Durch Gel-PrSzlpitation+ mit dem Organ-Antigen wird der organotrope Anteil festgestellt und dieser durch Diazotierung an das Arzneimittel gekoppelt.Example 3r A drug is said to act selectively on the cerebrum For this purpose, in step A, a surgical preparation is used human brain obtained and used to generate antibody-forming RNA used, in step B antibodies are obtained from the horse with it. These are saturated in operation D on an extract from beef spinal cord. in the Operation E is the precipitation of the organ-specific that did not react Antibodies with the extract from human brain. The precipitate is through 2-5 days Glycol solution dissociated according to OLITZKI and FRANKEL (see NATURE: 126, 723 (1930) and proc. Social exp. Biol. A. Med. 28, 492 (1931)) and Globulin. through half saturation precipitated with ammonium sulfate and centrifuged. The antigens are obtained from the supernatant obtained and for diagnostics of the tropism of the preparations obtained later as well of the patient's degree of senibilization against the brain. The Antibody are broken down into fragments by fermentation and by ion exchange chromatography in DEAE cellulose (cf. FRANKLI @ J. clin. Invest. 39t 1933 (1960)). By Gel-PrSzlpitation + with the organ antigen, the organotropic part is determined and this coupled to the drug by diazotization.

Claims (3)

Patentansprüche 1.) Verfahren zur Herstellung organspezifischer und gegen Krebs spezifischer Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß man A.) die in bekannter Weise aus Blutkonserven oder frischem menschlichen oder tierischem Blut isolierten Leukozyten, insbesondere Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen rit Tumor-Antigenen inkubiert und durch kannte physikalische und bzw. oder chemische Methoden in praemorbiden Zustand versetzt, konserviert oder aus den Zellen nach bekannten M-thoden die Ribonucliensäuren isoliert und konserviert, diese Präparate nach bekannten Methoden über Mittlertiere oder in Kulturen von antikörperbildenden Zellen bzw. den daraus hergestellten, oder auch künstlich erzeugten zellfreien Systemen, zur Gewinnung von Antikörperglobulinen benutzt und bzw. oder entsprechende Antikörper aus Blut oder Körperflüssigkeiten des antsprechenden Krebs-Patienten nach Vorbehandlung rit den nach Arbeitsgang A hergestellten Präparaten gewinnt, dann (D) diese nach Arbeitsgang B und C gewonnenen Antikörperglobuline nach bekannten Methoden einzeln oder als Mischung « an Organextrakten aus den Geweben des normalen Mutterbodens der Geschwulat absättigt und E ! die sich nicht bindenden Antikörperglohuline mit Tumorextrakten präzipitiert, dieses Präzipitat nach Gekannten Methoden isoliert und in ihre beiden Bestandteile dissoiiert, die Antikörper und Antigene, bzw. Claims 1.) Process for the production of organ-specific and Anti-cancer drugs, characterized in that A.) the in known way from blood reserves or fresh human or animal blood isolated leukocytes, especially lymphocytes, plasma cells and macrophages rit Tumor antigens are incubated and known physical and / or chemical Methods placed in a premorbid state, preserved or removed from the cells after known methods that isolate and conserve ribonuclic acids, these preparations according to known methods via medium-sized animals or in cultures of antibody-forming Cells or the cell-free systems produced from them or artificially produced, used to obtain antibody globulins and / or corresponding antibodies from the blood or body fluids of the corresponding cancer patient after pretreatment rit wins the preparations made in step A, then (D) these antibody globulins obtained in steps B and C by known methods individually or as a mixture of organ extracts from the tissues of normal topsoil the tumor is satiated and E! the non-binding antibody globules with Tumor extracts precipitated, this precipitate isolated by known methods and dissociated into their two components, the antibodies and antigens, or Haptene, chemisch oder fermentativ in Fragmente mit erhaltenem Tropis aufspaltet und an an diese Fragmente durch bekannte chemische Verfahren krebswirksam bzw. zytolytische Medikamente ankuppelt, wobei die Verfahronsschritte Ag A und B ; A und C; D und E, sowie D, E und F und E und F für sich allein ausgeführt werden können 2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß anstell der Tumor-Extrakto, Organ-æxtrakte oder Organ-Antigene als Ausgang stoffe benutzt werden und im Arbeitsschritt D) andere Organarten, als diejenigen des Ausgangsproduktes verwendet werden.Haptens, chemically or fermentatively in fragments with retained tropis and on these fragments are carcinogenic or cytolytic by known chemical processes Coupling drugs, the process steps Ag A and B; A and C; D and E, as well as D, E and F and E and F can be carried out on their own 2.) Procedure according to claim 1, characterized in that instead of the tumor extracts, organ extracts or organ antigens are used as starting materials and others in step D) Organ species than those of the starting product are used. 3.) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl gesundheitsfördernde, , wie -schädigende, als auch unmittelbar und mittelbar pharmakologisch wirkende chemische Moleküle an die organotropen bzw. tumortropen Schleppersubstanzen angekoppelt werd 4.) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Molekül verwendet werden, die durch elektromagnetische Strahlen oder durch andere Stoffe biologisch aktiv werden. 3.) Method according to claim 1 and 2, characterized in that both health-promoting, as well as harmful, as well as directly and indirectly pharmacologically active chemical molecules to the organotropic or tumor tropic Tractor substances are coupled 4.) The method according to claim 3, characterized in that that molecule can be used by electromagnetic rays or by others Substances become biologically active.